Exploratie van Fusarium spp. op prei in Vlaanderen

Transcriptie

1 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2015 Exploratie van Fusarium spp. op prei in Vlaanderen Herlinde Vanheule Promotor: Prof. dr. ir. Kris Audenaert Co-promotor: Prof. dr. ir. Geert Haesaert en Prof. dr. Ir. Monica Höfte Tutor: Lien Tyvaert Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de biowetenschappen: land- en tuinbouwkunde

2

3 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2015 Exploratie van Fusarium spp. op prei in Vlaanderen Herlinde Vanheule Promotor: Prof. dr. ir. Kris Audenaert Co-promotor: Prof. dr. ir. Geert Haesaert en Prof. dr. Ir. Monica Höfte Tutor: Lien Tyvaert Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de biowetenschappen: land- en tuinbouwkunde

4 Auteursrechtelijke bescherming De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis. Gent, juni 2015 Herlinde Vanheule Auteur Kris Audenaert Promotor

5 Woord vooraf Ik wil graag alle mensen bedanken die bijgedragen hebben tot het realiseren van deze masterproef. Eerst en vooral wil ik mijn promotor prof. dr. ir. Kris Audenaert van harte bedanken. Het hele jaar door kon ik steeds bij hem terecht voor zowel de begeleiding van het praktisch werk als de theoretische kant van mijn masterproef. Dankzij hem heb ik enorm veel bijgeleerd, wat zeker nog van pas kan komen in mijn verdere beroepsleven. Een woord van dank gaat ook uit naar Lien Tyvaert voor de praktische hulp in het eerste semester. Ook wil ik Inagro, het PCG en het PKSW bedanken voor de hulp bij het verzamelen van de Fusarium isolaten. Verder wil ik mijn co-promotor prof. dr. ir. Geert Haesaert bedanken voor het nalezen en opvolgen van mijn masterproef. Ook wil ik alle leden van mijn leescommissie bedanken voor hun interesse in dit onderwerp. Ik wil ook graag mijn ouders bedanken voor alle kansen en steun die ik kreeg de voorbije vier jaar. Ze hielpen me steeds waar mogelijk en motiveerden me wanneer dat nodig was. In dat opzicht wil ook mijn drie broers en zus bedanken voor de nodige steun en ontspanning. Als laatste wil ik mijn klasgenoten bedanken. Vriendschappen zijn ontstaan die hopelijk lang na mijn studententijd zullen blijven bestaan. Vooral de reis naar Californië is iets om nooit meer te vergeten.

6 Abstract Voet- of rozerot, veroorzaakt door Fusarium spp. is een schimmelziekte bij prei. De schimmel treedt voornamelijk op als zwakteparasiet. Er is weinig geweten over welke species deze aantasting veroorzaken in Vlaanderen. In deze masterproef werden isolaten van verschillende locaties in Vlaanderen verzameld en geïdentificeerd. Hierbij bleek dat de twee species die prei aantasten in Vlaanderen behoren tot de species Fusarium (F.) avenaceum en F. culmorum. Daarbij werd ook een chemotype karakterisering en mycotoxine bepaling uitgevoerd, waaruit kon geconcludeerd worden dat F. avenaceum enkel enniatine (ENN) B produceert en F. culmorum enkel nivalenol (NIV). Vervolgens werd een virulentietest ontwikkeld waarbij uiteindelijk een subset van een aantal isolaten getest kon worden op hun virulentie. Het infectie-assay dat hiervoor het meest geschikt was, bestond uit het infecteren van jonge preiplanten in potgrond. Via deze virulentietest bleek dat er een verschil was in virulentie tussen de isolaten op vlak van mate van aantasting. Op vlak van de wortellengte of schacht- en bladlengte vertoonden de isolaten echter geen significante verschillen. De mycotoxine productie was positief gecorreleerd met de mate van aantasting. De F. avenaceum isolaten werden ook getest op hun variabiliteit van esyn1, een gen dat codeert voor het enzym enniatine synthase. De variabiliteit van esyn1 tussen de verschillende isolaten werd in beeld gebracht door het opstellen van een dendrogram, gebaseerd op een 470 bp fragment van het esyn1 gen. Daarbij kon vastgesteld worden dat de isolaten aan de hand van enkele consistente verschillen in drie groepen worden verdeeld. Kernwoorden: Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, prei, virulentie, esyn1

7 Summary Foot- or pink rot caused by Fusarium spp. is a fungal disease on leek. However, little is known about the species causing this disease in Flanders. In the present master dissertation the causal agent of Fusarium foot rot in leek was identified. Genetic analysis depicted F. avenaceum and F. culmorum as the causal agents of leek foot rot in Flanders. In addition, using both an in vitro and in vivo approach the chemotypes of both pathogens were determined, being respectively enniatin (ENN) B and nivalenol (NIV). With a selection of isolates, an artificial infection protocol was optimized. The infection method in potting soil was selected, being the most uniform method. In subsequent virulence tests a difference in virulence between isolates was observed. However, in terms of root length or stem and leaf length, the isolates showed no significant differences. The mycotoxin production was positively correlated with the degree of decay. In order to assess the variability within the F. avenaceum population, a dendrogram was constructed based on a 470 bp fragment of the esyn1 gene, responsible for enniatin synthesis. Based on sequence homology, the isolates were distributed in three groups. Despite these consistent differences, the variability was low. Keywords: Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, leek, virulence, esyn1

8 Inhoudsopgave Inhoudsopgave... 1 Lijst met afkortingen... 4 Lijst met figuren... 5 Lijst met tabellen... 7 Inleiding Literatuurstudie Inleiding Taxonomie Productie en belang in België Europa wereld Teelt Ziekten en plagen Ziekten Plagen Het genus Fusarium Fylogenie Morfologie Levenscyclus van Fusarium op tarwe: een goed gekend modelsysteem Fusarium spp. op het geslacht Allium Levenscyclus Voorkomen Fusarium species die voetrot veroorzaken in Europa Fusarium species die voetrot veroorzaken in rest van de wereld Productie van mycotoxinen door Fusarium Overzicht van de belangrijkste groepen van mycotoxinen Trichothecenen Fumonisinen Zearalenon Emerging mycotoxinen door Fusarium Algemeen Fusaproliferine

9 Beauvericine enniatinen Moniliformine Materiaal en methoden Isolaten Fusarium spp Staalname Isolatie, monospoor maken en opkweken Fusarium spp Isolatie vanuit prei Monospoor maken en bewaring van Fusarium spp. isolaten Identificatie Fusarium spp Optimalisatie van een infectie-assay Disc assay Seedling assay Potproef Virulentietest Analyse mycotoxinen Bepaling mycotoxinen Kwalitatieve mycotoxine analyse van geïnfecteerde prei Kwantitatieve mycotoxine analyse van geïnfecteerde prei Testen van fytotoxiciteit enniatine B Sequenering enniatine synthase gen Statistische analyse Resultaten en discussie Survey Optimalisatie infectie-assay Inleiding Disc assay Seedling assay Virulentietest: potproef Eerste potproef Tweede potproef Analyse mycotoxinen Bepaling mycotoxinen Kwalitatieve mycotoxine analyse van geïnfecteerde prei

10 Kwantitatieve mycotoxine analyse van geïnfecteerde prei Testen van fytotoxiciteit enniatine B Sequenering enniatine synthase gen Alignering van een 467 bp fragment Dendrogram gebaseerd op vergelijking van de contig Proteïnesequentie esyn Algemeen besluit Referentielijst

11 Lijst met afkortingen A. Allium AZ aminozuur BEA beauvericine DAS diacetoxyscirpenol DON deoxynivalenol ENNs enniatinen F. Fusarium FPP farnesyl pyrofosfaat FUS fusaproliferine GFPP geranyl-farnesyl pyrofosfaat G. Gibberella GPP geranyl pyrofosfaat IPP isopentenyl pyrofosfaat M. Monographella MAS monoacetoxyscirpenol MON moniliformine NEO neosolaniol NIV nivalenol NRPS niet-ribosomale peptiden NRPSs niet-ribosomale peptide synthasen P. Phytophtora PDA Potato Dextrose Agar PKS polyketiden PKSs polyketide synthasen ZEA zearalenon ZOL zearalenol 15-ADON 15-acetyldeoxynivalenol 3-ADON 3-acetyldeoxynivalenol 4

12 Lijst met figuren Figuur 1. Verbouwd areaal (ha) aan prei in België van 1965 tot 2011 (Eurostat, 2012)... 9 Figuur 2. Levenscyclus van Phytophthora porri (Declercq et al., 2012)...12 Figuur 3. Symptomen van de belangrijkste ziekten en plagen in prei (A = Phytophthora porri (papiervlekkenziekte); B = Puccinia allii (preiroest); C = Thrips tabaci (tabakstrips); D = Acrolepia assectella (preimot))...14 Figuur 4. Fylogenetische boom van Fusarium spp. (O'Donnell et al., 2013)...16 Figuur 5. Ziektecyclus van het aarfusarium ziektecomplex...17 Figuur 6. Structuurformule van type A en B trichothecenen (eigen bewerking van Ueno, 1984)...24 Figuur 7. Structuurformule van de voornaamste fumonisine analogen (Krska et al., 2007)...26 Figuur 8. Structuurformule van zearalenon (Bennett en Klich, 2003)...27 Figuur 9. De structuurformule van fusaproliferine (R = CH 3 CO - ) en gedeacetyleerde fusaproliferine (R = H) (Jestoi, 2008)...28 Figuur 10. De structuurformule van beauvericine en enniatinen (Jestoi, 2008)...29 Figuur 11. De biosynthese van beauvericine en enniatine (Hiv = D-α-methylbutaanzuur; Xaa = L-fenylalanine voor BEA, valine of isoleucine voor ENNs; E = beauvericine synthase voor BEA, enniatine synthase voor ENNs; AMP = adenosyl monofosfaat; -S- = thiolgroep; Me = methylgroep) (Jestoi, 2008)...30 Figuur 12. Voorstelling van enniatine synthase (esyn1) (EA = L-valine activerende module; EB = D-α-methylbutaanzuur activerende module; S = 4 -fosfopantetheine binding sites, M = N-methyltransferase; C = vermeende condensatie sites; nummers = de aminozuurpositie i in de sequentie van enniatine synthase) (Hornbogen et al., 2002)...31 Figuur 13. De structuurformule van MON (X = H voor het vrije zuur: X = Na voor het natriumzout; X = K voor het kaliumzout) (Jestoi, 2008)...32 Figuur 14. De biosynthese van moniliformine (Jestoi, 2008)...33 Figuur 15. Oorsprong isolaten Fusarium spp. vanop prei in Vlaanderen (1 = Dentergem; 2 = Passendale; 3 = Beitem; 4 = Kruishoutem; 5 = Sint-Katelijne-Waver)...34 Figuur 16. PCR Amplicons verkregen met DNA van Fusarium spp. (isolaten 10, 19, 21, 24 en 30) met de primerset EF1/EF2. Gradiënt van de annealing temperatuur bestaat uit volgende temperaturen ( C): 60,0-59,6-59,0 58,1 56,9 56,0 55,3 55,0. Grootte van de amplicons bedraagt 700 bp Figuur 17. Overzicht infectie-assays (A: disc assay - controle; B: disc assay - isolaat 15; C: seedling assay, herhaling 1 - controle; D: seedling assay, herhaling 1 - isolaat 18; E: seedling assay, herhaling 2 isolaat 16; F: seedling assay, herhaling 2 controle)...39 Figuur 18. Opzet eerste potproef (a = onderdompelmethode; b = aangietmethode; C = controle; nummers duiden op isolaten in tabel 10)...41 Figuur 19. Opzet tweede potproef (C = controle; nummers duiden op isolaten in tabel 10)..42 Figuur 20. Testen van fytotoxiciteit door enniatine B (A: methode met preischijfjes; B: methode met preiplantjes)

13 Figuur 21. Amplificatieproduct van species en chemotype PCR (A: identificatie F. avenaceum 220 bp; B: identificatie F. culmorum 457 bp; C: bepaling chemotype F. culmorum (NIV) 415 bp)...49 Figuur 22. Overzicht disc assay (A: eerste herhaling; B: tweede herhaling (controle isolaat 5 isolaat 20); C: tweede herhaling (controle isolaat 16 isolaat 5 isolaat 19 isolaat 20))...51 Figuur 23. Seedling assay (A: controle; B: isolaat 7 - isolaat 9 - isolaat 18)...52 Figuur 24. De wortellengte in functie van het isolaat en aantasting door twee verschillende conidiënsuspensies...53 Figuur 25. Het percentage preiplanten met bepaalde score per isolaat en per inoculatiemethode voor de twee potproeven (A: eerste potproef met opsplitsing van de twee inoculatiemethodes (a en b) en met vermelding van drooggewicht (g); B: tweede potproef; av = F. avenaceum; cul = F. culmorum; x = isolaten afkomstig van tarwe; * = significant verschillend van de controle volgens de Kruskal-Wallis en paarsgewijze Mann-Whitney U test met een betrouwbaarheid van 95 %)...54 Figuur 26. planten eerste potproef: controle (C) - isolaat 15 - isolaat Figuur 27. Wortellengte of schacht- en bladlengte in functie van het isolaat behandeld met methode a (A en C) en methode b (B en D) (grijs = controle; blauw = F. avenaceum; oranje = F. culmorum)...56 Figuur 28. Wortellengte (A) of schacht- en bladlengte (B) in functie van het isolaat (grijs = controle; blauw = F. avenaceum; oranje = F. culmorum; groen = F. culmorum tarwe)...58 Figuur 29. Fragment uit contig van esyn1 gen (A) (Fusariumox: Fusarium oxysporum GU ; Fuariumsc: Fusarium scirpi Z ; lysoeesyn1: volledig genoom esyn1 (Lysoe et al., 2015); KF2805, KF3704, KF3718 en KF3719: zie tabel 9); grafische weergave van het esyn1 gen (B)...63 Figuur 30. Dendrogram van sequenties bekomen met primerparen Esyn_1/Esyn_2 en ES_BeaF/ES_BeaR (tabel 8) en referentiesequenties (Fusariumox: Fusarium oxysporum GU ; Fuariumsc: Fusarium scirpi Z ; lysoeesyn1: volledig genoom esyn1 (Lysoe et al., 2015) ; KF2805, KF3704, KF3718 en KF3719: zie tabel 9; nummer bij vertakking wijst op bootstrapping met 1000 herhalingen)...64 Figuur 31. Esyn1 proteïne uit F. equiseti (A); fragment van proteïnesequentie van esyn1 (B) (rode lijn: geconserveerd AZ; blauwe lijn duidt op positie gesequeneerd fragment)

