DE ONTWIKKELING VAN EEN HPLC-MS/MS MULTI-ANALYTMETHODE VOOR DE DETECTIE EN KWANTIFICATIE VAN DRUGS IN VOLBLOED

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2014-2015 DE ONTWIKKELING VAN EEN HPLC-MS/MS MULTI-ANALYTMETHODE VOOR DE DETECTIE EN KWANTIFICATIE VAN DRUGS IN VOLBLOED Saar FAVOREEL Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. Dr. C. Stove Commissarissen Dr. Katleen Van Uytfanghe Dr. Marthe De Boevre

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2014-2015 DE ONTWIKKELING VAN EEN HPLC-MS/MS MULTI-ANALYTMETHODE VOOR DE DETECTIE EN KWANTIFICATIE VAN DRUGS IN VOLBLOED Saar FAVOREEL Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. Dr. C. Stove Commissarissen Dr. Katleen Van Uytfanghe Dr. Marthe De Boevre

AUTEURSRECHT De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. 21 mei 2012 Promotor Auteur Prof. Dr. C. Stove Saar Favoreel

SAMENVATTING Het besturen van voertuigen onder invloed van drugs is een actueel probleem. Het doel van deze thesis is de ontwikkeling van een HPLC-MS/MS multi-analytmethode voor de detectie en kwantificatie van verscheidene klassen drugs in volbloed. Tijdens deze thesis moeten zowel cannabinoïden, opiaten, cocaïne en benzoylecgonine, amfetamine, methamfetamine, en amfetamine-analogen worden bepaald binnen eenzelfde run. Hierbij is het belangrijk dat de ontwikkelde methode voldoende gevoelig is. Waarden lager dan de cut-off waarden die opgenomen zijn in wet betreffende rijden o.i.v. drugs moeten kunnen gekwantificeerd worden. Tijdens de ontwikkeling van deze methode werden eerst de MS-parameters geoptimaliseerd door gebruik te maken van infusie en flow injection analysis. Vervolgens werd de chromatografie geoptimaliseerd door verschillende kolommen, mobiele fases te evalueren. Uiteindelijk werd geopteerd voor een Kinetex C18 kolom, een core-shell kolom en als mobiele fase A 0,01 % mierenzuur, 1 % acetonitrile in water, mobiele fase B 0,01 % mierenzuur in acetonitrile. Het gradiënt werd geoptimaliseerd zodat voldoende resolutie werd bekomen in een zo kort mogelijke run. Tijdens de run moet gebruik gemaakt worden van polarity switching omdat 11-OH-THC en THC-COOH negatieve ionisatie ondergaan, terwijl de andere componenten positieve ionisatie ondergaan. Er werd ook gezocht naar een eenvoudige staalvoorbereiding met een voldoende hoog extractierendement. Uiteindelijk zijn twee verschillende staalvoorbereidingen uitgevoerd. Namelijk proteïneprecipitatie en vloeistof-vloeistof extractie. Uiteindelijk werd een chromatografische methode ontwikkeld van 10,5 minuten waarin alle componenten gevisualiseerd konden worden en zo goed mogelijk gescheiden zijn. De twee uitgevoerde staalvoorbereidingsmethodes moeten in de toekomst nog verder geoptimaliseerd worden. Ook methodevalidatie zal nog moeten worden uitgevoerd.

DANKWOORD Het schrijven van een thesis is geen simpele opdracht; het zou onmogelijk zijn zonder hulp en steun van anderen. Als eerste wil ik mijn promotor Prof. Dr. C. Stove bedanken voor het interessante onderzoeksonderwerp en het ter beschikking stellen van het Laboratorium voor Toxicologie. Vervolgens wil ik mijn begeleidster Sara Capiau bedanken voor de goede begeleiding, grondige verbetering en interessante feedback. De doctoraatsstudenten wil ik bedanken voor de aangename werksfeer. Mijn medethesisstudent Sophie wil ik bedanken voor dit leuke semester. Ook wil ik vrienden en kotgenoten bedanken voor de steun tijdens deze stressvolle periode. Mijn vriend Siel wil ik bedanken voor het verdragen van mijn kuren. Als laatste en evenzeer de belangrijkste wil ik mijn ouders bedanken voor de steun tijdens deze thesis en om me de kans te geven deze studie aan te vatten. Dank je dat ik op kot mocht en hier een fantastische tijd heb. Ik weet dat jullie altijd in mij geloven en er altijd voor mij zullen zijn. Papa en Mama, bedankt voor alles.

1. INLEIDING... 1 1.1 SITUERING VAN HET ONDERZOEK... 1 1.2 DRUGSBEPALINGEN... 2 1.2.1 Screeningstesten... 2 1.2.1.1 Algemeen... 2 1.2.1.2 Speekseltest... 2 1.2.1.3 Andere screeningstechnieken... 3 1.2.2 Bevestigende testen... 4 1.2.2.1 Algemeen... 4 1.2.2.2 Speekselanalyse... 5 1.2.2.3 Bloedanalyse... 6 1.3 PSYCHOTROPE EN VERDOVENDE STOFFEN... 7 1.3.1 Cannabinoïden... 7 1.3.1.1 Algemeen... 7 1.3.1.2 Metabolisatie... 7 1.3.2 Opiaten... 8 1.3.2.1 Algemeen... 8 1.3.2.2 Morfine... 9 1.3.2.3 Codeïne... 9 1.3.2.4 Heroïne... 9 1.3.2.5 Metabolisatie... 9 1.3.3 Cocaïne... 11 1.3.3.1 Algemeen... 11 1.3.3.2 Metabolisatie... 11 1.3.4 Amfetamines... 12 1.3.4.1 Algemeen... 12

1.3.4.2 Metabolisatie... 13 1.3.5 Amfetamine-analogen... 13 1.3.5.1 Algemeen... 13 1.3.5.2 Metabolisatie... 13 1.4 HOGE DRUK VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE TANDEM MASSASPECTROMETRIE... 14 1.4.1 Algemeen... 14 1.4.2 Hoge druk vloeistofchromatografie... 14 1.4.3 Massaspectrometrie... 15 2. OBJECTIEVEN... 17 3. MATERIALEN EN METHODEN... 19 3.1 REAGENTIA... 19 3.2. TOESTELLEN EN ANDERE MATERIALEN... 19 3.3 MEETINSTRUMENTEN... 20 3.4 AANMAKEN WERKOPLOSSINGEN... 20 3.5 METHODEONTWIKKELING... 21 3.5.1 Optimalisatie MS-parameters... 21 3.5.1.1 Startcondities gebaseerd op bestaande literatuur... 21 3.5.1.2 Bepaling MRM-transities en optimalisatie componentspecifieke MS-parameters... 21 3.5.1.3 Optimalisatie bronspecifieke MS-parameters... 22 3.5.2 Optimalisatie chromatografie... 23 3.5.2.1 Startcondities gebaseerd op literatuur... 23 3.5.2.2 Kolomkeuze... 23 3.5.2.3 Mobiele fase... 23 3.5.2.4 Gradiënt... 24 3.5.2.5 Dwell-tijden... 25 3.5.2.6 Needle wash... 25

