Een zwangere vrouw met een gemengde erytrocytenpopulatie bij de bloedgroepbepaling

Een zwangere vrouw met een gemengde erytrocytenpopulatie bij de bloedgroepbepaling Auteurs Trefwoorden J.A.P. Bons, S.J.M. Rouwette, R.J.M.H.E. Straat, J.P.M. Offermans en Y.C.M. Henskens bloedgroepantigenen, foetomaternale bloeding, hemolytische ziekte van de pasgeborene, intra-uteriene vruchtdood, Jkb-antigeen, kleihauer-betketest Samenvatting Een 30-jarige vrouw meldde zich bij de verloskundige in verband met haar eerste zwangerschap. Tijdens de 12 e -weeks screening werd de ABO-bloedgroep en rhesus-d-factor bepaald als A, rhesus-d-positief en screening op irregulaire antistoffen was negatief. Bij een zwangerschapsduur van 39 weken en 4 dagen was er sprake van intra-uteriene vruchtdood veroorzaakt door een grote foetomaternale bloeding. In het transfusielaboratorium vond men een gemengde erytrocytenpopulatie en een sterk positieve kleihauer-betketest. De bloedgroepantigenen van moeder en overleden kind vertoonden slechts 1 verschil. Moeder was Jkb-negatief en kind was Jkb-positief. Tegen dit Jkb-antigeen werd een antistof gevormd door de moeder ten gevolge van de foetomaternale bloeding. Vier maanden na de intrauteriene vruchtdood was mevrouw opnieuw zwanger. De antistoffen die gevormd waren tijdens de eerste zwangerschap vormden een risico voor de tweede zwangerschap. De Jkbantistoffen konden de hemolytische ziekte van de pasgeborene veroorzaken. Het tweede kind werd goed vervolgd en direct na de geboorte was de directe antiglobulinetest negatief, het Jkb-antigeen was afwezig en de hemoglobine en bilirubine uitslagen werden vervolgd en waren niet afwijkend. (Tijdschr Bloedtransfusie 2010;3:122-6) Inleiding Een 30-jarige vrouw met in de voorgeschiedenis vitiligo en tonsillectomie werd begeleid door de verloskundige in verband met haar eerste zwangerschap. Er werd een 12 e -weeks screening aangevraagd. De bloedgroep/rhesus was A, rhesus-d-positief en er werden geen irregulaire antistoffen aangetoond. Bij een zwangerschapsduur van 39 weken en 4 dagen was er sprake van intra-uteriene vruchtdood veroorzaakt door een massale foetomaternale bloeding. Het transfusielaboratorium ontving een aanvraag voor bloedgroep/rhesus en screening irregulaire antistoffen. Er werd ook een kleihauer-betketest aangevraagd in verband met de intra-uteriene vruchtdood. Laboratoriumuitslagen bloedgroepbepaling De bloedgroepbepaling bij de moeder, aan het einde van de zwangerschap, vertoonde een gemengde erytrocytenpopulatie, bestaande uit erytrocyten die het A-antigeen wel bevatten en erytrocyten die het A- antigeen niet bevatten (zie Figuur 1 op pagina 123). Oorzaken voor een gemengde erytrocytenpopulatie kunnen zijn: niet-identieke transfusie, allogene stamceltransplantatie, chimerisme, subgroepen van bloedgroep A, chromosoomafwijkingen ten gevolge hemato-oncologische ziekte. 1 Bij navraag bleek er geen sprake te zijn van een transfusiehistorie, stamceltransplantatie of hemato-oncologische ziekte. Chimerisme leek niet waarschijnlijk aangezien je dan ook problemen zou verwachten tijdens de 12 e - weeks bloedgroepbepaling. Kleihauer-betketest Met behulp van de kleihauer-betketest kan foetaal hemoglobine (HbF) in erytrocyten worden aangetoond. In deze casus werd gebruik gemaakt van de kleihauer-kit van Immucor gamma. Er werd een 122

