Verbetering SIKB protocol Opdrachtgever: SIKB

Transcriptie

1 Verbetering SIKB protocol 6802 Opdrachtgever: SIKB

2 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L O P D R A C H T G E V E R : SIKB P R O J E C T T I T E L : Verbetering SIKB protocol 6802 P R O J E C T C O D E : /1195 D O C U M E N T T Y P E : Rapport P U B L I C A T I E D A T U M : 23 juni 2016 P R O J E C T L E I D E R : A U T E U R ( S ) C O L L E G I A L E T O E T S Sabine Doddema Elsemiek Croese Sabine Doddema Bioclear Microbial Analysis b.v. Postadres: Postbus 2262; 9704 CG Groningen Bezoekadres: Rozenburglaan 13C; 9727 DL Groningen Telefoon: microbialanalysis@bioclear.nl Website: Bioclear werkt met het INK kwaliteitssysteem (Instituut Nederlandse Kwaliteit), een managementmodel, dat is afgeleid van het Europese EFQM Excellence model. Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze uitgave mag worden vermenigvuldigd en/of openbaar gemaakt door middel van druk, fotokopie, microfilm of op welke andere wijze dan ook, zonder voorafgaande toestemming van Bioclear Microbial Analysis. Microbial Analysis b.v. Op opdrachten aan Bioclear - Microbial Analysis zijn van toepassing de Algemene Voorwaarden voor onderzoeksopdrachten aan Bioclear, zoals gedeponeerd bij de Kamer van Koophandel te Groningen.. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

3 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Samenvatting De doelstelling van deze studie was om beter inzicht te krijgen of het huidige SIKB protocol 6802 geschikt is voor het vaststellen van MIC risico s in ondergrondse brandstof tanks en indien nodig suggesties te formuleren voor aanpassingen aan hoofdstuk vier van SIKB protocol Sinds de wettelijk verplichtte bijmenging van biodiesel aan diesel lijkt MIC een steeds groter probleem te zijn. MIC kan snel verlopen en onverwachte doorbraken van tanks en daarmee ernstige vervuiling van de ondergrond veroorzaken. In het huidige protocol 6802 wordt voorzien in catp metingen voor de bepaling van microbiologische verontreiniging in brandstof. Het is echter niet bekend of deze metingen ook geschikt zijn om een beeld te krijgen van het risico op MIC. In deze studie hebben we in acht ondergrondse dieseltanks monsters genomen tijdens de jaarlijkse inspectie, gebruikmakend van een monsterdief. Tijdens vijftienjaarlijkse inspecties zijn slib en/of swab monsters aan het oppervlakte van de tankbodem genomen. Op de diesel monsters (jaarlijkse inspectie) zijn catp metingen uitgevoerd en op alle monsters is het QPCR MIC pakket toegepast. De resultaten laten zien dat de catp metingen een representatief beeld geven van de aanwezige microbiologie in diesel, maar dat de jaarlijkse inspectie en dus monstername via monsterdief, niet voorspellend lijkt te zijn voor wat er wordt aangetroffen op de tank bodem. In het merendeel van de gevallen geeft het slib onderin de tanks een middelmatig risico op MIC. Of de schade aan de tanks daadwerkelijk MIC betrof was niet te bepalen vanwege gebrek aan voldoende bewijsvoering. Ons advies voor de aanpassing van SIKB protocol 6802 hoofdstuk 4 is om, ten behoeve van voorspelling van MIC risico s in de tanks, de monstername techniek van de jaarlijkse inspectie aan te passen en monster van het oppervlakte te nemen in plaats van de brandstof zelf. Daarnaast is het advies om catp als eerste indicatie te gebruiken en indien catp hoog is (volgens huidige grenswaarden), dan QPCR MIC pakket uit te voeren om een MIC risico inschatting te kunnen doen. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

4 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Inhoudsopgave 1. Samenvatting 3 2. Achtergrond Introductie Achtergrond Doel Inspectie MIC Technieken Hypothese Plan van Aanpak Jaarlijkse inspectie Vijftienjaarlijkse inspectie Biocide Coating Opmerking Resultaten Uitgangssituatie Bemonstering Monsters en monsterpunten Resultaten catp Resultaten QPCR Beperkingen Interpretatie resultaten Interpretatie ATP metingen Interpretatie QPCR metingen Inspectie Samenvatting Resultaten Conclusie Discussie Aanbevelingen Suggesties voor aanpassing protocol Monstername techniek catp meting of QPCR meting catp grenswaarden Aanpassing protocol Suggesties voor vervolgonderzoek Vervolgonderzoek met betrekking tot SIKB protocol Vervolgonderzoek algemeen 24 B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

5 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Bijlagen: 1. SIKB protocol Achtergrondinformatie MIC 3. QPCR method 4. Foto in tank 5. Bemonsteringprotocollen B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

6 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Achtergrond 2.1. Introductie Dit rapport beschrijft de resultaten en bevindingen betreffende de opdracht van SIKB aan Bioclear Microbial Analysis (MA) zoals beschreven in de offerte met referentienummer /1036 met aanpassingen zoals beschreven in de offerte met referentienummer /1127, betreffende het verbeteren van hoofdstuk vier van SIKB protocol 6802 controle op water/bezinksel/microorganismen in onder- en/of bovengrondse tanks, als onderdeel van AS 6800 controle en keuring tank(opslag)installaties Achtergrond Brandstof voor tankstations wordt opgeslagen in ondergrondse brandstof tanks. In Nederland zijn er ongeveer van dit soort ondergrondse tanks waarvan ongeveer dieseltanks. Het is van essentieel belang voor de bodem dat deze tanks robuust zijn. Lekkage van dergelijk tanks kan verstrekkende vervuilende gevolgen hebben voor de ondergrond waarin deze tanks zich bevinden. Volgens Europese wetgeving is het sinds 2010 verplicht om fossiele diesel bij te mengen met biodiesel (diesel van plantaardige oorsprong, bijvoorbeeld FAME). Sinds deze wettelijke verplichting wordt er, tijdens keuringen, steeds meer corrosie (en specifiek putcorrosie) in de tanks aangetroffen. Een verklaring voor deze observatie is dat biodiesel meer water kan vasthouden dan fossiele diesel. Daarnaast zijn de grenswaarden voor de hoeveelheid zwavel die in de diesel mag zitten erg verlaagd. Deze beide componenten zorgen ervoor dat er een hoger risico is voor microbiologische groei dan voorheen en daarmee een verhoogd risico op micro-organismen die corrosie kunnen veroorzaken. Deze vorm van corrosie wordt microbiologically influenced corrosion (MIC) genoemd. Omdat MIC zeer lokaal kan optreden en veel sneller kan verlopen dan andere vormen van corrosie, kan MIC grootse gevolgen hebben vanwege het risico op onverwachte lekkages van tankwanden waardoor de ondergrond, waarin de tank zich begeeft, ernstig vervuild kan raken. Huidige inspectieprotocollen houden geen rekenschap met MIC Doel Het doel van het beschreven onderzoek is het verbeteren van hoofdstuk vier van SIKB protocol 6802 (bijlage 1). Dit protocol voorziet in een catp meting om het risico tot het dichtslaan van filters vast te stellen, welke wordt veroorzaakt door micro-organismen. Echter kunnen micro-organismen ook betrokken zijn bij corrosie van brandstoftanks. In hoeverre een catp meting geschikt is om risico s op microbiële corrosievorming vast te stellen, is vooralsnog onbekend. Aanvullend onderzoek is gewenst om uit te wijzen of catp geschikt is om risico s op microbiële corrosievorming vast te stellen en zo ja, via welke wijze de bemonstering moet plaatsvinden om te komen tot een betrouwbaar resultaat en een risicobeoordeling. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

7 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Inspectie Brandstof wordt opgeslagen in onder- en bovengrondse tanks. Deze tanks dienen jaarlijks geïnspecteerd te worden volgens AS SIKB 6800 Controle en keuring tank(opslag)installaties. Eén van de bijbehorende protocollen bedraagt SIKB protocol 6802 (zie bijlage 1). Dit protocol voorziet in de controle op de aanwezigheid van water/bezinksel en micro-organismen, waarbij toestandsvoorspellende grootheden voor inwendige corrosie worden bepaald. SIKB protocol 6802 voorziet in de geleidbaarheid en zuurgraad bepaling, maar tevens wordt gecontroleerd op microbiologische verontreinigingen middels een catp bepaling. Deze controle op microorganismen is noodzakelijk aangezien deze kunnen zorgen voor verstoppingen van filters en daarnaast het corrosieproces kunnen versnellen vanwege de eventuele aanwezigheid van MIC processen MIC MIC is een vorm van corrosie die wordt veroorzaakt of versneld door de biologische activiteiten van micro-organismen. MIC wordt geacht betrokken te zijn in ongeveer 35% van de corrosiegevallen en kan lokaal leiden tot maal hogere corrosiesnelheden. Er zijn verschillende typen micro-organismen die betrokken zijn bij MIC, echter worden sulfaatreducerende bacteriën verondersteld de belangrijkste veroorzakers te zijn. Ook van andere typen micro-organismen is bekend dat ze MIC kunnen veroorzaken, met name organismen die betrokken zijn bij de zwavelcyclus en zwaveloxidatie maar daarnaast ook methanogenen, ijzerreducerende en ijzeroxiderende bacteriën. Sinds de verplichte vermenging van fossiele brandstoffen met biobrandstoffen wordt een toename van MIC in (opslag)tanks geconstateerd. Dit heeft te maken met de eigenschap van biobrandstoffen dat ze veel meer water kunnen opnemen dan fossiele brandstoffen. De aanwezigheid van water is cruciaal voor microbiologische overleving en groei. Een omgeving waarin wordt voorzien van water en brandstof creëert voor bepaalde micro-organismen de ideale omgeving om te (over)heersen. Wanneer deze micro-organismen in staat zijn om het corrosieproces te beïnvloeden spreken we van MIC. Deze organismen kunnen grote schades aan hun omgeving aanrichten aangezien ze in staat zijn het corrosieproces (plaatselijk) dusdanig te versnellen dat er in relatief korte periodes ernstige metaalverliezen optreden waardoor lekkages kunnen ontstaan. Aanvullende achtergrondinformatie met betrekking tot het MIC mechanisme wordt gegeven in bijlage Technieken Micro-organismen kunnen op vele verschillende manieren worden gedetecteerd. In het huidige onderzoek hebben we gebruik gemaakt van catp en QPCR. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

