BIOFILMVORMING EN GROEI LEGIONELLA- BACTERIËN IN LEIDINGWATER- INSTALLATIES

Transcriptie

1 communicatie platform legionella BIOFILMVORMING EN GROEI LEGIONELLA- BACTERIËN IN LEIDINGWATER- INSTALLATIES Bestrijding van legionellabacteriën in waterinstallaties neemt een centrale plaats in bij de preventie van legionellapneumonie. Hierbij kan onderscheid worden gemaakt in curatieve methoden (afdoding van de aanwezige legionellabacteriën) en preventieve methoden (verhindering van de groei van legionellabacteriën). Kennis van biofilmvorming en het gedrag van legionella in biofilms is nodig voor het ontwikkelen en toepassen van efficiënte, doeltreffende maatregelen. TEKST: DICK VAN DER KOOIJ EN HARM R. VEENENDAAL FOTOGRAFIE: INDUSTRIE Legionellabacteriën kunnen zich vermeerderen in de afweercellen in de longblaasjes van de mens, waarna ze in grote aantallen vrijkomen en ziekte kunnen veroorzaken. Het vermogen tot intracellulaire replicatie speelt ook een cruciale rol bij de vermeerdering van deze bacteriën in het aquatische milieu. Ondanks de hoge voedingseisen blijken legionellabacteriën alom aanwezig in zoetwatermilieus, omdat ze zich kunnen vermeerderen in bepaalde vrijlevende protozoa. Deze protozoa zijn eencellige diertjes die zich voeden zich met bacteriën. Ze grazen bij voorkeur op oppervlakken in contact met water, waarop bacteriën zich vermeerderen (biofilm). De groei van legionella in waterinstallaties hangt dus sterk af van de mate van biofilmvorming. De temperatuur is daarbij een belangrijke, selecterende factor. De vorming van biofilms op oppervlakken in contact met water is een samenspel van biologische en fysisch-chemische processen. Hechting van bacteriën aan het oppervlak is de eerste fase van biofilmvorming, waarbij fysisch-chemische processen, zoals transport, elektrostatische en Van der Waals krachten een rol spelen. Een volgende fase is de onomkeerbare verankering van de cellen aan het oppervlak door uitscheiding van polymere componenten, gevolgd door vermeerdering van de bacteriën. Het tempo van vermeerdering is afhankelijk van de aanvoer en aard van de voedingsstoffen en van de mate waarin de bacteriën losraken van het oppervlak. Bij de groei worden echter verscheidene polymere componenten uitgescheiden, waardoor een matrix ontstaat die de bacteriën omgeeft en beschermt. Ophoping van anorganische componenten, zoals ijzer, mangaan en kalk, versterkt de biofilm. Invloed watersamenstelling Biofilmvorming in waterleidingen is afhankelijk van de concentratie van afbreekbare stoffen in het aangevoerde leidingwater en van de afgifte van afbreekbare stoffen door het leidingmateriaal. In drinkwater is de concentratie aan afbreekbare stoffen laag door toepassing van diverse zuiveringsprocessen, waarmee dergelijke stoffen uit het water worden verwijderd. Het gehalte organische koolstof van het behandelde water ligt in de regel tussen 0,5 en 5 mg/l. Slechts een klein deel van deze verbindingen is afbreekbaar. Daarom is een speciale methode ontwikkeld om het gehalte gemakkelijk afbreekbare organische koolstof (AOC) in het drinkwater te bepalen. Het AOC-gehalte wordt berekend uit het maximum groeiniveau (koloniegetal) van de testbacteriën, waarbij gebruik wordt gemaakt van de groeiopbrengst van deze organismen op acetaat (figuur 1). Het 54

2 Bacteriën in filters van actieve kool spelen een belangrijke rol bij de verwijdering van afbreekbare stoffen uit het water bij de drinkwaterbereiding. 