3.5.3 Staalvoorbereiding... 25 3.5.3.1 Proteïneprecipitatie... 25 3.5.3.1.1 Proteïneprecipitatie met ACN... 25 3.5.3.1.2 Proteïneprecipitatie met MeOH... 26 3.5.3.1.3 Recovery proteïneprecipitatie... 26 3.5.3.1.4 Matrixeffect proteïneprecipitatie... 27 3.5.3.1.5 Selectiviteit... 27 3.5.3.2 Vloeistof-vloeistof extractie... 27 3.5.3.2.1 Enkelvoudige vloeistof-vloeistof extractie... 27 3.5.3.2.2 Dubbele vloeistof-vloeistof extractie... 28 3.5.3.2.3 Recovery en matrixeffect vloeistof-vloeistof extractie... 28 3.6 TOEPASSING VAN DE ONTWIKKELDE METHODE OP ROUTINESTALEN... 28 3.6.1 Case 1... 29 3.6.2 Case 2... 29 4 RESULTATEN... 30 4.1. METHODEONTWIKKELING... 30 4.1.1 Optimalisatie MS-parameters... 30 4.1.1.1 Bepaling MRM-transities en optimalisatie componentspecifieke MS-parameters... 30 4.1.1.2 Optimalisatie bronspecifieke MS-parameters... 32 4.1.2 Optimalisatie chromatografie... 32 4.1.2.1. Evaluatie methode gebaseerd op literatuur... 32 4.1.2.2 Kolomkeuze... 33 4.1.2.3 Mobiele fase... 33 4.1.2.3 Gradiënt... 34 4.1.2.4 Needle wash... 37 4.1.3 Staalvoorbereiding... 38

4.1.3.1 Proteïneprecipitatie... 38 4.1.3.1.1 Proteïneprecipitatie met ACN... 38 4.1.3.1.2 Proteïneprecipitatie met MeOH... 38 4.1.3.1.3 Recovery van de proteïnepreciptatie... 38 4.1.3.1.4 Matrixeffect proteïneprecipitatie... 39 4.1.3.1.5 Selectiviteit... 40 4.1.3.2 Vloeistof-vloeistof extractie... 40 4.1.3.2.1 Enkelvoudige vloeistof-vloeistof extractie vs. dubbele vloeistof-vloeistof extractie 40 4.1.3.2.2 Recovery vloeistof-vloeistof extractie... 41 4.1.3.2.3 Matrixeffect vloeistof-vloeistof extractie... 41 4.2 TOEPASSING VAN DE ONTWIKKELDE METHODE OP ROUTINESTALEN... 42 4.2.1 Case 1... 42 4.2.2 Case 2... 42 5. DISCUSSIE... 43 5.1 METHODEONTWIKKELING... 43 5.1.1 Optimalisatie MS-parameters... 43 5.1.1.1 Bepaling MRM en optimalisatie componentspecifieke MS-parameters 44 5.1.1.2 Optimalisatie bronspecifieke MS-parameters... 43 5.1.2 Optimalisatie chromatografie... 43 5.1.2.1. Evaluatie methode gebaseerd op literatuur... 43 5.1.2.2 Kolomkeuze... 44 5.1.2.3 Mobiele fase... 44 5.1.2.4 Gradiënt... 44 5.1.2.5 Needle wash... 45 5.1.3 Staalvoorbereiding... 45 5.1.3.1 Proteïneprecipitatie... 45

5.1.3.2 Vloeistof-vloeistof extractie... 46 5.1.3.3 Recovery en matrixeffect... 46 5.2 TOEPASSING VAN DE ONTWIKKELDE METHODE OP ROUTINESTALEN... 47 6. CONCLUSIE... 48 7. BIBLIOGRAFIE... 49

LIJST MET AFKORTINGEN 11-OH-THC 6-MAM ACN BE CB CE CXP CYP DBS DP ELISA EME EMIT EP FIA GC-MS HCOOH HPLC IS LFIA LLE LLOQ m/z MDA MDEA MDMA MeOH MS PP S/N SPE THC THC-COOH UP 11-hydroxy- 9-tetrahydrocannabinol 6-monoacetylmorfine Acetonitrile Benzoylecgonine Cannabinoïdreceptoren Collision Energy Cell exit potential Cytochroom P450 Dried blood spots of gedroogde bloedspots Declustering potential Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Ecgoninemethylester Enzyme Multiplied Immunoassay Technique Entrance potential Flow injection analysis Gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie Mierenzuur High Pressure Liquid Chromatography of Hoge druk vloeistofchromatografie Interne standaard Lateral Flow Immuno Assay Liquid-liquid extraction of vloeistof-vloeistof extractie Lower Limit Of Quantification Massa over lading verhouding 3,4-methyleendioxyamfetamine 3,4-methyleendioxyethylamfetamine 3,4-methyleendioxymethamfetamine Methanol Massaspectrometrie Proteïneprecipitatie Signaal over ruis verhouding Solid phase extraction of vaste fase extractie 9-tetrahydrocannabinol 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol Ultrapure

1. INLEIDING 1.1 SITUERING VAN HET ONDERZOEK In het verkeer is druggebruik de oorzaak van veel verkeersongevallen en fataliteiten. 1,2 Afhankelijk van het type drugs dat gebruikt wordt, zal een andere invloed op het rijgedrag worden waargenomen. 3 Zo zal het gebruik van cannabinoïden de motorische coördinatie van de bestuurder veranderen. 4 Personen onder invloed van amfetamine of zijn analogen zijn dan weer gevoeliger voor licht doordat de pupillen gedilateerd zijn o.i.v. het sympathicomimetische effect van deze drugs. 5 Stimulerende drugs zorgen er bovendien voor dat bestuurders meer risico s nemen. Daarnaast kan het gebruik van drugs hallucinaties, slaperigheid en psychosen uitlokken. 1,6 Om drugs op te sporen in het kader van het verkeer, is het veelal noodzakelijk dat er volbloedstalen worden afgenomen voor verdere analyse. Naar de toekomst toe zou het echter nuttig zijn dat in de plaats van deze klassieke bloedstalen, gedroogde bloedspots (DBS) zouden kunnen worden geanalyseerd. Hierbij wordt een druppel capillair bloed opgevangen op een filterpapiertje en twee uur gedroogd aan de lucht. Het grote voordeel van DBS is enerzijds de eenvoudige staalname, wat inhoudt dat deze in principe niet door een medisch getraind persoon dient te worden uitgevoerd. Anderzijds kan het bereiden van DBS (via een vingerprik of uit een klassiek veneus staal) beschouwd worden als een eenvoudige staalvoorbereidingstechniek, die bovendien slechts een zeer klein volume bloed vereist. De DBS-analyse zelf kan daarenboven ook volledig geautomatiseerd verlopen. 7 Om die redenen wil het Laboratorium voor Toxicologie een DBS-methode ontwikkelen voor de kwantificatie van verscheidene drugs. In eerste instantie moet hiervoor een volbloedanalyse worden ontwikkeld, zodat resultaten bekomen a.d.h.v. de DBS-analyse kunnen worden vergeleken met resultaten bekomen via de klassieke methode. Dit om te bevestigen dat de analyses op DBS dezelfde kwalitatieve en kwantitatieve resultaten opleveren als de analyses op volbloed. Deze thesis kadert dan ook in de ontwikkeling van een Hoge druk vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) multi-analytmethode om meerdere drugs zoals cannabinoïden, opiaten, cocaïne, amfetamine en amfetamineanalogen op te sporen in volbloed. 1