Figuur 1. Bloedgroepbepaling uitgevoerd met behulp van monoklonale gelkolom van DiaMed, waarin een gemengde erytrocytenpopulatie (mixed-field reactie) waarneembaar was, bestaande uit erytrocyten die het A-antigeen wel bevatten en erytrocyten die het A-antigeen niet bevatten. bloeduitstrijkje gemaakt van bloed van de moeder en de erytrocyten werden gefixeerd met methanol. Het hemoglobine werd bij een lage ph uit de erytrocyten geëlueerd met uitzondering van HbF omdat HbF bestand is tegen zure elutie. Het uitstrijkje werd vervolgens gekleurd met eosine waardoor de HbF-bevattende erytrocyten duidelijk zichtbaar werden als rozerode erytrocyten. Erytrocyten die geen HbF bevatten, kleuren niet aan en doorgaans is slechts de celmembraan zichtbaar (zie Figuur 2). Uitslag kleihauer-betketest en kanttekeningen De uitslag van de kleihauer-betketest bleek sterk positief te zijn. Het promillage HbF-bevattende erytrocyten was 250 en dit komt ongeveer overeen met 1.250 ml foetaal bloed. Dit is slechts een schatting. Bij de berekening is men er vanuit uitgegaan dat er sprake is van een gemiddeld bloedvolume van 5.000 ml van de moeder. Bij de berekening is aangenomen dat het aantal erytrocyten van de foetomaternale transfusie is te verwaarlozen ten opzichte van het totaal aantal erytrocyten bloedvolume van de moeder. Tevens wordt er bij de berekening aangenomen dat de erytrocytenconcentratie van de moeder en de foetus gelijk zijn. Indien er sprake is van een ernstige anemie bij de moeder, moet hiervoor gecorrigeerd worden. Indien je het totaal aantal foetale erytrocyten zou optellen bij bloedvolume van de moeder, krijg je nog een hoger berekend volume foetaal bloed. Normaal heeft een pasgeborene een bloedvolume van 80-90 ml/kg. 1 Gewicht van het overleden kind bedroeg 3.655 gram. Een hoog promillage HbF-bevattende erytrocyten kan veroorzaakt worden door meerdere episoden van bloedingen gedurende het laatste trimester van de zwangerschap. 2 Met behulp van flowcytometrie werd aangetoond dat de levensduur van ABO-compatibele foetale Figuur 2. Bloeduitstrijkje na behandeling met kleihauer-kit van Immucor gamma. De erytrocyten die foetaal hemoglobine (HbF) bevatten zijn rozerood gekleurd en de erytrocyten die geen HbF bevatten zijn zichtbaar als lege membranen. Men telt het aantal foetale cellen per 1.000 volwassen cellen. Door de uitkomst te vermenigvuldigen met 5.000 (gemiddeld bloedvolume volwassen vrouw is 5.000 ml) kan men het aantal ml foetaal bloed berekenen. erytrocyten 120 dagen bedraagt. 3 De 250 promille, zoals gevonden in deze casus, is echter zeer hoog. Kanttekeningen bij de kleihauer-betketest zijn dat deze test moeilijk te standaardiseren is met als gevolg hoge variatiecoëfficienten. 4 Daarnaast kunnen vals-positieve uitslagen gevonden worden indien er sprake is van een intrinsiek hoog HbF-bevattende erytrocyten van de moeder zoals bij persistentie van foetaal hemoglobine. Vervolgonderzoek Indien de gemengde erytrocytenpopulatie werd veroorzaakt door de foetomaternale bloeding, dan zou het kind O-positief moeten zijn aangezien moeder tijdens de 12 e -weeks screening nog bepaald werd als A-positief, terwijl de bloedgroepbepaling op 39 weken 2 populaties erytrocyten liet zien; erytrocyten die wel en niet het A-antigeen bevatten. Om het bloed van het kind te kunnen typeren was een isolatie van de erytrocyten van het kind uit het maternale bloed noodzakelijk aangezien bloedmonsters van het overleden kind niet verkregen konden worden. Deze isolatie is uitgevoerd door gebruik te maken van anti-a-antistoffen. Deze anti- A-antistoffen werden toegevoegd aan het maternaal bloed waardoor de erytrocyten van de moeder die het A-antigeen bevatten werden geprecipiteerd. Deze isolatiestap is meerdere malen herhaald om 123