8 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L catp Een ATP meting wordt veelvuldig gebruikt in de voedingsmiddelenindustrie vanwege de eenvoud en lage prijs van de analyse. De ATP analyse geeft inzicht in de reinheid van een monster. ATP staat voor adenosine trifosfaat, dit is aanwezig in alle dierlijke, plantaardige, bacteriële, gist en schimmelcellen. catp staat voor cellulaire ATP wat inhoudt dat het gemeten ATP afkomstig is van intacte (levende) cellen. De meting is gebaseerd op luciferase welke licht geeft bij de introductie van ATP. De catp meting kenmerkt zich vanwege zijn eenvoud qua analyseprotocol en de snelheid waarmee resultaat wordt verkregen (binnen één uur analysetijd). Echter kent de analyse ook nadelen. Zo dient het monster na bemonstering gekoeld bewaard te worden en binnen 24 uur geanalyseerd te zijn ter voorkoming dat cellen in de tussentijd afsterven en het analyseresultaat niet meer betrouwbaar is. Daarnaast is de herkomst van catp niet eenvoudig toe te schrijven aan micro-organismen aangezien alle levende organismen ATP bevatten. Een hoog resultaat betekent dan ook niet per definitie dat er een hoog risico op MIC aanwezig is. Zelfs als het ATP afkomstig is van micro-organismen, dan is nog niet gesteld dat deze betrokken zijn bij MIC. Tevens resulteert de ATP meting op veldmonsters niet altijd in representatieve resultaten. Dit kan zeker gesteld worden als de gekozen catp meting niet geschikt is voor het type monstermateriaal. Zo zijn er bijvoorbeeld voor water monsters andere protocollen beschikbaar dan voor brandstof monsters. De keuze voor het juiste protocol dient dan ook altijd zorgvuldig gekozen te worden. Moleculair (QPCR) Naast ATP metingen kan ook gekozen worden voor moleculaire analysetechnieken om microorganismen aan te tonen. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van het genetisch materiaal van de organismen. De genetische blauwdruk van organismen is aanwezig in de vorm van DNA. Bij actieve cellen wordt het DNA afgelezen en omgezet naar RNA welke nodig is voor de daadwerkelijke functionele omzettingen. Door te screenen op specifieke DNA patronen kunnen groepen micro-organismen, unieke soorten of functionele eigenschappen kwantitatief worden bepaald middels de Q-PCR methodiek (zie bijlage 3). Indien dit wordt uitgevoerd op het RNA, dan kan tevens een uitspraak worden gedaan over de activiteit van het desbetreffende microorganisme of functionele eigenschap. De moleculaire methode kent echter ook nadelen, zo is de analyse complex welke een nadelig effect heeft op de analyseprijs. Daarnaast kan de analyse enkel uitgevoerd worden op basis van de informatie welke bekend is in de literatuur. DNA patronen die nog niet onderzocht zijn worden zodoende gemist. De voordelen van de analyse zijn echter groot, zo worden monsters geconserveerd waardoor ze tot drie maanden na bemonstering nog nauwkeurig geanalyseerd kunnen worden. Daarnaast wijst de analyse ook in de praktijk uit dat de resultaten betrouwbaar en reproduceerbaar zijn. Tevens kunnen resultaten snel gerapporteerd worden, binnen twee werkdagen is mogelijk. Vanwege de grote voordelen van deze techniek maakt MA voornamelijk gebruik van moleculaire detectie voor het vaststellen van MIC of de risico s hierop. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

9 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Hypothese Voor het beschreven onderzoek is een hypothese geformuleerd welke beantwoord dient te worden middels het uit te voeren onderzoek. De hypothese luidt als volgt: een catp bepaling kan dienen als een eerste snelle screeningmethode voor de eventuele aanwezigheid van MIC in een opslagtank. De uitkomsten van dit onderzoek zullen de hypothese bekrachtigen of verwerpen Plan van aanpak Jaarlijkse inspectie Bij de jaarlijkse inspecties worden de tanks niet visueel beoordeeld op interne corrosie, maar aan de hand van vloeistof bepalingen uit de tanks. Met behulp van een monsterdief worden op het laagste punt (normaal gesproken segment 1) een vloeistofmonster genomen. Het is dan ook van belang dat een betrouwbare analyse kan worden uitgevoerd op de vloeistoffase uit de tank waarmee een MIC risico-inschatting gedaan kan worden. De vraag is of een catp meting kan leiden tot een dergelijke betrouwbare uitspraak. Echter zijn de voordelen van een catp meting, de snelle analysetijd en lage kosten, dusdanig groot dat moet worden onderzocht of SIKB protocol 6802 geschikt is voor een MIC risicobeoordeling of dat er aanpassingen vereist zijn waarna SIKB protocol 6802 wel geschikt is voor een risicobeoordeling. Aan de hand van de beoordeling kan worden geadviseerd of vervolgonderzoek naar MIC wel of niet is aan te bevelen. Een vervolgonderzoek naar MIC kan plaatsvinden middels moleculaire en chemische analyses. De wijze waarop dergelijke moleculaire analyses uitgevoerd dienen te worden, in combinatie met chemische parameters, is een beproefde methode. Het plan van aanpak voorziet dan ook met name in de behoefte om catp metingen te linken aan moleculaire analyses ter risicobeoordeling van MIC. Getracht wordt om een relatie te vinden tussen beide analysetechnieken waarbij de focus ligt op een primaire risicobeoordeling middels catp volgens een aangepast SIKB protocol Voorzien wordt dat het SIKB protocol 6802 aangescherpt dient te worden op de analysemethode, maar tevens ook op de bemonsteringsmethode. De huidige bemonsteringsmethode voorziet nog niet in het voorkomen van potentiële gevaren van crosscontaminatie. Dit is een belangrijk aspect aangezien ten alle tijden voorkomen dient te worden dat onbesmette tanks een microbiële besmetting oplopen via het gereedschap dat wordt gebruikt bij de inspecties Vijftienjaarlijkse inspectie Tevens voorziet het plan van aanpak in het beoordelen van interne corrosieplekken die visueel duiden op MIC tijdens vijftienjaarlijkse inspecties (ook wel herkeuring genoemd). Tijdens deze vijftienjaarlijkse inspecties worden tanks geleegd en gereinigd (cleaning) waarna een inspecteur de tank betreedt en visueel beoordeelt op corrosiedefecten. In deze studie zullen vlak voor de vijftienjaarlijkse inspectie, monsters van het tank oppervlakte, of als dat niet mogelijk is van het aanwezige slib genomen worden. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

10 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Indien er geen aanwijzing is om een ander monster te nemen zullen deze monsters ook uit segment 1 worden genomen. Dit om zoveel mogelijk vergelijkbaar materiaal te hebben tussen de jaarlijkse en vijftienjaarlijkse inspectie monster. Op de verzamelde monsters zal een QPCR-MIC pakket worden uitgevoerd om het MIC risico aan het oppervlakte van de tank te bepalen. Dit zal naast aanvullende informatie worden gelegd om te kijken of er aanwijzingen zijn voor corrosiedefecten veroorzaakt of beïnvloed door micro-organismen (vanwege typerende corrosie producten, putcorrosie, tunnelvorming of neerslagen). Ook zal hierbij het uiteindelijke keuringsresultaat worden mee genomen. Door de catp en moleculaire analyses uit te voeren op tanks waarbij zowel de jaarlijkse inspecties (water of brandstof analyses) als de vijftienjaarlijkse inspecties (interne tankinspecties) direct na elkaar worden uitgevoerd, kan tevens de beoordeling van het MIC risico worden vergeleken met de daadwerkelijke situatie (wel of geen visueel optredende MIC) Biocide Microbiologische groei wordt geremd door toevoeging van biocides. Wanneer er biologische vervuiling van de brandstof wordt vermoed kunnen op verschillende momenten in de keten (bijvoorbeeld bij transport tanks, opslagtanks of in pijpleidingen) biocides gedoceerd worden. De dosering van biocides is echter niet gecontroleerd. In het huidige onderzoek is zoveel mogelijk uitgegaan van tanks waaraan geen biocide is toegevoegd. Deze informatie is echter zeer beperkt beschikbaar en kan daarom niet worden uitgesloten Coating Nieuw geïnstalleerde tanks en tanks die matige interne corrosie laten zien (tussen 33% en 50% wanddikteafname) worden intern gecoat om verdere schade door corrosie te voorkomen. Een degelijke, niet beschadigde coating van biologisch resistent materiaal (bijvoorbeeld Epoxy) is een goede barrière tegen corrosie en ook MIC. Het merendeel van de ondergrondse tanks is echter nog steeds ongecoat. De ongecoate tanks vormen hierdoor het hoogste MIC risico profiel. Er moet wel worden opgemerkt dat kleine scheurtjes in een coating wel weer MIC kunnen toelaten. In het huidige onderzoek is gekeken naar ongecoate tanks. De gecoate tanks, en inspectie procedures daarvoor, zijn buiten beschouwing gelaten Opmerking MA heeft de moleculaire kwantitatieve analyses uitgevoerd op micro-organismen en/of microbiële eigenschappen betrokken bij het MIC proces, bestaande uit: totale microbiële populatie (bacteriën en archaea); de microbiële groep ijzeroxiderende bacteriën (Gallionella spp.); de microbiële groep ijzerreducerende bacteriën (Geobacter spp.); een gen specifiek voor sulfaatreductie: sulphite reductase; een gen specifiek voor zwaveloxidatie: thiosulphate oxygenase; een gen specifiek voor de zwavelcyclus: adenylyl sulphite reductase; een gen specifiek voor methanogenese: methyl coenzyme M reductase. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

11 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L De catp bepaling is uitgevoerd door zowel MA als SGS middels een methode die geschikt is voor brandstof monsters uit brandstoftanks. Hiermee kan bepaald worden of er verschillen zichtbaar zijn tussen verschillende meetlaboratoria. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