1. AOC-gehalte van drinkwater. Groeicurven van teststammen (A) en AOC-gehalte (B) in filtraat van langzame zandfilters. AOC-gehalte van drie drinkwatertypen bij distributie (C). AOC-gehalte wordt uitgedrukt in hoeveelheid acetaatkoolstof equivalenten per liter water en ligt in het drinkwater in Nederland meestal ligt tussen 1 en 20 µg C/l. Bij AOC-gehalten beneden 10 µg C/l treedt vrijwel geen AOC-opname op tijdens verblijf van het water in het leidingnet (figuur 1.C) en blijven de koloniegetallen van de bacteriën in het drinkwater laag. Een tweede werkwijze die is ontwikkeld voor de bepaling van de groeibevorderende eigenschappen van drinkwater berust op het meten van de biofilmvorming in een biofilmmonitor. De biofilmmonitor bestaat uit een glazen kolom, gevuld met cilinders van glas, die wordt doorstroomd met het te onderzoeken water. Op deze glazen cilinders treedt biofilmvorming op. Periodiek worden enkele cilinders uit de kolom genomen en wordt de concentratie van de biofilm gemeten via de analyse van het gehalte adenosinetrifosfaat (ATP). ATP speelt een rol bij de energieoverdracht in de cel en is aanwezig in alle actieve (levende) organismen. Met een specifieke enzymatische methode kan een snelle (enkele minuten) en gevoelige analyse (ca. 0,5 ng/l) worden uitgevoerd. De biofilmvormingssnelheid (BVS, pg ATP/cm 2. d) kan worden berekend uit de lineaire toename van de biomassaconcentratie op de glazen ringen, gemeten als functie van de tijd (figuur 2.A). BVS-waarden van het drinkwater in Nederland liggen meestal tussen 0,5 en circa 50 pg ATP/(cm 2. d) (figuur 2.B). Ook bij AOC-waarden beneden 10 µg C/l treedt biofilmvorming op. Met doseerexperimenten is vastgesteld dat een concentratie van 10 µg C/l van een gemakkelijk afbreekbare organische stof (acetaat) een biofilmvormingssnelheid geeft van circa 360 pg ATP/cm 2. d. Hieruit kan worden afgeleid dat de waargenomen BVS-waarden van drinkwater worden veroorzaakt door zeer lage concentraties aan afbreekbare stoffen. Invloed van leidingmaterialen Leidingmaterialen zijn eveneens van invloed op de biofilmvorming, vooral wanneer deze materialen groei- > 55

3 BIOFILMVORMING EN GROEI LEGIONELLABACTERIËN IN LEIDINGWATERINSTALLATIES 2. Biofilmvorming in de biofilmmonitor. A: bij drie typen drinkwater bereid uit grondwater (AOC < 10 µg C/l). B: biofilmvormingsnelheid (BVS) van 37 drinkwatertypen (DGW, drinkwater uit grondwater, DOW, drinkwater uit oppervlaktewater). De stippellijn geeft BVS-waarde bij dosering van 1 µg acetaat-c/l. 3. Bepaling van de biomassaproductiepotentie (BPP) van materialen in contact met (leiding-)water. A: invloed van de aanwezigheid van materialen op de concentratie van biomassa in het water (PB) in de BPP-test bij 30 ºC. B: het verband tussen de biofilmconcentratie op de materialen (BFP) en PB. Controle: test zonder materiaal. BFP is de gemiddelde concentratie van de biomassa op de materialen (biofilm) gemeten op dagnummers 56, 84 en 112 (PVCp: zacht PVC). bevorderende stoffen afgeven. Afgifte kan vooral optreden bij synthetische materialen, zoals plastic, rubbersoorten en coatings. In 2004 is in Nederland een werkwijze gestandaardiseerd voor de bepaling van de biomassaproductiepotentie (BPP) van materialen. Deze werkwijze berust op het meten van de vorming van biomassa op proefstukjes van het te onderzoeken materiaal die in leidingwater met een laag AOC-gehalte worden geïncubeerd. De ATP-analyse wordt ook hier gebruikt voor de bepaling van de biomassaconcentratie. Om deze analyse mogelijk te maken wordt de biomassa, die zich heeft gevormd op het oppervlak van het materiaal, losgemaakt met ultrasone trillingen. De teststukjes van de materialen worden met een totale externe oppervlakte van 150 cm 2 geïncubeerd in 900 ml leidingwater bij 30 ºC (figuur 3). Het water wordt elke week ververst en na acht weken, twaalf weken en zestien weken incubatie worden teststukjes verwijderd en de concentraties van biomassa in het water en op het materiaal gemeten. Uit het stabiliteitsdiagram van figuur 3.B komt naar voren dat de geteste materialen RVS en PVCc in de test vrijwel geen versterking van de biofilmvorming veroorzaakten. Wel is in aanwezigheid van RVS gedurende circa vijf weken een verhoogde concentratie van biomassa in het water waargenomen (figuur 3.A). Bij biofilmconcentraties boven circa 100 pg ATP/cm 2 is de concentratie van de biomassa in het water onder de testcondities hoger dan in het water zonder materiaal (controle) of met glas. Tevens blijkt dat de waargenomen biofilmconcentraties liggen tussen circa 30 pg ATP/cm 2 (glas) en

