H.-Hartziekenhuis Roeselare - Menen vzw Wilgenstraat 2-8800 Roeselare Stamtyperingen Dr. Thierry De Baere
Bacteriële stam-typering : wat? = opsporen van verschillen op stam-niveau tussen verschillende isolaten van éénzelfde species. Waarom: 1. uitbraak-controle 2. surveillance / epidemiologische studies (referentiecentra)
Bacteriële stam-typering : waarom? Voor de inventarisatie van de verspreiding van infectieuze agentia is typering van deze microorganismen van essentieel belang. Bedoeling is om te karakteriseren op subspecies en isolaatniveau om epidemiologische (of uitbraak) isolaten te onderscheiden van niet met elkaar verband houdende isolaten. Ziekenhuishygiëne.
Bacteriële stam : wat? Stam is - Een subset van een bacteriëel species, die verschillen van andere bacteriën binnen hetzelfde species in kleine maar identificeerbare verschillen. - een populatie van organismen die afstammen van één enkel isolaat of reincultuur. - Verschillen tussen stammen onstaan door mutaties. Mutaties kunnen spontaan gebeuren, onder druk van de omgeving (chemicaliën, antibiotica), contact met andere organismen of door humane toevoeging (genetische manipulatie)
Bacteriële stam typering: waarom? Eénzelfde bacteriëel species meerdere malen geïsoleerd K601, K602 en K603 K202 en K209 Hospital K105
Bacteriële stam typering: waarom? Eénzelfde bacteriëel species meerdere malen geïsoleerd Toevallige naast elkaar staande infecties K601, K602 en K603 Overdracht van patiënt naar patiënt K202 en K209 Allen gelinkt aan éénzelfde kamer, apparaat, dokter, verpleegster??? Hospital K105
Bacteriële stam typering: waarom? Is er een link? Hoe is de overdracht van de ene patiënt naar de andere gebeurd? Wie moet er bijkomend gescreend worden? Hoe kan dit voorkomen worden?
Bacteriële stam typering: waarom? Is er een link? Hoe is de overdracht van de ene patiënt naar de andere gebeurd? Wie moet er bijkomend gescreend worden? Hoe kan dit voorkomen worden?
Bacteriële stam typering: hoe? Twee technologieën : Fenotypische technieken Genomische technieken
Bacteriële stam typering: hoe? Fenotypische (morfologische) methodes Antibiotica resistentie patronen
Bacteriële stam typering: hoe? Fenotypische (morfologische) methodes Antibiotica resistentie patronen Principe: door een panel van antibiotica te gebruiken krijgt men mogelijke combinaties van resistenties. Wanneer stammen eenzelfde antibioticaresistentiepatroon hebben zijn ze mogelijks verwant.
Bacteriële stam typering: hoe? Titel - niveau 1 Niveau 2 Niveau 3 Niveau 4 Niveau 5 Echter : Horizontale transfer van resistentie genen.
Bacteriële stam typering: hoe? Fenotypische (morfologische) methoden Serotypering
Fenotypische (morfologische) technieken Serotypering Principe: Het bepalen van een bacterietype door de bacterie te laten reageren met bekende antistoffen. Wanneer er antigenen aanwezig zijn op het oppervlak van de bacterie ontstaat er reactie met agglutinatie tot gevolg. Opdeling slechts in serotypes en niet tot op stamniveau.
Bacteriële stam typering: hoe? Fenotypische (morfologische) methoden Serotypering Salmonella Salmonella enterica serotypes Kauffman-White shema E. coli E. coli O157H7
Bacteriële stam typering: hoe? Salmonella Salmonella enterica serotypes Kauffman-White shema
Fenotypische (morfologische) technieken Deel 1: antibiotica gevoeligheid en serologie Bruikbaar om mogelijke uitbraken te detecteren.
