Relatie tussen factor VIII-genotype en risico van remmervorming bij hemofilie A-patiënten

Transcriptie

1 Relatie tussen factor VIII-genotype en risico van remmervorming bij hemofilie A-patiënten Auteurs Trefwoorden W.L. van Heerde, J. Boekhorst, I.R.O. Nováková, M.G. van Kraaij en H.W. Verbruggen alloantistoffen, factor VIII, genotype, hemofilie A, remmers Samenvatting De ontwikkeling van remmende antistoffen (remmers of inhibitors) tegen factor VIII is een ernstige complicatie bij de behandeling van hemofilie met zowel factor VIII dat is bereid uit normaal humaan plasma, als recombinant factor VIII. Uit analyses is gebleken dat de kans op remmervorming tussen de 20 en 30% ligt en dat patiënten met ernstige hemofilie A het meest zijn aangedaan. Het ontstaan van remmers bij hemofilie A-patiënten is een multifactorieel proces waarbij zowel omgevings- als genetische factoren een rol spelen. Hoewel behandeling met producten die factor VIII bevatten de belangrijkste risicofactor is voor de ontwikkeling van remmende antistoffen, speelt de genetische afwijking in het factor VIII-gen eveneens een belangrijke rol. In dit overzicht wordt ingegaan op de genetische achtergrond van hemofilie A en de relatie tussen het factor VIII-genotype en het risico van remmervorming. Bovendien wordt de detectie van remmers besproken. (Ned Tijdschr Hematol 2006;3:207-12) Inleiding Hemofilie A is een X-gebonden, recessieve aandoening met een toegenomen bloedingsrisico door een tekort aan of niet goed functionerende factor VIII. Afhankelijk van de factor VIII-activiteit, wordt hemofilie A ingedeeld in een ernstige (factor VIIIactiviteit<1%), matig ernstige (1-5%) en een milde vorm (6-30%). Spontane bloedingen in gewrichten en spieren komen voornamelijk voor bij patiënten met ernstige en matig ernstige hemofilie A. Nabloedingen na traumata en operaties komen voor bij alle hemofiliepatiënten. De bloedingscomplicaties worden behandeld met i.v. toediening van uit plasma bereide of recombinant factor VIII of, bij milde hemofilie A, met 1-desamino-8-D-argininevasopressine (DDAVP; Octostim ). DDAVP is een vasopressineanalogon dat de afgifte van factor VIII en Von Willebrandfactor (VWF) uit endotheelcellen en trombocyten stimuleert. 1 Patiënten met ernstige hemofilie A worden ter voorkoming van bloedingen vaak profylactisch behandeld met plasma gezuiverd of recombinant factor VIII. De belangrijkste complicaties van de behandeling van hemofilie met bloedproducten zijn virusinfecties (hiv, hepatitis B en C) en de ontwikkeling van remmende alloantistoffen. Deze remmers zijn gericht tegen het, voor de hemofilie A-patiënt, lichaamsvreemde eiwit factor VIII. De ontwikkeling van remmers treedt slechts op als reactie op een behandeling met producten die factor VIII bevatten. In de jaren 80 van de vorige eeuw zijn veel hemofiliepatiënten overleden, vooral door hiv-infecties. Veel energie is daarom gestoken in de ontwikkeling van betere zuiveringstechnieken en virusinactivatieprocessen van uit plasma bereide factor VIII en in de ontwikkeling van recombinant factor VIII-producten. Recombinant factor VIII is echter afkomstig uit celkweken van niet-humane zoogdiercellijnen en zal daardoor licht afwijken van de humane factor VIII. Het testen van factor VIII-remmers is in n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 3 n r

