UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar VACCINATIE TEGEN VLEKZIEKTE BIJ DOLFIJNEN door Yi CUI Promotor : Prof. Dr. Eric Cox Medepromotor : Dr. Geraldine Lacave Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

2

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar VACCINATIE TEGEN VLEKZIEKTE BIJ DOLFIJNEN door Yi CUI Promotor : Prof. Dr. Eric Cox Medepromotor : Dr. Geraldine Lacave Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

4 De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

5 VOORWOORD Een thesis maken is geen éénmanswerk. Er wordt veel werk verzet achter de schermen om het uiteindelijke stuk tot een goed einde te brengen. Graag zou ik mijn promotor, Prof. Cox willen bedanken om mij de kans te geven deze thesis aan te vatten, mij de juiste richtingen uit te sturen, bij te sturen indien nodig en te helpen bij de verschillende verbeteringen. Ook mijn begeleider Dr. Lacave zou ik graag bedanken. Bedankt om me te helpen in een wereld die niet altijd even makkelijk toegankelijk is. Ondanks uw drukke schema had u altijd wel ergens een kleine gaatje voor mij, bedankt daarvoor. Bedankt ook Prof. Dewulf voor het uitlenen van de epidemiologische boeken en het advies allerhande. Verder zou ik ook graag iedereen bedanken die mij het hele jaar heeft bijgestaan met het schrijven van mijn thesis. Het is geen vanzelfsprekende job om een klagende thesisstudente te ondersteunen en verder te helpen! Een extra bedankje gaat naar de mopeke van Dries en Dries zelf voor het nalezen van de thesis.

6 INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING INLEIDING LITERATUURSTUDIE E. rhusiopathiae bij het varken Epizoötiologie Pathogenese Immunologie Diagnose Klinische diagnose Isolatie en identificatie van E. rhusiopathiae Serologische diagnose bij het levend dier Evolutie in de diagnostische technieken voor de vlekziekte Behandeling en bestrijding Behandeling Bestrijding Toekomstige vaccins E. rhusiopathiae bij de dolfijn Epizoötiologie Bron van infectie Pathogenese Immunologie Diagnose Behandeling en bestrijding Behandeling Bestrijding Immunologisch profiel na vaccinatie bij de dolfijn Antistoffen aanwezig in het serum van de dolfijn Actieve immuniteit Vaccinatie met dolfijnenisolaten Antistoffen in dolfijnenmelk Vaccinatie bij dolfijnkalveren Cellulaire immuniteit na vaccinatie Epidemiologie: klinische veldstudie Algemeen Protocol van een klinische veldstudie Achtergrond en het waarom van de studie Specifieke doelstellingen Criteria voor het selecteren van dieren Beschrijving van de studieopzet Beschrijving van de behandelingsprocedure Beschrijving van alle klinische, biologische e.a. methodes Kwaliteitscontrole Parameters ter vergelijking Opvolging (follow-up) Definitie van bijwerkingen (Statistische) analyse Veldstudie: Evaluatie van vlekziektevaccins bij varkens Conclusies LITERATUURLIJST... 28

7 SAMENVATTING Erysipelothris rhusiopathiae veroorzaakt vlekziekte bij verschillende dieren. Het dringt binnen via de exogene en endogene weg en manifesteert zich in drie vormen bij de dieren, namelijk de acute, de subacute en de chronische vorm. Men kan tegen deze ziekte vaccineren met levend verzwakte of geïnactiveerde vaccins. Vooral in de varkensindustrie heeft de ziekte een grote economische impact. De laatste jaren ondervinden de varkensbedrijven in Amerika, Australië en Azië opnieuw opflakkeringen van vlekziekte. De uitbraken veroorzaken veel economische verliezen in de industrie. Men heeft de laatste tien jaar veel onderzoek verricht naar nieuwe diagnostische technieken (genetische identificatie en dergelijke) om de kiem op te sporen en te karakteriseren. Verder wordt gewerkt aan onderzoek naar nieuwere vaccins. Men heeft potentiële kandidaten (namelijk oppervlakte antigenen) gevonden die men als subeenheid in een vaccin kan gebruiken. Deze proteïnen zijn sterk immunogene antigenen. Het ontwikkelen van DNA vaccins behoort ook tot de toekomstige mogelijkheden. Ook bij de dolfijn veroorzaakt E. rhusiopathiae veel problemen. De belangrijkste weg van besmetting is de perorale weg (via gecontamineerde vis en water). Hier komt de ziekte enkel in de acute en chronische vorm voor. Wegens de zeer acute aard van de eerste vorm wachten de verzorgers van de dieren niet tot ze symptomen vertonen. De dieren worden direct behandeld met hoge dosissen antibiotica en symptomatische ondersteuning. Men kan ook hier preventief ingrijpen door de dolfijnen te vaccineren met commerciële varkensvaccins. Deze vaccins gaven echter aanleiding tot problemen in Amerika, Zuid-Afrika en Australië. Zo stierven in het verleden al dolfijnen door anafylactische shock, geïnduceerd door de vaccinatie. Hierdoor stopten de meeste dolfinaria in deze gebieden met vaccineren en bleven ze twijfelachtig tegenover het gebruik van commerciële vaccins. Europese dolfinaria bleken niet met deze problemen van anafylactische shock te kampen te hebben, maar vaccineerden in die periode ook minder. Sinds men in de jaren negentig begonnen is met het onderzoek naar vaccinatie bij de dolfijn, zijn vele dolfinaria in Europa begonnen met het gebruiken van het commerciële varkensvaccin Eurovac Ery, dat in het onderzoek gebruikt werd. Dit vaccin was niet op de Amerikaanse markt. Een nieuw bacterinvaccin, ER BAC PLUS, beschikbaar sinds een aantal jaren in Amerika, maar nog niet in Europa, zou de neveneffecten van oudere vaccins reduceren of elimineren. Mede hierdoor, en ook omdat er de laatste jaren meerdere acute gevallen van vlekziekte gerapporteerd werden binnen grote privécollecties van walvisachtigen, hebben sommige Amerikaanse dolfinaria rond 2003 besloten tot het herinvoeren van het vaccinatieprogramma tegen vlekziekte. Doordat Eurovac Ery tegenwoordig uit de Europese markt genomen is door de komst van nieuwe vaccins, tracht men het Amerikaanse vaccin, ER BAC Plus, te registreren voor het gebruik op de Europese markt. Dit vaccin heeft als voordeel dat het de bijwerkingen van de oudere vaccins elimineert en reeds werd uitgetest in de praktijk in Amerika (Lacave G., Persoonlijke mededeling, 2011). Hoe kan men echter de efficiëntie van een nieuw vlekziektevaccin evalueren? Dit probleem werd vanuit een epidemiologische standpunt benaderd. Vertrekkende vanuit een theoretische achtergrond werd ook bekeken hoe men in de praktijk een epidemiologische veldstudie tot stand kan brengen.