4 pg ATP/cm 2 (zacht PVC, rubber) en dus een range omvatten van ongeveer een factor Deze gegevens illustreren dat de groeibevorderende eigenschappen van een materiaal in contact met leidingwater met een relatief eenvoudige werkwijze kunnen worden bepaald. Een volgende stap is het definiëren van toelatingscriteria voor de groeibevorderende eigenschappen van de materialen. In opdracht van Vrom voert Kiwa Water Research onderzoek uit, dat gericht is op het verkrijgen van informatie die nodig is voor het definiëren van dergelijke criteria. Sinds enkele jaren bestaan de distributieleidingen in Nederland voor het grootste deel uit hard PVC. Dit materiaal is vrijwel niet groeibevorderend, dus de biofilm op de wand van deze leidingen is gevormd door groei van bacteriën die afbreekbare stoffen uit het leidingwater opnemen. Uit onderzoek van enkele tientallen leidingsegmenten, afkomstig uit verschillende leidingnetten, is naar voren gekomen dat de biofilmconcentratie op de buiswand meestal ligt tussen circa 50 en pg ATP/cm 2. Evenals bij de BVS-waarden zijn de hoogste biofilmconcentraties circa honderdmaal hoger dan de laagste waarden. Uit de gegevens kan worden afgeleid dat waarden van pg ATP/cm 2 als normaal kunnen worden beschouwd en nagroeiproblemen veroorzaken in het leidingnet. grazen op de biofilm; (iii) groei van deze bacteriën in de amoeben die vervolgens te gronde gaan, waarbij de legionellabacteriën zich verspreiden. Deze keten van processen wordt beïnvloed door de concentratie van voedingsstoffen, de watertemperatuur, de samenstelling en de concentratie van de biofilm. Aanwezigheid van amoeben is ook een voorwaarde. Uit onderzoek met moleculaire technieken is naar voren gekomen dat H. vermiformis algemeen voorkomt in oppervlaktewater en ook uit verder onderzoek blijkt dat protozoa van nature in allerlei watertypen aanwezig zijn. AARD VAN MATERIAAL IS VAN INVLOED OP HET AANTAL LEGIONELLA- BACTERIËN IN WATER Groei legionellabacteriën in biofilms Enkele jaren na de ontdekking van Legionella pneumophila bleek dat het organisme in laboratoriumexperimenten pathogeen is voor bepaalde vrijlevende amoeben. Inmiddels is duidelijk dat soorten van ten minste zes verschillende geslachten van amoeben, een ciliaat en een slijmzwam als natuurlijke gastheer kunnen dienen. In 1988 is aangetoond dat groei van L. pneumophila in water alleen optreedt in aanwezigheid van een filtreerbare groeifactor, die werd geïdentificeerd als de amoebe Hartmannella vermiformis. Uit onderzoek, uitgevoerd met biofilms gevormd op stukjes zacht PVC, kwam eenduidig naar voren dat L. pneumophila zich ook in biofilms uitsluitend vermeerdert in protozoa. H. vermiformis is ook bij dit onderzoek geïdentificeerd als gastheer. In alle natuurlijke watermilieus en in watersystemen die door de mens zijn aangelegd (distributieleidingen, leidingwaterinstallaties, koeltorens, whirlpools en dergelijke) zijn biofilms aanwezig op oppervlakken in contact met water. De aanwezigheid van L. pneumophila in (leiding-)water is dus een gevolg van een keten van drie processen: (i) hechting en vermeerdering van bacteriën die de aanwezige afbreekbare stoffen benutten, (ii) opname van legionellabacteriën door amoeben die Prooibacteriën en biofilmconcentratie Het is te verwachten dat er meer protozoa in biofilms voorkomen bij hogere biofilmconcentraties. Niet alle bacteriesoorten vormen een geschikte voedselbron (prooibacterie) voor protozoa. De amoebe H. vermiformis heeft een voorkeur voor bepaalde bacteriesoorten, waaronder bacteriën van de coligroep. Gepigmenteerde bacteriën daarentegen zijn niet aantrekkelijk als voedingsbron. Onlangs is aangetoond dat Limnobacter thiooxidans en een Acidovorax-soort