Tabel 1. Bloedgroep antigeentypering met behulp van DiaMed-kaartjes. De bloedgroep, rhesus en rhesusfenotype van moeder werd na 3 maanden na foetomaternale transfusie bepaald. Er is sprake van 1 antigeenverschil tussen kind en moeder. Kind is Jk b -positief en moeder is Jk b -negatief. Kind Moeder Vader Bloedgroep O A A Rhesus-D POS POS POS Rh-fenotype CCDee CCDee CcDee Antigeentypering M POS POS POS N POS POS POS S NEG NEG POS s POS POS POS P1 NEG NEG POS Le(a) NEG NEG POS Le(b) POS POS NEG Lu(a) NEG NEG NEG Lu(b) POS POS POS K NEG NEG NEG k POS POS POS Kp(a) NEG NEG NEG Kp(b) POS POS POS Fy(a) POS POS NEG Fy(b) POS POS POS Jk(a) POS POS POS Jk(b) POS NEG POS een zuivere bloedgroep van de foetale erytrocyten, afkomstig uit het maternale bloed, te bepalen. Het kind bleek, na scheiding van maternale en foetale erytrocyten, inderdaad 0-positief te zijn. Drie maanden na de foetomaternale bloeding werd de bloedgroep en screening van de moeder herhaald en tevens werd er een antigeentypering ingezet van moeder, kind en vader (zie Tabel 1). De antigeentypering van kind is verricht op de erytrocyten verkregen na scheiding van het moederlijk bloed ten tijde van de intra-uteriene vruchtdood. Afgezien van bloedgroep AB0, bleek er slechts 1 verschil te zijn tussen moeder en kind en dit betrof het Kiddbloedgroepensysteem. Kind was Jk b -positief en moeder was Jk b -negatief. Er werd tevens voor de eerste keer een positieve antistofscreening gevonden bij de moeder die werd veroorzaakt door anti-jk b - antistoffen en de gemengde erytrocytenpopulatie was niet meer zichtbaar. Het is echter wel opmerkelijk dat in deze casus de foetale erytrocyten het Le(b)-antigeen bezitten. Normaal gesproken zijn direct na de geboorte de Lewis-antigenen nog niet aantoonbaar op de erytrocyten. Eerst verschijnt het Le a -antigeen en de personen die het Se-allel bezitten ontwikkelen vervolgens het Le b -antigeen. Pas op ongeveer zevenjarige leeftijd is het mogelijk het definitieve Lewis-fenotype vast te stellen. Doordat in deze casus geen bloedmonsters van het overleden kind meer beschikbaar waren, maar wel antigeentypering kon worden uitgevoerd door middel van het isoleren van foetale erytrocyten uit het maternale bloed, is het mogelijk dat de hechting van het Le b -antigeen op de erytrocytenmembraan van de foetale erytrocyten al eerder heeft plaatsgevonden. De foetale erytrocyten hebben zich waarschijnlijk voor een langere tijd in de maternale circulatie bevonden waardoor deze hechting van het maternale Le b -antigeen op de foetale erytrocyten mogelijk was. Deze resultaten ondersteunen het vermoeden dat er sprake is geweest van een langere periode van bloedingen en dat komt ook overeen met het hoge promillage HbF-bevattende erytrocyten. 124

Aanwijzingen voor de praktijk 1. Een gemengde erytrocytenpopulatie kan worden veroorzaakt door een massale foetomaternale bloeding in het derde trimester van de zwangerschap. 2. Antistofvorming bij de moeder kan optreden ten gevolge van een foetomaternale bloeding. Dit kan consequenties hebben voor een zwangerschap aangezien de hemolytische ziekte van de pasgeborene kan optreden indien maternale antistoffen foetale erytrocyten afbreken. 3. De kleihauer-betketest is moeilijk te standaardiseren en vals-positieve uitslagen kunnen gevonden worden indien er sprake is van een intrinsiek hoog HbF bij moeder. 4. Goed overleg tussen het transfusielaboratorium, de obstetrie en de kindergeneeskunde is absoluut noodzakelijk indien er een mogelijk risico bestaat op de hemolytische ziekte van de pasgeborene. Tweede zwangerschap Vier maanden na de intra-uteriene vruchtdood was er sprake van een tweede zwangerschap. Aangezien mevrouw anti-jk b -antistoffen had gevormd door de foetomaternale bloeding kon dit consequenties hebben voor de tweede zwangerschap. Hemolytische ziekte van de pasgeborene (HZP) kan optreden indien maternale antistoffen foetale erytrocyten afbreken. De ernst van HZP is onder andere afhankelijk van de immunoglobuline klasse, of het antigeen al volledig tot expressie komt op foetale erytrocyten en de hemolytische activiteit van de antistof. 