8 1 INLEIDING E. rhusiopathiae is de verwekker van vlekziekte. De kiem is een niet-zuurvast gram-positief staafje. Het is een onbeweeglijke, niet sporenvormende, obligaat parasitaire, facultatief pathogene, facultatief anaerobe en α- haemolytische bacterie (Morgan et al., 1994; Wood 1984). De kiem komt ubiquitair voor. Hij kan geïsoleerd worden uit de tonsillen van gezonde varkens, wilde varkens, vogels, vissen, runderen, schapen, knaagdieren, zeezoogdieren en ook uit de bodem. Hoewel de kiem geïsoleerd kan worden uit de slijmlaag van vissen, is hij niet pathogeen voor de vis zelf. Voor een niet sporenvormend bacterie is E. rhusiopathiae opmerkelijk resistent tegen uitwendige invloeden (Cornelisse, 1993). De bacterie is wel gevoelig aan een lage ph en galzouten, en is dus geen enterische kiem (Bauwens et al., 1992). Men onderscheidt twee kolonietypen: de S(mooth) en de R(ough)-vorm. Bij inoculatie op bloed agars vormt het S-type kleine, ronde, gladde, glanzende kolonies, omgeven door een partiële zone van haemolyse. Deze kolonies worden gevormd uit smalle, kromme staafjes die men isoleert bij acuut geïnfecteerde dieren. Het R- type daarentegen vormt ruwe, onregelmatige, doffe kolonies die niet haemolytisch zijn. De R kolonies ontwikkelen zich uit de filamenteuze vormen van de bacterie, die men kan isoleren uit chronisch geïnfecteerde dieren (Bauwens et al., 1992; Wood, 1992). Het R-type is in het algemeen minder virulent dan het S-type (Cornelisse, 1993). Het genus Erysipelothrix werd door Takahashi et al. (1987a, 1992) in twee species onderverdeeld: Erysipelothrix rhusiopathiae (serotypes 1a, 1b, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 21 en serotype N) en Erysipelothrix tonsillarum (serotypes 3, 7, 10, 14 en 20). Het onderscheid tussen de twee bovenstaande species gebeurt met behulp van DNA-DNA hybridisatie. De twee species verschillen van elkaar in hun mogelijkheid om zuur te produceren uitgaande van saccharose. E. tonsillarum is niet pathogeen voor het varken, in tegenstelling tot E. rhusiopathiae (Takahashi et al., 2008). De stammen die tot de serotypes 13, 17, 18, 22 en 23 behoren, vertonen patronen die niet samengaan met één van de twee hoger vermelde species. De verschillende isolaten worden geserotypeerd door een immunoprecipitatietest met gekende antisera (antisera specifiek voor bepaalde serotypes). Dit gebeurt op basis van antigenische verschillen tussen de diverse hittestabiele, oplosbare peptidoglycaanfragmenten van de celwand. Deze fragmenten mogen niet verward worden met de glycolipoproteïne-antigenen die de gastheerimmuniteit induceren (Wood, 1979). De N- stammen bezitten geen hitte-stabiele antigenen (Takahashi et al., 1992). De meeste stammen van de vlekziekte bezitten één of meerdere gemeenschappelijke hitte-labiele celwandantigenen (proteïnen of proteïne-saccharide-lipide complex). De aanwezigheid van deze antigenen resulteert in kruisagglutinatie of gemeenschappelijke kruisimmuniteit (Wood, 1992). Erysipelothrix rhusiopathia produceert de virulentiefactor neuraminidase om zijn pathogeniciteit te verhogen. Neuraminidase verwijdert N-acetylneuraminezuur van mucine, fibrinogeen en erythrocyten. Het verhoogt tevens het katabolisme door zijn invloed op de erythrocyten, leukocyten en de levensduur van de glycoproteïnen. De virulentiefactor neuraminidase tast ook het N-neuraminezuur van de hartcellen en de immunoglobulines aan. Men vindt neuraminidase niet terug in de niet-pathogene Erysipelothrix species (zoals E. tonsillarum) (Abrashev en Orozova, 2006; Gyles en Thoen, 1993; Wang et al., 2005). Een andere virulentiefactor is een hitte-labiele en trypsinegevoelige structuur op de bacteriële oppervlakte die verantwoordelijk is voor de adhesie (Muller, 1980; Takahashi et al., 1987b). 2

9 De virulentie van de kiem wordt ook gedefinieerd door zijn capaciteit om de immuniteit van de gastheer te omzeilen. Erysipelothrix rhusiopathiae slaagt erin om na fagocytose te overleven en zich te vermenigvuldigen in een macrofaag. De verklaring kan deels gezocht worden in de gereduceerde productie van de reactieve oxidatieve metabolieten van de macrofaag. Een hypothese is dat vlekziekte de gastheercel binnendringt via een receptor die de oxidatieve burst niet initieert (Yoshihiro et al., 1996). Men heeft ook gevonden dat bij het verlies van het exopolysaccharide kapsel bij mutanten van vlekziekte, de kiem niet meer in staat is om de fagocytose te overleven in de proefmuizen. Ze worden gefagocyteerd door de polymorfonucleaire leukocyten en overleven ook niet meer in macrofagen. Dit suggereert dat het kapsel ook een virulentiefactor is. Het kapsel beschermt waarschijnlijk tegen gastheerreacties zoals fagocytose en adhesieve oppervlakteproteïnen die binden aan de extracellulaire matrixproteïnen (Shimoji et al., 1994; Shimoji et al., 1998; Shimoji et al., 2003). E. rhusiopathiae bezit het heat-shock proteïne gen dat samen met de dnaj en grpe co-chaperone genen wordt geactiveerd in stressomstandigheden (de immuniteitsrespons van de gastheer creeërt bijvoorbeeld zo n stressmilieu). Na de beschadiging van de cellulaire proteïnen door de stress-situatie is hun hoofddoel de eiwitten herplooien in hun correcte driedimensionele structuur. Ook katalyseren ze de degradatie van de beschadigde proteïnen bij onmogelijk herstel. Deze genen spelen een belangrijke rol in de pathogenese van de gram-positieve bacterieën in hun strijd tegen de gastheerimmuniteit (Rockabrand et al., 1993). Hieronder worden de verschillende facetten van vlekziekte bij het varken en de dolfijn besproken. Er wordt ook nader ingegaan op de verschillen tussen de twee diersoorten. Tenslotte wordt er uitgebreid ingegaan op de methodes voor het opzetten van een epidemiologische veldstudie. 3