12 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Resultaten 3.1. Uitgangssituatie De uitgangssituatie van dit onderzoek was om volgens de huidige bemonstering- en reinigingmethode van de opslagtanks de monsters te nemen. Er is in dit onderzoek dan ook niet ingegrepen in de voorgeschreven wijze van bemonstering of reiniging. Voorafgaand aan dit onderzoek was niet te voorspellen welke opslagtanks waterbezinksel zouden bevatten of enkel diesel. Tevens was er niet bekend wat men zou aantreffen bij de vijftienjaarlijkse inspectie Bemonstering Bemonstering is uitgevoerd bij acht ondergrondse, ongecoate, diesel tanks. De jaarlijkse inspectie monsters zijn steeds niet meer dan 27 dagen voor de vijftienjaarlijkse inspectie genomen. De jaarlijkse monsters zijn door MA zelf genomen, de monsters bij de vijftienjaarlijkse inspectie zijn door de inspecteur of cleaner genomen. In onderstaande tabel (tabel 1) is een overzicht gegeven van type te nemen monsters. Bij de jaarlijkse inspectie zijn telkens vloeistofmonsters genomen met een monsterdief en bij de vijftienjaarlijkse inspectie zijn slib en/of swab monsters genomen met het MA bemonsteringmateriaal (volgens bijlage 5). Swab monsters zijn alleen genomen als het oppervlakte van de tank na leegpompen goed te bereiken was, zonder aanwezigheid van een te dikke sliblaag. Tabel 1: Te nemen monsters per tank Inspectie moment Analyse Type monster Jaarlijks Jaarlijks Jaarlijks Jaarlijks 15 jaarlijks Keuring Keuring Foto, Goed(+), ATP 24h ATP 24h ATP ter plekke QPCR QPCR indien Actie nodig(+-), MA SGS mogelijk Afgekeurd (-) vloeistof vloeistof vloeistof vloeistof Slib of swab Vanwege de grote hoeveelheid slib in de tanks was het in geen van de gevallen mogelijk om monsters van corrosieproducten te nemen voor het beoordelen van de samenstelling ervan, daarom zijn deze monster types ook uit deze tabel gelaten. Daarnaast konden er geen monsters genomen worden voor nutriënten bepalingen vanwege het ontbreken van een waterfase Monsters en monster punten In geen van de geïnspecteerde tanks is water aangetroffen met bemonstering middels de monsterdief. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

13 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Vandaar dat er bij de jaarlijkse controle diesel monsters genomen zijn, gebruikmakend van een monsterdief (monstercode 001 t/m 008). Op de genomen monsters zijn catp en QPCR metingen verricht. De monsters tijdens de vijftienjaarlijkse inspectie zijn de dag voor de herkeuringsdatum genomen. Hiervan is steeds het monster uit tank segment 1 gebruikt en in de meeste gevallen is een slib monster genomen voor cleanen. In het geval van Nieuwegein tank 2 was het niet mogelijk om voorafgaande aan de cleaning een monster te nemen. Vandaar dat van deze locatie geen slib monster aanwezig is, maar in plaats daarvan is een oppervlakte swab genomen van het metaal (na cleanen). Voor de locaties Culemborg en Enschede is er naast een slib monster ook een swab monster genomen. Het swab monster van Enschede is na cleaning genomen en het swab monster van Culemborg voor cleaning. De volgende monsters zijn genomen of ontvangen in de periode maart/april 2016: Tabel 2: verzamelde monsters Monstercode Monsternaam Datum bemonstering Monstertype Opmerkingen 001 Enschede 1 maart 2016 Diesel Tank was bijna leeg 002 Culemborg 1 maart 2016 Diesel 2x per week bijgevuld 003 Nieuwegein tank 3 1 maart 2016 Diesel Goed volle tank 004 Nieuwegein tank 2 1 maart 2016 Diesel Goed volle tank 005 Lemmer 3 maart 2016 Diesel Tank werd bijgevuld vlak voor monstername 006 Opeinde 3 maart 2016 Diesel Vlaardingen 12 april 2016 Diesel Tank was leeg, van de bodem nog wat diesel kunnen krijgen 008 Rotterdam 12 april 2016 Diesel Tank wordt wekelijks bijgevuld jaarlijks Opeinde 30 maart 2016 Slib jaarlijks Lemmer 8 maart 2016 Slib jaarlijks Nieuwegein tank 2 17 maart 2016 Swab Na cleaning, geen slib aanwezig jaarlijks Nieuwegein tank 3 14 maart 2016 Slib jaarlijks Culemborg 15 maart 2016 Slib jaarlijks Culemborg swab 15 maart 2016 Swab Voor cleaning jaarlijks Enschede 3 maart 2016 Slib Tank op tegenschot jaarlijks Enschede swab 3 maart 2016 Swab Na cleaning jaarlijks Rotterdam 19 april 2016 Slib jaarlijks Vlaardingen 19 april 2016 Slib Tank bleek toch deels gecoat te zijn B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

14 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Resultaten catp De catp meting is uitgevoerd op de monsters van de jaarlijkse inspectie. Voor de catp bepaling is een protocol gebruikt wat specifiek is voor brandstof monsters. catp is voor ieder monster drie keer gemeten: direct na monstername in het veld, 24 uur na monstername in het lab van MA en binnen 24 uur in het lab van SGS. Hoe hoger de catp waarde hoe meer biologische activiteit er wordt verwacht. Van de tank in Vlaardingen kon geen catp meting worden uitgevoerd, omdat de tank bijna leeg was aangetroffen en er niet genoeg monster genomen kon worden om catp en QPCR te meten. Er is hierbij gekozen om alleen QPCR uit te voeren. Tabel 3: Resultaten catp metingen Locatie tank catp MA catp SGS Directe meting in veld 24 uurs meting 24 uurs meting Enschede (pg/ml) 384,6 206,3 230 Culemborg (pg/ml) 13,6 7,0 6,7 Nieuwegein tank 3 (pg/ml) 3,2 3,5 <5,0 Nieuwegein tank 2 (pg/ml) 9,2 4,9 <5,0 Lemmer (pg/ml) 3,0 1,3 <5,0 Opeinde (pg/ml) 8,3 8,0 14 Vlaardingen (pg/ml) Niet uitgevoerd Niet uitgevoerd Niet uitgevoerd Rotterdam (pg/ml) 39,0 12,0 <5,0 Pg = picogram Zoals hierbij te zien is, is er een verschil tussen de catp meting in het veld en in het lab, maar dit verschil lijkt een structurele afname van de hoeveelheid gedetecteerde catp. Alleen in de gevallen dat catp al heel laag is (<5 pg/ml) zijn de verschillen groter. Relatie tussen catp MA en catp SGS De metingen van MA na 24 uur en van SGS binnen 24 uur lijken vergelijkbaar. Uit validatie van de gebruikte meetmethode wordt door SGS een meetonzekerheid van 25% geaccepteerd. Dit betekent dat twee meetwaarden als vergelijkbaar kunnen worden beschouwd wanneer er niet meer dan 25% afwijking is. Wanneer we de metingen van SGS en MA vergelijken, zien we dat de meeste metingen binnen deze meetonzekerheid blijven. Echter Opeinde en Rotterdam hebben een grotere meetonzekerheid (zie hiervoor ook hoofdstuk 4.2 Suggesties voor vervolgonderzoek, punt 4). Over het algemeen lijken de metingen van SGS iets hoger uit te vallen dan de metingen van MA. Dit zou te wijten kunnen zijn aan het exacte moment van meten (MA exact op 24 uur na bemonstering en SGS binnen 24 uur, waarschijnlijk eerder dan 24 uur). B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

15 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Resultaten QPCR De QPCR metingen laten zien dat er in de diesel monsters (jaarlijkse inspectie) relatief weinig micro-organismen aanwezig zijn (10 1 tot 10 2 bacteriën per milliliter), met uitzondering van de monsters van Vlissingen en Rotterdam (10 6 bacteriën per milliliter). Daarnaast worden er in de slib monsters bij de vijftienjaarlijkse inspectie relatief veel micro-organismen gemeten (10 5 tot 10 7 bacteriën per milliliter). Voor het aantonen van MIC of de risico s op MIC wordt gebruik gemaakt van specifieke genetische markers voor sulfaatreductie, zwavelcyclus en methanogenese. Deze markers zijn niet aangetroffen op de geselecteerde locaties. Ook de ijzeroxideerders (Gallionella) en de ijzerreduceerders (Geobacter) zijn niet of nauwelijks aangetroffen. Wel zijn de zwaveloxiderende bacteriën aangetroffen in alle geselecteerde tanks. Deze zijn in Vlaardingen en Rotterdam aangetroffen in de diesel en op de overige locaties in het slib. De volledige resultaten van de qpcr worden weergegeven in tabel 4. Zwaveloxiderende bacteriën gebruiken sulfide (S 2- ) of zwavel (S0) als bron van energie en produceren daarbij sulfaat (SO4 2- ). Deze groep micro-organismen beïnvloedt het corrosieproces direct door productie van zwavelzuur (H2SO4). Zij zijn daarmee in staat te overleven in een zuur milieu. Vanwege dit zure milieu raakt het metaal sneller in oplossing waardoor het corrosieproces wordt versneld. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

16 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Tabel 4: Resultaten QPCR Monsternaam Monster Totaal Totaal IJzer- IJzer- Sulfaat- Zwavel- Methano- Zwavel-cyclus specifieke detectielimiet Bacteriën Archaea oxiderende bacteriën (Gallionella reducerende bacteriën (Geobacter reductie oxidatie genese spp.) spp.) Cellen Cellen Cellen Cellen DNA-kopieën DNA-kopieën DNA-kopieën DNA-kopieën Enschede (N/ml) 3,8x10 1 5,5x10 1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Enschede 15 jaarlijks (N/g) 7,9x10 2 5,7x10 6 3,0x10 3 n.a. n.a. n.a. 1,8x10 3 n.a. n.a. Enschede 15 jaarlijks (N/swab) 9,5x10 2 1,2x10 7 n.a. n.a. + n.a. 4,3x10 3 n.a. n.a. Culemborg (N/ml) 1,0x10 1 3,9x10 1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Culemborg 15 jaarlijks (N/g) 5,4x10 2 1,7x10 6 n.a. n.a. n.a. n.a. 4,4x10 3 n.a. n.a. Culemborg 15 jaarlijks (N/swab) 1,3x10 3 9,1x10 6 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Nieuwegein tank 3 (N/ml) 6,3x10 0 2,4x10 2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Nieuwegein tank 3 15 jaarlijks (N/g) 5,1x10 2 3,8x10 7 2,7x10 3 n.a. n.a. n.a. 4,3x10 3 n.a. n.a. Nieuwegein tank 2 (N/ml) 6,3x10 0 1,1x10 2 6,5x10 0 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Nieuwegein tank 2 15 jaarlijks (N/swab) 9,5x10 2 3,9x10 6 n.a. n.a. n.a. n.a. 1,9x10 3 n.a. n.a. Lemmer (N/ml) 1,3x10 1 6,3x10 1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Lemmer 15 jaarlijks (N/g) 1,7x10 3 8,6x10 6 4,7x10 3 n.a. n.a. n.a. 1,7x10 4 n.a. n.a. Opeinde (N/ml) 1,0x10 1 2,1x10 2 n.a. n.a. + n.a. n.a. n.a. n.a. Opeinde 15 jaarlijks (N/g) 7,0x10 3 9,2x10 6 1,7x10 4 n.a. n.a. n.a. 8,7x10 3 n.a. n.a. Vlaardingen (N/ml) 1,0x10 1 1,1x10 6 1,3x10 2 n.a. n.a. n.a. 3,0x10 2 n.a. + Vlaardingen 15 jaarlijks (N/g) 6,6x10 2 4,3x10 5 n.a. n.a. 8,9x10 2 n.a. n.a. n.a. n.a. Rotterdam (N/ml) 1,0x10 1 1,4x10 6 4,6x10 1 n.a. n.a. n.a. 2,7x10 2 n.a. n.a. Rotterdam 15 jaarlijks (N/g) 3,6x10 3 1,4x10 7 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