1.2 DRUGSBEPALINGEN 1.2.1 Screeningstesten 1.2.1.1 Algemeen Wanneer een staal moet gecontroleerd worden op de aanwezigheid van drugs, wordt er eerst een screeningstest uitgevoerd. Dergelijke test vereist immers geen of minimale staalvoorbereiding en kan snel een eerste indicatie geven van druggebruik. Screeningstesten zijn semi-kwantitatief en werken volgens immunologische principes. 9 Meer bepaald maken ze gebruik van antilichamen. Deze antilichamen kunnen bepaalde klassen drug(s) herkennen door te interageren met een epitoop op deze drug (het antigen). Een antigen kan meerdere epitopen hebben. 10 Een groot nadeel van screeningstesten is het voorkomen van vals positieven en vals negatieven. Vals negatieven treden op wanneer de test niet voldoende gevoelig is, vals positieven door kruisreactiviteit. Daarom is het noodzakelijk dat de resultaten van screeningstesten steeds bevestigd worden. 9 1.2.1.2 Speekseltest 5,8 Sinds oktober 2010 is de wet op het uitvoeren van speekseltesten in het verkeer van kracht. 11 Deze speekseltest vervangt het gebruik van urinestalen voor drugsscreening in het verkeer en heeft als voordeel dat deze moeilijker kan vervalst worden. Bovendien zijn speekseltesten eenvoudiger toepasbaar in de praktijk. 5,12 Een speekseltest wordt pas afgenomen nadat er via een gestandaardiseerde checklist wordt nagegaan of er tekenen van mogelijk druggebruik worden waargenomen bij de bestuurder. Hiervoor moet een bestuurder aan tenminste drie tekenen voldoen uit twee verschillende rubrieken van de checklist of betrokken zijn in een verkeersongeval. 11,13 De test die in België gebruikt wordt, is de drugwipe 5S + van het merk Securetec. Deze kan drugs uit verschillende klassen detecteren, namelijk cannabinoïden, opiaten, cocaïne en benzoylecgonine (een metaboliet van cocaïne), amfetamines, methamfetamines en 3,4-methyleendioxymethamfetamine (MDMA). 8,14 De drugwipe werkt volgens het principe van een Lateral Flow Immuno Assay (LFIA). 15 Bij LFIA (Fig. 1.1) bevinden zich in de staalapplicatiezone antilichamen gericht tegen de verscheidene klassen drugs die geconjugeerd zijn met colloïdale goudpartikels. De antilichamen kunnen een complex vormen met de drugs door te interageren ter hoogte van 2

het epitoop van elke drug. Na het openen van een reservoir aanwezig in de test, zal een bepaalde hoeveelheid buffer vrijkomen. Hierdoor migreert het staal o.i.v. capillaire krachten samen met de antilichamen door de teststrip. Wanneer er vervolgens een verkleuring optreedt bij een van de testlijnen betekent dit dat er drugs aanwezig zijn in het speeksel van de bestuurder. Op elke testlijn bevinden zich namelijk geïmmobiliseerde antilichamen tegen een bepaalde klasse van drugs. Onafhankelijk van het feit of er drugs aanwezig zijn in het staal of niet zal er een verkleuring van de controlelijn optreden. De controlelijn verkleurt door de kleurreactie van de colloïdale goudpartikels die geconjugeerd zijn aan de antilichamen tegen de drugs. Deze antilichamen worden weerhouden op de controlelijn, doordat zich op de controlelijn geïmmobiliseerde antilichamen bevinden tegen de antilichamen die geconjugeerd zijn met de colloïdale goudpartikels. Verkleuring van de controlelijn is een indicatie van een correct uitgevoerde test. 6,15,16 1.2.1.3 Andere screeningstechnieken Figuur 1.1: Schematische weergave LFIA 15 Wanneer een drugsscreening dient te gebeuren op urine, bloed of speekselstalen, zal veelal gebruik worden gemaakt van Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) of Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). EMIT is een homogene en competitieve screeningstechniek. 10,17,18 ELISA daarentegen is een heterogene screeningstest daar verscheidene wasstappen moeten worden uitgevoerd. Bij ELISA kan een onderscheid gemaakt worden tussen een competitieve ELISA en een sandwich ELISA. Bij een competitieve ELISA is het zo dat wanneer er drugs aanwezig zijn in het staal, er weinig kleurreactie zal optreden. Bij een sandwich ELISA zal er daarentegen een sterkere kleurreactie optreden wanneer de concentratie drugs aanwezig in het staal hoger is. 19,20 3

1.2.2 Bevestigende testen 1.2.2.1 Algemeen Volgens de Belgische wetgeving moet een positieve screeningstest altijd geconfirmeerd worden a.d.h.v. een tweede onafhankelijke analyse. 11 Dergelijke analyse moet in het kader van druggebruik in het verkeer uitgevoerd worden op een bloed- of speekselstaal d.m.v. gaschromatografie of vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie. 5,11 In België wordt in het kader van het verkeer gebruik gemaakt van bepaalde cut-off waarden (Tabel 1.1) om druggebruik vast te stellen. Bij een concentratie hoger dan deze cut-off waarde is de bestuurder onder invloed van de drug. 3,5 Wanneer de waarden van de kwantitatieve bepaling onder de vastgelegde cut-off waarden vallen, wordt de speeksel- of bloedanalyse dan ook als negatief beschouwd. 11 Hierdoor is het essentieel dat de Lower Limits of Quantification (LLOQ) van de nieuw ontwikkelde technieken lager zijn dan onderstaande cut-off waarden. Tabel 1.1: Cut-off waarden voor speeksel- en bloedanalyse in het kader van verkeer opgenomen in de Belgische wet. 22 Stof Cut-off waarden bloedanalyse (ng/ml) Cut-off waarden speekselanalyse (ng/ml) Delta-9-tetrahydrocannabinol 1 10 Amfetamine 25 25 MDMA 25 25 Morfine (vrij) 10 5 Cocaïne of benzoylecgonine 25 10 Bovendien moet volgens de wet voor deze bevestigende analyse gebruik worden gemaakt van gedeutereerde interne standaarden (IS). Bij gedeutereerde componenten worden waterstofatomen vervangen door deuterium ( 2 H). Deuterium is een stabiele isotoop van waterstof en bevat naast een proton ook een neutron in zijn kern. 11 Gedeutereerde IS hebben dezelfde chemische eigenschappen als de target component. Hierdoor zijn gedeutereerde standaarden betere IS dan structuuranalogen. 21 4