10 2 LITERATUURSTUDIE 2.1 E. RHUSIOPATHIAE BIJ HET VARKEN Epizoötiologie Het varken is het belangrijkste reservoir voor E. rhusiopathiae. Bijna de helft van de varkens is drager van de kiem in de tonsillen en andere lymfoïde weefsels. Buiten de varkens komt de kiem ook voor bij talrijke andere dieren (wilde zoogdieren, wilde vogels, verschillende huisdieren, vissen, zeezoogdieren, ). Hun rol in de spreiding van de ziekte is echter van ondergeschikt belang (Buxton en Fraser, 1977; Geraci et al., 1966). Door de omgevingsresistentie van de kiem kunnen mechanische vectoren zoals huisvliegen en bloedzuigende arthropoda ook een middel zijn van verspreiding (Geraci et al., 1966). Vlekziekte is tevens een zoönose. Ze wordt meestal verspreid door een wondinfectie en komt dus voornamelijk voor bij mensen die vis of vlees hanteren (Brooke 1999) Pathogenese Het al dan niet ontstaan en het verloop van de ziekte hangt sterk af van de virulentie van de stam, de infectiedruk, predisponerende factoren en de afweer van de gastheer. Het gaat om een facultatief pathogene kiem die zowel een endogene als exogene infectie kan veroorzaken. De bacterie kan bij een exogene infectie intreden via een huidwonde, per oraal of via inhalatie. Bij een endogene infectie zijn de pathogenen aanwezig in de tonsillen. Door omgevingsfactoren (zoals voeding, omgevingstemperatuur, stress, transport, ) doorbreekt de kiem de epitheelbarrière ter hoogte van de tonsillen en komt zo in de bloedbaan terecht. Na de exogene of endogene infectie treedt een septicemie op. Deze evolueert dan verder tot een acuut, subacuut, subklinisch of chronisch ziektebeeld (Buxton en Fraser, 1977; Gyles en Thoen, 1993; Cornelisse, 1993; Timoney en Groschup, 1993; Wood, 1984; Wood 1992). Varkens zijn het meest gevoelig tussen de leeftijd van drie maanden en drie jaar. Vóór de drie maanden speelt de maternale immuniteit een rol in de protectie tegen vlekziekte. Vanaf drie jaar ouderdom hebben de varkens al een beschermende immuniteit opgebouwd door meervoudige subklinische infecties gedurende hun leven (Opriessnig et al. 2004). Acute vlekziekte wordt gekenmerkt door het plots optreden van (ernstige) algemene symptomen. Koorts kan aanleiding geven tot abortus (er vindt geen transplacentaire overdracht van de kiem plaats) en vruchtbaarheidstoornissen. Bij een uitgebreide septicemie vindt men vaak hyperacute sterfte. Men constateert ook frequent hemorrhagische plekken op meerdere plaatsen van het lichaam. Bewegingstoornissen kunnen aanwezig zijn ten gevolge van (acuut) non-purulente arthritis. Bij subacute vlekziekte zijn de algemene symptomen en non-purulente arthritis gelijkaardig aan het acute beeld, maar minder sterk uitgesproken. Het sterftepercentage ligt ook lager. Typerend aan de subacute vorm of huidvorm zijn de centraal gedepigmenteerde, grijze, rhomboïde letsels ( diamond skin lesions ) verspreid over het lichaam. Na enkele dagen treedt er genezing op van de vlekken. Men kan in de praktijk niet altijd even duidelijk het onderscheid maken tussen de acute en subacute vorm, omdat er vaak overgangsvormen voorkomen (Buxton en Fraser, 1977; Gyles en Thoen, 1993; Cornelisse, 1993; Timoney en Groschup, 1993; Wood, 1984; Wood 1992). 4

11 Vanuit de acute, subacute en subklinische vorm kan vlekziekte evolueren tot een chronische ziekte. Deze wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van proliferatieve endocardities, arteritis en/of polyarthritis. Men vermoedt dat door een continue aanwezigheid van de pathogeen of zijn antigenen een type III allergie (vorm van hypersensitiviteit) wordt uitgelokt. Initiële schade (bijvoorbeeld aan het kraakbeen) wordt veroorzaakt door de pathogeen zelf, maar de latere destructie is mogelijk een gevolg van de opgewekte type III allergie. Dit impliceert dat de behandeling van deze vorm sterk bemoeilijkt wordt (Buxton en Fraser, 1977; Denecke en Trautwein, 1986; Drommer, 1982; Schulz et al., 1980; Wood, 1984; Wood 1992) Immunologie De vlekziektebacil induceert zowel de humorale als cellulaire immuniteit (Galán en Timoney, 1990). Desondanks speelt de humorale immuniteit wel een grote rol in de bescherming (Shimoji et al., 1996; Imada et al., 1999). De IgA, IgG en IgM antistoffen worden gevormd in het verweer tegen de Erysipelothrix. IgG en IgM zijn complement-activerende en opsoniserende antistoffen. Protectie wordt geboden door binding van de antistoffen op het sterk immunogene Spa antigen van vlekziekte. De opsoniserende antistoffen zorgen ook voor een efficiëntere eliminatie van de kiem door het activeren van de macrofagen en de polymorfonucleaire leukocyten (Roit et al., 1993; Sawada et al., 1987). Eerder onderzoek heeft uitgewezen dat een antigen ter grootte van kda zeer immunogeen is. Dit celwandproteïne blijkt het voornaamste protectieve oppervlakte-antigen (SpaA) te zijn (Galán en Timoney, 1990; Makino et al., 1998). De antigenstructuur heeft veel gelijkenis met de glycopeptide- componenten die men vaak terugvindt in de celwanden van bacteriën. Na het toedienen van dat antigen aan muizen stelde men vast dat muizen actief worden beschermd tegen vlekziekte. Protectie bestaat dan voornamelijk uit het vormen van antistoffen tegen dit antigen (Timoney en Groshup, 1993). Deze bescherming is ook niet serotype-specifiek. Met behulp van een latex-agglutinatietest wil men de antistoffen tegen die kda proteïnen opsporen (Sato et al., 1998, White et al., 1970). Later heeft men ook gevonden dat het SpaA proteïne gecodeerd wordt door het spaa gen. De volledige sequentie van het spaa lijkt sterk geconserveerd te zijn bij alle serotypes van E. rhusiopathiae die dit gen bezitten (Imada et al., 1999). Het gaat hier om de serotypes 1a, 1b, 2, 5, 8, 9, 12, 15, 16, 17 en N van E. rhusiopathiae (Makino et al., 1998). Met behulp van sequentie analyse heeft men de spa gerelateerde genen van alle E. rhusiopathiae serotypes en van het serotype 18 onderzocht. Men heeft hierbij drie spa gerelateerde molecules gevonden die aanwezig zijn in het Erysipelothrix genus. Hieruit blijkt dat alle E. rhusiopathiae serotypes minstens één Spa proteïne op hun celloppervlak hebben. De drie Spa proteïnes kunnen worden geclassificeerd in drie moleculaire soorten: SpaA, SpaB en SpaC. Na onderzoek met PCR en immunoblotting heeft men dit Spa gen/proteïne niet teruggevonden bij E. tonsillarum. Dit suggereert dat de Spa proteïnen misschien ook een virulentiefactor zouden kunnen zijn tijdens de pathogenese van vlekziekte. Ze kunnen dus ook gebruikt worden in het differentiatieproces tussen de twee Erysipelothrix species met behulp van diagnostische technieken (PCR, immunoblotting, ). Het SpaA proteïne komt, zoals hierboven beschreven voor bij de serotypes 1a, 1b, 2, 5, 8, 9, 12, 15, 16, 17 en N van E. rhusiopathiae. SpaB komt voor bij de serotypes 4, 6, 11, 19 en 21. Serotype 18 produceert het SpaC proteïne. Serotype 18 wordt niet geclassificeerd bij E. rhusiopathiae of E. tonsillarum. De gelijkenissen 5