17 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Beperkingen Aangezien de huidige studie is ingepast in de standaard keurings- en reinigingsprocedures was het in geen van de tanks mogelijk om monsters van de corrosieproducten te nemen, aangezien de aanwezige slib voorafgaand daaraan verwijderd moest worden. De verwijdering van slib gaat middels cleaning, waardoor tevens de eventueel aanwezige corrosieproducten weggespoeld worden. Ook was het in geen van de tanks mogelijk om chemische analyses (zoals nitraat, ammonium, ortho-fosfaat) uit te voeren. De reden hiervoor was dat deze analyses alleen op water uitgevoerd kunnen worden en er geen waterfase in de tanks aangetroffen is. Het is bekend dat er door bijmengen van biodiesel steeds minder vaak vrij water wordt aangetroffen, maar dat er in geen van de acht tanks water is aangetroffen was niet de verwachting. Dit heeft tot gevolg dat er twee lijnen van bewijsvoering missen om vast te stellen of er sprake is (geweest) van MIC in de aangetroffen corrosieplekken in de tanks. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

18 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Interpretatie resultaten 4.1. Interpretatie ATP metingen In het huidige SIKB protocol 6802 zijn de criteria voor beoordeling van de meetresultaten voor catp metingen als volgt: Tabel 5: SIKB criteria beoordeling catp meting catp waarde Conclusie microbiële verontreiniging Risico op dichtslaan filters 0 t/m 10 pg/ml Verwaarloosbaar Geen 11 t/m 100 pg/ml Licht verontreinigd Beperkt > 100 pg/ml Zwaar verontreinigd Verhoogd Deze criteria zijn gebaseerd op een catp meting binnen 24 uur. Op basis van deze criteria kunnen we onze meetresultaten ook rangschikken in de categorieën hoog, middel en laag, zie de samenvatting van de resultaten in tabel 7 onder paragraaf 3.5. Op basis van deze criteria kunnen we concluderen dat in alle tanks, behalve Enschede en Rotterdam, lage hoeveelheid catp en dus lage microbiële verontreiniging hadden. Rotterdam zat daarbij net boven de grens van 10 pg/ml voor de metingen van MA en eronder bij de metingen van SGS. Bij het monster van Enschede moet worden opgemerkt dat het monster er heel troebel uitzag en dit mogelijk de c ATP meting heeft kunnen verstoren Interpretatie QPCR metingen De QPCR metingen laten zien dat er in de diesel monsters (jaarlijkse inspectie) relatief weinig micro-organismen aanwezig waren en naast totaal bacteriën geen andere MIC gerelateerde processen (met uitzondering van de monsters van Vlissingen en Rotterdam). Daarom is voor de ze monsters het MIC risico laag. Voor Vlissingen en Rotterdam geeft het hoge aantal aanwezige micro-organismen, in combinatie met het aantreffen van zwaveloxiderende bacteriën, een middelmatig risico op MIC. Hierbij moet worden opgemerkt dat dit alleen iets zegt over het MIC risico in de brandstof, dit hoeft niet gerelateerd te zijn aan wat er aan de tankwand gaande is. In de slib en swab monsters, genomen tijdens de vijftienjaarlijkse inspectie, zijn relatief veel microorganismen aangetroffen. Daarnaast is in de slib monsters in de meeste gevallen de marker voor zwavel oxidatie aangetroffen. Biologische zwaveloxidatie is een van de processen die bij MIC betrokken is. Dit is echter in relatief lage hoeveelheden aangetroffen. Daarom is het MIC risico in deze monsters middelmatig. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

19 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Alleen in het monster van Rotterdam en Vlissingen is zwaveloxidatie niet aangetroffen. In Rotterdam wordt het MIC risico van het slib daarom ook laag ingeschat. In Vlissingen is geen zwavel oxidatie aangetroffen, maar wel ijzerreducerende soorten. Biologische ijzerreductie beïnvloed direct het corrosieproces maar ook deze bacteriën zijn niet in hele hoge hoeveelheden aangetroffen, vandaar dat het risico op MIC hier ook middelmatig is Inspectie De inspectie op wand aantasting van de tanks is uitgevoerd na cleanen. De wanddikte afname en putcorrosie diepte wordt gemeten met behulp van een putdiepte meter. Voor deze metingen wordt aangehouden dat de tank wordt goedgekeurd als er minder dan 33% wanddikte afname is. Als de wanddikte afname tussen de 33 en 50% ligt moet er actie worden ondernomen (bijvoorbeeld coaten) en als de wanddikte afname meer dan 50% is wordt de tank afgekeurd. Foto s van de tank oppervlaktes kunnen gebruikt worden voor extra beoordeling of de type corrosie die is aangetroffen op MIC aantasting lijkt. Het nemen van foto s in de tank is alleen gelukt voor de tanks in Nieuwegein en in Enschede (zie bijlage 4), daarom kon deze informatie verder niet worden verwerkt in de conclusies. Tabel 6: Keuringsresultaten tanks Tank locatie (monsters) Keuringsresultaat Minimale wanddikte (mm) Maximale putcorrosie (mm) Enschede (001/ 015/ 016) Goedgekeurd Culemborg (002/ 013/ 014) Matige corrosie: coaten Nieuwegein tank 3 (003/ 012) Afgekeurd Nieuwegein tank 2 (004/ 011) Afgekeurd Lemmer (005/ 010) Matige corrosie Opeinde (006/ 009) Afgekeurd Vlaardingen (007/ 018) Goedgekeurd Rotterdam (008/ 017) Goedgekeurd B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

20 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Samenvatting resultaten Tabel 7: Interpretatie resultaten MIC risico Interpretatie resultaten MIC risico Locatie (monsters) ATP QPCR jaarlijks QPCR 15 jaarlijks Schade (Maximale putcorrosie (mm) Enschede (001/ 015/ 016) Hoog Laag Middel 3,4 Culemborg (002/ 013/ 014) Laag Laag Middel 1,2 Nieuwegein tank 3 (003/ 012) Laag Laag Middel 5,2 Nieuwegein tank 2 (004/ 011) Laag Laag Middel 3,1 Lemmer (005/ 010) Laag Laag Middel 2,1 Opeinde (006/ 009) Laag Laag Middel 2,9 Vlaardingen (007/ 018) Niet uitgevoerd Middel Middel 0 Rotterdam (008/ 017) Middel Middel Laag 1,8 Nb 1. Voor ATP meting is de 24 uur meting genomen. Grenswaarden (in pg/ml) zoals in SIKB protocol 6802: hoog > 100; middel >10 <100; laag <10 Nb 2. Voor QPCR heeft een MA expert de meetresultaten geïnterpreteerd om tot een MIC risico (hoog, middel of laag te komen). Deze risico inschatting gaat over het MIC risico in het specifieke sample, en niet over de relatie met het MIC risico aan de tank wand Conclusie De resultaten van het uitgevoerde onderzoek leiden tot de conclusie dat catp een prima methode lijkt om te screenen op de aanwezigheid van bacteriën. Voor een betrouwbaar resultaat dienen de analyses uitgevoerd te worden op schone/heldere monsters. De uitgevoerde catp metingen laten zien dat troebele monsters de uitkomst van catp verstoren, waardoor deze minder betrouwbaar zijn. Een catp meting op diesel geeft een risico inschatting van de microbiologische vervuiling van de brandstof en kan bij een te hoge waarde leiden tot een vervolgonderzoek, waarbij de screening op typerende MIC organismen meer informatie kan verschaffen over het risico op MIC. Echter dient de notitie gemaakt te worden dat er bij een analyse op de brandstof alleen een uitspraak gedaan kan worden gedaan over het risico op MIC vanuit de micro-organismen in de vloeistoffase op dat moment. Er lijkt een dusdanige setteling te zijn van de MIC organismen op de bodem dat deze niet worden afgevangen middels een monsternamedief in de vloeistof. Een jaarlijkse analyse van slib van de bodem kan leiden tot een betrouwbaardere analyse ten aanzien van MIC, er wordt voorzien dat catp ook hierin een screeningfunctie kan vervullen. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

21 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Discussie Omdat het niet mogelijk was om nutriëntenbepalingen te verrichten of om de corrosieproducten te laten analyseren bij de vijftienjaarlijkse inspecties, mist er cruciale bewijsvoering dat de aangetroffen corrosieplekken primair te wijten zijn aan MIC. De conclusie die wel getrokken kan worden is dat er, met uitzondering van Rotterdam, in alle tanks een middelmatige potentie is voor het aanwezig zijn van MIC processen. In de proefopzet die hier is gebruikt is niet getest of er ook crosscontaminatie gevolgen zijn van de ene tank naar de andere tank door gebruik van eenzelfde, niet schoongemaakte monsterdief bij verschillende tanks. De metingen zoals hier uitgevoerd zijn altijd een moment opname, hiermee kan wel een risico inschatting worden gedaan voor de situatie op het moment van meten. Risico uitsluiten is echter niet mogelijk met de meetmethodes zoals hier toegepast. Daarnaast moet worden opgemerkt dat biocide gebruik een aanzienlijke invloed kan hebben op de resultaten van biologische metingen. Biocides worden ongecontroleerd toegepast in diesel en het is daarom niet mogelijk de effecten hiervan mee te nemen in de huidige methode van inspectie. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

