Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-153 I-MET-FLVVT-153 KWANTITATIEVE BEPALING VAN CHOLINE IN SPECIFIEKE Versie 03 Datum van toepassing 2014-05-09 Opgesteld door : Mieke Vanbrabant, Sectieverantwoordelijke Nazicht door : Sophie De Volder; QAM; 2014-04-28 Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens, Laboratoriummanager; 2014-05-05 Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : Toevoegingsmiddelen LAB 25 I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van Choline in specifieke levensmiddelen v.03 1/9
Overzicht wijzigingen Herziening door/datum * Reden van de herziening Tekstdeel/draagwijdte van de herziening M, Vanbrabant, 03/2013 Opsteller van initiële versie Volledige tekst J-P. De Lannoy, 01/2014 M. Vanbrabant, 04/2014 Aanpassing naar aanleiding van interne audit 2013/04; B25 en B26 en update Paragraaf 10 Paragraaf 8 en 12 Verduidelijking aanmaak chromogeen reagens Paragraaf 8 * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van Choline in specifieke levensmiddelen v.03 2/9
INHOUDSTABEL 1 DOEL... 4 2 TOEPASSINGSGEBIED... 4 3 WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN... 4 4 DEFINITIES EN AFKORTINGEN... 4 5 PRINCIPE... 4 6 PRESTATIEKENMERKEN... 4 7 VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN... 5 8 REAGENTIA EN HULPSTOFFEN... 5 8.1 REAGENTIA... 5 8.2 HULPSTOFFEN... 6 8.2.1 Standaarden... 6 9 TOESTELLEN... 7 9.1 ALGEMEEN... 7 9.2 SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE... 7 10 WERKWIJZE... 7 10.1 EXTRACTIE... 7 10.1.1 Voedingssupplementen en zuigelingenmelk... 7 10.2 STANDAARDCURVE... 7 10.3 ENZYMATISCHE REACTIE... 8 10.3.1 Standaard... 8 10.3.2 Monster... 8 10.4 METING VAN DE ABSORBANTIES... 8 11 KWALITEITSCONTROLE... 8 12 BEREKENING EN RAPPORTERING... 8 13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN... 9 LAB 25 I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van Choline in specifieke levensmiddelen v.03 3/9
1 Doel Kwantitatieve bepaling van choline in specifieke levensmiddelen. 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de kwantitatieve bepaling van choline in voedingssupplementen en zuigelingenmelk. De rapporteringsgrens bedraagt 200 mg/kg. Choline komt meestal voor onder vorm van choline chloride of cholinebitartraat en in mindere mate als cholinediwaterstofcitraat. 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. 4 Definities en afkortingen Term Definitie 5 Principe Choline wordt uit het monster geëxtraheerd via een alkalische hydrolyse met natriumhydroxide, vervolgens wordt een chromogeen reagens toegevoegd waardoor de resterende fractie gebonden choline wordt vrijgezet en er een kleurreactie plaatsvindt. Het choline-gehalte wordt geanalyseerd d.m.v. spectrofotometrie. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaarheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. LAB 25 I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van Choline in specifieke levensmiddelen v.03 4/9