14 Lijst met tabellen Tabel 1. Onderscheidende kenmerken van drie verschillende types prei (De Clercq et al., 1999)...10 Tabel 2. Gemiddelde opbrengst en afvoer van nutriënten bij prei (Baert, )...11 Tabel 3. Voorkomen van verschillende Fusarium species binnen het geslacht Allium in Europa...20 Tabel 4. Voorkomen van verschillende Fusarium species binnen het geslacht Allium in de wereld...21 Tabel 5. Verspreiding van genen van secundaire metabolieten in genoomsequenties van verschillende Fusarium species complexen (O Donnell et al., 2013)...23 Tabel 6. Gebruikte primers voor de species en chemotype identificatie...37 Tabel 7. Voorbeelden van verschillende scores bij evaluatie potproef...40 Tabel 8. Primers sequenering enniatine synthase gen...44 Tabel 9. Isolaten als referentiesequenties (Stepien en Waskiewicz, 2013)...44 Tabel 10. Gegevens schimmelisolaten Fusarium spp Tabel 11. Concentratie ENN B en NIV in preiplantjes eerste potproef (in µg/kg)

15 Inleiding is in Vlaanderen één van de belangrijkste vollegrondsgroenten geteeld in open lucht. Voetrot veroorzaakt door Fusarium spp. is een ziekte die hierbij vaak gerapporteerd wordt. Er is echter weinig geweten over welke species deze aantasting veroorzaken. Een duidelijk beeld van de aanwezige Fusarium soorten is belangrijk aangezien vele Fusarium species toxigeen zijn en infectie met deze soorten kan leiden tot de aanwezigheid van mycotoxinen. Exploratie van Fusarium spp. op prei omvat in deze masterproef ten eerste de identificatie van isolaten uit prei afkomstig van verschillende locaties. Zo werden de Fusarium species die prei aantasten in Vlaanderen in kaart gebracht. In een tweede luik van dit onderzoek werd een test ontwikkeld om de virulentie van de bekomen isolaten op prei te bepalen. Hierbij werden verschillende infectie-assays uitgevoerd, zowel een assay met preischijfjes (disc assay) uit de schacht van prei, als een assay met in vitro preiplanten (seedling assay) werden uitgewerkt. Uiteindelijk werd een potproef als beste methode bevonden voor het meten van de virulentie. Daarbij werden tussen de isolaten verbanden gelegd tussen wortellengte, wortel- en schachtlengte en de mate van aantasting. Aan de hand van kwalitatieve en kwantitatieve mycotoxine analyses werd vervolgens nagegaan of er tijdens de infectie mycotoxinen geproduceerd worden en zo ja welke mycotoxinen. Door koppeling van de grootte van mycotoxineproductie met de mate van aantasting in de virulentietest werd nagegaan in hoeverre deze mycotoxinen een rol spelen in de virulentie van het isolaat. Ten slotte werden de F. avenaceum isolaten getest op hun variabiliteit van het esyn1 gen, dat codeert voor enniatine synthase, verantwoordelijk voor de productie van het emerging mycotoxine enniatine. 8

16 1. Literatuurstudie 1.1 Inleiding Fusarium spp. zijn belangrijke plantpathogenen, die enerzijds bij heel wat gewassen opbrengstverliezen veroorzaken, maar anderzijds bij de juiste omstandigheden, ook secundaire metabolieten (mycotoxinen) produceren, die gezondheidsrisico s voor mens en dier kunnen inhouden. Fusarium spp. heeft een zeer ruime waardplantenreeks, in deze literatuurstudie zal gefocust worden op de interactie tussen Fusarium en prei (Allium porrum) Taxonomie (Allium ampeloprasum var. porrum) behoort tot de lookfamilie (Alliaceae), meer bepaald tot het geslacht Allium. Tot dit geslacht behoren meer dan 800 soorten, waaronder verschillende economisch belangrijke gewassen zoals A. (Allium) cepa (ui), A. sativum (knoflook), A. schoenoprasum (bieslook), A. ascalonicum (sjalot) en A. fistulosum (stengelui) (Block, 2010). Het meest verwant zijn Allium ampeloprasum var. kurrat (kurrat) en A. ampeloprasum var. ampeloprasum (olifantsknoflook), die tot dezelfde soort behoren. Deze soort vindt zijn oorsprong nabij het Middellandse Zeegebied en het Nabije Oosten (Van der Meer en Hanelt, 1990). A. kurrat is de variëteit geteeld in het Midden-Oosten, terwijl A. porrum grotendeels in Europa geteeld wordt. In tegenstelling tot Allium porrum, wordt kurrat vooral geteeld voor zijn bladeren Productie en belang in België Europa wereld is in België met 4800 ha één van de belangrijkste vollegrondsgroenten die geteeld wordt in open lucht (Eurostat, 2012). Met 75 % van de preiproductie, vindt de preiteelt vooral in West-Vlaanderen plaats (Platteau et al., 2010). Figuur 1 toont de evolutie van het areaal prei verbouwd in België van 1965 tot en met De huidige productie bedraagt ton (FAO, 2012). In 2013 werd ton geëxporteerd, voornamelijk naar Frankrijk, Denemarken, Polen, Zweden en Spanje. -export was in 2013 goed voor 8 % van de totale waarde van de verse groenten export in België. De vermarktbare productie voor de versmarkt bedroeg ton (VLAM, 2013). In België gaat een derde van de productie naar industriële doeleinden (De Clercq et al., 1999). Figuur 1. Verbouwd areaal (ha) aan prei in België van 1965 tot 2011 (Eurostat, 2012) 9

17 Wat het areaal verbouwde prei in Europa betreft, staat België met 4800 ha op de derde plaats, voorafgegaan door Turkije met 9000 ha en Frankrijk met 5800 ha. Op de vierde plaats komt Polen met 4400 ha. In totaal werd in 2010 in Europa ha prei verbouwd (Eurostat, 2012). Op wereldvlak wordt in Indonesië het grootste areaal prei geteeld (57320 ha), gevolgd door Turkije, Frankrijk, België, China en Polen (FAO, 2012) Teelt is een monocotyle plant die gekweekt wordt voor zijn cilindrische pseudostengel (schacht), bestaande uit lange bladschedes en bladschijven, die wanneer deze onder de grond blijven wit zijn. Aan de bladschijf, een sterk gedrongen en verbrede stengel, geeft het apicaal meristeem aanleiding tot bladeren. Elk nieuw blad wordt gevormd uit een ringvormig meristeem, binnenin de vorige bladschede (Van der Meer en Hanelt, 1989). is een tweejarige plant en kan dus in de generatieve fase (tweede levensjaar), na vernalisatie bloeien. De optimale vernalisatietemperatuur bedraagt 5 C. Bollen (knobbelvormige verdikking aan de basis) worden gevormd en bevorderd bij korte dagen tijdens vernalisatie en lange dagen na vernalisatie (Wiebe, 1994). Bij bloei worden bolvormige clusters van paarse, roze of witte bloemen gevormd op cilindrische stengels. In de commerciële teelt wordt prei echter geteeld als een eenjarige plant (Burt, 2008). Zaden worden gevormd als resultaat van zelf- of kruisbestuiving door insecten. Volgens De Clercq et al. (2003) vindt bij prei 20 % zelfbestuiving plaats. Het zaad van prei vertoont geen dormantie. De kieming hangt voornamelijk af van de temperatuur, waarbij 18 tot 20 C optimaal is (Van der Meer en Hanelt, 1989). Selectie leidde tot verschillende types van cultivars, elk type aangepast aan groei tijdens een specifiek deel van het jaar. Er worden drie types onderscheiden, naargelang de periode waarin geoogst wordt: zomer-, herfst- en winterprei. In tabel 1 worden ze onderscheiden van elkaar aan de hand van kleur van het blad, schachtlengte, maturiteit en kouderesistentie (De Clercq et al., 1999). Volgens Van der Meer en Hanelt (1989) is kouderesistentie sterk gecorreleerd met de schachtlengte. Tabel 1. Onderscheidende kenmerken van drie verschillende types prei (De Clercq et al., 1999) Kenmerken Types prei Zomerprei Herfstprei Winterprei Kleur van het blad geel-groen lichtgroen blauw-groen Schachtlengte lang (30-50 cm) medium (24-29 cm) kort (18-23 cm) Maturiteit groeit zeer snel groeit snel groeit traag Kouderesistentie niet bestand tegen vorst deels bestand tegen vorst goed bestand tegen vorst 10

18 zaden zijn zwart en hebben een rechthoekige vorm. Een zaadje weegt tussen de 2.2 en 3.6 mg en kiemt bij 15 C in het donker (Van der Meer en Hanelt, 1989). Het zaaien gebeurt meestal binnenshuis of in een verwarmde kas, bij hoge dichtheid. Voor zomerprei gebeurt dit vanaf december tot en met maart. Voor herfstprei gebeurt dit in maart en winterprei zaait men van april tot midden mei. Tien tot twaalf weken na zaai, wanneer de schacht een dikte heeft van 5 tot 10 mm, wordt de prei overgeplant naar het productieveld. Meestal wordt prei in ruggen geplant. Dit is voordelig om verschillende redenen: (1) de grond warmt sneller op, waardoor ook de plant sneller groeit; (2) de plant kan dieper geplant worden, waardoor een langere witte schacht verkregen wordt; (3) het is nuttig voor onkruidcontrole. Oogsten gebeurt voor zomer-, herfst- en winterprei respectievelijk van juni tot oktober, van september tot januari en van december tot mei. De bruto opbrengst per ha ligt rond de 50 ton. Na reiniging en sortering blijft daar nog 35 à 40 ton van over, afhankelijk van de cultivar en het seizoen. Gemiddelde waarden worden weergegeven in tabel 2. afval wordt na het schonen van de geoogste prei teruggereden op het land. Meestal worden de gewasresten ondergewerkt in de grond, waardoor deze kunnen verteren. De oogst is volledig gemechaniseerd. Met een preirooimachine wordt de prei uit de grond gehaald en gesorteerd. In de preispoelmachine wordt de prei gewassen, ontdaan van oude en bevuilde bladeren en bijgesneden (Inagro, z.j.). wordt volgens het kwaliteitslabel Flandria het best bewaard tussen 2 en 3 C en een relatieve vochtigheid van 90 à 95 %. kan groeien op zowat alle type gronden, maar vanwege zijn onvertakte wortels vraagt prei een goede, losse textuur. Zandige kleigronden zijn om deze reden het meest geschikt (Van der Meer en Hanelt, 1989). In België wordt vaak prei op zandleembodems geteeld. Een bodem-ph KCl van 5.8 is het meest optimaal. Het belangrijkste nutriënt voor optimale groei van prei is stikstof (N). vereist kg N per ha, kg fosfaat (P 2 O 5 ) en kg kalium (K 2 O) (Baker, 1998). De gemiddelde afvoer van de voornaamste nutriënten wordt weergegeven in tabel 2. Bemesting hang af van de eigenschappen en staat van de grond en de toegepaste rotatie. past in bijna alle rotatieschema s, enkel monocultuur prei is niet aan te raden. Meestal wordt een rotatieschema van één op drie gebruikt (Declercq, 2009). Tabel 2. Gemiddelde opbrengst en afvoer van nutriënten bij prei (Baert, ) Opbrengst (ton/ha) Afvoer (kg/ha) Vers DS N P 2 O 5 K 2 O MgO Marktbaar Oogstrest

19 1.2.4 Ziekten en plagen Ziekten - Phytophthora porri Papiervlekkenziekte bij prei wordt veroorzaakt door de oömyceet Phytophthora porri. De levenscyclus van deze grondgebonden ziekte wordt weergegeven in figuur 2. Op de bladeren ontstaan grote, onregelmatige, witte ingedroogde vlekken, meestal omgeven door een donkergroene, waterige rand. Op de aangetaste plaats knikt het blad vaak om (figuur 3). Deze ziekte komt vooral voor bij herfst- en winterprei. In koude en vochtige omstandigheden kan deze ziekte grote opbrengst- en kwaliteitsverliezen veroorzaken. Figuur 2. Levenscyclus van Phytophthora porri (Declercq et al., 2012) Oösporen vormen het primaire inoculum. Volgens Declercq et al. (2012) kiemen oösporen in de bodem wanneer water na regenval beschikbaar is en wanneer de temperatuur lager dan 24 C is. Oösporen vormen een sporangium en de zoösporen die daaruit ontstaan, komen tijdens hevige regenval of door contact van de bladeren met de grond op de plant terecht. Ze overleven daar in het water in de bladoksels en infecteren vervolgens de plant. Tijdens ongunstige condities vormt de pathogeen terug sexuele oösporen (versmelting antheridium en oögonium) op en in de bladeren, die kunnen overleven in de bodem wanneer de bladeren op de grond terechtkomen. De oösporen van P. porri zijn omgeven door een zeer dikke celwand die P. porri helpt overleven tijdens de gewasvrije periode. 12