5 Het Jk b -antigeen is reeds aantoonbaar op foetale erytrocyten en de vader was heterozygoot voor het Jk b -antigeen. In zeldzame gevallen kan anti-jk b HZP veroorzaken. Anti-Jk b - antistoffen kunnen ernstige transfusiereacties veroorzaken doordat het een complementbindende antistof is. Bij pasgeborenen is het complement echter nog niet volledig ontwikkeld en zal de hemolyse in het algemeen mild verlopen. Er zijn echter ook casussen beschreven waarbij er wel sprake is van een ernstige hemolyse bij de pasgeborene. 6 Op basis van deze gegevens werd periodiek een antibody-dependent cellular cytotoxicity test (ADCC) aangevraagd door de gynaecoloog. Met behulp van deze ADCC wordt de afbraak van erytrocyten die beladen zijn met antistoffen nagebootst. Indien er een ADCC wordt gevonden van <10% is de kans op HZP gering. De ADCC bleef <10% gedurende de gehele zwangerschap en de titer van de anti-jk b - antistof was zeer laag. De tweede zwangerschap en de bevalling verliepen zonder complicaties. Goed overleg tussen het transfusielaboratorium, de obstetrie en de kindergeneeskunde resulteerde in het adequaat vervolgen van de à terme neonaat in verband met mogelijke kans op hemolyse. De directe antiglobulinetest en het Jk b - antigeen van de pasgeborene waren negatief. De hemoglobine- en bilirubine-uitslagen van de pasgeborene werden vervolgd en waren niet afwijkend. Vijf maanden na de bevalling werd de kleihauer-betketest herhaald en tevens werd het HbFpercentage bepaald met behulp van hoge druk vloeistofchromatografie en massaspectrometrie. De kleihauer-betketest was negatief en het HbFpercentage gemeten met hoge prestatie vloeistof chromatografie en massaspectrometrie was niet afwijkend. Er was dus geen sprake van een intrinsiek verhoogd HbF bij de moeder. Conclusie Samenvattend kan men concluderen dat de gemengde erytrocytenpopulatie werd veroorzaakt door de massale foetomaternale bloeding die leidde tot intra-uteriene vruchtdood. Moeder had tijdens de zwangerschap door de herhaalde foetomaternale bloedingen als het ware een behoorlijk grote transfusie ontvangen met Jk b -positieve erytrocyten en hier was ook een antistof tegen gevormd. Deze antistofvorming kan consequenties hebben voor een eventuele volgende zwangerschap. Men dient hier rekening mee te houden in verband met een mogelijk risico op HZP. Referenties 1. Russcher H, Ligthart PC, Van Hulst-Sundermeijer AM, De Haas M, De Rijke T. Alleen of toch met twee? Chimerismen in het bloedtransfusielaboratorium. Tijdschr voor Bloedtransfusie 2009;2:22-6. 2. Dziegiel MH, Koldkjaer O, Berkowicz A. Massive antenatal fetomaternal hemorrhage: evidence for long-term survival of fetal red blood cells. Transfusion 2005;45:539-44. 125

3. Savithrisowmya S, Singh M, Kriplani A, Agarwal N, Mehra NK, Bhatla N. Assessment of fetomaternal hemorrhage by flow cytometry and Kleihauer-Betke test in Rh-negative pregnancies. Gynecol Obstet Invest 2008;65:84-8. 4. Iyer R, McElhinney B, Heasley N, Williams M, Morris K. False positive Kleihauer tests and unnecessary administration of anti-d immunoglobulin. Clin Lab Haematol 2003;25:405-8. 5. Hadley AG. Laboratory assays for predicting the severity of haemolytic disease of the fetus and newborn. Transpl Immunol 2002;10:191-8. 6. Kim WD, Lee YH. A fatal case of severe hemolytic disease of newborn associated with anti-jk(b). J Korean Med Sci 2006;21:151-4. Ontvangen 8 mei 2010, geaccepteerd 2 september 2010. C o r r e s p o n d e n t i e a d r e s Mw. dr. J.A.P. Bons, klinisch chemicus in opleiding Mw. S.J.M. Rouwette, specieel analist bloedtransfusie Dhr. R.J.M.H.E Straat, specieel analist bloedtransfusie Mw. dr. Y.C.M. Henskens, klinisch chemicus Maastricht Universitair Medisch Centrum Laboratorium Hematologie P. Debyelaan 25 6229 HX Maastricht Tel.: 043 387 47 12 E-mailadres: judith.bons@mumc.nl Dhr. dr. J.P.M. Offermans, gynaecoloog Afdeling Gyneacologie Correspondentie graag richten aan de eerste auteur. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. 126