1.2.2.2 Speekselanalyse Wanneer de speekseltest een positief resultaat oplevert voor een bepaalde drug of meerdere drugs, moet volgens de wet een speekselanalyse voor bevestiging zorgen. 5 Na een positieve speekseltest moet bij de geteste persoon een nieuw speekselstaal worden afgenomen voor analyse. Deze speekselanalyse dient plaats te vinden in erkende laboratoria. 22 Het gebruik van speeksel heeft verschillende voordelen. 23,24 Een eerste groot voordeel is dat de afname van speeksel een niet-invasieve vorm van staalname is. Hierdoor kan de politie zelf gemakkelijk een speekselstaal afnemen in het kader van verkeer. Een ander theoretisch voordeel is dat de speekselconcentratie van drugs in relatie staat tot de vrije fractie drugs in het bloed, aangezien enkel de vrije fractie vanuit de bloedbaan naar het speeksel kan diffunderen. 25 De vrije fractie in het bloed is door interactie met de receptor verantwoordelijk voor het effect van de drugs. Echter in de praktijk is gebleken dat er een grote variabiliteit is in de verhouding van de concentratie van de drugs in speeksel tot de systemische concentratie. Hierdoor is het niet correct om een systemische concentratie te berekenen uitgaande van een speekselconcentratie. 26 Een belangrijk nadeel is echter dat de concentratie in het speekselstaal sterk afhankelijk is van de manier van afname (bijvoorbeeld opwekken van speeksel door een swab met citroenzuur versus het afnemen met een neutrale swab 24 ). De passieve niet ionische diffusie van bloed naar speeksel en omgekeerd is afhankelijk van fysische eigenschappen van de drugs zoals moleculair gewicht, vetoplosbaarheid en ionisatiegraad. Ook de ph van speeksel heeft een invloed op de speekselconcentratie van drugs. Wanneer het speeksel een lage ph heeft, zullen de basische drugs geïoniseerd zijn en dus aangeconcentreerd worden in het speeksel. Dit fenomeen heet ion-trapping 23 Speeksel kan bovendien passief gecontamineerd worden met drugs, bijvoorbeeld wanneer men zich in een ruimte bevindt waar cannabis gerookt wordt. 27 In speeksel zijn drugs minder lang detecteerbaar dan in urine. Zo kan speeksel een betere indicator zijn voor het onder invloed zijn. 5 5

1.2.2.3 Bloedanalyse Volgens de wet moet een bloedanalyse worden uitgevoerd wanneer er geen speekseltest of speekselanalyse kan worden uitgevoerd. De speekselanalyse is in België echter nog niet ingevoerd, bijgevolg worden in de praktijk momenteel nog steeds bloedanalyses uitgevoerd. Wanneer er wel speekselanalyses kunnen uitgevoerd worden, zijn bloedanalyses nog steeds noodzakelijk wanneer een persoon weigert een speekselstaal af te leveren of de speekselproductie te gering is. Het bloedstaal moet worden afgenomen door een opgevorderde geneesheer. 22 Als alternatief zou in de toekomst gebruik kunnen worden gemaakt van DBS in plaats van volbloedstalen voor de bloedanalyses. DBS worden al meer dan 100 jaar gebruikt. Een voorbeeld hiervan is de hielprik bij baby s die aangewend wordt om stofwisselingsziektes zoals fenylketonurie op te sporen. Het gebruik van DBS is gekoppeld aan een aantal voordelen. Een eerste voordeel van DBS is de minimaal invasieve afname. Een bloedspot kan heel gemakkelijk afgenomen worden door middel van een contact activated lancet en vergt geen medisch getraind personeel. Met behulp van de contact activated lancet wordt een prikje in de vingertop gemaakt waarna een druppel capillair bloed opgevangen kan worden op een filterpapiertje. Vervolgens wordt dit filterpapiertje gedroogd aan de lucht. Andere voordelen zijn de geringe hoeveelheid bloed die nodig is voor het bereiden van een DBS en het feit dat transport en bewaring van DBS bij omgevingsomstandigheden kan plaatsvinden. 28,29 Een belangrijk probleem bij DBS-analyse is echter het zogenaamde hematocriet-effect. De hematocrietwaarde is de volumefractie van het bloed die ingenomen wordt door de rode bloedcellen en is afhankelijk van het aantal rode bloedcellen en het volume ervan. Bij een hoge hematocrietwaarde is het bloed viskeuzer en bekomt men een kleinere, meer geconcentreerde bloedspot. Wanneer voor de DBS-analyse een deel van de bloedspot wordt uitgeponst, zal de bekomen punch bij mensen met een hoge hematocrietwaarde meer bloed bevatten en bijgevolg ook meer van de op te sporen stof. 29 Dit houdt in dat het kwantitatieve resultaat van een DBS-analyse beïnvloed wordt door het hematocriet van het bloed dat gebruikt werd om de DBS te bereiden. Daarnaast beïnvloedt het hematocriet ook de droogtijd van een bloedspot, de extractie-efficiëntie en mogelijk ook het matrixeffect. 30 6

E Het hematocriet van een DBS kan echter voorspeld worden a.d.h.v. het endogene kaliumgehalte in een DBS. Het effect van het hematocriet op een kwantitatief resultaat kan bovendien gecompenseerd worden door gebruik te maken van een op kalium gebaseerd correctie-algoritme. 29,31 1.3 PSYCHOTROPE EN VERDOVENDE STOFFEN 1.3.1 Cannabinoïden 1.3.1.1 Algemeen De cannabinoïden zijn afkomstig van het harsachtig secreet van de vrouwelijk bloeiwijzen van Cannabis sativa. Met cannabis wordt zowel hasj als marihuana bedoeld. Cannabis is de meest gebruikte illegale softdrug. Delta-9-tetrahydrocannabinol (THC) is de meest psychoactieve component in cannabis. De gebruiker ervaart een kalmerend en euforisch gevoel. Door verlies van het korte termijngeheugen kan de gebruiker de realiteit ontvluchten. Daarnaast kan cannabis therapeutisch worden gebruikt tegen chronische pijn of als anti-emeticum bij de behandeling met chemotherapie. 4,32 Delta-9-tetrahydrocannabinol werkt in op het centrale zenuwstelsel door stimulatie van de cannabinoïdreceptoren. Er zijn twee soorten cannabinoïdreceptoren, namelijk CB 1 en CB 2, die beide behoren tot de G-proteïne gekoppelde receptoren. Deze zijn negatief gekoppeld aan adenylaatcyclase. De CB 1 -receptor bevindt zich voornamelijk in de hersenen, terwijl de CB 2 -receptor zich voornamelijk in cellen van het immuunsysteem bevindt, zoals de T-cellen, B-cellen, macrofagen en hematopoëtische stamcellen. 4 Stimulatie van de CB 1 -receptoren zorgt voor een vermindering van pijn en inwerking op de CB 2 -receptor voor de regulatie van inflammatoire reacties. De endogene neurotransmitters die inwerken op deze receptoren zijn anandamide en 2-arachidonoylglycerol, die ook wel de endocannabinoïden worden genoemd. 4,32 1.3.1.2 Metabolisatie De metabolisatie van THC vindt voornamelijk plaats in de lever en longen onder invloed van cytochroom P450 enzymen (CYP). De twee hoofdmetabolieten van THC zijn 11-hydroxydelta-9-tetrahydrocannabinol (11-OH-THC) en 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol (THC- COOH) (Fig. 1.2). Deze komen, vanwege hun lipofiliciteit, voornamelijk voor in minder goed 7