20 - Puccinia allii roest veroorzaakt door Puccinia allii kan verschillende Allium species aantasten, waarbij de voornaamste naast prei, look en ui zijn. De schimmel behoort tot de klasse van de Urediniomycetes en veroorzaakt volgens Anikster et al. (2004) over de hele wereld significante verliezen in look-, prei- en uiproductie. In de begin van de aantasting ontstaan witgrijze vlekjes. Later zijn aan beide bladkanten roestkleurige sporenhoopjes aanwezig. Het bladweefsel rondom de sporenhoopjes verkleurt bleekgroen. Er treedt vooral cosmetische schade op, maar bij een zware aantasting sterven de bladeren af (figuur 3). Puccinia allii ontwikkelt zich het sterkst bij vochtig, warm weer. Ook ochtendmist of condens bevordert de ziekte. Puccinia allii is een macrocyclische, autoëcische schimmel, waarbij dus op dezelfde waardplant pycnosporen, aeciosporen, uredosporen, teliosporen en basidiosporen gevormd worden. Varianten bestaan, in o.a. Californië zijn pycno- en aeciosporen afwezig. In Europa worden vaak varianten gevonden zonder teliosporen (Anikster et al., 2004). Uredosporen komen vrij bij het openbarsten van de epidermis en zorgen voor een snelle verspreiding van de ziekte. Met de teliosporen overwintert de schimmel Plagen - Thrips tabaci Schade door Thrips tabaci (Orde Thysanoptera) komt vooral bij tabak, prei en ui voor. Het insect is vooral schadelijk tijdens warme, droge jaren. Vanaf juli tot en met september bestaat de grootse kans op voorkomen. Ze bezitten raspende-zuigende monddelen en zowel larven als adulten doorboren de bladeren en schacht en zuigen het sap op. Het algemeen schadebeeld bestaat uit zilverachtige vlekken (lege epidermiscellen die zicht met lucht vullen), meestal in de lengterichting van het blad. Nadien kleurt het aangetaste weefsel bruin. In de vlekken vindt men vaak zwarte stippen, dit zijn de uitwerpselen van de tripsen. De schade is dus vooral cosmetisch met verminderde kwaliteit tot gevolg (figuur 3). Aangezien trips zich vooral bevindt op de overgang tussen schacht en blad is de schade pas zichtbaar na uitgroei. Daarnaast kan ook virusoverdracht plaatsvinden. Thrips tabaci werd gerapporteerd als vector van het Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV). De ontwikkelingscyclus kent twee nimfenstadia, gevolgd door voorpop- en popstadia. Naast geslachtelijke komt ook parthenogenetische vermenigvuldiging voor. De tijd tussen het eistadium en het volwassenstadium varieert van twee tot vijf weken en is temperatuursafhankelijk. In Vlaanderen treden gewoonlijk drie vluchten op. Wanneer deze vluchten zich situeren, is afhankelijk van de temperatuur. De volwassen trips is een klein, smal insect van 1 tot 2 mm, meestal met vier smalle, lange vleugels die met franjes omzoomd zijn. Ze leggen 50 tot 100 witte, boonvormige eitjes. De larven zijn eerder kleurloos tot lichtbruin. 13

21 - Acrolepia assectella De preimot (Acrolepia assectella) behoort tot de orde van de Lepidoptera en is net zoals de tabakstrips een plaag met de hoogste kans op voorkomen tussen juli en september. In het begin van de zomer worden eitjes aan de voet van de preiplant afgelegd. De duur van het eistadium is afhankelijk van de temperatuur, variërend van vier tot zestien dagen. Voor de eerste vervelling mineren de rupsen enkel de buitenste bladeren zodat vensterschade ontstaat (figuur 3). Nadien dringen ze door tot het hart van de plant. Via de vraatwonden kunnen planten ook secundaire infecties oplopen. Een tweede generatie vindt men in augustus, de derde overwintert als pop of als volwassen insect. De latere generaties in de zomer veroorzaken het meeste schade. Het aantal generaties per jaar en het tijdstip wanneer de preimot actief komt na de winter en dus het vermogen van de preimot om een plaag te zijn, is sterk temperatuursafhankelijk (Âsman, 2001). A B C D Figuur 3. Symptomen van de belangrijkste ziekten en plagen in prei (A = Phytophthora porri (papiervlekkenziekte); B = Puccinia allii (preiroest); C = Thrips tabaci (tabakstrips); D = Acrolepia assectella (preimot)) 14

22 1.3 Het genus Fusarium Fylogenie De taxonomische indeling van Fusarium spp. is als volgt: Rijk: Fungi Fylum: Ascomycota Klasse: Sordariomycetes Orde: Hypocreales Familie: Nectriaceae Geslacht: Fusarium In figuur 4 wordt de fylogenetische stamboom van Fusarium weergegeven, deze geeft de verwantschap aan tussen de verschillende species (O Donnell et al., 2013). Eén van de belangrijkste Fusarium species in Europa is F. graminearum. Het Fusarium species complex is de belangrijkste veroorzaker van aarfusarium (Goswami en Kistler, 2004), wereldwijd een ziekte die enorme opbrengstverliezen veroorzaakt op verschillende graangewassen (tarwe, gerst, haver, rogge en triticale). Als andere belangrijke veroorzakers worden F. culmorum, F. avenaceum en F. poae en Microdochium nivale genoemd (Parry et al., 1995; Bottalico en Perrone, 2002). F. graminearum en F. culmorum zijn genetisch nauw verwante species. Aan de hand van RAPD werden karakteristieke verschillen gevonden tussen de twee species (Miedaner, 1997). 15

23 Figuur 4. Fylogenetische boom van Fusarium spp. (O'Donnell et al., 2013) 16

24 1.3.2 Morfologie Er wordt onderscheid gemaakt tussen, micro-, macro- en chlamydoconidia. Macroconidia hebben minstens drie septa, met een gedifferentieerde apicale cel die puntig, afgerond, hoekig of filamenteus en een basale cel die voetvorming, met een afzonderlijke hiel of enkel licht getand kan zijn. Microconida worden meestal geproduceerd in het luchtmycelium en de meest voorkomende vorm is ellips- tot knotsvormig. Fusarium avenaceum wordt gekarakteriseerd door dunwandige, naaldachtige macroconidia (vier tot zeven septa) en door de afwezigheid van chlamydoconidia. F. culmorum produceert overvloedig korte, dikwandige macroconidia (vier tot vijf septa). Microconidia zijn afwezig. (Pitt et al., 2009; Koike et al., 2007) Levenscyclus van Fusarium op tarwe: een goed gekend modelsysteem Figuur 5 geeft de ziektecyclus weer van F. graminearum en andere Fusarium species uit het aarfusarium ziektecomplex. Figuur 5. Ziektecyclus van het aarfusarium ziektecomplex Gewasresten van maïs, tarwe en ander organisch materiaal, vormen de belangrijkste infectiebron waar aarfusarium saprofytisch op overleeft (figuur 5). Vooral gewasresten van maïs zijn een uitstekende voedingsbodem voor de groei van Fusarium mycelium en de productie van sporen. Ook als chlamydosporen (dikwandige duursporen) kan Fusarium overleven in de bodem, afhankelijk van de Fusarium soort. 17

25 In het verdere groeiseizoen kunnen ascosporen (sexueel), conidia (asexueel), chlamydosporen (asexueel) en hyfen (asexueel) overleven als primair inoculum. Sexuele ascosporen worden gevormd door Gibberella (G.) zeae, G. avenaceae en Monographella (M.) nivalis. Asexuele conidia worden gevormd door F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum, F. poae en M. nivale. Verspreiding van het inoculum kan op verschillende manieren gebeuren. Ascosporen worden met kracht vrijgesteld uit de perithecia en over lange afstanden door de wind verspreid om zo tijdens de bloei op aarpakjes terecht te komen. Conidia (macro- of microconidia) worden via opspattende regendruppels lokaal verspreid, maar ook insecten kunnen hier een rol spelen. Onder gunstige omstandigheden kiemen de sporen en induceren ze de uiteindelijke infectie. De aarpakjes zijn tijdens de anthesis het meest vatbaar voor infectie door sporen. Het primair inoculum vormt samen met een voldoende lange aarnatperiode tijdens de bloei, de basis voor de mate van aantasting met aarfusarium. Door deze korte gevoelige periode is aarfusarium in de meeste gevallen een monocyclische ziekte. Bij zeer gunstige omstandigheden voor de ascosporen van F. graminearum stijgt de inoculumdruk wat kan resulteren in twee of meer cyclussen per groeiseizoen. Tevens zal onder gunstige omstandigheden de groei van Fusarium soorten in de aar verder gaan en eventueel leiden tot secundaire infecties. Welke deze gunstige omstandigheden zijn, is afhankelijk van het species. Zo wordt bijvoorbeeld F. graminearum geassocieerd met warme en vochtige omstandigheden, terwijl F. avenaceum en F. culmorum geassocieerd worden met koude en vochtige omstandigheden (Xu et al., 2008; Uhlig et al., 2007). Het infectieproces werd vooral goed ontrafeld voor F. graminearum en F. culmorum. Eens de sporen op een aarpakketje terecht komen kan de infectie starten. Hierbij zal de schimmelspore kiemen en een primaire hyfe vormen die in de lengte toeneemt. In tegenstelling tot vele andere schimmels penetreert Fusarium niet rechtstreeks doorheen de epidermis, maar penetreert hij op gevoelige plaatsen, zoals de stomata, antheren, openingen tussen de palea en lemma of de basis van de glumae of kafblaadjes. Daar bevat de epidermis en het parenchymweefsel immers cellen met dunnen celwanden die makkelijk doorboord worden (Goswami en Kistler, 2004). Ook worden enzymen zoals xylanases, cellulases en pectinases geproduceerd, die de celwanden oplossen zodat de schimmel makkelijker kan penetreren. Na infectie wordt vlug een dicht myceliumnetwerk gevormd. Na een korte periode van intercellulaire groei (de biotrofe fase), groeien de hyfen zowel inter- als intracellulair (de necrotrofe fase) waardoor het aangetaste waardweefsel afsterft. Dit leidt uiteindelijk tot het afsterven van aarpakjes en de ganse aar in geval van een gevoelig ras (Parry et al., 1995; Audenaert et al., 2009). 18

26 1.4 Fusarium spp. op het geslacht Allium Levenscyclus Basaalrot van ui veroorzaakt door F. oxysporum is een grondgebonden ziekte. De schimmel kan saprofytisch in de bodem overleven op organische componenten of als chlamydosporen. Hij kan dus als duurspore langere tijd overleven in afwezigheid van ui, de duur is echter niet gekend. Blok en Bollen bewezen wel dat F. oxysporum f. sp. asparagi voor minstens 20 jaar kan overleven zonder het kweken van asperges. Verspreiding van de ziekte kan gebeuren door geïnfecteerd plantenmateriaal of bodem, door irrigatiewater of via besmette grond aan landbouwmachines (Cramer, 2000). De schimmel kan zich ook verspreiden via het zaad, maar het is niet geweten of dit van significante betekenis is voor de praktijk (Visser et al., 2006). De voornaamste manier van infectie is door directe penetratie van de basaalplaat. Ook via de wortels of door penetratie van de bol kan infectie gebeuren. Ook hier wordt door F. oxysporum gebruik gemaakt van enzymen. De schimmel produceert pectinasen (vb. exopolygalacturonase en endo-pectintranseliminase), die pectine afbreken in de celwanden van de ui. Deze afbraak resulteert in vrijstelling van suiker uit het bolweefsel, waarmee de schimmel zich voedt (Cramer, 2000). De optimale bodemtemperatuur voor de ontwikkeling ligt tussen is C (Koike et al., 2007), terwijl de ziekte kan voorkomen tussen een bodemtemperatuur van 15 tot 32 C. Beneden 12 C zal de ziekte zich niet ontwikkelen. De optimale bodem-ph bedraagt 6.6 (Cramer, 2000). Alle Allium species vertonen dezelfde symptomen, nl. rot van het weefsel van de wortelplaat. Dit rot is waar te nemen als licht tot donkerbruin weefsel. Naast de verkleuring van de wortelplaat, kan bij prei ook een rood-paarse verkleuring voorkomen op de buitenste bladscheden die in contact geweest zijn met de bodem Voorkomen Fusarium species die voetrot veroorzaken in Europa In tabel 3 wordt een samenvatting gegeven van de publicaties over Fusarium binnen het geslacht Allium in Europa. Cramer (2000) concludeert dat basaalrot van ui door F. oxysporum f. sp. cepae in de meeste uienteeltregio s in de wereld kan voorkomen en dit vooral onder hoge temperaturen. Er bestaat een sterk verband tussen de temperatuur en de aantasting van zaailingen van ui. Het percentage aantasting stijgt tussen 10 en 32 C (Abawi en Lorbeer, 1972). Uit pathogeniteitstesten met F. proliferatum geïsoleerd uit Allium sativum (look) op verwante gewassen bleek dat ui het meest gevoelig was met een drogestofreductie van 57.1 %, daarna volgde bieslook, knoflook en prei. Pijpajuin was het minst gevoelig (Palmero et al., 2012). Dit wijst erop dat dit pathogeen alternatieve gastheren kan aantasten in dezelfde bodem. 19

27 Voor wat betreft prei, werd vastgesteld door Armengol et al. (2001) en Quarta et al. (2005) in Spanje en Tamietti et al. (1977) in Italië dat infectie gebeurde door F. culmorum. Daarnaast werd in Duitsland F. oxysporum, F. solani en F. proliferatum uit prei geïsoleerd. Hierbij werd echter de agressiviteit van de isolaten en hun vermogen om Allium spp. te infecteren niet bevestigd. De mogelijkheid bestaat dus dat deze drie species enkel saprofytisch aanwezig waren (Boehnke et al., 2015). Tabel 3. Voorkomen van verschillende Fusarium species binnen het geslacht Allium in Europa Gastheer Fusarium species Land Referentie Allium cepa F. oxysporum F. solani Turkije Bayraktar en Dolar, 2011 F. acuminatum F. equiseti F. redolens F. proliferatum Servië Stankovic et al., 2007 F. oxysporum F. solani F. acuminatum F. equiseti F. proliferatum Italië Carrieri et al., 2013 F. tricinctum F. culmorum Nederland Galván et al., 2008 F. oxysporum F. proliferatum F. oxysporum Nederland Visser et al., 2006 F. oxysporum Duitsland Galván et al., 2008 F. oxysporum Duitsland Boehnke et al., 2015 F. solani F. proliferatum Allium sativum F. proliferatum Servië Stankovic et al., 2007 F. oxysporum F. solani F. proliferatum Spanje Palmero et al., 2010 F. oxysporum Spanje Galván et al., 2008 F. oxysporum Duitsland Boehnke et al., 2015 F. solani F. proliferatum Allium porrum F. culmorum F. culmorum Spanje Spanje Armengol et al., 2001 Quarta et al., 2005 F. culmorum Italië Tamietti et al.,

28 F. oxysporum Duitsland Boehnke et al., 2015 F. solani F. proliferatum Allium ascalonium F. oxysporum Frankrijk Galván et al., Fusarium species die voetrot veroorzaken in rest van de wereld In tabel 4 wordt vervolgens een samenvatting gegeven van de publicaties over Fusarium spp. binnen het geslacht Allium in de wereld. Voor wat betreft prei, werd door Hall et al. (2007) in Australië vastgesteld dat infectie gebeurde door F. avenaceum, F. oxysporum, F. semitecum en F. culmorum. In Californië was F. culmorum verantwoordelijk voor voetrot bij prei (Koike et al., 2003). Tabel 4. Voorkomen van verschillende Fusarium species binnen het geslacht Allium in de wereld Gastheer Fusarium species Land Referentie Allium cepa F. proliferatum VS (Washington, du Toit en Inglis, 2003 F. oxysporum Colorado) Everts et al., 1985 F. oxysporum Nieuw-Zeeland Dingley, 1961 F. oxysporum Zuid-Afrika Du Plessis, 1933 F. oxysporum F. solani Iran Ghanbarzadeh et al., F. proliferatum F. culmorum Mexico Montes-Belmont et al., 2003 F. oxysporum USA, Australië, Galván et al., 2008 Turkije, Argentinië, Uruguay F. proliferatum Argentinië, Uruguay Galván et al., 2008 F. avenaceum Uruguay Galván et al., 2008 Allium sativum F. proliferatum Noord-Amerika Dugan et al., 2003 F. proliferatum India Sankar en Babu, 2012 Allium porrum F. avenaceum Australië Hall et al., 2007 F. oxysporum F. semitectum F. culmorum F. culmorum VS (Californië) Koike et al., 2003 Allium fistulosum F. oxysporum F. verticillioides F. solani Japan Dissanayake 2009 et al., 21