Fenotypische (morfologische) technieken Faagtypering
Fenotypische (morfologische) technieken Faagtypering Principe: (bacterio)fagen zijn virussen die bacteriën kunnen infecteren. Na replicatie barst de cel. Fagen zijn echter niet specifiek voor een bepaald species, maar strikter tot op stam-niveau of groep van verwanten (maar toch verschillend) stammen
Bacteriofaag lysis
Fenotypische (morfologische) technieken Faagtypering Door gebruik te maken van een panel van selectieve fagen kunnen stammen met elkaar vergelijken worden inzake faaggevoeligheid van de stam. Faag-typering is gevoelig tot op quasi -niveau, Echter steunend op verouderde technologie.
Typering op basis van celwand-eiwitsamenstelling SDS-PAGE protein scheiding van totaal eiwit bacterie. Principe: via een scheiding worden de zware celwand eiwitten gescheiden op een gel, na kleuring bekomt men een bandenpatroon wat vergeleken kan worden.
Interpretatie moeilijk
Fenotypische (morfologische) technieken Multilocus enzym electroforese Principe: door mutaties wijzigen intracellulaire enzymes van samenstelling in hun aminozuren. Door de relatieve mobiliteit van een groot aantal intracellulaire enzymes te bestuderen kunnen verschillen tussen isolaten opgemerkt worden.
Omslachtig Discriminatief??
Fenotypische technieken deel 2 Discriminatief tot op zeker niveau Problemen : niet bruikbaar voor routine Technische eisen (eiwitlabo faciliteiten) Echter misschien in de toekomst: MALDI-TOF
Genotypische methoden (genotypering) Gaan de verschillen in het genoom opsporen Sporen de mutaties zelf op Meer discriminatief DNA-technologie meer toegankelijk voor klinische moleculaire laboratoria.
Genotypische methoden (genotypering) Sterk geëvolueerd door de jaren heen DNA-technologie meer toegankelijk binnen een klinisch moleculair labo Automatisatie
Genotypische methoden (genotypering) Plasmide electroforese Principe: stammen bevatten verschillende plasmides die ze opnemen of verliezen door evolutie. Door de plasmides tussen verschillende isolaten te evalueren kan men stammen typeren.
Chromosoom Plasmides
Genotypische methoden (genotypering) Plasmide electroforese Later: ging men selectief plasmides extaheren (zonder genomische DNA) en dit knippen met een restrictie enzyme, en evalueren via gelelectroforese. Echter kunnen plasmides overgaan van de ene bacterie naar de andere (horizontale transfer) en dit is niet meer evolutief. Momenteel wordt deze techniek gebruikt om onderzoek te doen naar antibiotica resistentie gen dragende plasmides.
Genotypische methoden (genotypering) Enige mogelijkheid: analyse van het volledige genoom van een isolaat. Echter: Grootte: 1 e bacteriëel genoom gesequenced E. coli K-12 : 4.6 10 6 baseparen. Waar zitten belangrijkste mutaties (evolutief) Hoe controleren? Bruikbaarheid in routine?
Genotypische methoden (genotypering) Restrictie analyse van het totale genoom. REA Principe : DNA-extractie van de bacterie, digestie van DNA door een restrictie-enzyme gevolgd door gel-electroforese.
Restrictie enzyme: wat? Enzyme dat DNA herkent en knipt Herkenningsplaats is meestel een palindroom sequentie van 4,6,8 nucleotiden lang Bacteriëel mechanisme om vreemd DNA te knippen.
Genotypische methoden (genotypering) REA Hééééél veel banden Niet duidelijke scheiding Hoe interpreteren?
Genotypische methoden (genotypering) Pulsed Field Gel Electroforese Principe: het geïsoleerde DNA wordt geknipt met een infrequente knipper (8 nucleotiden). Bekomen DNA fragmenten zijn verscheiden van grootte, dus een aangepaste electroforese waarbij zowel bij de grote als de kleine fragmenten een goede scheiding mogelijk is.
celmembraan Voorzichtige lysis in agar plugs: vrijzetten genomisch DNA Restrictie ( infrequent cutter ) PFGE - + Stam 1 Stam 2
Door combinatie van verschillende enzymes (meestal 2) krijgt men een hogere discriminatie.
Genotypische methoden (genotypering) Pulsed Field Gel Electroforese Conclusie: heel discriminatief Echter specifieke apparatuur en technologie Werk, tijd.. Door invloeden van PulseNet USA en PulseNet Europe uniformisatie van het protocol, vooral voor voedselpathogenen (Listeria, Salmonella, E. coli..) echter een taak voor referentielaboratoria.