gevasculariseerde weefsels zoals vetweefsel. De halfwaardetijd van THC is 4 uur. 33 THC- COOH heeft de langste halfwaardetijd en is dus belangrijk in bloed- en urineanalyses. 11-OH- THC werkt psychoactief, THC-COOH niet. THC-COOH kan nog verder geglucuronideerd worden tot THC-COOH-glucuronide. 34 1.3.2 Opiaten 1.3.2.1 Algemeen Figuur 1.2 Metabolisatie van THC 4 Opiaten zijn afkomstig uit het gedroogde melksap van de Papaver somniferum. Opiaten mimeren het effect van de endogene opioïden en hebben een typische heterocyclische ringstructuur. Deze drugs worden voornamelijk intraveneus misbruikt. Door het parasympathicomimetische effect zijn de pupillen vernauwd. Dit vormt een probleem voor het besturen van voertuigen in de duisternis. In de geneeskunde worden opiaten voornamelijk aangewend voor hun analgetisch effect. Opiaten hebben veel nevenwerkingen zoals afhankelijkheid, verslaving, dervingverschijnselen, braken en constipatie. 35 Opiaten werken in op de opioïdreceptoren, die G-proteïne gekoppeld zijn. Het analgetisch effect wordt voornamelijk veroorzaakt door inwerking op de µ-receptor. 36 De endogene opioïde peptiden zoals enkefalines, endorfines en dynorfines zijn kleine peptiden die fungeren als neuromodulatoren en als hormonen. Neuromodulatoren beïnvloeden de activiteit van andere neurotransmitters. Hormonen voeren een effect uit op receptoren in verder afgelegen weefsels. Opioïde peptiden zorgen voor analgesie. Door acupunctuur bijvoorbeeld kunnen endogene opioïden worden vrijgesteld en bekomt men een analgetisch effect. Andere effecten van de endogene opioïden zijn het vertragen van de darmmotiliteit, het verminderen van de respiratie en het ontstaan van een euforisch gevoel. 37 8

1.3.2.2 Morfine Morfine wordt voornamelijk gebruikt als analgeticum bij chronische pijn, geformuleerd in pleisters met vertraagde vrijstelling of via infusen. Daarnaast wordt morfine ook gebruikt bij acute pijn via orale inname of injectie. Het pijnstillend effect van morfine ontstaat door stimulatie van de µ-receptor. Een groot nadeel van morfine is afhankelijkheid en gewenning, i.e. de nood aan een steeds hogere dosis voor eenzelfde effect. Overdosering leidt tot coma wegens respiratoire depressie. Morfine wordt misbruikt als drug omwille van het euforiserend effect en het optreden van hallucinaties. 35 1.3.2.3 Codeïne Codeïne of 3-methylmorfine wordt voornamelijk gebruikt als antitussivum in hoestsiropen. Door de aanwezigheid van een methylgroep is het een minder potente agonist voor de opioïdreceptor dan morfine. Codeïne wordt ook gebruikt in combinatiepreparaten met paracetamol als pijnstiller omdat een kleine hoeveelheid codeïne in de lever wordt omgezet tot morfine. 35,38 1.3.2.4 Heroïne Heroïne of diacetylmorfine wordt synthetisch aangemaakt door acetylering van morfine. Heroïne wordt misbruikt vanwege het euforiserend effect, veroorzaakt door de dopaminerge werking van de drug. 39 Het hydrochloride zout van heroïne wordt ingespoten of gesnoven. De base wordt voornamelijk gerookt of geïnhaleerd. Door de esterstructuur is heroïne lipofieler dan morfine en kan het sneller doorheen de bloedhersenbarière diffunderen. Heroïne werkt in op de opioïdreceptor na metabolisatie tot morfine. 4,5,40 1.3.2.5 Metabolisatie Morfine wordt geconjugeerd met glucuronzuur tot hydrofiele verbindingen. Zestig procent wordt omgezet tot morfine-3-glucuronide. Vijf tot tien procent wordt omgezet tot morfine- 6-glucuronide. Wanneer beide glucuronidaties plaatsvinden ontstaat mofine-3,6- diglucuronide (Fig. 1.3). Morfine-6-glucuronide heeft een hogere affiniteit voor de opioïdreceptor en is hierdoor meer analgetisch dan morfine-3-glucoronide en morfine. 38 9

Ook codeïne wordt voornamelijk geconjugeerd met glucuronzuur tot codeïne-6-glucuronide. Deze omzetting gebeurt onder invloed van het uridinedifosfaat-glucuronosyltransferase-2b7. Codeïne kan door het CYP2D6 en in mindere mate door het CYP2D7 ge-o-demethyleerd worden tot morfine (Fig. 1.3) dat 200 keer meer affiniteit heeft voor de opioïdreceptor. Genetische polymorfismen in het CYP2D6 zorgen ervoor dat er zowel poor metabolizers als rapid metabolizers bestaan. Poor metabolizers zullen een minder goed pijnstillend effect ondervinden van codeïne dan rapid metabolizers. De omzetting van codeïne tot morfine varieert van 0 tot 15 procent. Daarnaast wordt 10 tot 15 procent van codeïne gedemethyleerd tot norcodeïne door het CYP3A4. 38 Heroïne heeft een lage affiniteit voor de opioïdreceptor dan morfine maar wordt door carboxylesterasen in de lever en de hersenen en door esterasen in het bloed snel gemetaboliseerd tot 6-monoacetylmorfine (6-MAM) en vervolgens verder gehydrolyseerd tot morfine (Fig. 1.3). 6-MAM is, in tegenstelling tot morfine, een specifieke merker voor heroïnegebruik. De aanwezigheid van morfine in een bloedstaal kan immers te wijten zijn aan het gebruik van heroïne, codeïne of morfine. 41 Figuur 1.3: Metabolisatie van opiaten 41 10

1.3.3 Cocaïne 1.3.3.1 Algemeen Cocaïne behoort tot de psychoanaleptica en is afkomstig uit de cocabladeren van de plant Erythroxylon Coca. 5 Andere namen voor deze drug zijn coke of snow. Cocaïne wordt voornamelijk gesnoven of ingespoten. De cocaïnebase kan worden gerookt. Cocaïne werkt als indirect sympathicomimeticum doordat cocaïne de heropname van dopamine, serotonine, epinefrine en norepinefrine remt. Cocaïne werd vroeger gebruikt als lokaal anestheticum daar het de natriumkanalen blokkeert, waardoor er geen prikkeloverdracht kan plaatsvinden tussen de verschillende neuronen. 42 Door de verhoogde dopamineconcentratie werkt cocaïne euforiserend en leidt het tot een gevoel van onvermoeibaarheid. Er kan gewenning optreden aan de verhoogde dopamineniveaus. 43 1.3.3.2 Metabolisatie Cocaïne wordt snel gemetaboliseerd (Fig. 1.4). De grootste fractie van cocaïne wordt door butyrylcholinesterase gemetaboliseerd tot het inactieve ecgoninemethylester (EME). Dertig tot veertig procent wordt door weefselesterasen en spontane omzetting omgevormd tot benzoylecgonine (BE), ook een inactieve metaboliet. Een minimaal deel van cocaïne wordt via CYP3A4 omgezet tot het actieve norcocaïne. Voornamelijk BE wordt gebruikt om cocaïnemisbruik aan te tonen, omwille van de lange halfwaardetijd van deze component. Benzoylecgonine kan namelijk tot vijf dagen na inname gedetecteerd worden in urine. 44 Wanneer er ook ethanol aanwezig is in het bloed, ondergaat cocaïne een transesterificatie tot cocaethyleen, het ethylester van cocaïne. Cocaethyleen is een farmacologisch actieve metaboliet, waardoor het effect van cocaïne verlengd wordt na alcoholinname. 45,46 11