29 1.5 Productie van mycotoxinen door Fusarium Overzicht van de belangrijkste groepen van mycotoxinen Mycotoxinen zijn toxische, secundaire verbindingen geproduceerd door schimmels. Mogelijk functioneren ze als insecticide of spelen ze een rol in de verdediging van de plant tegen de schimmel (Richard, 2012). De meest belangrijke schimmelgeslachten die mycotoxinen produceren die kunnen terug gevonden worden in voedsel zijn Aspergillus, Fusarium, Alternaria, Claviceps en Penicillium. Ze bezitten een brede range van toxische eigenschappen, waardoor ze een gezondheidsrisico inhouden voor mens en dier. Bovendien veroorzaken ze enorme economische verliezen. Fusarium toxinen zijn secundaire metabolieten geproduceerd door toxigene micromyceten van het geslacht Fusarium (Čonková et al., 2003). De drie voornaamste groepen van Fusarium toxinen zijn trichothecenen, fumonisinen en myco-oestrogenen (zearalenon). In tabel 5 wordt weergegeven welke mycotoxinen kunnen geproduceerd worden door de belangrijkste Fusarium species (O Donnell et al., 2013). Een aantal polyketiden (PKS) en niet-ribosomale peptiden (NRPS) zijn gelinkt aan genen, verantwoordelijk voor de productie van mycotoxinen. Hansen et al. (2015) onderzocht in dit aspect polyketide synthasen (PKSs) en niet-ribosomale peptide synthasen (NRPSs) van tien verschillende Fusarium species. Dit illustreerde het enorme vermogen van Fusarium om secundaire metabolieten te produceren. Van de species in deze studie onderzocht, heeft Fusarium avenaceum het grootste aantal PKSs en NRPSs, namelijk 24. Twee PKSs en acht NRPSs zijn uniek voor dit species. Fusarium avenaceum produceert dan ook in het algemeen meer secundaire metabolieten dan andere Fusarium species (Hansen et al., 2015). 22

30 Tabel 5. Verspreiding van genen van secundaire metabolieten in genoomsequenties van verschillende Fusarium species complexen (O Donnell et al., 2013) 23

31 Trichothecenen Trichothecenen zijn een groep van natuurlijk gevormde sesquiterpenoïde epoxiden, die een brede biologische activiteit bezitten. Ze inhiberen de eukaryotische eiwitsynthese (Sudakin, 2003). De algemene structuur wordt weergegeven in figuur 6. De epoxide ring op C 12 -C 13 is essentieel voor de toxiciteit (Desjardins et al., 1993). Naargelang hun functionele groep op vijf posities, worden ze ingedeeld in vier groepen (A, B, C en D). Type A trichothecenen, hoofdzakelijk geproduceerd door F. poae, F. langsethiae, F. sporotrichioides en F. equiseti (Thrane et al., 2004; Jurado et al., 2005), omvatten als belangrijkste mycotoxinen het T-2 toxine, HT-2 toxine, diacetoxyscirpenol (DAS), monoacetoxyscirpenol (MAS) en neosolaniol (NEO). Type B trichothecenen onderscheiden zich van type A door de aanwezigheid van een ketongroep op C 8. Ze omvatten deoxynivalenol (DON), nivalenol (NIV) en hun geacetyleerde derivaten: 3-acetyldeoxynivalenol (3-ADON), 15-acetyldeoxynivalenol (15-ADON) en fusarenon-x (FUS-X) (Kimura et al., 2007). De voornaamste species die trichothecenen B produceren zijn F. graminearum en F. culmorum (Kimura et al., 2007; Quarta et al., 2005). Type C en D trichothecenen worden niet geproduceerd door Fusarium species. Figuur 6. Structuurformule van type A en B trichothecenen (eigen bewerking van Ueno, 1984) Trichothecenen hebben een structuur afgeleid van farnesyl pyrofosfaat (FPP), dat gesynthetiseerd wordt door condensatie van isopentenyl pyrofosfaat (IPP), een isopreeneenheid met zijn isomeer dimethylallyl pyrofosfaat, gevolgd door de herhaalde condensatie van IPP, wat resulteert in geranylpyrofosfaat. FPP is een intermediair in eiwitisoprenylatie en in de biosynthese van steriol, ubiquinone, dolicol en verschillende secundaire metabolieten. Cyclisatie van FPP tot trichodiene vindt plaats door het enzym trichodiene synthase. Door opeenvolging van verschillende oxygenaties, isomeraties, cyclisaties en esterificaties kunnen vervolgens de verschillende trichothecenen worden gevormd (Kimura et al., 2007). Tien genen, Tri3 t.e.m. Tri12 in de biosynthese van trichothecenen zijn nauw verband met elkaar en vormen een gencluster (Grove, 2007). Tri5 codeert voor trichodiene synthase (Sweeney et al., 1999). Verstoring van dit gen resulteerde in minder symptomen, lager gewicht en levensvatbaarheid van de zaden en een lagere 24

32 contaminatie van trichothecenen op tarwearen. Trichothecenen zijn dus virulentiefactoren (Desjardins et al., 1996a). Trichothecenen zijn niet gastspecifiek in hun toxiciteit en kunnen de eiwitsynthese in een brede range van eukaryotische organismen inhiberen. Ze binden aan de 60S ribosomale subunit en interageren met het enzym peptidyltransferase, waardoor de peptidebinding tussen de eiwitten verstoord wordt (Sudakin, 2003). Ze zijn fytotoxisch aan zeer lage concentraties (10-5 tot 10-6 M) en kunnen verwelking, chlorose, necrose en andere symptomen veroorzaken bij diverse plantensoorten Fumonisinen Fumonisinen worden voornamelijk geproduceerd door F. verticillioides en F. proliferatum. Meer dan 28 homologen zijn ontdekt. Op basis van hun structuur worden drie groepen onderscheiden. Groep A en B worden gekarakteriseerd door de aanwezigheid van een amide- en aminegroep respectievelijk. Groep C verschilt van groep B door de afwezigheid van een methylgroep op C 1 (figuur 7). Van alle fumonisinen zijn FB1, FB2 en FB3 de belangrijkste. FB1 houdt meestal 70 % van de totale fumonisine-inhoud in gevonden in natuurlijk gecontamineerd voedsel en voeder. FB1 bezit een hydroxylgroep op de C 5 en C 10 positie. FB2 en FB3 verschillen door de afwezigheid van één van de hydroxylgroepen op de C 10 positie (FB2) of de C 5 positie (FB3) (Krska et al., 2007). Fumonisinen worden gesynthetiseerd door de condensatiereactie van het aminozuur alanine tot een acetaat afgeleide precursor. Vertakte methylgroepen worden toegevoegd op C 12 en C 16 door S-adenosyl methionine transferase. Het aantal en de volgorde van het aantal stappen dat leidt tot de oxygenatie en vervolgens esterificatie van de acetaat afgeleide precursor is echter onbekend (Desjardins et al., 1996b). Het is ook niet duidelijk of oxygenatie en methylatie voor of na de condensatie met alanine plaatsvindt. Het is wel waarschijnlijk dat de minder geoxygeneerde trichothecenen zoals FB2, FB3 en FB4 precursors zijn van het meer geoxygeneerde FB1 (Desjardins et al., 1996b; Sweeney et al., 1999). Desjardins et al. (1996b) stelt dat stammen die enkel FB2 of FB3 kunnen produceren en dus niet de mogelijkheid hebben om een hydroxylgroep te plaatsen op C10 of C5 respectievelijk, een gendefect hebben op nauw gerelateerde loci, nl. fum2 en fum3. Fum2 en fum3 zijn nauw verbonden met fum1, een gen dat de fumonisine productie reguleert. 25

33 Figuur 7. Structuurformule van de voornaamste fumonisine analogen (Krska et al., 2007) Fumonisinen hebben hun invloed door interactie in het sfingolipide metabolisme. Ceramiden, bestaande uit een sfingosine met een vetzuur en dus een afgeleide van het sfingolipide metabolisme is een component van sfingomyeline, een van de belangrijkste lipiden in de dubbele fosfolipidenlaag van het celmembraan. Ze fungeren ook als regulatiefactor met een invloed op o.a. de DNA-synthese (Dutton, 1996). Doordat FB1 en sfinganine een gelijkaardige moleculaire structuur hebben, inhibeert FB1 de vorming van ceramide en stapelt sfinganine (en soms sfingosine) zich op. Deze accumulatie veroorzaakt de toxische en carcinogene effecten (Merrill et al., 2001). Zo veroorzaken ze bijvoorbeeld leukoencephalomalacia bij paarden en konijnen, longoedeem en hydrothorax bij varkens en hepatotoxiciteit en carcinogene effecten in de lever bij ratten (Bennett en Klich, 2003). 26

34 Zearalenon Zearalenon (ZEA) is een β-resorcyclisch lactonzuur met als systematische naam 3,4,5,6,9,10-hexahydro-14,16-dihydroxy-3-methyl-[S-E)]-1H-2-benzoxacyclotetradecin- 1,7(8H)-dion (Krska et al., 2007). De structuurformule van ZEA wordt weergegeven in figuur 8. In zoogdieren wordt de ketogroep op positie C8 teruggebracht tot twee stereo-isomeren (α- en β-isomeer). Deze metabolieten worden ook geproduceerd door Fusarium zelf, zij het in veel lagere concentratie dan ZEA (Zinedine et al., 2007). ZEA wordt geproduceerd via de polyketide pathway voornamelijk door F. graminearum en F. culmorum (Bennett en Klich, 2003; Zinedine et al., 2007). Hierdoor komt ZEA vaak voor samen met DON, NIV of andere trichothecenen. Figuur 8. Structuurformule van zearalenon (Bennett en Klich, 2003) Zearalenon wordt gevormd uit acetaat via de polyketide pathway. De precursor van ZEA wordt zearalenol (ZOL) genoemd. Polyketide synthasen katalyseren de biosynthese van PKS. Kim et al. (2005) identificeerden een PKS gencluster (met genen PKS13 en PKS4) en twee andere genen, nodig voor de productie van ZEA in F. graminearum. Zearalenon is zeer weinig toxisch. Het vertoont echter wel voldoende gelijkenissen met 17-βestradiol, het voornaamste hormoon geproduceerd door de eierstokken, om te binden aan oestrogeenreceptoren van zoogdieren (Bennett en Klich, 2003). Dit brengt hormonale veranderingen teweeg, die aanleiding kunnen geven tot vroegrijpheid en andere hyperoestrogene syndromen bij zoogdieren. α-zearalenol is drie tot vier keer meer oestrogeen dan ZEA, daar waar β-zol gelijk of iets minder oestrogeen is dan ZEA (Kim et al., 2005) Emerging mycotoxinen door Fusarium Algemeen De hogervermelde mycotoxinen zijn voornamelijk bestudeerd in het modelsysteem FHBtarwe. Meer en meer onderzoek focust echter op de aanwezigheid van Fusarium species in andere gewassen en vaak zijn dit minder frequent voorkomende species met een zeer specifiek mycotoxineprofiel. De species beschreven in tabel 3 en 4 die voorkomen op prei behoren tot deze groepen van Fusarium spp. en hun toxinen worden vaak emerging mycotoxinen genoemd. 27

35 Mycotoxinen worden emerging genoemd omwille van hun pas late ontdekking, maar ook door hun pas laat of nog niet volledig begrepen rol als mycotoxine. Jestoi (2008) haalt in dit verband vier mycotoxinen aan: fusaproliferine (FUS), beauvericine (BEA), enniatinen (ENNs) en moniliformine (MON). Fusarium avenaceum bijvoorbeeld is niet gekend om zijn productie van de traditionele mycotoxinen zoals trichothecenen, maar om de productie van emerging mycotoxinen, meer bepaald BEA, ENNs en MON Fusaproliferine - Structuur Fusaproliferine is een bicylische sesquiterpeen bestaande uit vijf isoprene eenheden. Fusarium species die FUS produceren, produceren ook meestal deacetyl-fus in een verhouding van 3:1. De gedeacetyleerde vorm bezit echter wel een gelimiteerde toxiciteit in vergelijking met FUS zelf. De structuurformule van beide metabolieten wordt weergegeven in figuur 9. Fusaproliferine is bipolair doordat enerzijds de vier methylsubstituenten (op C3, C7, C11 en C15) samen met de CH- en CH2-groepen een hydrofobe omgeving vormen. Anderzijds zorgen de hydroxyl-, carbonyl- en estergroepen voor een hydrofiele zijde. De gedeacetyleerde vorm bezit een verhoogde polariteit, waardoor de mogelijkheid om het celmembraan te penetreren verlaagt en gedeacetyleerde FUS minder fytotoxisch is (Jestoi, 2008). Figuur 9. De structuurformule van fusaproliferine (R = CH 3 CO - ) en gedeacetyleerde fusaproliferine (R = H) (Jestoi, 2008) - Biosynthese FUS wordt geproduceerd door de mevalonzuurpathway, via gemeenschappelijke terpeen intermediairen oorspronkelijk gevormd uit acetyl-coa. Twee acetyl-coa-moleculen reageren met elkaar om acetoacetyl-coa te vormen, opname van een derde acetyl-coa vormt mevalonzuur. Mevalonzuur ondergaat fosforylatie en IPP wordt gevormd. Twee IPPmoleculen vormen geranyl pyrofosfaat (GPP) en bij binding van een derde GPP wordt FPP gevormd. Geranyl-farnesyl pyrofosfaat (GFPP) ontstaat door de reactie van GPP en FPP en na cyclisatie ontstaat uiteindelijk fusaproliferine (Jestoi, 2008). 28

