Exploratie van Fusarium spp. op prei in Vlaanderen

Transcriptie

1 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar Exploratie van Fusarium spp op prei in Vlaanderen Herlinde Vanheule Promotor: Prof dr ir Kris Audenaert Co-promotor: Prof dr ir Geert Haesaert en Prof dr Ir Monica Höfte Tutor: Lien Tyvaert Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de biowetenschappen: landen tuinbouwkunde

2 1 INLEIDING Deze masterproef werd uitgevoerd in het departement Toegepaste Biowetenschappen van de Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen aan de UGent Binnen dit departement wordt onderzoek gedaan naar plantpathogenen in diverse agro-ecosystemen Hierbij is een duurzame bestrijdingsstrategie steeds een finaliteit Duurzame primaire plantaardige productie wil immers in een achtergrond van de beperkte draagkracht van de aarde, voorzien in de behoeften van de huidige generatie met ook garanties naar volgende generaties Een duurzame invulling van plantaardige productie kan enkel gerealiseerd worden door een evenwicht na te streven tussen economische, ecologische en sociale pijlers Deze drie pijlers vinden we terug in de onderzoekslijn van toxigene 1 plantpathogene schimmels : Economisch Primaire plantaardige productie heeft als finaliteit de productie van hoog kwalitatieve en veilige voedings- en voederproducten Aanwezigheid van mycotoxinen is ongewenst Ecologisch De chemische beheersing van toxigene fytopathogene schimmels is niet eenvoudig gezien inzet van chemische gewasbeschermingsmiddelen enerzijds schimmelgroei onderdrukt, maar anderzijds de secundaire metabolietproductie van oa mycotoxinen activeert Bovendien is omwille van ecologische redenen de lijst van toegestane gewasbeschermingsmiddelen sinds kort onderworpen aan strengere regelgeving (verordening EG Nr 1107/2009) Sociaal Waar de aanwezigheid van toxigene schimmels reeds heel goed beschreven is bij ons, is de impact en aanwezigheid van mycotoxinen in de derde wereld nog grotendeels onbekend terrein Preliminaire kleinschalige surveys tonen aan dat de problematiek in deze landen catastrofale proporties aanneemt en een pertinent gezondheidsrisico voor mens en dier is Ook in Europa is de thematiek brandend actueel De Europese bezorgdheid aangaande toxigene schimmels en hun metabolieten wordt geïllustreerd door de vele onderzoeksthema s rond mycotoxinen en toxigene schimmels gefinancierd door de Europese Commissie Op vraag van de Europese commissie werd op 28 september 2013 dit onderzoeksthema door de Vakgroep Toegepaste Biowetenschappen voorgesteld op een internationaal symposium waarop academische-, overheidsen bedrijfsactoren aanwezig waren In de eindverklaring van dit symposium werd Onderzoek naar en beheersing van minder gekende mycotoxinen als speerpuntonderzoek naar voor geschoven In de masterproef van Herlinde Vanheule werd hierop geanticipeerd en werd er gewerkt rond een opkomend probleem in de Vlaamse preiteelt nl voet- of rozerot veroorzaakt door Fusarium Deze schimmel is beschreven als mycotoxine producent Prei is in België met 4800 ha één van de belangrijkste vollegrondsgroenten geteeld in open lucht (Eurostat, 2012) Met 75 % van de preiproductie, vindt de preiteelt vooral in West-Vlaanderen plaats De huidige productie bedraagt ton (FAO, 2012) In 2013 werd ton geëxporteerd, voornamelijk naar Frankrijk, Denemarken, Polen, Zweden en Spanje Prei-export was in 2013 goed voor 8 % van de totale waarde van de verse groenten export in België De vermarktbare productie voor de versmarkt bedroeg ton (VLAM, 2013) In België gaat een derde van de productie naar industriële