Moleculaire diagnostiek van infectieziekten Arjan de Jong 8 december 2015
Moleculaire diagnostiek Diagnostiek op basis van moleculair biologische (DNA/RNA) technieken
Moleculaire diagnostiek van infecties Diagnostiek op basis van moleculair biologische (DNA/RNA) technieken Het aantonen van de aan- of afwezigheid van DNA of RNA van microorganismen RNA: veelal RNA-virussen, dus virussen met RNA als genoom DNA: alle andere micro-organismen, inclusief virussen met DNA als genoom RNA: wanneer we geïnteresseerd zijn in expressie
Moleculair biologische technieken PCR Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) voor RNA targets Conventionele PCR PCR waarbij de detectie van een PCR product post-pcr plaatsvindt PCR waarbij post-pcr handelingen noodzakelijk zijn Real-time PCR PCR waarbij de detectie van een PCR product tijdens de reactie plaatsvindt gesloten reacties, dus geen post-pcr handelingen
Moleculair biologische technieken LiPA Line Probe Assay, meestal gebruikt voor geno- of resistentiebepaling Sequening Bepalen van de sequentie van een specifiek stukje genoom Next generation sequencing (NGS) / Whole genome sequencing (WGS) Bepalen van de sequentie van (een groot deel van) een heel (micro)organisme
PCR polymerase kettingreactie Nabootsen van natuurlijke proces van DNA replicatie/vermenigvuldiging Basis: twee specifieke primers Passen op target DNA als sleutel in slot 40-50 cycli van: Uitsmelten DNA strengen Binden primers Verlengen van de primers Na 30 cycli 10 9 moleculen
Monster PCR uitslag Nucleïnezuur isolatie (voorbehandeling) PCR mixenberekening, PCR set up PCR reactie (post PCR handelingen) Analyse Invoer en confirmatie in GLIMS Autorisatie, beschikbaarheid in EPIC
Kwaliteitsinstrumenten bij MolDiag Fout negativiteit Door remmende stoffen in monster Door niet optimaal verlopen van het proces Controles: isolatiecontroles EAV/PhHV Fout positiviteit Door contaminatie Controles: negatieve isolatiecontrole negatieve PCR controle Ruimtescheiding: pre- en post-pcr handelingen in verschillende ruimtes met eenrichtingsverkeer
Verdere verbetering kwaliteit en/of snelheid Automatisering van home-brew diagnostiek Aurora FLOW Verminderen van: werklast manuele handelingen overschrijfmomenten en resultaatinvoer momenten Implementatie moleculaire sneltesten (GeneXpert) Influenza/RSV MRSA HCV HIV (cito) Clostridium difficile
(semi)kwantitatieve PCR Kwantitatief: PCR met ijklijn van bekende standaarden Semi-kwantitatief: PCR zonder ijklijn, mate van positiviteit geschat op basis van Ct/Cp/Cq waarde t.o.v. historie of vaste positieve controle Kwantitatief: CE/IVD: HIV, HCV, HBV Home-brew: CMV, EBV, BKV Semi-kwantitatief: HSV, PCP
Multiplexing en panels Multiplexing: meerder reacties (targets/pathogenen) in dezelfde reactie Door gebruik van verschillende labels (kleurstoffen)
Multiplexing en panels Multiplexing: meerder reacties (targets/pathogenen) in dezelfde reactie Door gebruik van verschillende labels (kleurstoffen) Panels: syndroom diagnostiek Meerdere (multiplex) reacties om de aanwezigheid van een aantal potentiële verwekkers tegelijk aan te tonen Respiratoire diagnostiek Virale, bacteriële en parasitaire faecesdiagnostiek Kosten: panels goedkoper dan losse, individuele targets Kosten voor verwerking, isolatie, PCR plaatje etc. al gemaakt Hands-on-time neemt minimaal toe bij meer targets op bestaand monster
Workflow Huidige workflow Beperkt pakket niet op FLOW: Start om 12:30 PCR O/N uitslag volgende ochtend bulk routine op FLOW Start om 9:00 FLOW run overdag uitslag 2 e helft middag Respiratoire diagnostiek + virale faecesdiagnostiek: Start om 9:00 handmatig overdag uitslag einde van de dag Bacteriële en parasitaire feacesdiagnostiek: Start om 12:00 FLOW run overdag uitslag einde van de dag
Workflow CITO diagnostiek CITO diagnostiek mogelijk, maar niet wenselijk Drukke bezetting van apparaten met huidige workflow Analisten ingepland binnen huidige workflow In behandeling nemen van CITO leidt altijd tot een verstoring van de rest van workflow Indien noodzakelijk altijd in overleg met arts-microbioloog
16S PCR Identificatie van stammen of detectie/identificatie in directe materialen 16S rrna is de bouwsteen van ribosomen, in alle bacteriën aanwezig Geconserveerde en variabele delen
16S PCR Identificatie van stammen of detectie/identificatie in directe materialen Geconserveerde en variabele delen PCR + sequentie analyse Database vergelijking Contaminatie gevoelig
Sequencing: Sanger sequencing old-school sequencing, fragmenten tot ± 800 basen Sequence by synthesis, inbouw van gelabelde nucleotiden = stop reactie
Sequencing: Sanger sequencing old-school sequencing, fragmenten tot ± 800 basen Sequence by synthesis, inbouw van gelabelde nucleotiden = stop reactie Lee SH, et.al., Am J Clin Pathol. 2010 Apr;133(4):569-76.
Next generation sequencing Nieuwe technische ontwikkelingen Sequencing zonder voorkennis van wat er aanwezig is Verschillende approach van verschillende fabrikanten Korte stukjes sequencen Langer stukjes stukjes sequencen Alignment aan referentiegenoom De novo assembly
Next generation sequencing Technische ontwikkelingen gaan door Kosten gaan omlaag Workflow nog niet geautomatiseerd Met name analyse tijd lang Interpretatie? Het kan al wel.