2 29% ernstige hemofilie A 0% 20% het begin van de jaren 90 van de vorige eeuw sterk toegenomen. Dit kwam mede door een toegenomen aantal patiënten met remmende alloantistoffen na de introductie van een nieuw gezuiverde factor VIII en recombinant factor VIII. 2 Daarnaast is veel aandacht besteed aan de etiologie van deze remmers. 3 In dit overzichtsverhaal wordt vooral aandacht besteed aan de relatie tussen het ontstaan van factor VIII-remmers bij hemofilie A-patiënten en de genotypische afwijking in het factor VIII-gen. Daarnaast wordt kort ingegaan op het meten van remmende factor VIII-antistoffen. 16% 14% 0% 10% 1% 0% 0% 1% 88% 13% missensemutaties nonsensemutaties splice-sitemutaties inserties grote deleties kleine deleties inversies 8% 2% 7% 3% matig ernstige hemofilie A 11% 0% missensemutaties nonsensemutaties splice-sitemutaties inserties grote deleties kleine deleties inversies milde hemofilie A 69% missensemutaties nonsensemutaties splice-sitemutaties inserties grote deleties kleine deleties inversies Figuur 1. De verdeling van de verschillende typen mutaties in het factor VIII-gen bij hemofilie A. In het figuur is onderscheid gemaakt naar de ernst van de hemofilie. De gegevens zijn afkomstig uit de databank van de Haemophilia A mutation, structure, test and resource site (HAMSTeRS). 11 8% Hemofilie A Hemofilie A is een aandoening met een verhoogde kans op bloedingen, met als gevolg een toegenomen morbiditeit en voorheen ook een verhoogde mortaliteit. De aandoening wordt veroorzaakt door een afwijkende of in het plasma ontbrekende factor VIII. In de meeste gevallen is de oorzaak een genetische afwijking in het factor VIII-gen. Afwijkingen in VWF, het dragereiwit van factor VIII, of een verlaagde VWF-concentratie kunnen ook aanleiding geven tot een verlaagde factor VIII-concentratie. Door het ontbreken van factor VIII is vooral de trombinegeneratie gestoord, waardoor ook de fibrinolyse, via de trombineactiveerbare fibrinolyseremmer ( thrombin activatable fibrinolysis inhibitor ; TAFI) onvoldoende wordt geremd. 4 Zowel de gestoorde trombinegeneratie als de versnelde fibrinolyse geeft aanleiding tot bloedingscomplicaties. Hemofilie A komt voornamelijk voor bij mannen, met een incidentie van 1: Vrouwen zijn voornamelijk draagster van deze X-gebonden, recessieve ziekte. In zeldzame gevallen hebben ook vrouwen hemofilie A. De hoge frequentie van hemofilie A heeft onder andere te maken met de seksegebonden overerving en de hoge mutatiegraad in het factor VIII-gen. 5,6 Dertig procent van de factor VIII-mutaties ontstaat spontaan en is niet familiegerelateerd. Het is interessant dat spontane mutaties significant vaker voorkomen in mannelijke kiemcellen. 7 De ernst van de ziekte komt grotendeels overeen met de gevonden afwijking op het factor VIII-gen. Het factor VIII-gen is gelegen op de lange arm van het X-chromosoom. Het gen overspant 186 kilobasen (kb) en de coderende sequentie voor de aminozuren is verdeeld over 26 exonen. Het in het bloed circulerende eiwit is 19 aminozuren korter doordat het leaderpeptide dat betrokken is bij de secretie van factor VIII, wordt afgesplitst. Met name exon 14, dat bestaat uit basenparen (bp), en exon 26 (1.958 bp) zijn groot. Het gen bevat ook 6 grote intronsequenties (>14 kb), waarvan intron 22 met 32 kb het grootst is Factor VIII-mutaties bij hemofilie A Patiënten met ernstige hemofilie A hebben een plasmafactor VIII-concentratie van minder dan 208 v o l. 3 n r n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

3 Tabel 1. Overzicht van de incidentie van de diverse typen mutaties bij de totale hemofilie A- populatie en bij patiënten met ernstige hemofilie A. totale hemofilie A-populatie (n=846) Incidentie (%) populatie met ernstige hemofilie A (n=147) missensemutaties 38,2 18,4 nonsensemutaties 9,3 13,6 splice-sitemutaties 2,6 0,0 inserties 2,6 1,4 grote deleties 3 5,4 kleine deleties 7,5 9,5 inversie-intron 22 35,7 37,4 inversie-intron 1 1 n.b. onbekende mutatie 0,1 14,3 n.b.=niet bepaald. 