22 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Aanbevelingen 5.1. Suggesties voor aanpassing protocol Monstername techniek De methodiek om diesel monsters via een monsternamedief te nemen, geeft inzicht in de microbiologische kwaliteit van de brandstof en kan gebruikt worden als screening voor het risico op MIC organismen in de brandstof. Contaminatie, waarbij micro-organismen van de ene locatie naar de andere worden getransporteerd, kan voorkomen worden middels een reinigingsmiddel tussen de bemonsteringen door (bijvoorbeeld spoelen met ethanol). Om een beter beeld te krijgen van het risico op MIC zou een bemonsteringtechniek gebruikt moeten worden die monsters direct van de tankwand kan nemen. Monsters dienen ook niet alleen genomen te worden als er visueel water aanwezig is. Ook in de diesel zelf kunnen hoge hoeveelheden micro-organismen aanwezig zijn vanwege de hoge mate waarin opgelost water in de diesel kan zijn catp meting of QPCR meting CATP lijkt een afdoende methode om een beeld te krijgen van de hoeveelheid microbiologische verontreiniging in dieseltanks. Hierbij moet wel vermeld worden dat er een catp methode gebruikt moet worden die geschikt is voor brandstoffen. Indien de catp meting hoog is, wordt geadviseerd om middels bijvoorbeeld QPCR te bepalen of er ook daadwerkelijk een risico voor MIC is. Hieronder volgen een aantal aanwijzingen voor de catp meting: Binnen 24 uur na bemonstering (laten) uitvoeren. Kiezen voor een catp meting die geschikt is voor brandstoffen. Altijd een catp meting, niet alleen bij visueel aanwezig water. De huidige interpretatiewaarde voor catp is bruikbaar catp grenswaarden catp metingen kunnen direct in het veld of binnen 24 uur in een lab worden uitgevoerd. Hier zit echter wel een verschil tussen. Hiervoor zou een omreken factor bepaald moeten worden door deze metingen herhaaldelijk te vergelijken. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

23 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Aanpassingen protocol 6802 Om het protocol 6802 geschikt te maken voor inschatting van het MIC risico in brandstof tanks, zijn aanpassingen of een aanvullend hoofdstuk nodig. Het huidige protocol is niet geschikt om een MIC risico inschatting te maken. Voor MIC risico inschatting is het nodig om: 1. Een monstername techniek te ontwikkelen die zonder de tank te betreden oppervlakte monsters uit de tank kan nemen. 2. In deze monsters kan catp dan gebruikt worden als screening voor de aanwezigheid van totaal bacteriën. Indien catp hoog is moet er middels QPCR blijken of er daadwerkelijk een verhoogd risico op MIC is. 3. Tijdens de 15 jaarlijkse controle is het raadzaam om altijd, voor cleaning, monsters te nemen voor biologische analyse. Als catp daarin hoog is, wordt geadviseerd QPCR te doen op MIC micro-organismen. MIC kan veel sneller verlopen dan reguliere corrosie en in het geval dat er een hoog risico is, zijn voorkomende maatregelen raadzaam. Aangezien er geen bestaand protocol is voor een alternatieve monstername techniek ten opzichtte van de monsterdief, zullen de mogelijkheden hiervoor eerst onderzocht moeten worden voordat dit opgenomen kan worden in het huidige protocol (zie ook paragraaf 4.2 Suggesties voor vervolgonderzoek). In het huidige protocol zou al wel opgenomen kunnen worden dat de huidige catp metingen niet geschikt zijn om een risico op MIC te bepalen en dat het raadzaam is om tijdens de 15 jaarlijkse inspectie voor cleanen, een monster te nemen van het oppervlakte van de tank of eventueel het aanwezige slib en dit te analyseren op catp en wanneer dit hoog uitva lt ook middels QPCR om een inschatting te maken van het MIC risico aan het oppervlak van de tank Suggesties voor vervolgonderzoek Vervolgonderzoek met betrekking tot SIKB protocol 6802 Om het SIKB protocol aan te passen worden er, naar aanleiding van deze studie, nog een aantal vervolgstappen en eventueel studies aangeraden. Hieronder doen wij enkele suggesties voor deze vervolgstappen: 1. Onderzoeken van mogelijke bemonsteringtechnieken voor slib- of oppervlaktemonsters zonder toetreden van de tank. Uit het uitgevoerde onderzoek is gebleken dat bemonstering middels de monsterdief geen geschikte methode is om een inschatting te maken van het MIC risico. Een mogelijk alternatief is het gebruik van een pomp om slib op te pompen. Wellicht zijn er ook andere opties beschikbaar. Dit zal onderzocht moeten worden. 2. catp protocol voor slibmonsters valideren. Verwacht wordt dat catp ook een bruikbare methode is om een pre-screening te doen op de aanwezigheid van micro-organismen in slib. Dit zal echter getest moeten worden. 3. catp afname in de tijd testen voor een verschilbepaling tussen de catp metingen in het veld of in het lab. De huidige catp grenswaarden zijn gebaseerd op een eerder onderzoek en op metingen binnen 24 uur. Wanneer metingen in het veld worden uitgevoerd vallen catp metingen hoger uit waardoor aangepaste grenswaarden gehanteerd dienen te worden. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

24 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Dit kan bepaald worden middels herhaaldelijke metingen te verrichten waaruit een omrekenfactor kan worden bepaalt. 4. Eén van de conclusies is dat de catp metingen van SGS en MA voor dit onderzoek in dezelfde range lagen. De maximale toegestane afwijking van een catp meting is door SGS bepaald op 25%. Het merendeel van de metingen lag binnen deze range waarbij opgemerkt dient te worden dat deze studie een beperkte steekproef omvatte. Een uitgebreider onderzoek en structurele vergelijking van catp metingen in verschillende laboratoria kan duidelijkheid bieden of er inderdaad geen verschil is tussen de catp metingen gedaan door de verschillende laboratoria. 5. Protocol aanpassen ter voorkoming van crosscontaminatie (verspreiden) van MIC organismen door herhaaldelijk gebruik van niet schoon bemonsteringmateriaal (bijv. monsterdief). Of crosscontaminatie daadwerkelijk een probleem is, is niet getest maar wordt wel verwacht. Afhankelijk van de uiteindelijke bemonsteringmethode zal onderzocht moeten worden wat de beste methode is (haalbaarheid en effectiviteit) ter voorkoming van crosscontaminatie. 6. Op dit moment worden tanks één keer per jaar gecontroleerd op aanwezigheid van water onderin de tank en één keer per vijftien jaar gekeurd. Met betrekken tot MIC rijst de vraag of deze termijnen veilig genoeg zijn. MIC kan veel sneller verlopen dan reguliere corrosie en veroorzaakt vaak putcorrosie die zeer lokaal voor defecten zorgen. Het is daarom aan te bevelen om uit te zoeken wat een geschikte termijn is voor de verschillende controles en keuringen Vervolgonderzoek algemeen Uit de discussies binnen de begeleidingscommissie MIC zijn er verschillende onderwerpen naar voren gekomen waaruit blijkt dat de huidige methode van keuring, sinds de verplichtte vermenging van biodiesel, niet afdoende is om een goed beeld te krijgen van de risico s op schade aan ondergrondse brandstof tanks en daarmee het voorkomen van tankdoorbraken en bodemverontreinigende gevolgen. Het algemene beeld van de begeleidingscommissie MIC is dat er wordt gevreesd voor dergelijke problematiek in de nabije toekomst. Om dit voor te zijn worden onderstaande vervolgonderzoeken aangeraden: 1. Nieuwe methode ontwikkelen voor aantonen schadebeeld. Het huidige keuringsmethode (SIKB protocol 6802) gaat ervan uit dat een jaarlijkse controle op de aanwezigheid van water (water-sludge controle) onderin de tank een representatief beeld geeft van de corrosie staat in de tank. In de gevallen waar biodiesel wordt vergemengd wordt echter steeds minder vaak vrij water aangetroffen. Water wordt niet als aparte fase gemeten maar is dan wel als gebonden water aanwezig waardoor weldegelijk corrosie kan worden veroorzaakt. Gebonden water bevindt zich niet alleen op het laagste punt, maar meer verdeeld over het onderste gedeelde van de brandstof. Daardoor wordt aan de zijwanden ook steeds meer corrosie aangetroffen. Omdat deze huidige water-sludge controle niet meer afdoende is, wordt aangeraden een nieuwe methode te ontwikkelen voor de keuring van ondergrondse brandstof tanks. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

25 V E R B E T E R I N G S I K B P R O T O C O L Schadebeeld beter documenteren. Op het moment zijn de schadebeelden die worden aangetroffen in ondergrondse brandstof tanks niet goed gedocumenteerd. De tank eigenaar krijgt een rapport van het schadebeeld maar dit wordt niet bijgehouden in bijvoorbeeld een landelijke database van de status en schadebeelden over de tijd. Er heerst de indruk onder tankinspecteurs dat het schadebeeld steeds erger en minder voorspelbaar wordt en dat er steeds vaker kleinere, diepe puts worden aangetroffen, maar voor deze heersende indruk is geen concreet bewijs. Het verzamelen van alle schadebeelden van de verschillende inspectiebureaus kan hiervan een overzicht geven. In de toekomst zou het in ieder geval goed zijn de schadebeelden in een database vast te leggen. 3. Naast de heersende indruk dat er toename is in de corrosievorming, lijkt deze corrosie ook vaker dan voorheen MIC gerelateerd te zijn. Hiervoor is echter geen harde bewijsvoering aanwezig. Om goed te kunnen onderzoeken of er daadwerkelijk veelvuldig MIC plaatsvindt of heeft gevonden, is het nuttig om opgegraven tanks die buiten gebruik zijn genomen te onderzoeken om vast te stellen of MIC daadwerkelijk de (mede)verantwoordelijk is van de schade. 4. In het huidige keuringsprotocol wordt geen rekening gehouden met het type brandstof in de tanks. De algemene indruk en verwachting is dat het type brandstof, en specifiek of hierbij biodiesel wordt vergemengd, zeer grote invloed heeft op de keuring die uitgevoerd zou moeten worden. Het is daarom van belang om dit mee te nemen in het vervolgonderzoek en de opstelling van een nieuw keuringsprotocol. 5. Zoals eerder al genoemd is de dosering van biocides op het moment niet gecontroleerd en geregistreerd. Aangezien dit een groot effect heeft op de meetmethodes die gebruikt worden om MIC risico te voorspellen, is het relevant om een systeem op te zetten waarbij biocide toevoeging geregistreerd gaat worden. 6. Het huidige protocol en bovenstaande suggesties zijn gericht op ongecoate tanks. Steeds meer tanks worden intern gecoat. Een degelijke, niet beschadigde coating kan een goede bescherming bieden tegen corrosie en MIC. Er is momenteel geen protocol om gecoate tanks te keuren. Het is bijvoorbeeld van belang om een beeld te hebben of er beschadigingen in de coating zijn. Bij beschadiging van een coating kan MIC weldegelijk grote schade veroorzaken. Het is daarom wenselijk een protocol op te stellen hoe er omgegaan dient te worden met gecoate tank. B I O C L E A R M I C R O B I A L A N A L Y S I S J U N I 2016 P R O J E C T C O D E /