Genotypische methoden (genotypering) Ribotyping Principe: isolatie van genomisch DNA van de bacterie. Verknippen (REA). Blotten van de gel en hybridisatie met specifieke rrna probes. Door enkel de banden op te lichten waar rdna zit, wordt het overzichtelijk en toch bruikbaar.
Genotypische methoden (genotypering) Ribotyping Automatisatie: Riboprinter
Genotypische methoden (genotypering) Amplification based AFLP (amplified fragment length polymorphism) Principe: chromosomaal DNA wordt geknipt met restrictieenzymes (2), vervolgens worden adapters toegevoegd (die de uitstekende restrictieuiteindjes herkennen) en geligeerd, met daaropvolgend een amplificatie-reactie (al dan niet met selectieve primers)
Genotypische methoden (genotypering) Amplification based De PCR techniek laat toe een overzicht te bekomen van het volledige genoom maar toch maar met PCR-fragment lengtes die scheidbaar zijn op gel-electroforese of caplillaire electroforese (door fluorescente probes)
Genotypische methoden (genotypering) Amplification based AFLP
Genotypische methoden (genotypering) Tandem repeat amplification Principe: primers gericht aan de buitenzijde van een zone het genoom waar korte stukjes DNA enkele malen na elkaar voorkomen. Aantal maal het voorkomt is typisch voor de stam en evolueert verder. Vb. Spoligotyping (specifieke techniek voor Mycobacterium tuberculosis) Principe volgt nog in MLVA.
Genotypische methoden (genotypering) Arbitrary primer PCR (AP-PCR) ofwel randomly amplified polymorphic DNA-analysis (RAPD) Principe: één (of twee) primer(s) gaat bij lage annealingtemperatuur een beetje ad-random binden op het genoom, door de PCR hierbij worden fragmenten geamplificeerd van de ene bindsite naar de andere. Gel-electroforese levert een fingerprint op.
Genotypische methoden (genotypering) AP-PCR of RAPD Voordelen: snel, efficient voor uitbraak controle Nadelen: geen gel-gel vergelijking mogelijk, geen databank opbouw mogelijk.
Genotypische methoden (genotypering) Interrepeat spacer length polymorphism analysis. Primers richten op stukje DNA dat meerdere malen voorkomt in het genoom, maar naar buiten richten zodat gebied tussen die genen ligt geamplificeerd wordt. Resultaat: fingerprint die specifiek is voor de stam Vb. ERIC, BOX en REP-PCR.
Genotypische methoden (genotypering) Rep-PCR Voordelen: Stabiele fingerprints (reproduceerbaar) Commercieel beschikbaar Kit-systeem: stabiliteit (reagentia) Automatisatie analyse (Agilent) lab-on-chip Databank opbouw
DiversiLab systeem
Genotypische methoden (genotypering) Sequence based typing MLST: multi-locus sequence typing Principe: De genen van 7 huishoudgenen worden gesequenced. Door evolutie zijn er mutaties opgetreden in deze huishoudgenen die verder verticaal meegaan in de evolutie. Per sequentie wordt een allel-type aangeduid door vergelijking van de bekomen sequentie met een database (MLST.net Institut Pasteur). Combinaties van allel-types levert een ST (sequence type) op voor die bepaalde stam.
Verschillende regio s, verwerking via externe websites (MLST.net) Nadelen: veel sequenties, databases beperkt tot bepaalde species.
Genotypische methoden (genotypering) MLVA (multiple loci VNTR analysis) Principe: analyse van meerdere variable number tandem repeats. Regio s waar gekende tandem-repeats zitten worden geamplificeerd. De bekomen amplificatieproducten worden gescheiden via een capillaire electroforese. Combinatie van de verschillende tandemrepeats numbers levert een cijfer-combinatie op die stam-specifiek is.
Verschillende regio s Verwerking via externe websites MLVA.net Nadelen: Standardisatie moeilijk Databases slechts voor beperkt aantal species (voedingspathogenen)