doeleinden voornamelijk de diepvriesindustrie Op wereldvlak wordt in Indonesië het grootste areaal prei geteeld (57320 ha), gevolgd door Turkije, Frankrijk, België, China en Polen (FAO, 2012) Phytophthora porri en Puccinia allii zijn twee belangrijke schadeverwekkers bij prei maar de laatste jaren wordt steeds meer voetrot of rozerot (Figuur 1) gerapporteerd Dit rot wordt gerealiseerd door een schimmel behorende tot het genus Fusarium Binnen een genus heeft met verschillende soorten, species genoemd Onderzoek doorheen Europa toont aan dat de ziekteverwekkers op prei in Duitsland voornamelijk bestaan uit de soorten (species) Fusarium oxysporum en Fusarium proliferatum terwijl in Spanje en Italië F culmorum dominant aanwezig is in prei Hoewel de ziekte lange tijd niet gerapporteerd werd in Vlaanderen, zijn er de laatste jaren meer en meer meldingen van deze ziekte Er is niks geweten over welke species deze aantasting veroorzaken in Vlaanderen In samenwerking met het proefstation voor de groententeelt in Sint-Katelijne Waver en het Provinciaal onderzoekscentrum Inagro, werd daarom een survey opgestart om na te gaan welke schimmelsoorten voetrot in de Vlaamse preiteelt veroorzaakte 1 Mycotoxinen zijn toxische producten geproduceerd door schimmels Ze zijn schadelijk voor mens en dier In totaal zijn enkele 100-den mycotoxinen beschreven en ze hebben een zeer grote verscheidenheid aan chemische structuur en werking Voor enkele mycotoxinen werden door de Europese Commissie maximum niveaus vastgesteld omwille van hun hoge toxiciteit of hun hoge incidentie Daarnaast zijn er ook wat men noemt opkomende mycotoxinen: zij waren vroeger onbekend of geen probleem en worden nu her en der gerapporteerd Voor deze opkomende mycotoxinen bestaat nog geen wettelijk kader Vanuit Europa worden deze opkomende mycotoxinen meer en meer onder de aandacht gebracht en verschillende Europese onderzoeksgroepen hebben hun focus verlegd naar deze opkomende mycotoxinen

3 2 DOEL VAN DEZE MASTERPROEF Het doel van deze thesis was: Het determineren van de Fusarium species die voetrot veroorzaken in de Vlaamse preiteelt Het opstellen van een chemotype 2 van een isolaat Het op punt stellen van een modelinfectiesysteem dat toelaat om de pathogeniciteit (= ziekteverwekkend vermogen) van de isolaten in kaart te brengen Inzicht verwerven in de genetische diversiteit van de populatie Een inzicht van de diversiteit is interessant omdat het een idee geeft van het adaptief vermogen van een bepaalde schimmelsoort aan wijzigende condities 3 RESULTATEN EN RESULTAAT BESPREKING 31 Fusarium voetrot in prei wordt veroorzaakt door meerdere Fusarium species In deze masterproef werden isolaten van verschillende locaties in Vlaanderen verzameld en geïdentificeerd De locaties lagen verspreid over Oost- en West Vlaanderen aangezien dit de belangrijkste regio s zijn waar prei op grote schaal geteeld wordt Hierbij bleek dat de twee species die prei aantasten in Vlaanderen behoren tot de species Fusarium avenaceum en Fusarium culmorum Fusarium culmorum is een belangrijke soort en wordt voornamelijk in verband gebracht met aarfusarium in kleinkorrelige granen Het is een mycotoxine producent en produceert afhankelijk van het isolaat de trichothecenen nivalenol (NIV) of deoxynivalenol (DON) Figuur 1 Symptomen van voetrot op een preiplantje Fusarium avenaceum komt ook voor in het aarfusarium ziektecomplex maar wordt beschouwd als een zwakte pathogeen die niet in staat is om de typische aarfusariumsymptomen te induceren Het wordt binnen Europa beschouwd als een opkomende soort, dwz dat dit species tot voor