36 - Belang en voorkomen FUS werd reeds gerapporteerd als secundair metaboliet van acht Fusarium species. De belangrijkste hiervan is F. proliferatum. In maïs werd in Italië tot 500 mg/kg FUS teruggevonden (Ritieni et al., 1997). Tot 300 µg/kg, 62 µg/kg en 8200 µg/kg werd teruggevonden in respectievelijk de USA, Zuid-Afrika en Slovakije (Munkvold et al., 1998; Shephard et al., 1999; Srobarova et al., 2002) Beauvericine enniatinen - Structuur Beauvericine (BEA) en enniatinen (ENNs) zijn cyclische hexadepsipeptiden, bestaande uit drie afwisselende D-α-methylbutaanzuur- (2-hydroxy-3-methylbutaanzuur) en aminozuureenheden. In BEA zijn deze aminozuren aromatische N-methyl-fenylalanines, terwijl de aminozuureenheden in enniatine A en B alifatische N-methyl-valine, -isoleucine of een mengsel van de twee zijn. Deze eenheden zijn verbonden met peptidebindingen en intramoleculaire esters, waardoor een depsipeptide ontstaat. De structuurformule wordt weergegeven in figuur 10. BEA en ENNs zijn ionofore moleculen die stabiele en lipofiele complexen kunnen vormen met kationen en hen kunnen transporteren in de lipofiele fase. Deze ionofore complexen bestaan meestal uit een kation en een ionofoor (1:1). Dankzij de N-methylatie van de peptidebindingen, vormen zich geen stabiliserende intramoleculaire waterstofbindingen in BEA en ENNs moleculen. Hierdoor verhoogt de selectiviteit met welke kationen er kan gecomplexeerd worden. BEA en ENNs zijn dus in staat complexen te vormen met verschillende metaalkationen of met neutrale of geladen kleine moleculen, zoals natrium en kalium. Niet enkel 1:1 verbindingen kunnen gevormd worden, er kunnen ook multicomplexen met kationen, en twee (1:2) of drie (2:3) ionofore moleculen gevormd worden. De stabiele BEA-metaalion-anioncluster kan worden gevormd in een kanaalporie in het celmembraan, dat verantwoordelijk is voor het transport van ionen door het membraan. Deze eigenschap zorgt voor de toxiciteit van BEA en ENNs (Jestoi, 2008). Figuur 10. De structuurformule van beauvericine en enniatinen (Jestoi, 2008) 29

37 - Biosynthese De biosynthetische pathway van BEA en ENNs is gelijkaardig. De productie van deze secundaire metabolieten wordt gekatalyseerd door niet-ribosomale multifunctionele enzymen, nl. beauvericine of enniatine synthasen. Het gen dat bij enniatine synthase hoort, esyn1 (figuur 12) werd geïsoleerd en gesequeneerd uit F. scirpi coderend voor een Open Reading Frame (ORF) van 9393 baseparen (3131 aminozuren). Het enzym is een polypeptide van 347 kda. De enzymen bestaan uit een peptide synthase en een geïntegreerde N-methyltransferase. Peptide synthasen zijn georganiseerd in groepen van actieve sites, modules genoemd. Enniatine synthase bestaat uit twee modules (EA en EB). De module EA is verantwoordelijk voor de activatie en binding van D-α-methylbutaanzuur. De module EB activeert en bindt L-valine. Iedere module is dus verantwoordelijk voor de katalyse van één cyclus van de polypeptide ketenverlenging en functionele groep modificaties. Door interactie van de twee modules wordt met de precursoren (D-αmethylbutaanzuur en L-fenylalanine voor BEA; valine of isoleucine voor ENN A, A1, B en B1) een dipeptidol eenheid gevormd. Een thiolgroep fungeert als acceptor van de groeiende peptideketen (condensatiereactie van dipeptidol eenheden). Het enniatine molecule wordt gevormd door drie opeenvolgende condensatiereacties van enzymgebonden dipeptidoleenheden. De N-methylatie vindt plaats voor de vorming van de peptidebindingen en de uiteindelijke cyclisatie van het lineaire hexadepsipeptide (Jestoi, 2008; Hornbogen et al., 2002). Een structurele weergaven van deze biosynthese wordt weergegeven in figuur 11. Figuur 11. De biosynthese van beauvericine en enniatine (Hiv = D-α-methylbutaanzuur; Xaa = L-fenylalanine voor BEA, valine of isoleucine voor ENNs; E = beauvericine synthase voor BEA, enniatine synthase voor ENNs; AMP = adenosyl monofosfaat; -S- = thiolgroep; Me = methylgroep) (Jestoi, 2008) 30

38 Figuur 12. Voorstelling van enniatine synthase (esyn1) (EA = L-valine activerende module; EB = D-α-methylbutaanzuur activerende module; S = 4 -fosfopantetheine binding sites, M = N-methyltransferase; C = vermeende condensatie sites; nummers = de aminozuurpositie i in de sequentie van enniatine synthase) (Hornbogen et al., 2002) - Toxiciteit De primaire toxische activiteit van BEA en ENNs is dus zoals gezegd gerelateerd aan hun ionofore eigenschappen. Ze zijn in staat om het transport van mono- en divalente kationen door membranen te reguleren, wat leidt tot toxiciteit door verstoring van normale fysiologische concentraties. In de mitochondriale membranen resulteert dit in ontkoppeling van de oxidatieve fosforylatie (Escrivá et al., 2015). Sommige studies suggereren dat BEA (en ENNs) zich in het membraan kan gedragen als een ioncarrier, andere als selectief kationkanaal. Eukaryotische cellen sterven door ofwel necrose, waarbij het DNA intact blijft of door apoptose, waardoor DNA wordt gefragmenteerd in fragmenten van baseparen. BEA kan apoptose induceren door een verhoging van de cytoplasmatische Ca 2+ -concentratie te veroorzaken. Dit proces houdt twee stappen in. Ten eerste interageert BEA met het celmembraan (ionoforische actie), wat een verhoging van de intracellulaire Ca 2+ -concentratie teweegbrengt. Deze verhoging van de Ca 2+ -concentratie is noodzakelijk, maar niet voldoende om het Ca 2+ -afhankelijk endonuclease te stimuleren. Ten tweede, wanneer de membraanbeschadiging groot genoeg is, kunnen BEA-molecules de kern binnendringen en toegang krijgen tot het DNA. Hierdoor kan uiteindelijk het beschadigde DNA gefragmenteerd worden door het Ca 2+ -afhankelijk endonuclease. BEA en ENNs inhiberen ook de activiteit van acyl-coa:cholesterolacyltransferase (ACAT). ACAT is een membraangebonden enzym dat de omzetting van cellulair cholesterol en langketenige acyl-coa tot cholesterylester katalyseert. Het is een component die een belangrijke rol speelt in de cholesterylaccumulatie in atherogenese en in cholesterolabsorptie in de maag. BEA heeft het hoogst inhiberend effect op dit enzym (BEA > ENN A > ENN A1 > ENN B1> ENN B) (Jestoi, 2008). 31

39 - Belang en voorkomen In het algemeen wordt enniatine B teruggevonden als metaboliet met de hoogste concentratie. De volgorde kan als volgt opgesteld worden: enniatine B > enniatine B1 > enniatine A1 > enniatine A > beauvericine. In Finse granen (tarwe, gerst, haver en rogge) werd enniatine B en B1 in alle stalen teruggevonden, enniatine A en A1 in respectievelijk 74 en 95 % van de stalen. De maximale concentratie van enniatine B in tarwe bedroeg µg/kg, terwijl de concentratie van beauvericine minder dan 10 µg/kg bedroeg (Jestoi et al., 2004). In maïs rapporteerden verschillende andere studies wel hoge concentraties van BEA. In Italië werd een concentratie in mais tot µg/kg gevonden (Ritieni et al., 1997). Vergelijking van deze resultaten is echter moeilijk, aangezien beauvericine in maïs doorgaans het gevolg is van infectie met F. subglutinans en F. proliferatum. Terwijl infectie in het onderzoek van Jestoi et al. (2004) voornamelijk gebeurd was door F. avenaceum (Uhlig et al., 2007). Kulik et al. (2010) stelden een significant positieve correlatie vast tussen de hoeveelheid enniatine en de hoeveelheid F. avenaceum/f. tricinctum esyn1 genotype (R = 0,61) en F. poae esyn1 genotype vast. Het gen esyn1 speelt ook een rol in de virulentie van F. avenaceum. De virulentie, getest op aardappelweefsel, verminderde significant na verstoring van het esyn1 gen (Herrmann et al., 1996) Moniliformine - Structuur Moniliformine (MON) benoemd men ook als 3-hydroxycyclobut-3-een-1,2-dion. In de natuur komt MON voor als een natrium of kalium zout van het semikwadraatzuur (Jestoi, 2008). De structuurformule van MON wordt weergegeven in figuur 13. Figuur 13. De structuurformule van MON (X = H voor het vrije zuur: X = Na voor het natriumzout; X = K voor het kaliumzout) (Jestoi, 2008) - Biosynthese De biosynthese van MON volgt de polyketide pathway. Door koppeling van twee azijnzuureenheden ontstaat één cyclobutadion. Deze intermediair ondergaat verder oxidatie en dehydrogenatie om zo uiteindelijk MON te vormen (Jestoi, 2008). De biosynthese wordt structureel weergegeven in figuur 14. In tegenstelling tot bijvoorbeeld ENN is bij MON niet geweten welk gen verantwoordelijk is voor zijn biosynthese. 32

40 Figuur 14. De biosynthese van moniliformine (Jestoi, 2008) - Toxiciteit De cytotoxiciteit van MON is doorgaans tamelijk laag, behalve in lymfocyten, skelet- en hartmyocyten. De concentraties met werking, bekomen in in vitro onderzoek duiden hoe dan ook op een groter toxische effect van MON op celniveau dan in vivo (Jestoi, 2008). Door de structurele gelijkenis met pyruvaat, heeft MON via de inhibitie van mitochondriaal pyruvaat en de oxidatie van α-ketoglutaraat een invloed op het energiemetabolisme (Krebs cyclus) (Escrivá et al., 2015). - Belang en voorkomen In maïs worden de hoogste concentraties MON vastgesteld. In Polen werden concentraties tot en met µg/kg gevonden in zichtbaar aangetaste maïskorrels (Logrieco et al., 1993). Ook in Zuid-Afrika werden concentraties tot µg/kg gevonden (Thiel et al., 1982). MON-concentraties in graan uit Noorwegen en Finland bedroegen respectievelijk maximum 950 µg/kg en 810 µg/kg. Hierbij werd echter wel opgemerkt dat klimatologische omstandigheden niet gunstig leken voor MON-productie. De grootste concentratie in granen bedraagt µg/kg, gevonden in haver in Polen (Sharman et al., 1991). Bij maïs ging het echter wel om een selectie van zwaar aangetaste korrels, wat bij haver misschien minder het geval was. Volgelgsang et al. (2008) vond in granen geïnfecteerd met F. avenaceum 2400 tot µg/kg MON. Hoe groter de aantasting was door F. avenaceum, hoe groter de MON-inhoud was. Naast F. avenaceum, wordt MON nog geproduceerd door verschillende andere Fusarium species, waaronder ook F. culmorum (Scott et al., 1987). 33

41 2. Materiaal en methoden 2.1 Isolaten Fusarium spp Staalname De isolaten werden op verschillende plaatsen in Vlaanderen verzameld vanop geïnfecteerde prei (figuur 15). In tabel 10 worden deze isolaten weergegeven, met hun chemotype, gastheer, jaar van staalname en oorsprong. De isolaten komen van zes verschillende locaties (twee in Passendale). De stalen vanop locatie 4 (Kruishoutem) werden zelf genomen, de rest werd verzameld in samenwerking met Lien Tyvaert (Laboratorium Phytopathologie, UGent), Inagro in Beitem, PCG in Kruishoutem en PSKW in Sint-Katelijne- Waver Figuur 15. Oorsprong isolaten Fusarium spp. vanop prei in Vlaanderen (1 = Dentergem; 2 = Passendale; 3 = Beitem; 4 = Kruishoutem; 5 = Sint-Katelijne-Waver) Isolatie, monospoor maken en opkweken Fusarium spp Isolatie vanuit prei Veldstalen van Fusarium spp. werden vanuit prei geïsoleerd via een oppervlakkige sterilisatie. De preistukjes werden eerst gesteriliseerd door ze gedurende 1 minuut in een 4 % javel oplossing te dompelen, driemaal te spoelen met steriel water en te laten drogen in een laminaire flowkast. De preistukjes werden vervolgens geïncubeerd op Potato Dextrose Agar (PDA)-medium bij 22 C gedurende vijf dagen, zodat schimmelgroei plaatsvond. Bij besmetting met andere schimmelspecies werd getracht de Fusarium stam op te zuiveren door het overzetten op nieuwe PDA-platen Monospoor maken en bewaring van Fusarium spp. isolaten De gebruikte veldisolaten werden opgekweekt en monospoor gemaakt op PDA-medium (39 g/l). De conidiën werden verkregen door de isolaten gedurende vijf dagen afwisselend 12 uren in een donkere omgeving en 12 uren onder UV-licht met een golflengte van 365 nm te plaatsen. Via een verdunningsreeks werden afzonderlijke kolonies bekomen die werden overgezet naar nieuwe PDA platen. Deze platen werden opnieuw ter sporulatie geïncubeerd 34