7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Alle werkzaamheden dienen te worden verricht in diffuus daglicht, in afwezigheid van fluorescent licht en direct licht. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Alle reagentia dienen van pro analyse -kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld. Reagentia Labonr. 8.1.1 Water, HPLC-kwaliteit (H 2 O) R1003 8.1.2 Zoutzuur, 37% (HCl) R0304 8.1.3 Natriumhydroxide pellets (NaOH) R0206 8.1.4 Norit, actieve kool, geactiveerd R2019 8.1.5 Tris hydroxymethyl aminomethaan R2020 8.1.6 Phospholipase D (poedervorm) R2028 8.1.7 Phospholipase D (in oplossing) R2032 8.1.8 Choline oxidase R2022 8.1.9 Peroxidase, Type I R2029 8.1.10 4-aminoantipyrine R2026 8.1.11 Phenol R2027 Zoutzuur (HCl) 5N: 8.1.12 Voeg 425 ml HCl (R0304) toe aan 500 ml water (R1003) in een maatkolf van W0230 1000 ml. Leng aan tot de maatstreep en meng. Zoutzuur (HCl) 1N: 8.1.13 Voeg 85 ml HCl (R0304) toe aan 300 ml water (R1003) in een maatkolf van W0009 1000 ml. Leng aan tot de maatstreep en meng. Natriumhydroxide (NaOH) 1N: 8.1.14 Los 40 g NaOH (R0206) op in 1000 ml water (R1003) W0110 LAB 25 I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van Choline in specifieke levensmiddelen v.03 5/9
8.1.15 8.1.16 KWANTITATIEVE BEPALING VAN CHOLINE IN SPECIFIEKE Tris hydroxymethyl aminomethaan (Trizma) buffer 0,05M, ph 8,0: Weeg 3,03 g tris hydroxymethyl aminomethaan (R2020) af in +/- 200 ml H 2 O. Breng op ph 8,0 met HCl 1 N (W0009) en leng verder aan met water tot 250 ml. Bewaar bij een temperatuur van 4 ± 4 C. Chromogeen reagens: Weeg achtereenvolgens af in een maatkolf van 100 ml: Choline oxidase: 100-120 units (R2022) Phospholipase D: 1,3 à 1,5 mg (~ 75-100 units; 60 IU/mg) (R2028) of 1 à 1,3 µl (~ 75-100 units; 79000 IU/ml) (R2032) Peroxidase: 1,7 à 5,6 mg (250-280 units; 50-150 IU/mg) (R2029) 4-aminoantipyrine: 15 mg (R2026) Phenol: 50 mg (R2027) Leng aan met Trizma buffer (W0231) en meng. Dit mengsel is 3 dagen houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4 C. W0231 W0232 8.2 Hulpstoffen 8.2.1 Standaarden Choline (bitartraat) standaardstof met gegarandeerde zuiverheid (S2165) 8.2.1.1 Choline standaard stockoplossing, 2500 μg/ml choline hydroxide (W0229) Weeg, rekening houdend met de zuiverheid, x mg choline bitartraat (S2165) tot op 0,1 mg nauwkeurig af in een maatkolf van 100 ml. Leng aan tot de maatstreep met water (R1003) en meng zodat een uiteindelijke concentratie van 2500 μg/ml choline hydroxide bekomen wordt. Deze oplossing is 1 week houdbaar, bij een temperatuur van 4 ± 4 C. 8.2.1.2 Choline standaard werkoplossing 1 (W1), 250 μg/ml choline hydroxide Pipetteer 10 ml van de standaard stockoplossing (W0229) in een maatkolf van 100 ml. Leng aan tot de maatstreep met water (R1003) en meng. Deze werkoplossing wordt bereid op de dag van de analyse. 8.2.1.3 Choline standaard werkoplossing 2 (W2), 375 μg/ml choline hydroxide Pipetteer 15 ml van de standaard stockoplossing (W0229) in een maatkolf van 100 ml. Leng aan tot de maatstreep met water (R1003) en meng. Deze werkoplossing wordt bereid op de dag van de analyse. LAB 25 I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van Choline in specifieke levensmiddelen v.03 6/9
9 Toestellen KWANTITATIEVE BEPALING VAN CHOLINE IN SPECIFIEKE 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode UV/Vis spectrofotometer met λ = 505 nm Glazen cuvetten met een optische weglengte van 10 mm 10 Werkwijze 10.1 Extractie 10.1.1 Voedingssupplementen en zuigelingenmelk Weeg, afhankelijk van het verwachte gehalte, 1 20 g monster af in een fles van 250 ml. Voor zuigelingenmelk wordt standaard 5 g monster afgewogen. Voeg 30 ml NaOH 1N (W0110) toe en schud. Plaats de fles gedurende 3 uur in een warmwaterbad op 70 C. Laat afkoelen en breng vervolgens op ph 3,5 à 