enkele jaren zelden voorkwam, maar dat het aantal meldingen van de pathogeen is toegenomen in verschillende gewassen de laatste jaren Deze masterproef toonde voor de eerste keer aan dat voetrot in Vlaamse prei niet enkel wordt veroorzaakt door de gekende Fusarium soort Fusarium culmorum maar ook door de opkomende pathogeen Fusarium avenaceum Deze laatste werd in Europa nog nooit geassocieerd met voetrot in prei en de enige wetenschappelijke publicatie waarbij Fusarium avenaceum wordt gerapporteerd in prei komt uit Australië Dit is een belangrijke mijlpaal in de studie van deze problematiek Een goed bestrijdingsprogramma kan slechts tot stand komen eens men weet met welke schimmel men te maken heeft 32 Fusarium op prei gaat gepaard met mycotoxine productie Eens de soorten gekarakteriseerd waren, werd ook het chemotype bepaald van zowel de Fusarium culmorum isolaten als de Fusarium avenaceum isolaten Hieruit kon geconcludeerd worden dat F avenaceum enniatine (ENN) B produceert en Fusarium culmorum nivalenol (NIV) Hoewel Fusarium culmorum ook beschreven wordt als producent van DON werd geen enkel dergelijk chemotype teruggevonden op prei Ook in Fusarium culmorum geïsoleerd in Vlaanderen vanop tarwe werd reeds vastgesteld dat deze vooral van het NIV chemotype warenvooral de productie van ENN door Fusarium avenaceum was een opmerkelijke vaststelling ENN B is een mycotoxine dat behoort tot de cyclodepsipeptiden Door zijn ionofore 3 eigenschappen ontregelt het de membraantransporten van eukaryotische cellen Vanuit EFSA (European Food Safety Agency) werd recent een call for data gelanceerd om specifiek de problematiek van ENNes in kaart te brengen In deze masterproef werd een nieuwe matrix nl prei beschreven als matrix waarin ENN B kan accumuleren door de aanwezigheid van Fusarium avenaceum 2 Het chemotype van een isolaat is de mix van mycotoxinen die door dat isolaat kan geproduceerd worden Dit chemotype kan zich beperken tot één welbepaald mycotoxine, maar bepaalde Fusarium soorten zijn in staat om een complexe mix van vijf of meer mycotoxinen te produceren 3 Een molecule met ionofore eigenschappen kan ionen binden en over een membraan transporteren Hierdoor wordt de ionenstroom over dit membraan verstoord en kan celdood optreden Vaak veroorzaken dergelijke moleculen oxidatieve schade waardoor het membraan van cellen beschadigd wordt en de desbetreffende cel zal afsterven

4 33 Virulentie van de Fusarium isolaten op prei Een virulentietest op prei werd ontwikkeld waarbij uiteindelijk een subset van een aantal isolaten getest kon worden op hun virulentie Het infectie-assay dat hiervoor het meest geschikt was, bestond uit het infecteren van jonge preiplanten in potgrond Een ordinaal score systeem werd op punt gesteld (Tabel 1) Via deze virulentietest bleek dat er een verschil was in virulentie tussen de isolaten op vlak van symptoomontwikkeling Op vlak van de wortellengte of schacht- en bladlengte vertoonden de isolaten echter geen significante verschillen Tenslotte bleek uit de experimenten dat de Fusarium culmorum isolaten het meest agressief waren (Figuur 2) De Fusarium culmorum isolaten die afkomstig waren van tarwe planten met aarfusarium symptomen waren echter niet of nauwelijks virulent Dit kan erop wijzen dat de Fusarium culmorum isolaten een aangepaste virulentiestrategie hebben die hen toelaat om specifiek prei te infecteren Tabel1 Ordinaal visueel scoringssysteem voor Fusarium aantasting in prei Score Voorbeeld Score Voorbeeld