1%, die wordt veroorzaakt door inversies, deleties, inserties, splice-site-, nonsense- en ook missensemutaties van het factor VIII-gen. Bij inversies, splice-site- en nonsensemutaties, deleties en inserties die vervolgens een veranderd open reading frame geven, leidt dit tot null-allelen. Figuur 1 geeft een overzicht van de verschillende percentages afwijkingen die zijn gevonden bij ernstige, matig ernstige en milde hemofilie A. Matig ernstige en milde hemofilie A worden vooral veroorzaakt door missensemutaties in het factor VIII-gen. Splice-sitemutaties zijn in de 3 subgroepen voor ongeveer 8% verantwoordelijk voor het ontstaan van hemofilie A. De in de Figuur 1 weergegeven verdeling van de diverse typen mutaties is niet representatief voor het voorkomen van deze mutaties bij met name ernstige hemofilie. De reden is onder andere dat de inversies niet in de databank van de Haemophilia A mutation, structure, test and resource site (HAMSTeRS) zijn opgenomen. 11 Bij ongeveer 35% van de patiënten met ernstige hemofilie A is een inversie in intron 22 aanwezig De door Bagnall et al. in 2002 beschreven inversie in intron 1 komt daarnaast bij ongeveer 1 tot 5% van de populatie met ernstige hemofilie A voor. 7,15 De nonsense- en missensemutaties komen in grote verscheidenheid voor en vertegenwoordigen ongeveer 32% van de mutaties in de populatie met ernstige hemofilie. 16 In Tabel 1 is de relatieve incidentie van de diverse typen mutaties bij de totale hemofilie A-populatie afgezet tegen die bij patiënten met ernstige hemofilie A. 7 Remmende alloantistoffen tegen factor VIII Het risico op het ontwikkelen van remmers bij hemofilie A-patiënten is gerelateerd aan de behandeling met producten die factor VIII bevatten. De aanwezigheid van remmers uit zich vaak door een toename van het aantal bloedingen en wordt vaak gezien bij een verhoogd gebruik van factor VIII-producten. Op basis van de antistofspiegel na de toediening van factor VIII, worden de patiënten met remmers ingedeeld in high en low responders. High-responderpatiënten hebben een piekwaarde van >5 BU/ml. Low responders hebben hun piekwaarde onder de 5 BU/ml. Tijdelijke remmers kunnen ook aanwezig zijn. De factor VIII-opbrengst na factor VIII-infusie is bij deze categorie remmers over het algemeen normaal. Factor VIII-remmers ontstaan meestal vlak na de start van een therapie (gemiddeld na 10 behandelingen). Als gevolg daarvan worden factor VIIIremmers met name aangetroffen bij jonge kinderen met ernstige hemofilie A of na verandering van het factor VIII-concentraat. 17,18 De remmende antistoffen zijn voornamelijk van de IgG4- en soms ook van de IgG1-subklasse. Etiologie van factor VIII-remmers In het verleden is gesuggereerd dat bij patiënten die zijn behandeld met recombinant factor VIII de kans op remmervorming groter is. Tot op heden is dit echter niet bewezen. Wel is door de toegenomen interesse in factor VIII-remmers duidelijk geworden dat zowel genetische als omgevingsfactoren een belangrijke rol spelen bij het ontstaan van remmende n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 3 n r

4 0,75 0,5 prevalentie 0,25 0 grote deleties inversie intron 22 nonsensemutaties inserties kleine deleties splice-sitemutaties missensemutaties Figuur 2. Relatie tussen het genotype en de prevalentie van remmervorming bij patiënten met ernstige hemofilie A. De gegevens zijn geëxtraheerd uit de databank van de Haemophilia A mutation, structure, test and resource site (HAMSTeRS). Voor de inversie in intron 22-mutaties is gebruik gemaakt van de getallen van Schwaab et al. 20 Gemiddelde en 95% betrouwbaarheidsinterval zijn weergegeven. antistoffen. Zo zijn naast de leeftijd waarop wordt gestart met profylaxe, ook het ras, het type factor VIII-product dat wordt gesubstitueerd en een positieve familieanamnese gerelateerd aan de vorming van remmers. Recentelijk zijn polymorfismen in immunomodulatoire moleculen eveneens in verband gebracht met de ontwikkeling van remmers. 