12 tussen de aminozuursequenties zijn het grootst bij de serotypes die behoren tot dezelfde Spa soort en kleiner tussen de serotypes van verschillende Spa soorten. De grootste diversiteit in de Spa proteïnen vindt men terug ter hoogte van het N-terminale uiteinde van de molecule. Dit uiteinde speelt ook een belangrijke rol in de bescherming tegen vlekziekte. Met immunoblotting heeft men gevonden dat konijn-antiserum dat specifiek gericht is tegen elk van de Spa proteïnen, sterker reageert met een homoloog Spa proteïne dan met een heteroloog Spa proteïne. Een muis kruis-protectie test toonde aan dat de drie recombinante Spa stammen een hogere bescherming bieden aan de homologe stammen dan aan de heterologe. Het recombinante SpaC heeft zelfs goeie protectie tegen de heterologe stammen. Men had dit niet verwacht omdat de sequentie tussen SpaA en SpaC, in het domein belangrijk voor de inductie van de immunologische bescherming, sterk divers zijn. Men kan dit fenomeen op twee manieren verklaren. Een eerste verklaring is dat er bij beide Spa s eventueel gelijkaardige, korte, lineare epitopen voorkomen in het protectieve domein. Een andere verklaring is dat in de SpaC conformationele epitopen aanwezig zijn die functioneren als kruis-protectieve epitopen. Hoe dan ook, het SpaC heeft het meeste potentieel om als antigeen te fungeren in een nieuw vaccin (To en Nagai, 2007). De Spa proteïnen hebben twee evolutionair sterk geconserveerde regio s. Het C-terminale uiteinde met negen tandem-repeats van 20 aminozuren en het N-terminale uiteinde met aminozuursequenctie van de signaalsequentie regio. De tandem-repeats regio van het C-terminale uiteinde zou functioneren als een verankeringssysteem om het Spa proteïne stevig te binden aan het bacteriële oppervlakte (To en Nagai, 2007). De aanwezigheid van die 20-aminozuren tandem-repeats zou essentieel zijn voor de inductie van de immuniteit, wat het een goede kandidaat maakt voor een toekomstige subeenheid vaccin tegen vlekziekte (Makino et al., 1998). Imada et al. (1999) en Shimoji et al. (1999) betwisten echter het belang hiervan. Shimoji et al. (1999) hebben in een proefopstelling waarbij muizen geïmmuniseerd werden met ofwel het SpaA proteïne of het C-terminale uiteinde, aangetoond dat het C-terminale uiteinde niet aan de basis ligt van de protectie. Daarbij is het voorkomen van deze repeat regio ook niet exclusief bij E. rhusiopathiae, men heeft het ook nog gevonden bij oppervlakteproteïnen van andere gram-positieve bacteriën. Dit suggereert dat het verankeringsmechanisme behalve bij vlekziekte ook nog voorkomt bij andere gram-positieve pathogene bacteriën (To en Nagai, 2007). De aminozuren van de signaal-sequentieregio van het N-terminale deel van de Spa s zijn identiek voor alle Spa proteïnen. Men vermoedt dat de Spa proteïnen doorheen de bacteriële celwand kunnen migreren en uiteindelijk gesecreteerd kunnen worden met behulp van een secretiemechanisme dat voorkomt bij E. rhusiopathiae stammen. In de α helicale helft van het N-terminale uiteinde vindt men de sequentiediversiteit weer van de Spa proteïnen. Dit gebied zou men kunnen aanduiden als een hypervariabel domein. Men heeft ook gevonden dat deze helft van het N-terminale uiteinde belangrijk is voor de immunoprotectie tegen E. rhusiopathiae infectie (Imida et al. 1999; Shimoji et al. 1999; To en Nagai, 2007). Imida et al. (1999) hebben in hun onderzoek gevonden dat de N-terminale 342 aminozuren (van 90 tot 431) van de Fujisawa SpaA, gefusioneerd met een histidine hexameer, de component is die bescherming induceert in het varken tegen de vlekziekte serotype 1 en Diagnose Diagnose van de vlekziekte gebeurt op basis van de klinische tekens, bacteriologisch onderzoek en serologie. 6

13 Klinische diagnose Door de vage aard van de symptomen is het onmogelijk een onderscheid te maken tussen de vlekziekte en andere septicemische aandoeningen. Enkel de rhomboïde huidletsels zijn pathognomonisch voor de vlekziekte, maar deze zijn enkel te zien bij de subacute vorm. Bij varkens kan men een hoge dosis penicilline gebruiken als een diagnostische behandeling bij acute vlekziekte. Na deze behandeling treedt na uur een opmerkelijke verandering op (Wood, 1992) Isolatie en identificatie van E. rhusiopathiae De kiem kan bij een acute infectie geïsoleerd worden uit verschillende organen (lever, milt, nier, long, hart, gewrichten) van het gestorven dier. Bij een chronische infectie kan de bacterie enkel nog geïsoleerd worden uit de gewrichten. Het cultiveren van de bacterie gebeurt in eerste instantie in een cultuurmedium aangevuld met tryptose, of in een vleesinfusiemedium met of zonder bloed of serum (Wood, 1992). Men heeft daarnaast selectieve media die de kiem verder kunnen onderscheiden van andere contaminanten. Een medium met inhibitoren zoals natriumazide, kristalviolet, fenol en/of kanamycine kan ook gebruikt worden (Bratberg, 1981). Men kan de kiem ook opkweken in een aanrijkend milieu zoals Wood s Erysipelothrix selectieve bouillon. Opkweken in zo n aanrijkend milieu maakt dat de isolatie van de kiem met een hogere gevoeligheid kan gebeuren dan de directe isolatie (Bender et al. 2009). Ook een hemocultuur kan gebruikt worden worden voor isolatie bij levende dieren. Hierbij dient men wel stalen te nemen van verschillende geïnfecteerde dieren omdat de kiem niet altijd aanwezig is bij elk individueel dier (Wood, 1992). Een manier om de vlekziekte-bacil van andere gram-positieve bacillen (Listeria monocytogenes, Corynebacterie species) te differentiëren is door zijn serum-coagulerende eigenschappen na te gaan. De kiem wordt vaak verward met andere gram-positieve bacillen door hun gelijkende gramkleuring en koloniemorfologie. E. rushiopathiae veroorzaakt geen stafylocoagulase geïnduceerde coagulatie van het serum. Het bezit dus geen coagulase enzyme dat de coagulatiecascade in gang zet. Wat het wel doet is het anticoagulerende citraat afbreken tijdens de bacteriële groei, zodat er fysiologische coagulatie kan plaatsvinden (Takahashi et al., 1990). Men kan de verschillende stammen serotyperen aan de hand van de oplosbare peptidoglycaan-fragmenten van de bacteriële celwand. Deze fragmenten zijn hittestabiele antigenen die antigenisch verschillend zijn. Met behulp van een immunoprecipitatietest met antisera specifiek tegen bepaalde serotypes, gaat men de verschillende stammen serotyperen (Wood, 1979). Bij varkens met acute vlekziekte behoren de meeste isolaten tot serotype 1a, 1b en 2 (Eamens et al., 1988; Wood, 1979), in tegenstelling tot de isolaten die bij de varkens geen acute vlekziekte veroorzaken. Twintig procent daarvan behoort tot andere serotypes dan de courante serotypes 1a, 1b en 2 (Wood en Harrington 1978). Volgens Opriessnig et al. (2004) worden de serotypes 1a en 1b eerder geassocieerd met de acute vlekziekte en serotype 2 eerder met de chronische vorm. 7