4,0 met HCl 5N (W0230). Breng het extract kwantitatief over in een maatkolf van 100 ml en leng aan met H 2 O (R1003). Centrifugeer, indien nodig, filtreer (595 ½ Whatman plooifilter) en verwijder de eerste 5 à 10 ml filtraat. Controleer nogmaals of ph gelijk is aan 3,5 à 4,0 en pas aan indien nodig. Voeg 0,2 g Norit (R2019) toe, schud en filtreer opnieuw. Herhaal de filtratie met Norit tot het extract helder is. 10.2 Standaardcurve Maak een standaardreeks in 15 ml Falcon tubes volgens onderstaand schema: [STD] Verdunning 0 0 µg/ml H 2 O 1 6,25 µg/ml 0,25 ml W1 / 10 ml H 2 O 2 25 µg/ml 1 ml W1 / 10 ml H 2 O 3 100 µg/ml 4 ml W1 / 10 ml H 2 O 4 200 µg/ml 8 ml W1 / 10 ml H 2 O 5 375 µg/ml = W2 LAB 25 I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van Choline in specifieke levensmiddelen v.03 7/9
10.3 Enzymatische reactie 10.3.1 Standaard Voor meetpunt 0: Neem 100 µl H 2 O en voeg 3 ml chromogeen reagens toe (A reag ) Voor meetpunt 1 tot 5: Neem van elk standaardniveau 100 µl en voeg 3 ml chromogeen reagens toe (A std ) Plaats in warmwaterbad op 37 ± 2 C gedurende 15 minuten 10.3.2 Monster Blanco: Neem van elk monster 100 µl extract en voeg 3 ml H 2 O (R1003) toe (A bl ) Neem voor elk monster 100 µl extract en voeg 3 ml chromogeen reagens toe (A smp ) Plaats in warmwaterbad op 37 ± 2 C gedurende 15 minuten 10.4 Meting van de absorbanties Na toevoegen van het chromogeen reagens treedt er een kleurverandering op. Meet vervolgens binnen 15 minuten de absorbantie van de standaard- en monsteroplossingen bij de maximale golflengte (λ max = 505 nm) met behulp van een UV/Vis spectrofotometer. 1. Start de spectrofotometer en wacht tot het toestel geïnitialiseerd is 2. Kies vervolgens: Library / Cholnew / Load en bevestig telkens met Enter 3. Plaats 2 glazen cuvetten met blanco-oplossing H 2 O in het toestel en stel de absorptie op nul met behulp van Zero base 4. Meet de absorbantie van de oplossingen bij 505 nm in een glazen cuvet ten opzichte van de blanco-oplossing met behulp van Run 5. Print de ruwe data af en vul alle gegevens in in Berekening Choline.xls om de standaardcurve en geëxtrapoleerde resultaten te bekomen (A reag, de absorptie van het chromogeen reagens wordt in mindering gebracht bij elke absorbantie meetwaarde, zodat de standaardcurve het nulpunt bevat) 11 Kwaliteitscontrole Zie LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN 12 Berekening en rapportering LAB 25 I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van Choline in specifieke levensmiddelen v.03 8/9
Onderstaande berekening gebeurt met behulp van de Excel-file Berekening Choline.xls. Netto absorbantie monster A = A smp A bl A reag X mg/kg choline hydroxide = = Met: A = Netto absorbantie monster A reag = Absorbantie nulpunt standaard (absorbantie chromogeen reagens) A bl = Absorbantie monster + H 2 O A smp = Absorbantie monster + chromogeen reagens S = Helling standaardcurve (a uit vergelijking standaardcurve y = ax) V = Volume hydrolysaat (ml) W = Afgewogen monster (g) f = Verdunningsfactor (g/ml) 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-D 38 LAB 25-F 62 LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25-P 04 LAB 25-P 07 WERKWIJZE CHOLINE REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT BEREKENING CHOLINE.XLS LAB 25 I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van Choline in specifieke levensmiddelen v.03 9/9