42 zoals hierboven beschreven. Vervolgens werden de conidiën in 20 % (v/v) glycerol op -80 C bewaard. Bij een andere methode om inoculum te produceren voor de infectietesten wordt Mung Bean Broth gebruikt. Hierbij werd 20 g groene soja per halve liter gedurende 15 minuten gekookt en vervolgens geautoclaveerd. Van elk isolaat werden enkele myceliumpluggen genomen en aan 50 ml Mung Bean Broth in een geautoclaveerde erlenmeyer toegevoegd. Na de erlenmeyers een week te laten schudden konden de conidiën geoogst worden Identificatie Fusarium spp. Na het enten en vervolgens groeien van de zuivere isolaten op vloeibaar medium, werd het mycelium gevriesdroogd en vermalen, om daarna een DNA-extractie te ondergaan. Het vloeibaar medium bestaat voor 250 ml, enkel geconcentreerd uit de volgende componenten: 7,5 g sucrose, 217,75 mg L-arginine, 0,25 g KH 2 PO 4, 0,125 g MgSO 4.7H 2 O, 0,125 g KCL, 2,5 mg Fe SO 4.7H 2 O, 50 µl Trace Element Solution (TES) en 225 ml H 2 O. Dit geheel werd tot ph 6,5 gebracht en gefiltersteriliseerd (Correll et al., 1987; Gardiner et al., 2009). DNA-extractie gebeurde met de hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)-methode (Saghaimahroof et al., 1984). Aan elk epje werd 500 µl van de CTAB extractie buffer toegevoegd, bestaande uit 0,1 M Tris (ph 7,5), 1 % CTAB (hexadecyl trimethyl ammonium bromide), 0,7 M NaCl, 10 mm EDTA, 1 % β-mercaptoethanol en 0,3 mg/ml proteïnase K. De stalen werden gevortext en gedurende 60 minuten geïncubeerd in een warmwaterbad op 65 C. Daarna werd aan ieder staal 500 µl chloroform:isoamylalcohol (24:1) toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 15 minuten aan 13 rpm gecentrifugeerd en 350 µl van het supernatans werd gepipetteerd en overgebracht naar een nieuw epje. Om het DNA te doen neerslaan werd vervolgens 350 µl isopropanol toegevoegd. Na centrifugatie gedurende 10 minuten op 13 rpm, werd de DNA-pellet gescheiden van het supernatans. Na deze stap werd het DNA gewassen met 150 µl 70 % ethanol en hierna gedroogd door het DNA onder de flow te zetten gedurende 60 minuten. Ten slotte werd 50 µl TE-buffer en 2 µl RNAse toegevoegd en bewaard op -20 C. In tabel 6 worden alle gebruikte primers weergegeven voor de species en chemotype identificatie. DNA amplificatie werd uitgevoerd in een Applied Biosystems GeneAmp PCR System Van elk staal werd 2 µl naar een PCR-epje overgebracht, daarbij werd 23 µl van een PCR-mix gevoegd, bestaande uit volgende componenten (voor 1 staal): 5 µl GoTaq polymerase (700 mm Tris-HCl, 200 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 0,1 % (v/v) Tween 20), 1,25 µl dntp s, 1 µl primer forward (5000 nm), 1 µl primer forward (5000 nm), 1,25 BSA (bovine serum albumine), 13,5 µl mq H 2 O en 0,125 µl Taq polymerase. De stalen werden in het PCR-toestel gedurende 5 minuten aan 95 C onderworpen (initiële denaturatie). Daarna werden 38 cycli doorlopen. Eén cycli bestaat uit 30 seconden bij 95 C (denaturatie), 25 seconden bij 60 C (annealing), 45 seconden bij 72 C (extension). Tot slot werd het extract 10 minuten geïncubeerd bij 72 C (final extension) en afgekoeld tot 4 C (bewaring). 35

43 Amplicons werden gescheiden op een 1 % agarosegel, waarbij de agarose opgelost werd met TAE buffer (Tris base, Acetic acid en EDTA). Aan de hand van gelelektroforese werden de DNA-fragmenten gescheiden op basis van hun lengte. Vervolgens werden de amplicons gekleurd met 0.1 µg/ml ethidium bromide. Ter controle van identificatie met de species specifieke primers, werd DNA geamplificeerd en gesequeneerd (700 bp) van de translatie elongatie factor (EF-1α) aan de hand van de primers EF_1 en EF_2, weergegeven in tabel 6. Hierbij werd gebruik gemaakt van een werkoplossing van 50 µl. De annealing temperatuur bedroeg 55,3 C in plaats van 60 C. Dit werd bepaald met een PCR met gradiënt van de annealing temperatuur (60 C - 59,6 C - 59 C - 58,1 C - 56,9 C - 56 C - 55,3 C - 55 C). Amplicons worden weergegeven in figuur Figuur 16. PCR Amplicons verkregen met DNA van Fusarium spp. (isolaten 10, 19, 21, 24 en 30) met de primerset EF1/EF2. Gradiënt van de annealing temperatuur bestaat uit volgende temperaturen ( C): 60,0-59,6-59,0 58,1 56,9 56,0 55,3 55,0. Grootte van de amplicons bedraagt 700 bp. Voor het bepalen van de sequentie, werd het PCR product daarna opgezuiverd aan de hand van een E.Z.N.A. Cycle Pure Kit Centrifugation Protocol. Na verkrijgen van de sequenties kon via het National Center for Biotechnology Information (NCBI) het species bevestigd worden. 36

44 Tabel 6. Gebruikte primers voor de species en chemotype identificatie Sequentie (5-3 ) Grootte (bp) Referentie Species F. avenaceum GCTAATTCTTAACTTACTAGGGGCC 220 Turner et al., CTGTAATAGGTTATTTACATGGGCG 1998 F. culmorum ATGGTGAACTCGTCGTGGC 570 Nicholson et al., CCCTTCTTACGCCAATCTCG 1998 EF_1 EF_2 ATGGGTAAGGAGGACAAGAC GGAAGTACCAGTGATCATGTT 700 Stepien en Waskiewicz, 2013 Chemotype NIV vs DON TACGTGAAACATTGTTGGC GGTGTCCCAGGATCTGCG 415/234 Waalwijk et al.,

45 2.2 Optimalisatie van een infectie-assay Disc assay Bij dit infectie-assay werd gebruik gemaakt van schijfjes uit de preistengel. Analoog met onderzoek van Oxspring et al. (2004) werden de schijfjes eerst gesteriliseerd door ze gedurende 3 minuten in een 4 % javel oplossing te dompelen. Daarna werden ze gewassen met steriel water en gedroogd in een laminaire flowkast. Per isolaat werden zes preischijfjes op vochtig papier in een gesloten doosje gelegd. Hierop werd 0,5 ml chloramfenicol (100 mg/l) gepipetteerd, waarna een plug van een gesporuleerde PDA-plaat op het preischijfje gelegd werd. Deze proef werd tweemaal uitgevoerd met de isolaten 5,11,16,19 en 20. Dit zijn allen F. avenaceum isolaten. Figuur 17 geeft van de eerste herhaling in de tijd enerzijds de controle (A) weer, anderzijds isolaat 5 (B). Hierbij werden preischijfjes gebruikt met een diameter van 1 cm. Evaluatie vond plaats na 6 dagen. De tweede maal werden preischijfjes gebruikt met een diameter van 3 cm. Evaluatie vond hierbij plaats na drie dagen. De eerste maal werd op de preischijfjes een kwalitatieve mycotoxine analyse uitgevoerd Seedling assay Voor dit infectie-assay werd Murashige and Skoog (MS)-medium gebruikt (Murashige en Skoog, 1962). Dit medium bestaat uit de volgende componenten: 15 g/l sucrose, 121 g/l agar, 2,2 g/l MS. Dit geheel werd op ph 5.8 gebracht en geautoclaveerd. Dit medium werd in vierkante petriplaten gegoten, terwijl de petriplaten werden schuin gehouden, zodat het MSmedium slechts de helft van de petriplaat bedekte. Vervolgens werden preizaden gedesinfecteerd door ze 5 minuten in ethanol te houden, 15 minuten in 1 % javel en ten slotte gedurende 5 minuten te wassen in steriel water. Nadat de zaden in de flow gedroogd waren, werden 10 zaadjes per petriplaat op één lijn in het MS-medium gelegd. Van zodra de zaadjes kiemden, werd de plaat rechtop gezet, in een groeikamer geplaatst en de wortelzone omwikkeld met aluminiumfolie. Daarna werd telkens tussen twee zaadjes 5 µl van een conidiënsuspensie gepipetteerd. Na indringen in het MS-medium werden de platen terug rechtop gezet. Ook dit infectie-assay werd tweemaal herhaald in de tijd. Een eerste maal werd 8 dagen na zaaien van de prei de conidiënsuspensie toegevoegd. De concentratie bedroeg 10 6 conidiën per ml. Zes dagen na inoculatie werd de proef geëvalueerd. Er werd gebruik gemaakt van de isolaten 7, 9, 15 en 18. In figuur 17 wordt dit weergegeven (C en D). Een tweede maal werd langer gewacht met inoculatie en gebeurde dit 13 dagen na zaaien. Hierbij werd ook de concentratie gevarieerd, en bedroegen deze 10 5 en 10 6 conidiën per ml. Na drie dagen werd deze tweede proef geëvalueerd, waarbij ook de wortellengte opgemeten werd. Er werd ditmaal gebruik gemaakt van dezelfde isolaten als bij de disc assay, nl. 5, 11, 16, 19 en 20. Ook dit wordt weergegeven in figuur 17 (E en F). 38

46 A B C D E F Figuur 17. Overzicht infectie-assays (A: disc assay - controle; B: disc assay - isolaat 15; C: seedling assay, herhaling 1 - controle; D: seedling assay, herhaling 1 - isolaat 18; E: seedling assay, herhaling 2 isolaat 16; F: seedling assay, herhaling 2 controle) 39

47 2.2.3 Potproef Voor de potproef werden zaden van een gevoelig ras, nl. Harston uitgezaaid. Bij het overplanten van de plantjes in trays werden ze geïnoculeerd met F. avenaceum of F. culmorum. Er werd gebruik gemaakt van twee verschillende behandelingen. Een eerste behandeling bestond erin ieder plantje gedurende 10 minuten onder te dompelen in een conidiënsuspensie met een concentratie van 10 6 conidiën per ml (behandeling a). Bij de tweede behandeling werd 1 ml van de conidiënsuspensie (ook 10 6 conidiën per ml) aangegoten aan de plantbasis (behandeling b). Onder ieder plantje werd een petriplaat geplaatst, zodat contaminatie met andere isolaten niet mogelijk was. Bij evaluatie werd aan ieder plantje een score gegeven van 1 tot 5. Hierbij werd score 1 aan een volledig gezond preiplantje gegeven en score 5 aan een volledig afgestorven plantje (tabel 7). Van de plantjes met score 1 tot 4 werd telkens ook de wortellengte en schacht- en bladlengte bepaald. Van ieder isolaat werd vervolgens 2 plantjes (1 per behandeling) opzij gehouden voor mycotoxine analyse. De rest van de plantjes werden gedroogd en gewogen. Uit de resultaten bleek dat deze infectiemethodiek de beste resultaten gaf. Tabel 7. Voorbeelden van verschillende scores bij evaluatie potproeven Score Voorbeeld Score Voorbeeld

48 Deze potproef werd herhaald met behandeling b, dus de isolaten werden geïnfecteerd door 1 ml van een conidiënsuspensie (10 6 conidiën per ml) aan te gieten aan de plantbasis. Hierbij werd dezelfde evaluatiemethode gebruikt, maar werden mycotoxinen niet bepaald. 2.3 Virulentietest De infectiemethodiek beschreven onder werd gebruikt om van een aantal veldisolaten de virulentie in een vergelijkende studie te analyseren. Hierbij werd gebruik gemaakt van telkens zeven herhalingen en werden zes isolaten getest op hun virulentie, namelijk 9, 15, 27, 30, 36 en 39. De opzet van deze proef wordt weergegeven in figuur 18, hierbij werden de isolaten en hun behandelingen in een willekeurige volgorde geplaatst. Het verplanten in trays en inoculatie vond plaats bij preiplantjes van 35 dagen oud. Evaluatie van deze virulentietest gebeurde twee maanden na inoculatie. 39b 36b 15b 30a 27a 9b 27a Ca 39b 30b 30a 9b 27b 27a 36a Cb 15a 39a 39b 36b 36b 27b 36a 30a 15b Cb 15a 39b 27a 30b 9b 27b 9a 9a 30b 9b 36b 27a 15b 9a 36a 39a Cb Cb 15b 15a 9a 27b Ca 39a 27b 30b 27a 39a 39b Ca Cb 39a 9b 15b 36b 30a Ca 36a 30a 39a 30a 15a 15a 39b 9a 15a 39a 27b 36b 9b 15b Ca Cb 30a 36a 9b 9a 30b Ca 36a 15a 9a 27b Ca 15b 36a 30b 39b 27a Cb 30a 36b Figuur 18. Opzet eerste potproef (a = onderdompelmethode; b = aangietmethode; C = controle; nummers duiden op isolaten in tabel 10) Deze proef werd zoals vermeld een tweede maal uitgevoerd. De isolaten die hiervoor gebruikt werden, zijn representatief voor de hele beschikbare isolatenset. Er werd gebruik gemaakt van 22 isolaten, met elk vijf herhalingen. Samen met de controle, werden dus 115 plantjes gebruikt (44 dagen oud). De gebruikte isolaten zijn 1, 5, 9, 10, 13, 15, 17, 21, 25, 28, 30, 32, 35, 37, 38, 39, 40, 43, 45, 47, 48 en 49. Dit komt neer op elf isolaten F. avenaceum (afkomstig van drie locaties), negen isolaten F. culmorum (afkomstig van drie locaties) en 2 isolaten F. culmorum, geïsoleerd uit tarwe, om na te gaan of infectie vanuit tarwe op prei mogelijk is. De opzet van deze tweede potproef wordt weergegeven in figuur 19. Hierbij 41

49 werden de isolaten terug in een willekeurige volgorde geplaatst. Deze potproef werd 45 dagen na inoculatie geëvalueerd C C C C C 15 5 Figuur 19. Opzet tweede potproef (C = controle; nummers duiden op isolaten in tabel 10) 2.4 Analyse mycotoxinen Bepaling mycotoxinen Kwalitatieve mycotoxine analyse van geïnfecteerde prei Kwalitatieve mycotoxine analyse werd uitgevoerd om na te gaan of er tijdens een infectie mycotoxinen geproduceerd werden, en zo ja, welke mycotoxinen. Deze analyse gebeurde aan de hand van Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS MS) (Monbaliu et al., 2010). Enerzijds werd deze analyse uitgevoerd op door F. avenaceum geïnfecteerde preischijfjes uit de eerste herhaling van de disc assay. Daarbij werd enkel enniatine B teruggevonden. Anderzijds werd deze analyse ook op veldisolaten uit Sint-Katelijne-Waver (isolaten 43 t.e.m. 47) uitgevoerd Kwantitatieve mycotoxine analyse van geïnfecteerde prei Kwantitatieve mycotoxine analyse werd uitgevoerd volgens dezelfde methode (Monbaliu et al., 2010) en gebeurde enkel bij het geoptimaliseerde infectieprotocol, meerbepaald bij de eerste potproef. Bij elke combinatie van isolaat en behandeling werd één preiplant geanalyseerd. Van de F. avenaceum isolaten werd enkel op ENN B geanalyseerd, aangezien de kwalitatieve mycotoxine analyse bij de disc assay bewees dat enkel dit myotoxine geproduceerd werd. Aangezien het chemotype van de F. culmorum isolaten NIV is, werd voor de preiplanten die met dit isolaat geïnfecteerd waren enkel op dit mycotoxine geanalyseerd. 42