14 Serologische diagnose bij het levend dier Voor de serologische diagnose zijn meerdere testen beschikbaar, namelijk de hemagglutinatie-inhibitietest, de complementbindingsreactie, de micro-agglutinatietest, de buisjesagglutinatietest, de indirecte immunofluorescentie, de passieve hemagglutinatietest en de groei-agglutinatietest. Voor routineonderzoek zijn deze testen echter ongeschikt, mede door het feit dat ze niet gevoelig genoeg zijn (Wood, 1992). Een groot nadeel bij de indirecte immunofluorescentietest is de residuele niet specifieke fluorescentie. Bij agglutinatietesten worden dan weer vooral de IgM antistoffen opgespoord en minder de IgG, terwijl de IgG antistoffen juist een belangrijke parameter zijn voor systemische afweer. Ook geven agglutinatietesten frequent ongewenste en aspecifieke reacties door antistoffen die binden aan een verwant antigen, rouleaux-vorming van erythrocyten of door aggregatie onder invloed van sommige chemische substanties (hyaluronzuur, metaalionen, ). Men heeft dus bij deze testen vaak te maken met vals positieven en vals negatieven (Kennedy-Stoskopf, 1990) Evolutie in de diagnostische technieken voor de vlekziekte Voor de detectie van antilichamen tegenover pathogene organismen is de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) een nieuwer populaire techniek. De specificiteit van deze techniek is wel afhankelijk van het voorhanden zijn van een specifiek en stabiel (subunit) antigen om de gewenste antilichamen mee op te sporen. Men heeft gevonden dat het immunogene 65kDa antigen een goeie kandidaat is voor het opsporen van de anti- E. rhusiopahtiae antilichamen (IgG, IgM, IgA). Dat antigen werd gebruikt in een ELISA voor het serologisch onderzoek van varkens geïnfecteerd met serotype 1a, 1b en 2. In alle drie de gevallen gaf de ELISA een positief resultaat. Verder onderzoek naar verband tussen de kwantiteit van de antilichamen en de protectieve mogelijkheden ervan moet nog gebeuren (Chin et al., 1991). Een nieuwere techniek van detectie van E. rhusiopathiae is PCR (polymerase chain reaction). Men maakt hierbij gebruik van species-specifieke primers die gevormd zijn op basis van de sequenties op de chromosomale loci die vermoedelijk verantwoordelijk zijn voor de virulentie van de bacterie. Men kan ook gebruik maken van species-specifieke primers op basis van het ribosomale DNA (Shimoji et al., 1998a; Takeshi et al. 1999; Yamazaki 2006). Deze vorm van detectie maakt het mogelijk om ook een onderscheid te maken tussen E. rhusiopathiae, E. tonsillarum en andere micro-organismen (Streptococcus suis, Mycoplasma hyosynovia en Mycoplasma hyorhinis). Men kan met deze methode ook de klassieke vlekziekte serotypes differentiëren van de nieuwere E. rhusiopathiae soorten (voorbeeld de serotypes 13 en 18) (Shimoji et al., 1998a; Takeshi et al. 1999). In het onderzoek van Takeshi et al. (1999) paste men PCR toe op weefselstalen van het slachthuis en heeft men de resultaten vergeleken tussen de directe PCR detectie en cultivatie. Men kwam tot de conclusie dat de resultaten van de directe PCR detectie evenwaardig waren aan de isolatie. Bij de PCR duurde de test in totaal slechts vijf uur. In die gevallen van klinisch aangetaste dieren waar rechtstreekste opsporing met PCR negatief waren, werden de kiemen eerst aangerijkt door cultiveren in een verrijkt milieu. Dit is vaak nodig bij chronisch geïnfecteerde dieren waar men de kiemen probeert te detecteren uit bijvoorbeeld het synoviaal vocht. Dit heeft echter als nadeel dat de testen langer duren (24u), omdat men eerst de kiemen moet opkweken (Shimoji et al., 1998a; Yamazaki 2006). De detectielimiet is ongeveer van 10 3 tot 10 5 kolonievormende eenheden (CFU)/reactie. Bij gebruik van de kwantitatieve real-time PCR heeft men maar een aanrijkingsperiode 8

15 van 12 uur nodig en duurt de test zelf maar 90 minuten, waardoor de resultaten veel sneller beschikbaar zijn dan bij de klassieke PCR (To et al. 2009). Wegens de eenvoud, snelle beschikbaarheid en hoge sensitiviteit kan men de PCR gebruiken als een eerste-lijns screening waar men de resultaat snel nodig heeft (Shimoji et al., 1998a; Takeshi et al. 1999; To et al. 2009). In Amerika was er tijdens de zomer van 2001 een stijgend aantal uitbraken van vlekziekte op zowel gevaccineerde als niet gevaccineerde varkensbedrijven. De varkens stierven hoofdzakelijk aan de acute vorm van E. rhusiopathiae. In de slachthuizen werden ook meer varkens afgekeurd door het voorkomen van vlekziekte-achtige huidletsels. De industriële gemeenschap vreest voor de mogelijke ontwikkeling van nieuwe erysipelas serotypes of stammen, daling van de vaccin-efficaciteit of dat de uitbraken veroorzaakt werden door de vaccins zelf. Men maakt gebruik van pulsed-field gelelektroforese (PFGE) voor de differentiatie van de genotypes binnenin de serotypes (Eriksson et al., 2009; Opriessnig et al. 2004). PFGE is een techniek die grote deoxiribonucleïnezuur (DNA) molecules scheidt met behulp van een elektrisch veld. Het is de eerste keer in Amerika dat men een genetische karakterisatie maakt van een stam van een bepaald serotype. Op deze manier heeft men geprobeerd om de geïsoleerde stammen met de gekende te vergelijken. Daaruit bleek dat men niet te maken heeft met nieuw ontwikkelde stammen. Of de uitbraken veroorzaakt worden door het vaccin zelf, had men geen conclusieve resultaten. De uitbraken kunnen eventueel ook het gevolg zijn van een slecht vaccinatieschema (schema niet strikt opgevolgd, geen rekening gehouden met maternale immuniteit, ) of door recurrente opflakkering van andere agentia (porcine reproductive en respiratoire syndroom, porcine circovirus type 2) die de immuniteit van de varkens onderdrukten en zo vlekziekte de kans geven om op te komen. Andere technieken werden ook aangewend om E. rhusiopathiae isolaten verder te onderzoeken die eventueel een rol hebben gespeeld in uitbraken. Eamens et al. (2006a) hebben bacteriële isolaten van uitbraken (bij zowel gevaccineerde als niet gevaccineerde dieren) gekarakteriseerd met moleculaire fingerprinting strategiën: restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyse en plasmid profiling. Het zijn goede onderzoeksmethoden om te gebruiken bij epidemiologische toezicht op de E. rhusiopathiae stammen die zowel in het verleden als nu circuleren. In hun onderzoek gebruikten de onderzoekers de restrictie-enzymen: RsaI en AluI. Sinds men in Japan gebruik maakt van een gecommercialiseerd levend verzwakt vaccin is de prevalentie van de acute en subacute vorm van vlekziekte sterk teruggedreven. Maar men komt steeds meer en meer de chronische vorm van de ziekte tegen in de slachthuizen. Om te achterhalen of dit mogelijk het gevolg is van het gebruik van een geattenueerd vaccin, heeft men een procedure opgesteld om te screenen naar vaccingerelateerde stammen. Men gaat eerst de geïsoleerde stammen serotyperen en onderwerpen aan random amplified polymorphism DNA (RAPD) analyse. De tweede stap is een sequentieanalyse van de hypervariabele regio in het spaa gen (Nagai et al. 2008). In het onderzoek van Imada et al. (2004) heeft men met behulp van RAPD gevonden dat in de laatste elf jaar, 37% van de chronische gevallen van vlekziekte bij varkens te wijten is aan het levend verzwakte vaccin Behandeling en bestrijding Behandeling Men kan penicilline en antiserum, vaak gecombineerd, toedienen tegen vlekziekte. Deze therapie is het meest efficiënt in een vroeg stadium van de ziekte. Bij het varken zou het toedienen van een hoge dosis 9