26 Bijlage 1: SIKB protocol 6802

27 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon WBM-controle Controle op water/bezinksel/micro-organismen in onder- en/of bovengrondse tanks Protocol 6802 Vastgesteld door het Accreditatiecollege bodembescherming op 7 juni 2012 Versie 1.1 Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 1 van 12

28 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon Kenmerk SIKB-Officiële doc._s_12_51769 Status Het Accreditatiecollege Bodembescherming heeft op ingestemd met de inhoud van dit protocol. Vervolgens is het door het bestuur van SIKB is vastgesteld. Dit protocol treedt in werking op Eigendomsrecht Dit protocol is opgesteld in opdracht van en uitgegeven door de Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer (SIKB). Het Accreditatiecollege Bodembescherming, ondergebracht bij SIKB, beheert dit protocol inhoudelijk. De actuele versie van dit protocol staat op de website van SIKB ( en is op elektronische wijze tegen ongewenste aanpassingen beschermd. Het is niet toegestaan om wijzigingen aan te brengen in de originele en door het Accreditatiecollege Bodembescherming goedgekeurde en vastgestelde teksten met het doel hieraan rechten te (kunnen) ontlenen. Vrijwaring SIKB is behoudens in geval van opzet of grove schuld niet aansprakelijk voor schade die bij de accreditatie-instelling, het geaccrediteerde bedrijf of derden ontstaat door het toepassen van dit protocol en het gebruik van dit accreditatieschema. Copyright SIKB Overname van tekstdelen is toegestaan met bronvermelding. Alle rechten berusten bij SIKB. Bestelwijze Dit protocol is, evenals het bijbehorende accreditatieschema, in digitale vorm kosteloos te verkrijgen via de website van SIKB. Een ingebonden versie kunt u bestellen tegen kosten bij SIKB. Updateservice Door het Accreditatiecollege Bodembescherming vastgestelde mutaties in dit protocol zijn te verkrijgen bij SIKB. Via kunt u zich aanmelden voor automatische toezending van mutaties. U kunt daar ook verzoeken tot toezending per post van de gratis reguliere nieuwsbrief van SIKB: info@sikb.nl. Helpdesk/gebruiksaanwijzing Voor vragen over inhoud en toepassing kunt u terecht bij SIKB. Voor geschillen in het kader van beoordelingen zie de klachten- en geschillenregeling in de Beleidsregel Accreditatie, ook bekend onder de code RvA-BR002, te downloaden van Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 2 van 12

29 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon Inhoudsopgave 1. INLEIDING DOEL TOEPASSING PRINCIPE Water/bezinkselcontrole Controle op aanwezigheid micro-organismen PLAATS VAN HET PROTOCOL IN HET KWALITEITSSYSTEEM DEFINITIES TITELS VAN VERMELDE NORMEN, AANBEVELINGEN EN LITERATUUR AFKORTINGEN BESCHRIJVING VAN APPARATUUR EN HULPMIDDELEN APPARATUUR Algemeen Kritieke apparatuur Niet - kritieke apparatuur HULPMIDDELEN WERKWIJZE CONTROLE WATER / BEZINKSEL VOORBEREIDING VASTLEGGING GEGEVENS UITVOEREN VAN DE CONTROLE Controle op aanwezigheid van water Controle op aanwezigheid van bezinksel CRITERIA VOOR BEOORDELING VAN DE MEETRESULTATEN RAPPORTAGE WERKWIJZE CONTROLE OP MICROBIOLOGISCHE VERONTREINIGING ALGEMEEN VOORBEREIDING VASTLEGGING GEGEVENS UITVOEREN VAN DE CONTROLE CRITERIA VOOR BEOORDELING VAN DE MEETRESULTATEN RAPPORTAGE BIJLAGE 1 MONSTERNAME MET MONSTERDIEF Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 3 van 12

30 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon Inleiding 1.1 Doel Het vastleggen van regels en eisen die moeten worden gehanteerd bij de controle op de aanwezigheid van water/bezinksel/micro-organismen in onder- en/of bovengrondse tanks. 1.2 Toepassing Dit protocol is van toepassing bij de controle op de aanwezigheid van water/bezinksel/micro-organismen bij onder- en/of bovengrondse tank welke in het algemeen vallen onder de Wet Bodembescherming en de Wet Milieubeheer. 1.3 Principe Water/bezinkselcontrole De water/bezinkselcontrole is een niet destructieve onderzoeksmethode waarbij toestandsvoorspellende grootheden voor (inwendige) corrosie worden bepaald. Een water/bezinkselcontrole 1 omvat een monstername van product via de peilleiding(en) uit de tank alsmede het ter plaatse uitvoeren van een aantal metingen en waarnemingen op het genomen monster. Van eventueel aanwezig water moet de zuurgraad en de geleidbaarheid worden gemeten teneinde de corrosiviteit (agressiviteit) van het milieu te bepalen. Ten gevolge van de specifieke eigenschappen is op sommige producten een analyse op water/bezinksel 2 niet zinvol Controle op aanwezigheid micro-organismen De controle op micro-organismen is een niet destructieve onderzoeksmethode waarbij toestandsvoorspellende grootheden voor (inwendige) corrosie kan worden bepaald. Voor de detectie zijn verschillende methoden beschikbaar. In dit protocol is gekozen voor de catp-meting. Dit is namelijk een relatief snelle methode voor detectie. Eventuele vervolgonderzoeken vallen buiten de scope van dit protocol en zijn derhalve niet beschreven. Biobrandstoffen kunnen tot 400 keer meer water opnemen dan fossiele brandstoffen. Daarnaast bevat biobrandstof veelal micro-organismen. Door het mengen van biobrandstoffen met fossiele brandstoffen neemt de hoeveelheid water en micro-organismen in brandstoffen toe. Bij grote hoeveelheden micro-organismen kan een biofilm ontstaan, met grote gevolgen voor de aanwezige brandstof, de tank en het leidingwerk. Indien deze film zich hecht op de tankwand, kan dit leiden tot corrosie van de stalen wand. Indien de aanwezigheid van micro-organismen is vastgesteld, legt de inspecteur dit vast in het inspectierapport. 1 Toelichting: De resultaten van de water/bezinkselcontrole moeten jaarlijks worden gevolgd om een goede risico-inschatting te kunnen maken van de mate waarin (inwendige) corrosie van de wand plaatsvindt. In relatie tot de bepaling van de restlevensduur van een tank moet eventueel aanvullend onderzoek worden uitgevoerd naar de resterende wanddikte 2 Toelichting: Alleen tanks met producten met een relatieve dichtheid < 1 zonder wateroplossend vermogen komen in aanmerking voor een controle op de aanwezigheid van water/bezinksel. Tanks met producten met een relatieve dichtheid > 1 en/of een wateroplossend vermogen komen niet in aanmerking voor een controle op de aanwezigheid van water, deze tanks komen mogelijk in aanmerking voor een controle op bezinksel. Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 4 van 12

31 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon Plaats van het protocol in het kwaliteitssysteem De gebruiker (inspectie-instelling) van dit protocol is geaccrediteerd, of bevindt zich in het toelatingstraject tot accreditatie, voor AS SIKB 6800 en dit onderliggende protocol. AS SIKB 6800 regelt de wijze waarop kwaliteit wordt geborgd en de wijze waarop de eisen uit dit AS en dit protocol dienen te zijn verankerd in het kwaliteitssysteem van de geaccrediteerde instelling. Het is toegestaan dit protocol integraal als werkdocument op te nemen in het kwaliteitsen/ of milieuzorgsysteem van de geaccrediteerde instelling. 1.5 Definities catp-meting Biofilm Inspectie-instelling Micro-organismen bepaling van de graad van microbiologische verontreiniging grote, dichte concentratie van micro-organismen Rechtspersoon die door de Raad voor Accreditatie is geaccrediteerd, of zich in het toelatingstraject tot accreditatie begeeft, overeenkomstig NEN-EN-ISO/IEC Type A, waarmee wordt gewaarborgd dat de inspectie-instelling op generlei wijze een relatie heeft met het te controleren/keuren object om belangenverstrengeling in relatie tot de resultaten te voorkomen. kleinste levende wezen dat niet met het blote oog zichtbaar is, zoals bacteriën en schimmels. 1.6 Titels van vermelde normen, aanbevelingen en literatuur Bij het opstellen van dit protocol is gebruik gemaakt van de volgende normen, publicaties en afspraken: PGS 28 PGS 30 PGS 31 (concept) ASTM D7463 / D7687 Vloeibare aardolieproducten, Afleverinstallaties en ondergrondse opslag. Vloeibare aardolieproducten, Buitenopslag in kleine installaties. Overige vloeistoffen opslag in ondergrondse en bovengrondse tankinstallaties Standard Test Method for Adenosine Triphosphate (ATP) Content of Microorganisms in Fuel, Fuel/Water Mixtures and Fuel Associated Water 1.7 Afkortingen catp SIKB RvA cellular adenosine triphosphate Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Raad voor Accreditatie Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 5 van 12