in biofilms als prooibacteriën dienen voor H. vermiformis. Een toename of een afname van het aantal prooibacteriën door veranderingen van de populatiesamenstelling van de biofilm, kan dus leiden tot een verandering van het aantal (gastheer-)amoeben, en indirect meer of minder groei van legionella tot gevolg hebben. De samenstelling van de biofilm is echter lastig te beïnvloeden, terwijl beperking van biofilmvorming kan worden gerealiseerd door de concentratie van afbreekbare stoffen in het water en de selectie van materialen die (vrijwel) geen afbreekbare stoffen afgeven te beperken. Uit batchtesten met diverse materialen, waarbij het water wekelijks werd ververst, is gebleken dat de aard van het materiaal van invloed is op het aantal legionellabacteriën in het water. > 57

5 BIOFILMVORMING EN GROEI LEGIONELLABACTERIËN IN LEIDINGWATERINSTALLATIES 4. Invloed van materialen op groei van Legionella pneumophila. A: materialen in leidingwater (batchtest) bij 37 ºC met wekelijks verversen (NR: natuurrubber). B: biofilmconcentraties in leidingen van een experimentele warmtapwaterinstallatie. C: legionellaconcentraties in biofilms op leidingen van een experimentele warmtapwaterinstallatie. In aanwezigheid van het materiaal dat het sterkste biofilmvormend was, zijn de hoogste aantallen L. pneumophila waargenomen (figuur 4.A). In een experimentele warmtapwaterinstallatie (boiler met leidingen van circa 6 m, watertemperatuur circa 37 ºC) met een huishoudelijk tappatroon vermeerderden legionellabacteriën zich in de biofilms in de leidingen van roestvast staal, koper en PE-Xa. Biofilmvorming op PE-X was sterker dan op RVS en koper. Zelfs bij biofilmconcentraties beneden 500 pg ATP/cm 2 was L. pneumophila aanwezig in de biofilm (figuur 4.B, C). De invloed van de relatie tussen biofilmconcentratie en de groei van legionellabacteriën wordt nader onderzocht om na te gaan in welke mate beperking van de biofilmvorming onder invloed van water en materialen kan leiden tot beperking van de groei van deze bacteriën. Temperatuur Bij temperaturen beneden 25 ºC groeit L. pneumophila traag en gaan andere soorten legionellabacteriën overheersen. Gebleken is dat in drinkwater bij een lage temperatuur (<15 ºC) een grote variëteit van legionellabacteriën kan worden aangetoond met moleculaire technieken. Deze bacteriën zijn niet kweekbaar en het merendeel behoort tot soorten die nog niet zijn beschreven. Er zijn geen aanwijzingen dat dergelijke legionellasoorten ziekteverwekkend zijn. Een legionellasoort die vaak met de kweekmethode wordt aangetroffen is L. anisa. Dit organisme is ondermeer waargenomen in zestien van vierhonderd onderzochte woninginstallaties. Er zijn aanwijzingen dat L. anisa zich bij lagere watertemperaturen vermeerdert en handhaaft dan L. pneumophila. L. anisa is wereldwijd echter slechts in enkele gevallen van legionellapneumonie aangetroffen en is niet waargenomen bij gevallen van beginselloze, gerapporteerd in Europa. Bestrijding van Legionella De groei van L. pneumophila kan worden beperkt door handhaving van een hoge (>60 ºC ) of lage (<25 ºC) watertemperatuur. Beperking van de vorming van biofilm en sediment, en het voorkomen van stagnatie dragen eveneens bij aan beheersing van de groei van legionella in watersystemen. Gebruik van water en materialen met een geringe biofilmvormingspotentie moet onderdeel zijn van een structurele aanpak (meervoudige barrière) gericht op beperking van de groei van legionella en andere ongewenste micro-organismen in (leiding-)waterinstallaties. In situaties waarbij deze benadering niet uitvoerbaar is, is toepassing van een alternatieve beheersmaatregel nodig. < Meer over legionella: AUTEURS Dick van der Kooij en Harm R. Veenendaal, Kiwa Water Research VERANTWOORDING De beschreven informatie is grotendeels gebaseerd op onderzoek dat in het kader van het bedrijfstakonderzoek (BTO) is uitgevoerd bij Kiwa Water Research. 59