16 penicilline een zichtbare klinische verbetering moeten geven binnen de 24 tot 36 uur. In de chronische fase heeft de pathogeen al irreversibele schade veroorzaakt in het lichaam. Bovendien is de kiem moeilijk bereikbaar voor het therapeuticum. Dit heeft tot gevolg dat de behandeling niet meer effectief is in dit stadium. Deze chronisch geïnfecteerde dieren kunnen wel nog steeds de kiem uitscheiden en de omgeving contamineren (Buxton en Fraser, 1977; Wood, 1992). Naast het toedienen van penicilline en een antiserum moeten de dieren ook symptomatisch behandeld worden. Rust, koele ligplaats, licht-verteerbaar of vloeibaar voedsel, weren van insecten e.d. is dan ook geen overbodige luxe (Cornelisse, 1993) Bestrijding Door zijn ubiquitair voorkomen en zijn uitgesproken resistentie tegenover de omgeving, is het bijna onmogelijk om de kiem uit te roeien. Daarom zijn profylactische maatregelen en behoud van goede hygiëne zeer belangrijk. Men past zowel passieve als actieve immunisatie toe (Cornelisse, 1993). Passieve immunisatie richt zich naar de niet-klinisch zieke contactdieren in een besmet milieu. Het hyperimmuunserum wordt subcutaan achter het oor toegediend. De bescherming duurt 1 à 2 weken (Cornelisse, 1993). Actieve immunisatie gebeurt aan de hand van levend verzwakte of geïnactiveerde vaccins. Door passage van serovar 1 of serovar 2 stammen op geëmbryoneerde eieren, konijnen of door het kweken van vlekziekte-stammen in een medium dat acridine kleurstoffen bevat, kan men levend verzwakt vaccin bekomen. Men kan deze stammen zowel parenteraal als via het drinkwater en via aërosol toedienen. In België worden geen verzwakte vaccins gebruikt (Buxton en Fraser, 1977; Wood 1992). Voor het bekomen van geïnactiveerde vaccins maakt men gebruik van stammen die behoren tot het serovar 2. Als men deze stammen opkweekt in een medium dat serum bevat, vormen ze een immunogeen, oplosbaar glycolipoproteïne (antigen). Dit antigen is noodzakelijk voor het induceren van de bescherming. Het met formaline geïnactiveerde vaccin bevat naast geïnactiveerde kiemen, het bovenvernoemde oplosbaar antigen en een adjuvans (aluminiumhydroxide) (Gyles en Thoen 1993; Wood, 1984; Wood 1992). De vaccins worden subcutaan of intramusculair toegediend. Voor de primo-vaccinatie moet het dier twee maal gevaccineerd worden, met een interval van drie tot vier weken. De vaccins beschermen het dier tegen zowel de acute als subacute vorm van E. rhusiopathiae, maar niet tegen de chronische ziektevorm (Haesebrouck et al., 2004; Wood 1992). Deze bescherming duurt ongeveer zes maanden. De colostrale immuniteit kan interfereren met de vaccinatie. Men neemt aan dat bij biggen van gevaccineerde zeugen, de duur van interferentie maximaal vier maanden bedraagt (Buxton en Fraser, 1977; Cornelisse, 1993). Om het bestaan van kruisprotectie tussen de verschillende serotypes te achterhalen heeft men varkens gevaccineerd met het serotype 2 vaccin, gechallenged met andere serotype stammen. Behalve de serotypes 9 en 10 die wel nog acute of gegeneraliseerde urticaria letsels veroorzaken, gaven de andere stammen (1a, 1b, 2, 5, 8, 11, 12, 18, 19, 21) geen vlekziekte meer. Hoewel er kruisprotectie is tussen de meeste stammen is dit niet het geval voor alle serotypes (Wood 1979, Wood et al., 1981; Takahashi 1984). Om de effectiviteit van het vaccin te evalueren kan men ook de cellulaire immuniteit bepalen. Eamens et al. (2006b) maten in het bloed van varkens de graad van lymfocytenproliferatie wanneer ze in contact kwamen met specifieke (serovar 2 lysaat) of niet specifieke (concanavalin A, ConA; phytohaemagglutinin, PHA) mitogenen. In hun studie hebben ze zelfs 10