Figuur 1.4: Metabolisatie van cocaïne en zijn metabolieten 47 1.3.4 Amfetamines 1.3.4.1 Algemeen Amfetamines of speed zijn stimulantia en hebben een sympathicomimetische werking. Ze zijn afgeleid van fenylethylamine. Stimulantia worden misbruikt om vermoeidheid tegen te gaan en waarbij een verhoging plaatsvindt van de vrijstelling van catecholamines zoals adrenaline en dopamine. Methamfetamine (crystal meth) is het N-gemethyleerde analoog van amfetamine. Amfetamines zorgen voor een verhoging van de bloeddruk en een versnelde hartslag. Fenylethylamines worden gebruikt voor de behandeling van ADHD en rookstop. Vroeger hadden fenylethylamines ook een toepassing als vermageringsmiddel. Dextro-amfetamine is 3 tot 4 keer meer potent dan levo-amfetamine. 42,48,49 Figuur 1.5: Chemische structuren van amfetamine (links) en methamfetamine (rechts) 50 12

1.3.4.2 Metabolisatie Amfetamine wordt gedeamineerd tot fenyllacton en verder geoxideerd en gehydrolyseerd tot verschillende afbraakproducten zoals noradrenaline en hydroxyamfetamine. Methamfetamine wordt door N-demethylatie door CYP450 enzymen gemetaboliseerd tot amfetamine. 50 1.3.5 Amfetamine-analogen 1.3.5.1 Algemeen MDMA en 3,4-methyleendioxyethylamfetamine (MDEA) zijn methamfetamine-analogen met een methyleendioxygroep op positie drie en vier van de fenylring. Daarnaast is ook 3,4- methyleendioxyamfetamine (MDA) een analoog van amfetamine. (Fig. 1.6) Een andere benaming voor MDMA en MDEA zijn respectievelijk Adam en Eve. Deze amfetamineanalogen werden oorspronkelijk ontwikkeld om de wetgeving te omzeilen. 51 Drugs afgeleid van amfetamine stimuleren de vrijstelling en inhiberen de heropname van serotonine, noradrenaline en dopamine. Inname zorgt voor een euforisch gevoel en vermindert de vermoeidheid. Hierdoor zijn de amfetamine-analogen zeer populair in het uitgaansleven. Gebruikers van deze drug beleven hallucinaties, depressies en verwardheid en zijn daarnaast snel geagiteerd. De bloeddruk en het hartritme zijn verhoogd, net als de lichaamstemperatuur. 52 Figuur 1.6 Chemische structuren van respectievelijk MDMA, MDEA en MDA 53 1.3.5.2 Metabolisatie MDMA wordt gemetaboliseerd door CYP450 enzymen. De metabolisatie van MDMA kan opgedeeld worden in twee grote pathways. De eerste begint met een O-demethylatie gevolgd door methylatie o.i.v. catechol-o-methyltransferase. Later vindt er eventueel een glucuronide- of sulfaatconjugatie plaats. De tweede pathway start met een N-dealkylatie tot 3,4-methyleendioxyamfetamine (MDA) gevolgd door een deaminatie en verdere oxidatie 13

naar de corresponderende benzoëzuurderivaten. Daarna kan conjugatie met glycine optreden. De halfwaardetijd van MDMA is 8 tot 9 uur. Dit is korter dan methamfetamine met een halfwaardetijd van 10 tot 12 uur en amfetamine met een halfwaardetijd van 12 tot 15 uur. 42,53 1.4 HOGE DRUK VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE TANDEM MASSASPECTROMETRIE 1.4.1 Algemeen In deze thesis wordt gebruik gemaakt van HPLC-MS/MS om drugs op te sporen en te kwantificeren in volbloedstalen. Vroeger werd voornamelijk gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (GC-MS) gebruikt voor de opsporing van drugs. Bij GC-MS is echter vaak derivatisatie noodzakelijk om de componenten vluchtig te maken. Bovendien is GC-MS nadelig voor thermolabiele componenten. Bij vloeistofchromatografie moeten componenten niet vervluchtigd worden. de 1.4.2 Hoge druk vloeistofchromatografie HPLC wordt steeds voorafgegaan door een vorm van staalvoorbereiding. Dit kan o.a. proteïneprecipitatie (PP), vaste fase extractie (SPE) of vloeistof-vloeistof extractie (LLE) zijn. 30 Het doel van staalvoorbereiding is het creëren van een geconcentreerd en zuiver extract. Na de staalvoorbereiding wordt het bekomen extract geïnjecteerd. 54 De verschillende componenten worden van elkaar gescheiden op de HPLC-kolom. Doordat iedere component op een andere manier interageert met de stationaire fase en mobiele fase, zal uiteindelijk een scheiding van de verscheidene analyten worden bekomen op basis van hun polariteit wanneer gebruik wordt gemaakt van reversed phase chromatografie. 55 Een belangrijk concept in HPLC is de Van Deemtervergelijking (Vergelijking 1.1). Deze beschrijft een verband tussen de schotelhoogte H (een maat voor de efficiëntie van de kolom; hoe hoger de schotelhoogte hoe beter) en de snelheid van de mobiele fase, u. 55-57 H = A + B + C u (1.1) u waarin: H: schotelhoogte u: snelheid mobiele fase A: eddydiffusie B: longitudinale diffusie C: massatransfer 14

De termen A, B en C in de Van Deemtervergelijking staan allen voor een oorzaak van piekverbreding. Een eerste oorzaak van piekverbreding is de eddydiffusie (term A) bij gepakte kolommen. Eddydiffusie slaat op het feit dat de ene molecule een langere weglengte kan hebben dan een andere door variabiliteit in de pakking. 58 De term B staat voor de longitudinale diffusie. De analyten zullen diffunderen van gebieden met hoge concentratie in de mobiele fase naar gebieden met lagere concentratie. Wanneer deze diffusie radiaal is, is er geen piekverbreding, bij axiale diffusie wel. Term C geeft weer hoe diep analyten in de pakking dringen. Sommige moleculen penetreren dieper in de silicaporiën dan andere, ook dit zorgt voor piekverbreding. 59,58 De snelheid van de mobiele fase heeft een impact op zowel term B als C. 1.4.3 Massaspectrometrie De detectie gebeurt op basis van massaspectrometrie (MS). Bij MS worden de componenten die van de HPLC-kolom elueren, geïoniseerd en gescheiden volgens hun massa over lading (of m/z-verhouding) en vervolgens gedetecteerd. 56 De eerste stap in het detectieproces is de ionisatie. Hiervoor wordt in deze thesis gebruik gemaakt van electrospray ionisatie (ESI). Bij ESI gebeurt de ionisatie onder atmosferische druk. 54 Het effluent van de HPLC-kolom komt in de ionenbron en wordt door een capillair gedwongen. Aan het uiteinde van het capillair wordt een potentiaal aangelegd. 56 Er ontstaat een wolk van druppels met eenzelfde lading, die vervolgens worden gedesolvateerd door een tegenstroom van drooggas. 54 Wanneer de Coulombse kracht de oppervlaktespanning overwint, zullen de druppels exploderen. Dit proces herhaalt zich tot er naakte ionen ontstaan. 60 Na de ionisatie worden de gewenste ionen geselecteerd door een massafilter, in dit geval een quadrupool. Tandem-massaspectrometrie bestaat uit twee opeenvolgende quadrupolen, Q 1 en Q 3, met ertussen een collisiecel Q 2 (Fig. 1.7). 54,56,61 In Q 1 worden de precursorionen geselecteerd. Deze zullen in de collisiecel botsen met een botsingsgas en fragmenteren. Dit proces heet collisie geïnduceerde dissociatie. Het gewenste fragmention kan op basis van de m/z-waarde geselecteerd worden in Q3. De geselecteerde 15

fragmentionen worden uiteindelijk gedetecteerd door een electron multiplier. 54 Deze zet de ionbundel om in een meetbaar elektrisch signaal. 56,63 Figuur 1.7: Schematische weergave tandem massaspectrometrie 62 16

