Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation.

Maat: px

Weergave met pagina beginnen:

Download "Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation."

Christian van de Velden
4 jaren geleden
Aantal bezoeken:

Cover Page The handle http://hdl.handle.net/1887/37412 holds various files of this Leiden University dissertation.

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Holkers, Maarten Title: The roles of adenoviral vectors and donor DNA structures on genome editing Issue Date:

3 Addendum Nederlandse samenvatting List of publications Curriculum Vitae Dankwoord

4 184 Addendum

5 NEDERLANDSE SAMENVATTING Sommige genetische aandoeningen, zoals bijvoorbeeld de ziekte van Pompe, kunnen bestreden worden door het aanbieden van medicijnen die de taak van het defecte of ontbrekende eiwit overnemen. Deze methode is kostbaar en belastend voor de patiënt. Gentherapie is een andere methode om dit soort genetische aandoeningen te behandelen. Hierbij wordt een correctie kopie van het defecte gen in de cel gebracht of wordt het defecte gen zelf gerepareerd in de aangedane cellen. In de jaren 90 van de vorige eeuw hebben onderzoekers het principe van gen-complementatie succesvol toegepast bij patiënten die lijden aan een aandoening van het immuunsysteem. Een correcte kopie van het gen werd met behulp van een virale vector in bloedcellen gebracht waar het, na integratie, kon zorgen voor de aanmaak van functioneel eiwit. Het succes van deze klinische studies werd helaas overschaduwd door de ontwikkeling van leukemie in enkele van de patiënten. Na onderzoek bleek integratie van de virale vector op een verkeerde plaats de oorzaak van de ontsporing van de witte bloedcellen. Nieuwe ontwikkelingen op het gebied van vector-ontwerp en diepgaande moleculaire screening van de gemodificeerde cellen heeft ervoor gezorgd dat er hedendaags vectoren beschikbaar zijn met een verhoogde veiligheidsprofiel waardoor deze vorm van patiënt-specifieke medische zorg steeds vaker toegepast kan worden met acceptabele risico s voor de patiënt. Naast deze vorm van gentherapie, de gen-complementatie, is het mogelijk om de sequentie van genen zodanig aan te passen dat mutaties gerepareerd kunnen worden. Deze vorm van gen-reparatie is complex en afhankelijk van de activatie van cellulaire eiwitten betrokken bij de reparatie van DNA schade. Door deze activatie kan de machinerie exogene donor-dna fragmenten gebruiken om het genoom te repareren. De kans op spontane activatie van deze cascade op de exacte locatie van het gendefect is vrijwel nihil. Door onderzoek in gistcellen is duidelijk geworden dat deze activatie kan worden getriggerd door het aanbrengen van een enkel- of dubbelstrengs breuk in het DNA. Middelen om deze breuk te genereren zijn tegenwoordig voorhanden in de vorm van artificiële nucleasen waarbij DNA digestie domeinen van restrictie enzymen naar de locatie van keuze worden gebracht door zink-vingers (ZFNs) of zogenoemde transcription activator-like effector nucleases, TALENs. De nieuwste toevoeging aan dit pallet is het CRISPR/Cas systeem, wat staat voor clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated proteins (Cas). Deze nucleasen worden doormiddel van korte stukken RNA, guide RNA genoemd, naar de exacte locatie gebracht. In hoofdstuk 2 van deze thesis vroegen we ons af of deze breuken ook gegenereerd konden worden doormiddel van DNA sequenties zelf in plaats van het aanmaken van niet-humane eiwitten. Op basis van pas gepubliceerde resultaten waarbij onderzoekers lieten zien dat een eiwit genaamd GEN1 specifieke secundaire DNA structuren kon herkennen en ontvouwen, construeerden we twee plasmiden, een S Nederlandse samenvatting 185