17 gevonden dat sommige vaccins een immunosuppressieve werking kunnen hebben op de cellulaire immuniteit, wat deels het falen van sommige vaccins kan verklaren Toekomstige vaccins Men heeft in een onderzoek nagegaan wat het protectieve effect zou zijn van een met NaOH geëxtraheerde inactief vlekziekte vaccin in varkens. Hierbij gebruikte men de Kyoto stam (serotype 2) van E. rhusiopathiae. Zowel de SPF (speficic pathogen free) biggen als conventionele biggen die nog maternale immuniteit bezaten op het opgenblik van de vaccincatie, vertoonden een hoge antistoffentiter na de vaccinatie. De antistoffentiter was nog hoger bij het gebruik van olie-adjuvanten in het vaccin. Beiden groepen proefdieren waren klinisch beschermd tegen een challenge met de serotypes 1a en 2 van de vlekziekte. De beschermde varkens vertoonden zelfs geen rhomboïdale huidletsels, dit in tegenstelling tot varkens die ingeënt werden met een levend vaccin van de Koganei stam (serotype 1a). Een mogelijke verklaring hiervoor zou de hoge antistoffentiter kunnen zijn die geïnduceerd wordt na de vaccinatie (Kitajima et al., 1997). Shimoji et al. (1998b) suggereren het ontwerpen van een recombinant levend vaccin dat zowel humorale als cellulaire immuniteit moet induceren. In hun proefopzet hebben ze een veelbelovende kandidaat gevonden die als vector kan dienen voor het vaccin, namelijk de acapsulaire E. rhusiopathiae YS-1 mutant. 2.2 E. RHUSIOPATHIAE BIJ DE DOLFIJN Epizoötiologie Bron van infectie E. rhusiopathiae kent verschillende infectiewegen bij de dolfijn. De belangrijkste is de perorale weg: via gecontamineerd voedsel (vis, schaaldieren, ) en water wordt de kiem opgenomen. De voornaamste infectiebron is besmette zeevis (Greenwell et al., 2002; Suer et al., 1988a). Men vermoedt dat de besmetting van de vissen gebeurt na de vangst, gezien vissen in volle zee normaal gezien onbesmet zijn (Cornelisse, 1993). Men heeft in de Antwerpse Zoo over meerdere jaren vier verschillende vissoorten (wijting, sprot, makreel en haring) onderzocht. Bijna de helft van de vissen hadden vlekziekte-isolaten in hun oppervlakkige slijmlaag (Bauwens, 1992). In een studie van Greenwell et al. (2002) heeft men ook de vlekziektekiem geïsoleerd uit haring, lodde en inktvis. Doordat de kiem via de oppervlaktewateren naar andere plaatsen kan getransporteerd worden, zou rioleringsverontreiniging van kustwater ook een besmettingsweg kunnen zijn van de zeevissen (Wood, 1992). De bacterie is niet pathogeen voor de vis zelf, maar wordt gedragen in de slijmlaag van de vissen. De infectie kan ook via schaafwonden of andere huidletsels binnendringen (Geraci et al., 1966). Dit laatste is geen onbelangrijke intredepoort, gezien dolfijnen vaak huidwonden oplopen tijdens het spelen (Gray en Klontz, 1974). De kiem kan ook binnendringen via de conjunctivale, respiratoire en parenterale infectieweg, door bijvoorbeeld steekvliegen en bloedzuigende arthropoden (Geraci et al., 1966; Neundorf en Seidel, 1977). Men heeft gevonden dat bij vis-isolaten verschillende serotypes van vlekziekte voorkomen. Hierbij is vooral het serotype 2 verantwoordelijk voor vlekziekte bij walvisachtigen in gevangenschap (Hashimoto et al., 1974; Turcksin, 2002). 11

18 Gezien vlekziekte een zoönose is, kan de dierenverzorger besmet geraken en vice versa. Dit gebeurt waarschijnlijk via gecontamineerde handen of geïnfecteerde huidwonden (Geraci et al., 1966; Dunn, 1990; Veraldi et al. 2009). Men heeft gevonden dat de serotypes 2, 5, 6, 15 en 21 bij de dolfijnen vlekziekte veroorzaken (Hermans, 1997; Lacave et al., 2001). Het is wel opmerkelijk dat serotype, 2 en 5 relatief veel voorkomen bij dolfijnen. Dit is belangrijke informatie naar de vaccinatie toe, gezien het commerciële vaccin bij varkens onder andere bestaat uit stammen behorend tot serotype 2 (Turcksin, 2002) Pathogenese Men dacht vroeger dat bij de dolfijn enkel de exogene infectieweg voorkomt, doordat men er nog niet in geslaagd was om de kiem te isoleren uit gezonde dolfijnen (Van Poucke, 1994). Later heeft men het agens kunnen isoleren uit klinisch normale walvisachtigen in gevangenschap, bijvoorbeeld een toevalsbevinding bij een elfjarige mannelijke tuimelaar met een maagtorsie, maar ook uit vrijlevende walvisachtigen (Greenwell et al., 2002, Lacave en Cox, Persoonlijke mededeling 2011). De pathogenese is vergelijkbaar met die van het varken. Het ziekteproces hangt ook af van de virulentie van de stam, de infectiedruk, de afweer van de gastheer en de predisponerende factoren (zoals stress, voeding, populatiedensiteit, waterkwaliteit, extreme temperatuurschommelingen, zware parasitaire infestaties, stress tijdens het voorplantingsseizoen, ) (Archaeopteryx, referaat 90; Calle et al., 1993; Sweeney en Ridgway, 1975; Wood 1992). Bij dolfijnen komen maar twee vormen van vlekziekte voor. De acute septicemische vorm en de subacute vorm of huidvorm. De chronische vorm die zich bij het varken uit in endocarditis, arteritis en/of non-purulente arthritis heeft men bij dolfijnen nog niet waargenomen (Fowler en Allen, 1986; Lacave et al. 2001; Sweeney en Ridgeway, 1975). Een vierde vorm, de vesiculaire glossitis, werd beschreven bij een zwaardwalvis (Orcinus orca). De bacterie werd ook geïsoleerd uit de tong van een tuimelaar (Bossart en Eimstad, 1988; Lacave G., Persoonlijke mededeling 2011). Bij de acute septicemische vorm krijgt men meestal sterfte van de dolfijn voordat men enige symptomen heeft waargenomen. Indien er klinische symptomen optreden zijn ze eerder vaag, zoals anorexie, depressie, sufheid, flatulentie, hypersalivatie, dysfagie, leucocytose,.... Histopathologisch vindt men hyperemie en degeneratie van de lever, nier en myocard terug. Zelfs met een vroege, agressieve behandeling kunnen de dieren sterven binnen enkele uren na het verschijnen van de eerste klinische symptomen (Dunn, 1990; Fowler en Allen, 1986; Gauckler, 1976; Geraci et al., 1966; Hoorens et al., 1988). De subacute vorm vertoont meestal algemene ziektesymptomen met leucocytosis, maar in minder erge mate dan bij de acute vorm (Dunn, 1990; Gearhart et al. 2005). Typisch zijn de verheven, diamant- of rechthoekvormige gedepigmenteerde huidlaesies. De leasies kunnen daarnaast ook onregelmatig van vorm zijn. Bij de huidvorm is herstel mogelijk, maar het kan ook eindigen met acute hemorragische septicemie en sterfte binnen enkele dagen of weken na het opkomen van de huidletsels (Archaeopteryx, referaat 90; Fowler en Allen, 1986; Lacave et al. 1997) Immunologie Dolfijnen vertonen een gelijkaardige immunologische reactie tegen vlekziekte als varkens. Zowel de humorale als cellulaire respons wordt getriggered door vlekziekte. Bij de humorale respons worden er buiten de 12