2. OBJECTIEVEN Rijden onder invloed van drugs in het verkeer is een actueel probleem. Om druggebruik op te sporen kan de politie in eerste instantie een speekselscreeningstest uitvoeren. De resultaten hiervan dienen echter altijd bevestigd te worden met een tweede onafhankelijke techniek. Wanneer een staal binnenkomt in een laboratorium ter bevestiging van de speekselscreening moet gas- of vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie gebruikt worden. Volgens de wet moet tijdens de bevestigende test gebruik gemaakt worden van gedeutereerde IS. Hierbij is het bovendien gewenst dat zoveel mogelijk stoffen in een zo kort mogelijk tijdsbestek kunnen worden opgespoord. Deze thesis kadert dan ook in de ontwikkeling van een HPLC-MS/MS multi-analytmethode voor de detectie en kwantificatie van drugs in volbloed. De drugs die in deze multi-analytmethode moeten gedetecteerd en gekwantificeerd worden d.m.v. LC-MS/MS zijn: Cannabinoïden: THC, 11-OH-THC en THC-COOH - Opiaten: morfine, codeïne en 6-MAM - Amfetamine en methamfetamine - Cocaïne en benzoylecgonine - Amfetamine-analogen: MDMA, MDA en MDEA Om een dergelijke methode te ontwikkelen, zullen volgende stappen worden uitgevoerd: - Bepalen van de MRM-transities van iedere component en de bijhorende IS. - Optimaliseren van de componentspecifieke en bronspecifieke MS-parameters voor de verscheidene componenten en de bijhorende IS. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van infusie en Flow Injection Analysis (FIA). - Het opstellen van het meest geschikte gradiënt door het selecteren van de meest geschikte kolom en mobiele fase. Ook de meest geschikte needle wash moet geselecteerd worden en de dwell-tijden dienen voor elke component zo ingesteld te worden dat goed gedefinieerde pieken worden bekomen. 17

- De ontwikkeling van een staalvoorbereiding waarbij alle componenten en IS in voldoende mate en op reproduceerbare wijze worden geëxtraheerd. Bij voorkeur wordt hiervoor gebruik gemaakt van een gemeenschappelijke staalvoorbereiding voor alle componenten van de verscheiden klassen drugs. - Beoordeling van recovery en matrixeffect van de geoptimaliseerde extractiemethode. - Uiteindelijk zal de multi-analytmethode ook gevalideerd moeten worden. Deze validatie valt echter buiten de scope van deze thesis. - Toepassing van de methode op stalen van het routinelabo. Bij het ontwikkelen van deze multi-analyt methode is het belangrijk dat voldoende gevoeligheid wordt gehaald zodat waarden onder de cut-off waarden die opgenomen zijn in de verkeerswet kunnen gekwantificeerd worden. Tijdens deze thesis wordt gebruik gemaakt van een Prominence liquid chromatography system van Shimadzu en een QTRAP 5500 massaspectrometer van AB Sciex die in triple quad modus wordt gebruikt. In de literatuur werd op zoek gegaan naar gelijkaardige methodes om daaruit verder te bouwen. Er werd geen enkele methode teruggevonden in de literatuur waarin alle componenten van deze thesis geïncorporeerd zijn. Daarom baseerden we ons op drie methoden: - Het artikel van Di Corcia et al. waarin amfetamine, methamfetamine, cocaïne, BE, MDA, MDMA, morfine, codeïne, 6-MAM en THC werden bepaald in speeksel. Bij Di Corcia et al. wordt gebruik gemaakt van een API 5500 in positieve modus. 64 - In het artikel van Schwope et al. werd gebruik gemaakt een AB Sciex 3200 QTRAP voor de bepaling van cannabinoïden in volbloed. - Uit het artikel van Sergi et al. werden amfetamine, methamfetamine, morfine, 6- MAM, MDA, MDEA, MDMA, cocaïne, BE, THC, THC-COOH bepaald in plasma gebruik makend van een API 2000. 66 18

3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1 REAGENTIA - Mierenzuur (HCOOH) (Sigma Aldrich, Missouri, VS) - Acetonitrile (ACN) (Biosolve, Dieuze, France) - Ethylacetaat (Merck, Darmstadt, Germany) - Azijnzuur (Merck, Darmstadt, Germany) - Methanol (MeOH) (Biosolve, Dieuze, France) - n-hexaan (Merck, Darmstadt, Germany) - Ultrapuur water (UP water) (Synergy Ultrapure waterpurificatiesysteem, Merck Millipore, Massachusetts, VS). - LC-MS water (Biosolve, Dieuze, France) - De standaarden (-)-delta9-thc, (+/-)-11-hydroxy-delta9-THC, (+/-)-11nor-9-carboxy-delta9- THC, benzoylecgonine, cocaïne, (+/-)-amfetamine, (+/-)-metamfetamine, (+/-)-MDMA, (+/-)- MDEA, (+/-)-MDA, 6-acetylmorfine, morfine, codeïne (Sigma Aldrich, Missouri, VS) - De interne standaarden: (-)-delta9-thc-d3, (+/-)-11-hydroxy-delta9-THC-D3, (+/-)-11-nor-9- carboxy-delta9-thc-d9, benzoylecgonine-d8, cocaïne-d3, (+/-)-amfetamine-d11, (+/-)- methamfetamine-d14, (+/-)-MDMA-D5, 6-acetylmorphine-D6, morfine-d6, codeïne-d6 (Sigma Aldrich, Missouri, VS) 3.2. TOESTELLEN EN ANDERE MATERIALEN - Puntbuizen 10 ml (Hirschmann, Eberstadt, Duitsland) - Vials amber 1.5 ml (VWR, Radnor PA, VS) - Micro-Inserts clear glass 0.1 ml (VWR, Radnor PA, VS) - Screw cap polypropylene blue 9mm (VWR, Radnor PA, VS) - BEH-C18-kolom (Waters, Milford, Massachusetts, VS) - Kinetex C18-kolom (Phenomenex, Californië, US) - Kinetex biphenyl kolom (Phenomenex, Californië, US) - Kinetex fenyl/hexyl kolom (Phenomenex, Californië, US) - K 2 EDTA bloedbuizen (Venosafe, VF-109SDK, 9-mL, Terumo, Leuven, België) - Zymark (Zymark, Hopkinton, USA) - Centrifuge 5804 (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) 19

- Sonicator (Branson, Dansbury, USA) - Rotary mixer L26 (Labinco, Breda, Nederland) - Analyst software 1.5.1 (AB Sciex, Warrington, UK) - Multiquant software (AB Sciex, Warrington, UK) 3.3 MEETINSTRUMENTEN In deze thesis werd gebruik gemaakt van een Shimadzu Prominence liquid chromatography system (Shimadzu, Duisburg, Duitsland) die tegendrukken aankan tot 400 bar. Als massaspectrometer werd een QTRAP 5500 (AB Sciex, Warrington, UK) gebruikt. Deze werd gebruikt in triple quad modus hierbij selecteren Q 1 en Q 3 ionen en fungeert Q 2 als collisiecel. Daarnaast kan de QTRAP 5500 in ion trap modus gebruikt worden waarbij Q 3 als lineair ion trap wordt gebruikt. 67,68 Figuur 3.1 Shimadzu prominence liquid chromatography system (links) QTRAP 5500 (rechts) 3.4 AANMAKEN WERKOPLOSSINGEN Voor overgegaan kon worden tot methodeontwikkeling, werden eerst werkoplossingen bereid van de standaarden enerzijds en de IS anderzijds. Voor de 13 standaarden werd uitgegaan van het startmateriaal beschreven onder 3.1. Om een multi-analytmix te bereiden waarin elke drug aanwezig was in een concentratie van 2 µg/ml. Deze mix werd aangemaakt in MeOH en werd verdund met het geschikte solvent tot de gewenste concentratie voor de hieronder beschreven experimenten, tenzij anders vermeld. 20