50 2.4.2 Testen van fytotoxiciteit enniatine B Om na te gaan of enniatine B fytotoxisch is, werden met enniatine B twee testen uitgevoerd. Een eerste test bestond erin enniatine B aan te brengen op stengelschijfjes van biologisch gekweekte prei. Hiervoor werd het enniatine eerst opgelost in methanol, waarna het verdund werd tot de concentratierange 1 mg/kg 100 µg/kg 10 µg/kg 1 µg/kg. De preischijfjes werden gedurende 5 minuten gewassen in 1 % javel en driemaal nagespoeld met steriel water. Hierna werd telkens 20 µl enniatine B op het preistukje aangebracht. Er werd gebruik gemaakt van vier herhalingen. Dit wordt weergegeven in figuur 20 (A). Bij een tweede test werden preiplantjes (ras Harston) van 1 maand oud gebruikt. Na het wassen van de wortels, werden deze per plantje geplaatst in falcons met dezelfde concentratierange. Hier werd gebruik gemaakt van vijf herhalingen. In figuur 20 wordt deze proefopzet weergegeven (B). A B Figuur 20. Testen van fytotoxiciteit door enniatine B (A: methode met preischijfjes; B: methode met preiplantjes) 43

51 2.5 Sequenering enniatine synthase gen Analoog met onderzoek van Stepien en Waskiewicz (2013) werden isolaten F. avenaceum getest op hun variabiliteit van esyn1, dat codeert voor het enzym enniatine synthase. De gebruikte primers worden weergegeven in tabel 8. Hierbij werd gebruik gemaakt van een werkoplossing van 50 µl DNA. Per staal werden de volgende componenten toegevoegd aan het PCR-epje: 2 µl DNA, 10 µl GoTaq polymerase (700 mm Tris-HCl, 200 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 0,1 % (v/v) Tween 20), 2,5 µl dntp s, 5 µl primer forward (5000 nm), 5 µl primer forward (5000 nm), 2,5 BSA (bovine serum albumine), 23 µl mq H 2 O en 0,250 µl Taq polymerase. De stalen met de primers Esyn_1/Esyn_2 werden in het PCR-toestel gedurende 15 minuten aan 95 C onderworpen (initiële denaturatie). Daarna werden 38 cycli doorlopen. Eén cycli bestaat uit 30 seconden bij 94 C (denaturatie), 60 seconden bij 60 C (annealing), 2 minuten bij 72 C (extension). Tot slot werd het extract 10 minuten geïncubeerd bij 72 C (final extension) en afgekoeld tot 4 C (bewaring). Voor de amplificatie met de primers ES_BeaF/ES_BeaR werd gebruik gemaakt van annealing gedurende 45 seconden bij 60 C en van extension gedurende 90 seconden bij 72 C. Tabel 8. Primers sequenering enniatine synthase gen Sequentie (5-3 ) Grootte (bp) Referentie Esyn_1 Esyn_2 GCCGTTGGCGAGCTGGTCAT GCAAAGCACGCGTCAACGCA 995 Stepien et al., 2013 ES_BeaF TCTACAGAACWGGHGAYCTTGC 750 Stepien en ES_BeaR CCYCGCATGCGSACRGCGWARGG Waskiewicz, 2013 Van de bekomen forward en reverse sequentie-pcr werd uiteindelijk een contig gemaakt van 467 bp. Hierbij werden de chromatogrammen bij twijfel tussen forward en reverse primers gecontroleerd en tegenstrijdigheden werden geremedieerd. De bekomen sequenties werden onderworpen aan een multi-alignering met ClustalW en vervolgens werd een dendrogram opgebouwd met het programma njplotwin95. Als referentie werden de sequenties van Fusarium oxysporum (GU ), Fusarium scirpi (Z ), 4 isolaten uit het artikel van Stepien en Waskiewicz (2013), weergegeven in tabel 9 en de referentiesequentie op basis van de whole genome sequencing paper van Lysoe et al. (2015) gebruikt. Tabel 9. Isolaten als referentiesequenties (Stepien en Waskiewicz, 2013) Isolaat Gastheer Jaar van isolatie Land van oorsprong KF_2805 Triticum aestivum 2009 Polen KF_3704 Zea mays 2011 Polen KF_3718 Pisum sativum 2012 Polen KF_3719 Pisum sativum 2012 Polen 44

52 De bekomen sequenties werden omgezet naar proteïnesequenties. Daarbij werden proteïnesequenties van drie species als referentie gebruikt, F. equiseti, F. avenaceum en tweemaal F. oxysporum. Deze proteïnesequenties werden geanalyseerd met behulp van een weergave van de functionele domeinen van F. equiseti (CAA ). 2.6 Statistische analyse Bij de statistische verwerking van de data werd gebruik gemaakt van het programma SPSS (Statistical Package for the Social Sciences). Alle testen worden uitgevoerd met een betrouwbaarheid van 95 %. Bij de evaluatie van de seedling assay werd een Two-way ANOVA gebruikt om na te gaan of de wortellengte verschilde voor de isolaten en voor de twee conidiënsuspensies. Daarvoor werden eerst gelijkheid van normaliteit en variantie nagegaan. Wat betreft de evaluatie van de potproef, werd eerst met de niet-parametrische Kruskal- Wallis test gecontroleerd of de wortellengte, schacht- en bladlengte en score van elkaar verschilden voor de controle en de isolaten. Daarna werden paarsgewijze Mann-Whitney U testen uitgevoerd als alternatief voor de post hoc test. Om vervolgens na te gaan of een significante correlatie bestaat tussen twee factoren, werd de Pearson correlatiecoëfficiënt R berekend. 45

53 3. Resultaten en discussie 3.1 Survey In tabel 10 worden alle verzamelde schimmelisolaten vanop prei weergegeven. Isolaat nr. 48 en 49 zijn verkregen vanop tarwe en werden gebruikt om na te gaan of infectie vanuit tarwe op prei mogelijk is. Tabel 10. Gegevens schimmelisolaten Fusarium spp. Nummer Species Chemotype Gastheer Jaar Oorsprong F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. avenaceum F. culmorum F. culmorum F. culmorum F. culmorum F. culmorum F. culmorum F. culmorum F. culmorum F. culmorum F. culmorum ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B ENN B NIV NIV NIV NIV NIV NIV NIV NIV NIV NIV Dentergem Dentergem Dentergem Dentergem Dentergem Dentergem Dentergem Dentergem Dentergem Dentergem Dentergem Dentergem Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale Passendale 46

54 34 F. culmorum NIV Beitem 35 F. culmorum NIV Beitem 36 F. culmorum NIV Kruishoutem 37 F. culmorum NIV Kruishoutem 38 F. culmorum NIV Kruishoutem 39 F. culmorum NIV Kruishoutem 40 F. culmorum NIV Kruishoutem 41 F. culmorum NIV Kruishoutem 42 F. culmorum NIV Kruishoutem 43 F. avenaceum ENN B 2015 Sint-Katelijne-Waver 44 F. avenaceum ENN B 2015 Sint-Katelijne-Waver 45 F. avenaceum ENN B 2015 Sint-Katelijne-Waver 46 F. avenaceum ENN B 2015 Sint-Katelijne-Waver 47 F. avenaceum ENN B 2015 Sint-Katelijne-Waver 48 F. culmorum NIV Tarwe 2011 Verrebroek 49 F. culmorum DON Tarwe 2011 Zwalm Uit deze survey bleek dat de twee Fusarium species die prei aantasten in Vlaanderen behoren tot de species F. avenaceum en F. culmorum. Dit werd bepaald via determinatie met een species specifieke PCR (figuur 21). Op drie van de zes locaties werd aantasting door F. avenaceum teruggevonden, op de andere drie F. culmorum. Binnen Europa werd enkel F. culmorum al gerapporteerd binnen het geslacht Allium, meerbepaald in Spanje (Armengol et al., 2001; Quarta et al., 2005) en Italië (Tamietti et al., 1977) op prei en in Nederland op ui (Galván et al., 2008). Daarnaast werd in Duitsland op prei, maar ook op ui en look F. oxysporum, F. solani en F. proliferatum gevonden. Hierbij werd echter de agressiviteit van de isolaten en hun vermogen om Allium spp. te infecteren niet bevestigd. De mogelijkheid bestaat dus dat deze drie species enkel saprofytisch aanwezig waren (Boehnke et al., 2015). Op wereldniveau werd F. culmorum op prei gerapporteerd in Californië (Koike et al., 2003), terwijl zowel F. avenaceum als F. culmorum werden beschreven in Australië. Fusarium avenaceum werd daar ook teruggevonden op symptoomloze zaailingen en in de bodem rondom de geïnfecteerde planten. Daarnaast werden nog twee andere species teruggevonden in Australië, namelijk F. semitectum en F. oxysporum (Hall et al., 2007). Verder werd op ui F. culmorum beschreven in Mexico (Montes-Belmont et al., 2003) en F. avenaceum in Uruguay (Galván et al., 2008). Vaak worden F. avenaceum en F. culmorum samen met F. graminearum aangehaald als de drie belangrijkste en meest verspreide Fusarium species bij FHB-tarwe. Fusarium graminearum wordt vooral teruggevonden in warme en gematigde regio s, terwijl in de koudere regio s van Noordwest-Europa F. culmorum domineert, alhoewel ook F. poae in 47

55 sommige jaren kan domineren. Fusarium avenaceum wordt teruggevonden over een range van klimaatzones (Uhlig et al., 2007; Bottalico en Perrone, 2002). Wat betreft het chemotype, werd met een kwalitatieve LC-MSMS analyse van deze prei vastgesteld dat alle F. avenaceum isolaten het ENN B chemotype hebben. Opvallend was daarbij ook het voorkomen van citrinine. Aangezien dit mycotoxine niet door Fusarium spp. geproduceerd wordt, was waarschijnlijk een secundair pathogeen aanwezig. Citrinine werd voor het eerst geïsoleerd bij Penicillium citrinum. Achteraf werd het teruggevonden bij meer dan twaalf Penicillium species en verschillende Aspergillus species (o.a. Aspergillus terreus en Aspergillus niveus). Citrinine werd ook geïsoleerd bij Monascus ruber en Monascus purpureus (Bennett en Klich, 2003). Het ENN B chemotype werd bevestigd door een kwalitatieve mycotoxine analyse van veldisolaten. Alle F. culmorum isolaten hebben het NIV chemotype. Ook F. culmorum isolaten vanop tarwe hebben in Vlaanderen voornamelijk het NIV chemotype. In onderzoek van Audenaert et al. (2009) had in % van de isolaten het NIV chemotype, in 2008 was dat 88%. Figuur 21 toont een overzicht van de PCR-reacties, uitgevoerd ter identificatie van het species en het chemotype. Bij B ontbreken amplicons bij isolaat 37 en 40, doordat de concentratie van het DNA te laag was, later werd het species echter bevestigd met een tweede PCR-reactie. 48

56 Figuur 21. Amplificatieproduct van species en chemotype PCR (A: identificatie F. avenaceum 220 bp; B: identificatie F. culmorum 457 bp; C: bepaling chemotype F. culmorum (NIV) 415 bp) 49

57 3.2 Optimalisatie infectie-assay Inleiding Er werd een infectieprotocol ontwikkeld om de virulentie van de bekomen isolaten op prei te bepalen. In deze virulentietest werd nadien nagegaan in hoeverre mycotoxinen geproduceerd door F. avenaceum en F. culmorum een virulentiefactor zijn voor de schimmel. Naar analogie met Oxspring et al. (2004) werd begonnen met een disc assay en seedling assay. Ter optimalisatie werd ten slotte een in vivo potproef als beste methode ondervonden Disc assay Op figuur 22 (A) wordt het resultaat weergegeven van het eerste maal uitvoeren van de disc assay. De vijf gebruikte isolaten zijn hier allen F. avenaceum. Hierop is duidelijk te zien dat er aantasting door de isolaten plaatsvindt, de preischijfjes waren namelijk zacht en rot geworden. De mate van pathogeniciteit door de verschillende isolaten kon echter moeilijk gekwantificeerd worden. Op deze preischijfjes werd een kwalitatieve mycotoxine bepaling uitgevoerd, het resultaat hiervan wordt besproken in Bij de eerste uitvoering van dit assay was de diameter van de preischijfjes te klein om enig verschil te kunnen zien. Daardoor werd dit infectieprotocol een tweede maal uitgevoerd, maar ditmaal met preischijfjes met een grotere diameter. Op figuur 22 (B) wordt de controle, isolaat 5 en isolaat 20 weergegeven na schimmelgroei van 3 dagen. Op alle preischijfjes was, na het verwijderen van de witte myceliumgroei, een bruine verrotting van de kern van het preistukje waar te nemen. Ook al is hier een duidelijk effect van de schimmel waar te nemen, kwantificatie van aantasting blijft moeilijk. Een algemeen overzicht van deze infectieassay wordt weergegeven in figuur 22 (C). Omwille van deze redenen werd een volgend infectie-assay ontwikkeld, de seedling assay (zie 3.2.3). 50

58 Figuur 22. Overzicht disc assay (A: eerste herhaling; B: tweede herhaling (controle isolaat 5 isolaat 20); C: tweede herhaling (controle isolaat 16 isolaat 5 isolaat 19 isolaat 20)) 51

59 3.2.3 Seedling assay Het volgend infectie-assay dat uitgevoerd werd, is de seedling assay, weergegeven op figuur 17. Bij vergelijken van de controle met de aantasting door de isolaten wordt duidelijk waargenomen dat wortel- en stengelgroei geremd worden. De worteltjes van de zaailingen vertoonden ook een bruine kleur. Bij het eerste maal uitvoeren van dit infectie-assay werden de zaailingen vrijwel meteen overwoekerd door schimmelmycelium, waardoor ze geen kans hadden tot overleven (figuur 23). Figuur 23. Seedling assay (A: controle; B: isolaat 7 - isolaat 9 - isolaat 18) Om deze reden werd bij het tweede maal uitvoeren enerzijds gebruik gemaakt van een conidiënsuspensie van 10 5 conidiën per ml, naast een concentratie van 10 6 conidiën per ml. Anderzijds werd nu langer gewacht voor het inoculeren van de zaailingen, namelijk 13 in plaats van 8 dagen. Wortellengtes werden opgemeten en worden grafisch weergegeven in figuur 24. Ook hier zijn alle isolaten F. avenaceum (blauwe kleur op figuur 24). Voor isolaat 11 wordt geen boxplot weergegeven bij 10 5 conidiën per ml, omdat een infectie plaatsvond die de wortellengte kan beïnvloeden. Uit de statistische analyse blijkt dat de wortellengte niet significant verschilt voor de vijf isolaten en de controle, evenals ze niet verschilt voor de twee gebruikte conidiënsuspensies. Omwille van deze redenen werd een derde infectie-assay ontwikkeld (zie 3.3), dat uiteindelijk als beste methode zal bevonden worden voor het meten van de virulentie. 52