19 Een belangrijke risicofactor voor het ontstaan van remmende antistoffen is de genetische afwijking in het factor VIII-gen. Vanwege de variatie in genetische afwijkingen bij patiënten met ernstige hemofilie en de grote kans op remmervorming bij deze patiëntengroep, is de relatie tussen de genotypische afwijking en het risico op remmervorming bij deze populatie onderzocht (zie Figuur 2). De incidentie is het hoogst bij patiënten met een grote exonoverstijgende deletie, gevolgd door nonsensemutaties geïntroduceerd door een no-nonsense(stop)codon en de inversie in intron 22. De kans op remmers bij inserties of kleine deleties is relatief klein in een hotspot (ongeveer 30%) van kleine inserties en deleties in een streng van adenines in exon 14. Een mogelijke verklaring hiervoor is beschreven door Young en collega s bij de bestudering van mrnatranscriptie van factor VIII. 21 Zij vonden mrnatranscripten van verschillende lengtes, wat mogelijkerwijs wordt veroorzaakt doordat DNA- en RNA-polymerase in polyadeninegebieden relatief meer fouten kunnen maken. Dit zou kunnen leiden tot de aanwezigheid van zeer kleine hoeveelheden (<1%, met standaardtechnieken niet detecteerbaar) normale factor VIII in de circulatie, wat bescherming biedt tegen remmerontwikkeling. De kans op remmervorming bij kleine deleties en inserties buiten deze hotspot is groter. Grofweg kan worden gesteld dat de kans toeneemt bij de afwezigheid van al dan niet gemuteerd factor VIII-eiwit in de circulatie. Detectie van remmers Sinds in de jaren 90 van de vorige eeuw bij patiënten die waren behandeld met een nieuw, uit plasma bereide, gepasteuriseerde factor VIII het aantal remmers plotseling toenam en nieuwe recombinant factor VIII-producten werden geïntroduceerd, is er veel aandacht voor remmerontwikkeling. 22 Het aantal analyses is ook enorm toegenomen. De achterliggende gedachte bij een mogelijk groter risico bij recombinant factor VIII-producten was dat recombinant factor VIII licht kan afwijken van humaan factor VIII, omdat het in niet-humane zoogdiercellen wordt geproduceerd. Recentelijk is de discussie over de toegenomen kans op remmervorming bij 210 v o l. 3 n r n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

5 klassieke Bethesdatest Nijmegenmodificatie patiëntenplasma normaalpoolplasma imidazolbuffer ph=7,4 patiëntenplasma gebufferd normaalpoolplasma (ph=7,4) factor VIIIdeficiënt plasma testmengsel 50/50-mix controlemengsel testmengsel 50/50-mix controlemengsel incubatie 2 uur, 37ºC incubatie 2 uur, 37ºC factor VIII-activiteitstest factor VIII-activiteitstest remmertiter (BU/ml) remmertiter (NBU/ml) Figuur 3. Factor VIII-remmerdetectie volgens de klassieke Bethesdatest en volgens de Nijmegenmodificatie. BU=Bethesdaunit, NBU=Nijmegen-Bethesda-unit. gebruik van recombinant factor VIII weer opgelaaid, hoewel in het verleden prospectieve studies met recombinant factor VIII hebben aangetoond dat de kans op remmervorming niet significant afwijkt in vergelijking met patiënten die zijn behandeld met plasmagezuiverde factor VIII-producten. 23,24 Niettemin worden hemofilie A-patiënten tegenwoordig frequenter gecontroleerd op de aanwezigheid van remmende antistoffen. De detectie van remmers is vooral gebaseerd op stollingstests waarbij het patiëntenplasma wordt gemengd met normaal plasma. Na 2 uur incubatie wordt de residuale factor VIII-concentratie gemeten. In het verleden werd dit vooral uitgevoerd met de klassieke Bethesdatest, waarbij gebruik werd gemaakt van een interne controle die bestond uit een imidazolbuffer. 25 Een recentere aanpassing van de Bethesdatest, waarbij de imidazolbuffercontrole wordt vervangen door factor VIII-deficiënt plasma en het normaalpoolplasma wordt gebufferd met imidazol, heeft een betere specificiteit (detectielimiet 0,4 BU/ml, zie Figuur 3). 