19 antistoffen tegen de kda proteïnen ook nog anti-neuraminidase immunoglobulines geproduceerd (Gyles en Thoen, 1993). Door het acute en vaak fatale verloop van de vlekziekte bij de septicemische vorm, wordt er aan de verdachte dieren onmiddellijk antibiotica toegediend. Een diagnostische bevestiging van de E. rhusiopathiae infectie wordt niet afgewacht. Dit zou kunnen leiden tot een antibiotica gestuurde, vervroegde beëindiging van de infectie. Het genereren van een T-cell gemedieerde immuniteitsrespons komt hierbij in het gedrag. Door het gebrek aan, of onvoldoende opbouw van een geheugen-immuniteit is het dier zeer vatbaar voor een herinfectie (Sitt et al., 2010; Tseng et al.,2009) Diagnose De diagnose bij de dolfijn gebeurt op gelijkaardige manier als bij het varken. Voor de isolatie en identificatie van de kiem kan men bij de dolfijn ook gebruik maken van een selectief medium zoals de Colombia agar bloedplaat, gesupplementeerd met nalidixinezuur en colistine (Hoorens et al., 1988). Vroeger dacht men dat de hemocultuur waarschijnlijk niet aangewend kon worden als een diagnostisch middel wegens het acuut verloop van vlekziekte bij de dolfijn (Wood, 1992). Tegenwoordig wordt in sommige dolfinaria een hemocultuur en hematologie tergelijkertijd in gang gezet met een antibioticatherapie wanneer de dolfijnen enige afwijkende tekens (gedragsveranderingen, anorexie, lethargie, ) vertonen (Greenwell et al., 2002). Serologische diagnose bij de levende dolfijn kan gebeuren met behulp van een agglutinatietest, haemagglutinatie-inhibitietest of precipitatietest (Van Bressem et al., 1999). Men kan gebruik maken van een latex-agglutinatietest om antistoffen tegen de kda proteïnen op te sporen (Jones et al., 2001; Sato et al., 1998). Haemagglutinatie inhibitietest kan gebruikt worden om antistoffen tegen E. rhusiopathiae te bepalen in het serum, volgens de methode van Rice. Een nadeel van de test is dat men geen antistoffen kan opsporen tegen bacteriële metabolieten. De aangetoonde antistoffen werken enkel tegen de antigenen van de celwand of van die van het kapsel (Gilmartin et al., 1971). Een nieuwere serologische techniek bij de dolfijn is de ELISA waarmee isotype-specifieke antistoffen (IgA, IgM, IgG) tegenover E. rhusiopathiae opgespoord kunnen worden (Suer et al. 1988b). Deze test is niet zo kostelijk vergeleken met de andere testen, en kan snel uitgevoerd worden. De species-specifieke indirecte ELISA s worden dan ook vaak beschouwd als de test bij uitstek voor serologische diagnose (Harlow en Lane, 1999; Van Bressem et al., 1999). Voor de test heeft men speciesspecifieke anti-immunoglobuline monoclonale (MAb) of polyclonale antilichamen (polyab) nodig. Bij de walvisachtigen heeft men een tekort aan zulke antilichamen (Nollens et al., 2007). Nollens et al. (2007) heeft één polyab en twee MAbs ontwikkeld die specifiek gericht zijn tegen de IgG van de tuimelaar. Men weet niet of deze antistoffen ook gaan binden op de antistoffen van andere walvisachtigen, daarvoor is verder onderzoek vereist. Men kan ook gebruik maken van PCR technieken om preventief/diagnostisch de aanwezigheid van de Erysipelothrix kiem te detecteren in de slijmlaag van vis (Palmer en Jones. 2005; Boerner et al., 2004). Palmer en Jones. (2005) hebben het PCR protocol toegepast van Takeshe et al. (1999) en vermoeden dat de techniek eventueel gevoelig genoeg is voor de rechtstreekse detectie van de kiem in de slijmlaag, een eventuele verrijking zou niet nodig zal zijn. Dit zou de duur van de detectie gevoelig reduceren, wat een groot voordeel is. 13

20 2.2.5 Behandeling en bestrijding Behandeling Net zoals bij het varken bestaat de therapie bij de dolfijn ook in het toedienen van een antibioticatherapie. Hyperimmuunserum is moeilijk te verkrijgen voor dolfijnen wegens moeilijkheden met het zuiveringsproces. Daarom wordt het af en toe eens gebruikt voor preventie, of bij eventuele protectie van een dolfijn- of orcakalfje (Lacave G., Persoonlijke mededeling, 2011). De therapie dient ook in een vroeg stadium toegepast te worden (Wood, 1992). In tegenstelling tot het varken resulteert het toedienen van een hoge dosis penicilline in een vroeg stadium niet in een snelle verbetering binnen de 24 tot 36 uur (Archaeopteryx, referaat 90). Daarnaast mag het symptomatisch behandelen (electrolytenoplossing, maagbeschermers, ) zeker niet verwaarloosd worden (Calle et al., 1993). Vochttherapie is essentieel voor de overleving van de dolfijn, men moet hierbij ook opletten dat men niet overhydrateert en de pulmonaire complicaties in de gaten houden. De gegeven medicijnen moet men ook aanpassen aan de renale excretie capaciteiten, zodat de nieren bij septicemie niet overbelast worden (Gearhart et al., 2005). Niet enkel dient de therapie zeer vroegtijdig gestart te worden, ze moet ook zo correct mogelijk nageleefd worden, waarbij men best om het uur of bij verbetering om de dag de conditie van de patiënten controleert. Een geëngageerd team is daarbij uitermate belangrijk (Gearhart et al., 2005) Bestrijding De huisvestingscondities (waterzuiveringssysteem, temperatuur, ) dienen zo optimaal mogelijk gehouden te worden (Geraci, 1986). Om de overdracht van vlekziekte zoveel mogelijk te beperken is het geven van vis van goede kwaliteit noodzakelijk. De verzorgers en trainers moeten ook op regelmatige basis hun handen reinigen en ontsmetten (Archaeopteryx, referaat 90). De dieren worden best preventief geïmmuniseerd tegen vlekziekte. Hoewel vaccineren met een levend verzwakt vaccin een betere immuniteit geeft dan met geïnactiveerd vaccin, worden levende vaccins bij de dolfijn niet meer gebruikt. De reden is een uitbraak van vlekziekte bij twee dolfijnen van de Amerikaanse marine na gebruik van een levend vaccin (Dunn. 1990; Gilmartin et al., 1971). Het geïnactiveerde vaccin bestaat uit met formaline gedode serotype 2 stammen (Gyles en Thoen, 1993). In een onderzoek van Nollens et al. (2005) heeft men ook de humorale immuniteit geëvalueerd na de vaccinatie met een commercieel varkensvaccin. Men heeft gevonden dat de humorale respons bij de dolfijnen zeer gelijkaardig is aan deze bij het varken (Lacave en Cox, 2000). Nollens et al. (2005) stellen een schema voor van een primo-vaccinatie bestaande uit twee vaccinaties met vier weken tussenpauze en dan om de zes maanden een boostervaccin. Het boostervaccin zou nodig zijn omdat men twaalf maanden na de primo-vaccinatie geen antistoffen meer kan aantonen in het serum. Mogelijke bijwerking bij geïnactiveerde vaccins zouden een anafylactische repons en lokale reacties kunnen zijn, en dit meestal op het tijdstip van de boostervaccinatie (Sweeney en Ridgway, 1975; Walsh et al., 2005). Dit werd waargenomen in Amerika, Zuid-Afrika en Australië, maar niet in Europa (Lacave, persoonlijke mededeling, 2011). De nevenwerkingen zouden geminimaliseerd worden door de grondige controle van de huidige varkensvaccins op bijwerkingen (Van Poucke, 1994). Nieuwere vaccins worden ontwikkeld die het gezuiverde protectieve 64 kda vlekziekteproteïne bevatten. Het nieuwe ER BAC PLUS bacterinvaccin heeft geen bijwerkingen of toch zeker een reductie van de 14