32 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon Beschrijving van apparatuur en hulpmiddelen 2.1 Apparatuur Algemeen De inspectie-instelling beschikt over geschikte apparatuur om alle activiteiten gerelateerd aan het uitvoeren van een water/bezinksel/micro-organismen controle voor medewerkers uitvoerbaar te maken Kritieke apparatuur Kritieke apparatuur valt onder het regime van de RvA T18 herleidbaarheidscategorie A. Dit houdt onder andere in dat de apparatuur moet zijn voorzien van een geldige kalibratie, uitgevoerd door een daarvoor geaccrediteerd laboratorium (ISO/IEC 17025). Het betreft : Buffervloeistof (t.b.v. controle ph- en geleidbaarheidsmeter): De buffervloeistoffen moeten onder certificaat worden geleverd en moeten binnen de aangegeven houdbaarheidstermijnen en volgens de voorschriften worden gebruikt Niet - kritieke apparatuur Niet - kritieke apparatuur valt onder het regime van de RvA T18 herleidbaarheidscategorie B. Niet van toepassing in dit protocol 2.2 Hulpmiddelen De inspectie-instelling beschikt over geschikte hulpmiddelen om alle activiteiten, gerelateerd aan het uitvoeren van de controles, voor medewerkers uitvoerbaar te maken. Tevens wordt gegarandeerd dat alle hulpmiddelen geschikt zijn om er de genoemde controles mee uit te voeren. De volgende hulpmiddelen kunnen worden gebruikt: Geleidbaarheidsmeter: De geleidbaarheidsmeter moet een bereik hebben van 0 tot minimaal 100 ms/m. De maximale absolute afwijking mag niet groter zijn dan 0,5 ms/m zijn. ph-meter: De ph-meter moeten een minimaal meetbereik hebben van ph 4 - ph 8. De maximale afwijking mag 0,5 ph zijn. catp-meter: De catp-meter moet een bereik hebben van 4 x tot 1 x 10-6 M ATP. Nauwkeurigheid: 10RLU De monsterdief voor monstername: De monsterdief heeft een zodanige voorziening of constructie dat uitsluitend een monster van de onderste laag wordt genomen. De apparatuur is uitgevoerd in een materiaal waarmee vonkvorming wordt voorkomen, bijvoorbeeld messing. Peillood met ketting: Maatlat met een bereik van tenminste 3 cm, met een schaalverdeling per 5 mm ± 0.1 mm; de lengte x breedte x diepte van de groef voor de waterdetectiepasta moet ca. 30 mm x 3 mm x 2 mm bedragen. Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 6 van 12

33 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon Waterdetectiepasta: De waterdetectiepasta is voorzien van een indicator die bij aanwezigheid van water leidt tot een scherp waarneembare kleuromslag van de waterdetectiepasta die met water in aanraking is geweest. De waterdetectiepasta is geschikt voor het meten van water in tanks en bestendig tegen het opgeslagen product in de tank. Het toepassingsgebied van de leverancier wordt gevolgd. Overige hulpmiddelen zijn o.a. scheidtrechter met standaard, opvangbeker, filtreerpapier, monsternamepotjes. Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 7 van 12

34 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon Werkwijze controle water / bezinksel 3.1 Voorbereiding Voor aanvang van de werkzaamheden controleert de inspecteur alle middelen visueel op reinheid om foutieve meetresultaten ten gevolge van contaminatie uit te sluiten. De phen geleidbaarheidsmeter wordt dagelijks voor aanvang en na afloop van de werkzaamheden gecontroleerd op een goede werking ten opzichte van buffervloeistoffen (zie 2.1.2). Bij een te grote afwijking wordt het instrument gekalibreerd en zo nodig gejusteerd. Dit is een proces wat is ingebouwd in de software van het instrument. Blijkt na afloop na de werkzaamheden dat er kalibratie noodzakelijk is, dienen voorgaande metingen te worden gecontroleerd Ter ondersteuning van de uitvoering is in Bijlage 1 Schematisch overzicht van de monsterdief een nadere toelichting gegeven. 3.2 Vastlegging gegevens De inspecteur rapporteert op locatie minimaal: projectcode; datum controle; naam uitvoerder(s); tankgegevens(inhoud, product); locatiegegevens van de gecontroleerde tank(s); meetresultaten; conclusies. 3.3 Uitvoeren van de controle Controle op aanwezigheid van water De inspecteur stelt het waterniveau op de bodem van de tank vast door middel van een peiling op het laagste punt van de tank, via de peilleiding, met behulp van een peillood of peilstok ingesmeerd met waterdetectiepasta of een gelijkwaardige methode. Indien er water in de tank wordt aangetroffen wordt dit, ongeacht het niveau, vermeld in de rapportage. Indien de tank van meerdere peilleidingen is voorzien, worden deze allen gecontroleerd. Indien in een tank een waterniveau wordt geconstateerd 5 mm, moet de agressiviteit van het water worden bepaald. Water wordt agressief geacht bij een ph < 6 of een geleidbaarheid >30 ms/m. Wanneer het waterniveau < 5 mm, is geen verdere controle van het water noodzakelijk 3. Voor een analyse op agressiviteit wordt op het laagste punt in de tank een monster genomen met behulp van een monsterdief. Het water wordt van het product gescheiden en vervolgens geanalyseerd op zuurgraad en geleidbaarheid. De zuurgraad van het water wordt bepaald met behulp van een ph-meter of een gelijkwaardige methode, de geleidbaarheid van het water bepaald met behulp van een geleidbaarheidsmeter of een gelijkwaardige methode. 3 Toelichting: Bij een waterniveau van < 5 mm is er te weinig water beschikbaar om een goede analyse uit te voeren. Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 8 van 12

35 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon Controle op aanwezigheid van bezinksel Naast de controle op aanwezigheid en agressiviteit van water wordt de tank gecontroleerd op de aanwezigheid van bezinksel. Hiervoor wordt op het laagste punt in de tank een monster worden genomen met behulp van een monsterdief. Ook het monster voor de watercontrole kan hiervoor worden gebruikt. Het monster wordt visueel beoordeeld op de aanwezigheid van corrosieresiduen (metabolen, deeltjes en/of verontreinigingen). Bij een constatering van corrosieresiduen wordt het monster gefiltreerd. Het residu wordt visueel worden gecontroleerd op de aanwezigheid van zwart/bruin/rood vlokvormige deeltjes. Indien er bezinksel in de tank wordt aangetroffen wordt dit, ongeacht de hoeveelheid, vermeld in de rapportage. Indien de tank van meerdere peilleidingen is voorzien, worden deze allen gecontroleerd. 3.4 Criteria voor beoordeling van de meetresultaten In een tank mag geen bezinksel aanwezig zijn. Zo ja dan vermelden in rapport. In een tank mag geen waterniveau > 5 mm aanwezig zijn met een zuurgraad < PH 6 en een geleidbaarheid > 30 ms/m). Zo ja dan vermelden in rapport. Is het waterniveau minder dan 5 mm. Dan hoeft dit niet te worden vermeld in de rapportage. 3.5 Rapportage Het inspectierapport van een controle op water/bezinksel bevat tenminste de volgende items: identificatienummer van het rapport naam en adres van de inspectie-instelling naam en adres van de opdrachtgever datum en identificatie van de opdracht plaats van inrichting waar de tankinstallatie zich bevindt identificatie van de te inspecteren objecten beschrijving van de inspectiewerkzaamheden verwijzing naar de norm waaraan is getoetst plaats en datum van de inspectie naam van de inspecteur meetresultaten conclusies bijzondere omgevingscondities indien van toepassing een lijst van gebruikte afkortingen Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 9 van 12

36 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon Werkwijze controle op microbiologische verontreiniging 4.1 Algemeen Naast corrosie ten gevolge van elektrochemische processen kunnen ook microorganismen oorzaak zijn van bacteriegroei. In de onderste laag van een tank, waar een anaeroob milieu kan heersen, zullen deze micro-organismen aanleiding geven voor bacteriegroei dat kan leiden tot het dichtslaan van filters. De controle op microbiologische verontreiniging is aanvullend op de controles die beschreven zijn in hoofdstuk 3. De inspectie-instelling staat voor de keuze om het monster zelf te meten dan wel dit door een geaccrediteerd laboratorium te laten doen. 4.2 Voorbereiding De wijze van monstername is, evenals de voorbereiding erop, afhankelijk van de voorschriften van het laboratorium / catp-meter. Indien er een catp-meter wordt gebruikt, wordt de werking ervan dagelijks gecontroleerd op basis van de gegevens van de fabrikant. Indien noodzakelijk wordt de meter gekalibreerd met behulp van kalibratievloeistof. E.e.a. wordt vastgelegd in een logstaat. 4.3 Vastlegging gegevens De inspecteur rapporteert op locatie minimaal: projectcode; datum controle; naam uitvoerder(s); tankgegevens; locatiegegevens van de gecontroleerde installatie; meetresultaten; conclusies; 4.4 Uitvoeren van de controle Hiervoor wordt op het laagste punt in de tank een monster worden genomen met behulp van een monsterdief. Van dit monster wordt op locatie of in een laboratorium een catp 4 meting uitgevoerd. 4 Toelichting: catp staat voor cellular adenosine triphosphate. Adenosine triphosphate is de energiedrager van elke levende actieve cel. Door deze snelle analyse kan men het ATP gehalte en dus ook het aantal levende actieve micro-organismen, bepalen binnen een brandstofstaal. De waarden van een catp worden uitgedrukt in pg/ml brandstof. Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 10 van 12

37 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon Voor de uitvoering van de test ter plaatse dienen de richtlijnen van de leverancier van de catp-meter te worden aangehouden. Wanneer de test in een laboratorium wordt uitgevoerd dient het monster te worden behandeld, geconditioneerd en opgeslagen conform de richtlijnen van het laboratorium. 4.5 Criteria voor beoordeling van de meetresultaten De volgende typische waarden dienen bij een catp meting te worden gehanteerd: catp waarde Conclusie microbiële verontreiniging Risico op dichtslaan filters 0 t/m 10 pg/ml verwaarloosbaar Geen 11 t/m 100 pg/ml Licht verontreinigd Beperkt > 100 pg/ml Zwaar verontreinigd Verhoogd De beoordeling is gebaseerd op de richtlijnen ASTM D7463 en ASTM D7687. Voor nadere informatie wordt verwezen naar deze richtlijnen. 4.6 Rapportage Een inspectierapport van een controle op microbiologische verontreiniging moet tenminste de volgende items bevatten: identificatienummer van het rapport naam en adres van de inspectie-instelling naam en adres van de opdrachtgever datum en identificatie van de opdracht plaats van inrichting waar de tankinstallatie zich bevindt identificatie van de te inspecteren objecten beschrijving van de inspectiewerkzaamheden verwijzing naar de norm waaraan is getoetst plaats en datum van de inspectie naam van de inspecteur meetresultaten conclusies eventuele bijzondere omgevingscondities indien van toepassing een lijst van gebruikte afkortingen Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 11 van 12

38 Stichting Infrastructuur Kwaliteitsborging Bodembeheer Groningenweg 10 Postbus AK Gouda telefoon Bijlage 1 Monstername met monsterdief Schematisch overzicht van monstername met monsterdief. Overzicht meetopstelling met monsterdief Detail monstername met monsterdief Protocol 6802, Versie 1.1 WBM-controle Datum Pagina 12 van 12