26,27 De Scientific and Standardization Committee van de International Society of Thrombosis and Haemostasis adviseert de Nijmegenmodificatie van de Bethesdatest. Onlangs is in het Centraal Hematologisch Laboratorium van het UMC St Radboud de Nijmegen-Bethesdatest opnieuw gemodificeerd, waardoor de sensitiviteit een factor 15 is verbeterd. Om kosten te besparen, wordt echter nog vaak met de klassieke Bethesdatest gewerkt. De HAMSTeR-databank registreert daarnaast noch de remmertiter, noch de gebruikte analytische methode. Beide aspecten kunnen aanleiding geven tot vervuiling van de databank en mogelijke misinterpretatie van de remmerincidentie. Conclusie In de westerse wereld is de levensverwachting van hemofilie A-patiënten genormaliseerd. Gezien de levensverwachting en de relatief hoge incidentie van spontane mutaties, zal het aantal hemofilie A- patiënten toenemen. Het is mede daarom van groot belang meer inzicht te krijgen in de etiologie van remmervorming bij deze patiënten. Hoewel remmers alleen ontstaan na behandeling met factor VIII, is gedurende het laatste decennium ook veel aandacht besteed aan de relatie tussen genotype en remmervorming. Desondanks is de kennis van remmers gebrekkig, wat (vooralsnog) de ontwikkeling van alternatieve therapieën ter voorkoming van remmervorming bemoeilijkt. Het is dan ook een uitdaging om nieuwe aangeboren en verworven risicofactoren op te sporen. n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 3 n r

6 Aanwijzingen voor de praktijk 1. Remmende antistoffen ontwikkelen zich alleen nadat hemofilie A-patiënten zijn blootgesteld aan lichaamsvreemde factor VIII. 2. De kans op remmervorming bij hemofilie A is het grootst bij patiënten met ernstige hemofilie. 3. De kans op remmervorming is afhankelijk van de genotypische afwijking in het factor VIII-gen. Referenties 1. Mannucci PM. Desmopressin (DDAVP) in the treatment of bleeding disorders: the first 20 years. Blood 1997;90: Rosendaal FR, Nieuwenhuis HK, Van den Berg HM, Heijboer H, Mauser-Bunschoten EP, Van der Meer J, et al. A sudden increase in factor VIII inhibitor development in multitransfused hemophilia A patients in The Netherlands. Dutch Hemophilia Study Group. Blood 1993;81: Scharrer I, Ehrlich HJ. Lack of evidence for increased inhibitor incidence in patients switched from plasma-derived to recombinant factor VIII. Haemophilia 2001;7: Broze GJ Jr., Higuchi DA. Coagulation-dependent inhibition of fibrinolysis: role of carboxypeptidase-u and the premature lysis of clots from hemophilic plasma. Blood 1996;88: Vogel F. A probable sex difference in some mutation rates. Am J Hum Genet 1977;29: Strauss HS. The perpetuation of hemophilia by mutation. Pediatrics 1967;39: Oldenburg J, Ananyeva NM, Saenko EL. Molecular basis of haemophilia A. Haemophilia 2004;10 Suppl 4: Wood WI, Capon DJ, Simonsen CC, Eaton DL, Gitschier J, Keyt B, et al. Expression of active human factor VIII from recombinant DNA clones. Nature 1984;312: Toole JJ, Knopf JL, Wozney JM, Sultzman LA, Buecker JL, Pittman DD, et al. Molecular cloning of a cdna encoding human antihaemophilic factor. Nature 1984;312: Gitschier J, Wood WI, Goralka TM, Wion KL, Chen EY, Eaton DH, et al. Characterization of the human factor VIII gene. Nature 1984;312: Homepage van de Haemophilia A mutation, structure, test and resource site (HAMSTeRS). Zie: mrc.ac.uk/webpages/main/main.htm (9 oktober 2006). 12. Lakich D, Kazazian HH Jr., Antonarakis SE, Gitschier J. Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A. Nat Genet 1993;5: Antonarakis SE, Rossiter JP, Young M, Horst J, De Moerloose P, Sommer SS, et al. Factor VIII gene inversions in severe hemophilia A: results of an international consortium study. Blood 1995;86: Neerman-Arbez M, Antonarakis SE, Blouin JL, Zeinali S, Akhtari M, Afshar Y, et al. The locus for combined factor V-factor VIII deficiency (F5F8D) maps to 18q21, between D18S849 and D18S1103. Am J Hum Genet 1997;61: Bagnall RD, Waseem N, Green PM, Giannelli F. Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene is a frequent cause of severe hemophilia A. Blood 2002;99: Becker J, Schwaab R, Moller-Taube A, Schwaab U, Schmidt W, Brackmann HH, et al. Characterization of the factor VIII defect in 147 patients with sporadic hemophilia A: family studies indicate a mutation type-dependent sex ratio of mutation frequencies. Am J Hum Genet 1996;58: Ehrenforth S, Kreuz W, Scharrer I, Kornhuber B. Factor VIII inhibitors in haemophiliacs. Lancet 1992;340: Peerlinck K, Arnout J, Di Giambattista M, Gilles JG, Laub R, Jacquemin M, et al. Factor VIII inhibitors in previously treated haemophilia A patients with a double virus-inactivated plasma derived factor VIII concentrate. Thromb Haemost 1997;77: Astermark J. Why do inhibitors develop? Principles of and factors influencing the risk for inhibitor development in haemophilia. Haemophilia 2006;12 Suppl 3: Schwaab R, Brackmann HH, Meyer C, Seehafer J, Kirchgesser M, Haack A, et al. Haemophilia A: mutation type determines risk of inhibitor formation. Thromb Haemost 1995;74: Young M, Inaba H, Hoyer LW, Higuchi M, Kazazian HH Jr., Antonarakis SE. Partial correction of a severe molecular defect in hemophilia A, because of errors during expression of the factor VIII gene. Am J Hum Genet 1997;60: Briet E, Rosendaal FR, Kreuz W, Rasi V, Peerlinck K, Vermylen J, et al. High titer inhibitors in severe haemophilia A. A meta-analysis based on eight long-term follow-up studies concerning inhibitors associated with crude or intermediate purity factor VIII products. Thromb Haemost 1994;72: Goudemand J, Rothschild C, Demiguel V, Vinciguerrat C, Lambert T, Chambost H, et al. Influence of the type of factor VIII concentrate on the incidence of factor VIII 212 v o l. 3 n r n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

7 inhibitors in previously untreated patients with severe hemophilia A. Blood 2006;107: Scharrer I, Bray GL, Neutzling O. Incidence of inhibitors in haemophilia A patients - a review of recent studies of recombinant and plasma-derived factor VIII concentrates. Haemophilia 1999;5: Kasper CK, Aledort L, Aronson D, Counts R, Edson JR, Van Eys J, et al. A more uniform measurement of factor VIII inhibitors. Thromb Diath Haemorrh 1975;34: Verbruggen B, Novakova I, Wessels H, Boezeman J, Van den Berg M, Mauser-Bunschoten E. The Nijmegen modification of the Bethesda assay for factor VIII:C inhibitors: improved specificity and reliability. Thromb Haemost 1995;73: Giles AR, Verbruggen B, Rivard GE, Teitel J, Walker I. A detailed comparison of the performance of the standard versus the Nijmegen modification of the Bethesda assay in detecting factor VIII:C inhibitors in the haemophilia A population of Canada. Association of Hemophilia Centre Directors of Canada. Factor VIII/IX Subcommittee of Scientific and Standardization Committee of International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost 1998;79: Ontvangen 6 maart 2006, geaccepteerd 15 augustus C o r r e s p o n d e n t i e a d r e s Dr. W.L. van Heerde, stollingsfysioloog Mw. drs. J. Boekhorst, arts-onderzoeker Dr. H.W. Verbruggen, stollingsfysioloog UMC St Radboud Centraal Hematologisch Laboratorium CHL 462 Postbus HB Nijmegen Tel.: Mw. dr. I.R.O. Nováková, internist-hematoloog Mw. dr. M.G. van Kraaij, internist-hematoloog Afdeling Hematologie Correspondentie graag richten aan de eerste auteur. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. Kansloos bestaat niet! n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 3 n r