6 acceptor en een donor. De acceptor plasmide bevat een relatief korte haarspeldstructuur in een hrgfp expressie cassette. Pas na recombinatie met een andere plasmide die de homologe sequenties bevatte zonder deze haarspeldstructuur, is het hrgfp gen functioneel en kleuren getransduceerde cellen fluorescent groen. In hoofdstuk 2 toont aan dat deze haarspeldstructuren homologe recombinatie activeren tussen deze twee plasmiden en dat dezelfde sequentie, gekloneerd in een directe oriëntatie of een haarspeldstructuur met een DNA fragment ertussen, deze recombinatie niet activeerden. Uitgebreide moleculaire karakterisering van de gerecombineerde plasmiden alsmede de bepaling van het mechanisme toonden aan dat deze recombinatie sequentie-onafhankelijk was, en onafhankelijk van replicatie van de plasmiden, maar afhankelijk van de haarspeldstructuur. Hoewel deze resultaten aangaven dat haarspeldstructuren in het DNA gebruikt kunnen worden om exogene DNA fragmenten in te brengen bleek na literatuurstudie dat deze structuren zeldzaam zijn. Vrijwel alle recombinogene sequenties zijn, tijdens de evolutie, uit het genoom verdwenen. In hoofdstuk 3 geeft weer dat de keuze voor een type virale vector een grote invloed kan hebben op de stabiliteit van TALEN gen sequenties na transductie in doelcellen. In deze studie zijn twee expressie cassettes voor AAVS1-specifieke TALENs in HIV-1 gebaseerde lentivirale vectoren (LV) geplaatst en in vectoren gebaseerd op adenovirussen (AdV). Waar de eerstgenoemde een grote diversiteit in ingekorte genomen laat zien, geven AdV getransduceerde cellen een hoge mate van TALEN activiteit weer. De hypothese was dat het kopiëren van het lentivirale RNA genoom in DNA, doormiddel van het eigen relatief slordige reverse transcriptase, deleties van specifieke stukken van het repetitieve deel van de TALEN met zich meebracht. Het sequensen van integreerde virale genomen toonde grote deleties, verschillend per kloon. Deze deleties waren heel specifiek en omvatten veelal een meervoud van 102 baseparen, waarbij elke 102 nucleotiden voor 1 variabel TALE domain codeerde. AdV getransduceerde cellen gaven dit patroon niet, integendeel, het genoom van de AdV was volledig intact en ook de eiwitten zelf waren functioneel in zowel getransformeerde als primaire cellen. Hoofdstuk 4 beschrijft een uitvoerig protocol voor het kloneren van deze TALENs in AdV, en laat zien hoe de virale vectoren geproduceerd en gekarakteriseerd kunnen worden. In hoofdstuk 5 van deze thesis is dezelfde principe van het door AdV afleveren van nuclease componenten in doelcellen toegepast voor elementen van het CRISPR/Cas systeem. In afzonderlijke virale vectoren werden expressie cassettes voor Cas9 nuclease en de guide RNA geplaatst en gebruikt om doelcellen te transduceren. We hebben aangetoond dat de efficiëntie van CRISPR/Cas-gemedieerde digestie van de doelsequentie afhankelijk was van de dosis virale vector en dat per celtype de effectiviteit gelijk is aan of minder is dan TALENgemedieerde digestie van de doelsequentie. Dit staat in contrast met wat Ding en collega s publiceerden in Cell Stem Cell waarbij ze aantoonden dat doormiddel van transfectie in 186 Addendum

7 humane pluripotente stamcellen, het CRISPR/Cas altijd superieur was aan TALENs. Onze mening is dat de efficiëntie van artificiële nucleasen gemedieerde digestie van sequenties in doelcellen sterk afhankelijk is van de wijze waarop de genen coderend voor deze eiwitten in doelcellen gebracht wordt. In hoofdstuk 6 van deze thesis hebben we de meest gangbare methodes voor het aanleveren van donor-dna in doelcellen met elkaar vergeleken en daarbij gekeken naar de effectiviteit van gebruik, maar ook naar de moleculaire compositie van het eindresultaat. De totale populatie gemodificeerde cellen kan meerdere subpopulaties bevatten, elk met hun eigen sequentie, wat gevolgen kan hebben voor de uiteindelijke expressie van het gecorrigeerde gen. Als eerste werden de twee meest gebruikte virale vectoren getest, die van de integratie deficiëntie lentivirale vectoren (IDLV) en AdV. Hoewel de eerstgenoemde een veel hogere efficiëntie van transgen insertie liet zien (9,1% tegenover 1,24% in myoblasten) liet de moleculaire karakterisatie duidelijk zien dat slechts 42,3% van deze populatie een enkele, correct ingebrachte, kopie van een egfp expressie cassette bevatte. Dit in tegenstelling tot de cellen getransduceerd met AdV deeltjes waarbij alle klonen deze juiste insertie liet zien. Pas nadat er genomisch instabiele HeLa cellen in combinatie met het intrinsiek slordige CRISPR/Cas nuclease systeem werd gebruikt konden er cellen gevonden worden die niet een juiste insertie bevatten. Als laatste werden ook plasmiden, in diverse conformaties, getest. Deze bleken dezelfde gemengde populatie te bevatten waarbij de circulaire vormen minder van deze onzorgvuldige inserties lieten zien. Samengevat geven de hoofdstukken 3, 4, 5 en 6 van deze thesis weer hoe AdVs gebruikt kunnen worden om individuele componenten van gentherapie efficiënt in doelcellen te brengen. Daarbij geeft het een basis om, naast de intensieve zoektocht naar steeds specifiekere nuclease systemen met gereduceerde off-target effecten, donor-dna fragmenten te onderzoeken die bijdragen aan deze specificiteit. De resultaten uit hoofdstuk 2 kunnen daaraan bijdragen; specifieke DNA samenstellingen dragen bij aan de activatie van reparatie van deze structuren wat mogelijk een toegevoegde waarde heeft om, wellicht, de efficiëntie van gen reparatie in de toekomst te verhogen. S Nederlandse samenvatting 187

8 188 Addendum

Vergelijkbare documenten

Cover Page. The handle http://hdl.handle.net/1887/18632 holds various files of this Leiden University dissertation.

Cover Page. The handle http://hdl.handle.net/1887/18632 holds various files of this Leiden University dissertation. Cover Page The handle http://hdl.handle.net/1887/18632 holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Joosse, Simon Andreas Title: Prediction of "BRCAness" in breast cancer by array