39 Bijlage 2: Achtergrondinformatie MIC

40 Achtergrondinformatie micro-organismen betrokken bij MIC Het corrosieproces kan beïnvloed worden door verschillende groepen micro-organismen. Deze omvatten zowel anaerobe als aerobe micro-organismen. De interacties tussen de microorganismen spelen daarbij een belangrijke rol. Onderstaand worden een aantal voorbeelden gegeven van relevante groepen micro-organismen en hun effect op het corrosieproces. Sulfaatreducerende bacteriën (SRB) Sulfaatreducerende bacteriën zijn veelal betrokken bij MIC. Deze bacteriën gebruiken sulfaat als bron van energie en produceren daarbij het toxische waterstofsulfide (H2S). Naast hevige corrosie veroorzaakt H2S andere problemen, zoals de typische "rotte eieren" geur, zwartkleuring van apparatuur en slijmvorming. De sulfaatreducerende bacteriën groeien onder anaerobe omstandigheden (dat wil zeggen dat zij geen gebruik maken van zuurstof) in een omgeving die voldoende sulfaat en organisch materiaal bevat. Zwaveloxiderende bacteriën (SOB) Zwaveloxiderende bacteriën gebruiken sulfide (S 2- ) of zwavel (S0) als bron van energie en produceren daarbij sulfaat (SO4 2- ). Deze groep micro-organismen beïnvloedt het corrosieproces direct door productie van zwavelzuur (H2SO4). Zij zijn daarmee in staat te overleven in een zuur milieu. Ze leven vaak in symbiose met de sulfaatreducerende bacteriën: de SOB consumeert sulfide dat wordt geproduceerd door SRB, terwijl de SRB het sulfaat consumeert dat wordt geproduceerd door de SOB. IJzerreducerende bacteriën (IRB) IJzerreducerende bacteriën gebruiken geoxideerd ijzer (Fe 3+ ) als energiebron en produceren daarbij opgelost (of gereduceerd) ijzer (Fe 2+ ). Zij zijn betrokken bij het MIC proces doordat ze Fe 2+ vrij maken voor de IOB, en daardoor een symbiotische relatie ontstaat tussen de twee groepen (vergelijkbaar met SRB en SOB). IJzeroxiderende bacteriën (IOB) IJzeroxiderende bacteriën gebruiken opgelost (of gereduceerd) ijzer (Fe 2+ ) als bron van energie en produceren daarbij geoxideerd ijzer (Fe 3+ ). Voor dit proces vereisen ze lage zuurstofconcentraties. Door verwijdering van Fe 2+ van het metaaloppervlak wordt het evenwicht bij de anode verstoord, waardoor meer ijzer in oplossing gaat. Geoxideerd ijzer (Fe 3+ ) precipiteert en is zichtbaar als roestgekleurde deeltjes (veelal in een slijmerige laag van micro-organismen). Dergelijke neerslagen veroorzaken vaak problemen door verkleuring van water en het blokkeren van filters, pompen en leidingen. Methaanproducerende micro-organismen De methaanproducerende micro-organismen (ook wel methanogenen genoemd) behoren tot de archaea. Ze gebruiken eenvoudige moleculen (zoals CO2, H2 en acetaat) als energiebron en produceren daarbij methaan (CH4). Deze organismen zijn strikt anaeroob en aanwezigheid is derhalve een goede indicatie dat een bepaalde omgeving (gedeeltelijk) anaeroob is. Omdat ze H2 als bron van energie kunnen gebruiken, kan het evenwicht op de kathode worden verstoord, waardoor de corrosiesnelheid toeneemt microbialanalysis@bioclear.nl

41 Nitrificerende micro-organismen De nitrificerende bacteriën en archaea zetten ammonium om naar salpeterzuur (HNO3). Dit zuur zorgt ervoor dat metalen sneller in oplossing gaan, met als gevolg hogere corrosiesnelheden. Als aanvulling versnelt het zuur de omzetting van zwaveldioxide (SO 2 ) naar sulfiet en vervolgens sulfaat. Sulfaat kan dan weer als bron dienen voor sulfaatreducerende bacteriën (SRB). Nitrificerende micro-organismen zijn in staat om zogenaamde exopolysacchariden (EPS) te produceren, de belangrijkste component van een biofilm. In een biofilm zijn micro-organismen in staat om extreme temperaturen, droogte en zelfs biocidebehandelingen te weerstaan. Denitrificerende bacteriën Deze bacteriën (ook nitraatreducerende bacteriën genoemd) reduceren nitraat of nitriet naar stikstofgas en vervolgens ammonium. Het gebruik van organische componenten (C-bron) resulteert in de productie van koolstofdioxide en hydroxide, wat kan reageren tot bicarbonaat en carbonaat. Deze stoffen verhogen de zuurgraad lokaal en veroorzaken daarbij corrosie microbialanalysis@bioclear.nl

42 Bijlage 3: QPCR methode

43 Q-PCR analysis Culture independent technique for quantification of microorganisms Analysis method Application of culture independent techniques for microbial detection is rising, because most microorganisms cannot be cultured (growth conditions are unknown or reproduction in the laboratory is not possible). The percentage of cultivable microorganisms depends on the complexity of the sample and can be as little as 1%. Therefore, the risk of false negatives is significantly increased. Bioclear has been using such techniques for approximately twenty years now. Key benefits Sampling is easy with our sampling kits (provided free of charge). Samples can be returned without cooling because of our innovative fixation technique. Fixation ensures that analysis results represent the actual microbial situation during sampling. Suitable for each type of sample (e.g. liquids, slurries, solids, surfaces and deposits). Attractive price to quality ratio. Procedure You can request a sampling kit by phone or (see contact details below). We will send you the necessary sampling material and protocol within one working day. Advantages of Q-PCR For quantifying microorganisms, we use the DNA technique Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR). Using this technique, microorganisms are detected and quantified based on distinguishing areas on their genetic material (DNA and/or RNA). The Q-PCR has a number of benefits: Culture-independent: approximately 1% of microorganisms is culturable. Q-PCR is culture-independent and therefore enables microorganisms to be found that will otherwise remain unseen. Flexible: we can perform any analysis in terms of microbial groups (e.g. Bacteria), species (e.g. Pseudomonas aeruginosa) or microbial conversions (e.g. sulphate reduction). Objective: results are determined online and are processed automatically using software tools. The results are therefore not susceptible to personal interpretation. Quality control: Internal controls are included in all analyses to determine the quality of the analyses. Use the kit to take your own samples and conserve them on-thespot. Send the sampling kit back to us (without cooling) and you will receive the analysis report by within ten working days. For more information about Q-PCR: T +31 (0) E microbialanalysis@bioclear.nl W microbialanalysis@bioclear.nl

44 Bijlage 4: Foto in tank Bijlage 4 Foto in tank Enschede Foto 1: aantasting lasnaad, overgang bodem naar tussenschot.

45 Nieuwegein Foto 200 bodem segment 1 Foto 201bodem segment 2 Foto 202 bodem segment 3 Foto 203 wand 1 e segment ongeveer heup hoogte Foto 204 wand 1 e segment ongeveer heup hoogte

46 Bijlage 5: Bemonsteringprotocollen

47 Protocol voor bemonstering en conservering van oppervlakten en biofilms. Materialen. 2 ml monstercupjes met conserveermiddel (draag persoonlijk beschermingsmateriaal zoals handschoenen om contact met de huid en contaminatie van het monster te voorkomen). Steriele swab. Schone handschoenen. Bemonsteringsprocedure. Zie de achterzijde van dit protocol voor een aantal belangrijke opmerkingen. 1. Trek de schone handschoenen aan. 2. Neem een steriele swab en verwijder de verpakking. Zorg er voor dat de swab nergens mee in contact komt. 3. Neem een monster door stevig over het oppervlak te strijken. 4. Plaats de swab in het cupje en breek het uiteinde van de swab af middels het dopje (raak de swab niet aan). 5. Sluit het cupje en zorg dat de swab volledig in contact is met het conserveermiddel. 6. Schrijf de benodigde informatie (monster omschrijving, datum) op het monsterpotje. Monsters kunnen samen met een ingevuld monster registratieformulier met reguliere post (ongekoeld) worden verzonden naar: Bioclear B.V. T.a.v. Microbial Analysis Rozenburglaan DL Groningen microbialanalysis@bioclear.nl

48 Opmerkingen omtrent de bemonsteringsprocedure Om de kwaliteit van onze moleculaire analyses te waarborgen, moeten monsters worden genomen met bemonsteringsmateriaal aangeleverd door Bioclear MA. Het aangeleverde materiaal is steriel om kruisbesmetting te voorkomen. Daarnaast bevatten de monsterpotjes een conserveermiddel om te garanderen dat de biologische situatie in de monsters niet meer veranderd tussen het moment van monstername en de analyse. Gebruik nieuw en schoon bemonsteringsmateriaal voor elk monster. Als het nodig is om andere materialen te gebruiken dan door ons aangeleverd, zorg er dan voor dat deze steriel zijn. Neem het monster zo steriel mogelijk: draag schone handschoenen, open het monsterpotje zo kort mogelijk en voorkom dat er iets in de monsterpotjes valt (zoals regen, aerosolen, etc.). Bewaaradvies. Monsterpotjes kunnen tot circa 3 maanden na ontvangst bewaard worden. Via onderstaande contactgegevens kunt u nieuw bemonsteringsmateriaal aanvragen. Na monstername adviseren wij om de potjes binnen 4 weken retour te sturen om de kwaliteit van onze analyseresultaten te garanderen. Wanneer dit niet mogelijk is, raden we aan om de monsters direct in een koele omgeving op te slaan (< 10 C) microbialanalysis@bioclear.nl

49 Protocol voor bemonstering en conservering van vaste monsters (e.g. corrosieproduct, poeder, metaal). Materialen. 18 ml monsterpotje met 10 ml conserveermiddel (lees voor gebruik de veiligheidsvoorschriften omtrent ethanol op bijgevoegd formulier). Steriele scalpel / steriele lepel / steriele pincet. Steriele handschoenen. Bemonsteringsprocedure. Zie de achterzijde van dit protocol voor een aantal belangrijke opmerkingen. 1. Trek de steriele handschoenen aan. 2. Neem een steriele scalpel, lepel of pincet en verwijder de verpakking. Zorg er voor dat het uiteinde nergens mee in contact komt. 3. Verzamel het monster en doe deze in het monsterpotje. Laat de vloeistof niet overlopen. 4. Schroef de dop op het monsterpotje en schudt om het conserveermiddel goed te laten mengen met het monster. 5. Schrijf de benodigde informatie (monster omschrijving, datum) op het monsterpotje. Monsters kunnen samen met een ingevuld monster registratieformulier met reguliere post (ongekoeld) worden verzonden naar: Bioclear B.V. T.a.v. Microbial Analysis Rozenburglaan DL Groningen microbialanalysis@bioclear.nl