5 % preiplanten behorende tot de klasse Figuur 2 Infectie assay van Fusarium avenaceum en Fusarium culmorum op prei Het % aantal planten dat tot een bepaalde klasse behoort wordt voorgesteld Hoe donkerder de balkjes, hoe agressiever de infectie De Fusarium culmorum isolaten aangeduid met x zijn isolaten die afkomstig zijn uit met aarfusarium aangetaste tarwe planten Deze grafiek toont dat de F culmorum isolaten agressiever zijn dan de F avenaceum isolaten muv de F culmorum isolaten afkomstig van tarwe, deze twee isolaten waren niet virulent op prei wat aantoont dat er bij de schimmel mogelijks een aanpassing is aan de specifieke waardplant prei F avenaceum isolaten F culmorum isolaten Het feit dat Fusarium avenaceum duidelijk minder virulent was kan wijzen op een eerder cryptische levenswijze van deze soort in prei Dit wil zeggen dat de aanwezigheid van deze schimmel niet steeds gepaard gaat met een duidelijke aanwezigheid van symptomen Tenslotte werd in deze infectieproef ook de mycotoxine productie opgevolgd Hieruit bleek dat infectie van prei door Fusarium culmorum isolaten gepaard ging met occasionele NIV accumulatie (max 4,395 mg/kg) Ook infectie van prei met Fusarium avenaceum ging gepaard met mycotoxine aanwezigheid, in dit geval ENN B De concentraties waren echter vrij laag met niveaus tot 0,266 mg/kg Gezien er nog niks geweten is over de fytotoxiciteit van ENN B werden preiplanten blootgesteld aan verschillende concentraties aan ENN B, maar er kon geen toxiciteit voor de preiplanten worden vastgesteld (data niet getoond) 34 Genetische diversiteit van de Fusarium avenaceum populatie Gezien Fusarium avenaceum wordt aanzien als een opkomend Fusarium species werd voor de Fuarium avenaceum isolaten op beperkte schaal de genetische diversiteit in kaart gebracht Dit werd gedaan door het sequeneren van het esyn1 gen Het esyn1 gen is een gen dat codeert voor het enzym enniatine synthase en is rechtsreeks verantwoordelijk voor de ENN B productie Eerder onderzoek toonde aan dat variabiliteit in het esyn1 gen belangrijk was voor de bepaling van het chemotype De variabiliteit van esyn1 tussen de verschillende isolaten werd in beeld gebracht door het opstellen van een verwantschapsboom, gebaseerd op een 470 bp fragment van het esyn1 gen Daarbij kon vastgesteld worden dat de isolaten aan de hand van enkele consistente verschillen in drie groepen konden worden verdeeld Bovendien werden enkele referentie isolaten uit andere Europese landen in deze analyse opgenomen Deze referentie isolaten waren vooral afkomstig vanop tarwe Uit deze analyse bleek dat de referentie isolaten clusterden doorheen de Vlaamse prei isolaten 35 Besluit In deze masterproef werd voor het eerst de Fusarium populatie op prei in kaart gebracht Hieruit bleek dat deze bestond uit Fusarium culmorum en Fusarium avenaceum Beide pathogenen zijn in staat om op prei mycotoxinen te produceren namelijk respectievelijk NIV en ENN B Het in kaart brengen van een nieuwe problematiek is dé eerste stap om te komen tot een efficiënte bestrijding van de pathogenen Of deze schimmels ook een gezondheidsrisico voor de consument inhouden is op dit moment niet geweten Wel is het zo dat preiteelt in Vlaanderen onderworpen is aan zeer strenge visuele eisen en alle preiplanten met symptomen van voetrot worden uit de preiplanten getrieerd en komen niet in de winkelrekken terecht De onderzoeksgroep werd momenteel verder om na te gaan of de aantasting van Fusarium op prei ook zonder symptoomontwikkeling kan leiden tot aanwezigheid van mycotoxinen in prei Dit is vooral voor de schimmel Fusarium avenaceum belangrijk gezien in de masterproef werd aangetoond dat ook zonder symptomen, de schimmel cryptisch aanwezig kan zijn