Daarnaast werd ook van de 11 gedeutereerde IS een multi-analytmix bereid, uitgaande van het startmateriaal beschreven onder 3.1. In deze mix was de concentratie van elke gedeutereerde IS 440 ng/ml. Deze mix werd aangemaakt in een mengsel van MeOH/water (50:50; V:V) en verdund voor de hieronder beschreven experimenten, indien nodig. Zowel de werkoplossingen van de standaarden als deze van de IS werden bewaard bij -20 C in amberkleurige vials met glazen inserts. De amberkleurige vials beschermen de componenten tegen de invloed van licht, wat voornamelijk belangrijk is voor de opiaten en cannabinoïden. 67,70 Er werd gebruik gemaakt van glazen inserts, aangezien gekend is dat cannabinoïden adsorberen aan plastics. 71 3.5 METHODEONTWIKKELING 3.5.1 Optimalisatie MS-parameters 3.5.1.1 Startcondities gebaseerd op bestaande literatuur Aangezien de drugs die geïncorporeerd werden in de multi-analytmethode in het verleden reeds allemaal bepaald werden a.d.h.v. LC-MS/MS, werd in bestaande literatuur gezocht naar te gebruiken MRM-transities en bijhorende componentspecifieke MS-parameters. De gebruikte MS-parameters werden gebaseerd op een artikel van Di Corcia et al.. 64 Amfetamine, methamfetamine, cocaïne, BE, MDA, MDMA, morfine, codeïne, 6-MAM en THC worden opgespoord in speeksel gebruikmakend van een API 5500. De instellingen voor 11- OH-THC en THC-COOH in positieve modus werden gebaseerd op een artikel van Schwope et al. waarin gebruik wordt gemaakt van een QTRAP 3200. 65 Voor de negatieve ionisatie van 11-OH-THC en THC-COOH werden de initiële parameters gehaald uit een artikel van Sergi et al. waar gebruik werd gemaakt van een API 2000. 66 Een indicatie van de bronspecifieke parameters werd bekomen a.d.h.v. het artikel van Di Corcia et al., aangezien in deze methode gebruik werd gemaakt van een API 5500. 3.5.1.2 Bepaling MRM-transities en optimalisatie componentspecifieke MS-parameters De MRM-transities en componentspecfieke parameters uit de literatuur werden geverifieerd en indien nodig aangepast a.d.h.v. infusie. Bij infusie werden de componenten en IS afzonderlijk rechtstreeks in de ionbron gebracht en onmiddellijk geïoniseerd. Hiervoor werd 21

gebruik gemaakt van individuele oplossingen per component met een concentratie van 10 ng/ml in MeOH/water (50:50; V:V). Bij infusie kunnen de precieze m/z-waarden van het precursorion en de fragmentionen bepaald worden. De meest intense MRM-transities werden na infusie weerhouden. Daarna werden de twee beste geselecteerd op basis van S/N verhouding na chromatografie. De componentspecifieke parameters declustering potential (DP), collision energy (CE) en collision cell exit potential (CXP) werden ook geoptimaliseerd d.m.v. infusie. De entrance potential (EP) werd niet geoptimaliseerd aangezien voor de QTRAP 5500 deze standaard wordt ingesteld op ±10 V. De keuze van de EP heeft een invloed op de andere potentialen. 72 CXP DP CE Figuur 3.2 Componentspecifieke MS-parameters: declustering potential (DP), collision energy (CE), cell exit potential (CXP) 72 3.5.1.3 Optimalisatie bronspecifieke MS-parameters Omdat er wanneer FIA uitgevoerd werd nog gewerkt werd met een chromatografische methode met drie periodes (positief, negatief, positief) werd uit elke periode de moeilijkste component gekozen om daarvoor de bronparameters te optimaliseren. FIA werd uitgevoerd in positieve modus voor morfine, THC en in negatieve modus voor 11-OH-THC. Bij herhaaldelijke injecties van een multi-analytmix van morfine, THC, 11-OH-THC met een concentratie van 10 ng/ml zonder kolom op het toestel werden alle parameters (ion spray voltage, temperatuur, curtain gas, ionbron gassen) één voor één geoptimaliseerd tot de beste S/N verhouding bekomen werd. 22

3.5.2 Optimalisatie chromatografie 3.5.2.1 Startcondities gebaseerd op literatuur Initieel werd getracht de chromatografie van Di Corcia et al. over te nemen, aangezien de meeste componenten die bepaald moeten worden in de multi-analytmethode, ook bepaald werden in dit artikel. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een BEH-C18-kolom en 5 mm HCOOH in water als mobiele fase A en 5 mm HCOOH in ACN als mobiele fase B. Het gradiënt gebruikt door Di Corcia et al. zag er als volgt uit: 98:2 (A:B; V:V) tot 0:100 in vijf minuten, gevolgd door één minuut isocratisch 100 % B. Vervolgens werd drie minuten gereëquilibeerd naar de startcondities (2 % B). Hoewel dit gebaseerd was op het gradiënt van Di Corcia et al, waren lichte wijzigingen noodzakelijk aangezien niet bij hetzelfde debiet kon worden gewerkt (UPLC vs. HPLC). Daarom werd het gradiënt verder aangepast totdat een meer geschikte chromatografie voor onze toepassing werd bekomen. 3.5.2.2 Kolomkeuze Omdat de chromatografie bekomen op basis van gegevens uit de literatuur (cfr. supra) een aantal nadelen had, werd overgegaan tot het opstellen van een nieuwe chromatografische methode. In eerste instantie werden hiertoe verschillende kolommen geëvalueerd en vergeleken met de resultaten bekomen met de BEH-C18-kolom. Tijdens deze thesis werd gebruik gemaakt van een BEH-C18-kolom van 5 cm en niet van 10 cm. Bij Di Corcia et al. was deze 10 cm, maar daar werd gebruik gemaakt van een UPLC toestel (Shimadzu Nexera LC-30 A Series system). Drie verschillende Kinetex kolommen werden uitgetest. Er werd overgeschakeld op Kinetex kolommen omdat deze core-shell kolommen zijn en een lagere tegendruk opleveren. Omdat de methode waarop we ons baseren gebruik maakt van een C18 kolom werd een Kinetex C18 kolom uitgetest. Daarnaast werden ook een Kinetex fenyl/hexyl en een Kinetex biphenyl kolom getest. 73 3.5.2.3 Mobiele fase Omdat morfine zeer weinig retentie vertoonde, zelfs wanneer het gradiënt startte met één minuut isocratische elutie bij 1 % ACN, werd getracht de retentietijd van deze component te verlaten door gebruik te maken van MeOH met 5 mm HCOOH als mobiele fase B. De 23