60 Figuur 24. De wortellengte in functie van het isolaat en aantasting door twee verschillende conidiënsuspensies 53

61 3.3 Virulentietest: potproef Hierbij werd een infectieprotocol in potgrond uitgewerkt (zie 2.2.3). Bij de eerste potproef werden twee inoculatiemethodes gebruikt, namelijk het onderdompelen van de zaailing in een conidiënsuspensie (inoculatiemethode a) en het aangieten van een conidiënsuspensie aan de wortelbasis (inoculatiemethode b). De controle buiten beschouwing gelaten, kregen exact 50 % van de preiplantjes bij evaluatie score 5, meer bepaald 22,6 % bij de methode a en 27,4 % bij methode b. De aangietmethode is dus de meest agressieve methode en wordt om deze reden gebruikt bij het tweede maal uitvoeren van deze potproef. Ieder plantje kreeg een score, naargelang hun aantasting door de schimmel (1 = gezond; 5 = dood). Figuur 25 geeft per isolaat het percentage preiplanten met bepaalde score per isolaat weer, voor beide potproeven. Een standaardvoorbeeld van de aantasting bij elke score wordt weergegeven in tabel 7. A B * * * * * * x x Figuur 25. Het percentage preiplanten met bepaalde score per isolaat en per inoculatiemethode voor de twee potproeven (A: eerste potproef met opsplitsing van de twee inoculatiemethodes (a en b) en met vermelding van drooggewicht (g); B: tweede potproef; av = F. avenaceum; cul = F. culmorum; x = isolaten afkomstig van tarwe; * = significant verschillend van de controle volgens de Kruskal-Wallis en paarsgewijze Mann-Whitney U test met een betrouwbaarheid van 95 %) Eerste potproef Uit statische verwerking blijkt dat de score van isolaten 27, 30, 36 en 39 significant verschillend is met de score van de controle. Onderling verschillen deze vier isolaten echter niet wat betreft hun score. Verder verschillen enkel isolaat 15 en 36 onderling. Er kan dus aangenomen worden dat in deze potproef de vier F. culmorum isolaten het meest virulent zijn, waarbij isolaat 36 het meest virulente isolaat is. Van de twee F. avenaceum isolaten was isolaat 15 in deze potproef dus het minst virulent. Het verschil is duidelijk waar te nemen op figuur

62 Figuur 26. planten eerste potproef: controle (C) - isolaat 15 - isolaat 36 Op figuur 25 (A) wordt onder het isolaat telkens het drooggewicht (g) van de overlevende planten weergegeven. Tussen de score en het drooggewicht bestaat een sterk negatieve correlatie, hoe groter dus de score of hoe groter de aantasting door het isolaat, hoe lager het drooggewicht (R = - 0,906). De wortellengte in functie van het isolaat (of de controle) wordt voor beide methodes weergegeven in figuur 27 (A en B). Hierbij werden de plantjes met score 5 niet opgemeten en dus niet vertegenwoordigd op deze figuren. Op de x-as staat onder het nummer van het isolaat het aantal (over)levende planten, met andere woorden alle planten met score 1 tot 4. Tussen de wortellengte en de score bestaat een significante, negatieve relatie (R = - 0,883). Hoe groter dus de score of hoe groter de mate van aantasting door het isolaat, hoe kleiner de wortellengte. Dit geeft echter geen garantie voor een significant verschil tussen de controle en de verschillende isolaten. Statische analyse bewijst dat geen significant verschil in wortellengte bestaat tussen controle en de isolaten, zowel binnen de behandeling als over de twee behandelingen heen. Tussen de schacht- en bladlengte en de score van aantasting bestaat geen significante correlatie. De schacht- en bladlengte van de controle is ook niet significant groter in vergelijking met deze van de isolaten. Ook binnen de twee methodes worden geen significante verschillen waargenomen. De schacht- en bladlengte in functie van het isolaat (of de controle) wordt voor beide methodes weergegeven in figuur 27 (C en D). Ook hier werd terug het aantal levende planten onder het nummer van het isolaat vermeld. 55

63 A B C D Figuur 27. Wortellengte of schacht- en bladlengte in functie van het isolaat behandeld met methode a (A en C) en methode b (B en D) (grijs = controle; blauw = F. avenaceum; oranje = F. culmorum) Tweede potproef Figuur 28 geeft de wortellengte (A) of schacht- en bladlengte (B) in functie van het isolaat weer. De preiplanten uit de tweede potproef vertoonden in het algemeen minder aantasting door Fusarium. Een verklaring hierbij kan zijn, dat bij de eerste potproef de planten twee dagen onder water hebben gestaan, doordat er een probleem was met de watertoevoer. Hierdoor vond er zuurstofgebrek plaats en verzwakten de planten. Het is immers bekend dat Fusarium spp. veelal optreedt als een zwakteparasiet. Zo vond er in onderzoek van Everts et al. (1985) bij mechanische verwonding van de wortels van ui 20 tot 28 % meer aantasting plaats door F. oxysporum. In de praktijk kan bijvoorbeeld aantasting door de preivlieg of een slechte bodemstructuur aanleiding geven tot infectie door Fusarium spp. Ook bij het overplanten vindt beschadiging van de wortels plaats en kan dit de infectie in de hand werken. Bij de tweede potproef vond de verzwakking door wateroverlast niet plaats. 56

64 Bij inoculatie van de planten met isolaat 25 en 39 (beide F. culmorum) leidde de infectie tot een volledig verlies van de plant bij vier van de vijf planten. Enkel deze twee isolaten zijn dan ook significant verschillend ten opzichte van de controle, wat betreft hun score. Verder verschilt isolaat 25 ook van de isolaten 10, 13, 43 en 48. Isolaat 39 verschilt eveneens van deze isolaten, maar daarbij komen nog isolaat 21, 32, 45 en 47. Opvallend is wel dat ook bij de tweede potproef de wortellengte of schacht- en bladlengte van de isolaten die de inoculatie overleefden onderling of in vergelijking met de controle niet significant verschilden. Dit was het geval voor de isolaten vanop prei, maar ook voor de twee F. culmorum isolaten vanop tarwe, met respectievelijk NIV en DON chemotype. Ook in deze tweede potproef, is er een sterk negatieve correlatie tussen de gemiddelde score van de preiplanten per isolaat en het drooggewicht (R = - 0,908). Waar bij de eerste potproef echter nog een negatieve correlatie bestond tussen wortellengte en de score, is dat hier niet meer het geval. Ook tussen schacht- en bladlengte en score bestaat geen correlatie. Logischerwijs zijn de wortel- en schacht- en bladlengte wel positief gecorreleerd (R = 0,425). Isolaten 48 en 49 zijn twee F. culmorum isolaten vanop tarwe, met respectievelijk het NIV en DON chemotype. Slechts één plant met het DON chemotype stierf af, de planten met het NIV chemotype bleven leven. Daarnaast kregen alle overige isolaten score 1. Er kan besloten worden dat deze isolaten niet in staat waren prei te infecteren. Dit wil echter niet zeggen dat F. culmorum vanuit tarwe, prei niet kan infecteren. Verder onderzoek met meerdere isolaten is hierbij nodig. Voor beide potproeven kan dezelfde conclusie getrokken worden. Isolaat 25 (uit Passendale en 39 (uit Kruishoutem) zijn het meest virulent, maar verder vindt er geen sterke spreiding in virulentie plaats. Ook wordt, ondanks het verschil in virulentie van deze twee isolaten ten opzichte van de andere op vlak van de aantasting, toch geen verschil in wortellengte of schacht- en bladlengte waargenomen. planten worden dus niet geremd in hun groei bij infectie van deze isolaten. 57

65 A A B Figuur 28. Wortellengte (A) of schacht- en bladlengte (B) in functie van het isolaat (grijs = controle; blauw = F. avenaceum; oranje = F. culmorum; groen = F. culmorum tarwe) 58

66 3.4 Analyse mycotoxinen Bepaling mycotoxinen Kwalitatieve mycotoxine analyse van geïnfecteerde prei Kwalitatieve mycotoxine analyse werd uitgevoerd om na te gaan of er tijdens een infectie mycotoxinen geproduceerd worden, en zo ja, welke mycotoxinen. Op door F. avenaceum geïnfecteerde preischijfje werd enniatine B teruggevonden. Ook werd in het preistukje dat geïnfecteerd was met isolaat 11 een minimale hoeveelheid T-2 toxine teruggevonden. F. avenaceum produceert geen T-2 toxine, de voornaamste species die dit mycotoxine wel produceren zijn F. langsethiae, F. sporotrichioides en F. equiseti (Thrane et al., 2004; Jurado et al., 2005). Waarschijnlijk is dus bij het opkweken van de preiplanten contaminatie gebeurd met een andere Fusarium species. Er werden ook veldstalen geanalyseerd die aangetast waren door F. avenaceum (uit Sint- Katelijne-Waver). Hierbij werd eveneens enkel ENN B teruggevonden Kwantitatieve mycotoxine analyse van geïnfecteerde prei Tabel 11 geeft het resultaat weer van kwantitatieve analyse op de preiplantjes uit de eerste potproef. Er werd voor beide species geanalyseerd op ENN B en NIV. Daarbij staat ook de score (mate van aantasting) vermeld die de preiplantjes kregen bij evaluatie van deze potproef. Tabel 11. Concentratie ENN B en NIV in preiplantjes eerste potproef (in µg/kg) B C Species F. av. F. av. F. cul. F. cul. F. cul. F. cul. Methode a Score NIV n.a. n.a. 116 n.a ENN B n.a. n.a n.a. n.a. n.a. n.a. Methode b Score NIV n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a ENN B n.a. 1 n.a n.a. n.a. Bij isolaat 9 (F. avenaceum) werd naast 130 µg/kg ENN B 116 µg/kg NIV teruggevonden. Waarschijnlijk vond hier tijdens de potproef contaminatie met F. culmorum plaats. De proefopzet op figuur 18 toont aan dat isolaat 9, geïnoculeerd met methode a, bij toeval telkens omringd was door isolaat 36. Aangezien dit het meest virulent isolaat is, bestaat de mogelijkheid dat vanuit dit isolaat infectie plaatsvond. Deze concentraties moeten met enige voorzichtigheid beoordeeld worden, Xu et al. (2007) stelde immers dat de aanwezigheid van andere Fusarium species meestal de mycotoxine productie stimuleert. Ook in isolaat 27 en 30 (beide F. culmorum) werden kleine hoeveelheden ENN B teruggevonden. Hierbij moet ook opgemerkt worden dat niet gewerkt werd met geautoclaveerde potgrond. 59

67 Tussen de concentratie NIV en de score van de F. culmorum isolaten (27, 30, 36 en 39) bestaat een significante, positieve correlatie (R = 0,695). Ook tussen de concentratie ENN B en de score van de F. avenaceum isolaten (9, 15) bestaat een positief verband (R = 0,872). Hoe groter dus de score is of hoe virulenter, hoe meer NIV of ENN B er wordt teruggevonden. Isolaat 36 en 39 waren de meest virulente isolaten van deze potproef en produceren dus ook de grootste hoeveelheid NIV. Hier dient wel opgemerkt te worden dat deze correlaties bepaald werden met een beperkt aantal isolaten. Onderzoek met een groter aantal isolaten dient uit te wijzen of deze stelling in het algemeen geldt. Dit wijst aan dat de score een middel zou kunnen zijn om de ENN B en NIV-concentratie in prei te bepalen. Gezien de toxiciteit van deze twee mycotoxinen kan dan al dan niet bepaald worden om de geïnfecteerde prei te vernietigen. Hierbij moet wel rekening gehouden worden met het feit dat de potproef uitgevoerd werd met preiplanten van het ras Harston, dat algemeen bekend staat om zijn Fusarium gevoeligheid. In de praktijk zijn variëteiten verschillend in hun vatbaarheid voor Fusarium spp. Niet altijd bestaat een correlatie tussen de hoeveelheid secundaire metabolieten en het percentage aantasting. Zo kwam bijvoorbeeld in onderzoek van Stepien et al. (2003) het percentage door F. avenaceum aangetaste maïskorrels niet overeen met de geproduceerde hoeveelheid ENN B. De biosynthese van secundaire metabolieten hangt immers niet altijd af van schimmelgroei en incidentie. Omgevingsomstandigheden (chemisch, fysisch en biologisch) beïnvloeden de productie van mycotoxinen (Audenaert et al, 2009; Stepien et al., 2003). Zo stelde bijvoorbeeld Llorens et al. (2004) dat de optimumtemperatuur voor NIVproductie 20 C bedraagt. Wagacha et al. (2007) merkte op dat de schimmel ook onder suboptimale omstandigheden NIV kan produceren om zijn competitiviteit te verbeteren. Om na te gaan of ENN bijdraagt tot pathogeniciteit, werd in onderzoek van Herrmann et al. (1996) van een virulent F. avenaceum isolaat het enniatine synthase gen verstoord. De virulentie, getest op aardappelweefsel werd significant verminderd in vergelijking met de oorspronkelijke isolaten. Daardoor kon geconcludeerd worden dat enniatine productie bijdraagt tot de virulentie van F. avenaceum. Ook trichothecenen, zoals NIV dragen bij tot de virulentie van een isolaat. Desjardins et al. (1996a) bewees dat mutanten die geen trichothecenen produceerden minder virulent waren dan isolaten die dat wel deden. Hierbij ging het wel om F. graminearum isolaten. Zowel NIV als ENN B zijn dus virulentiefactoren bij tarwe. Dit impliceert dat ENN B of NIV productie niet noodzakelijk is om pathogeen te zijn, maar dat deze mycotoxinen wel een rol kunnen spelen in de agressiviteit van deze isolaten. De maximale concentratie aan ENN B die werd teruggevonden in de potproef, is 266 µg/kg. Voor de veldisolaten bedroeg de maximale concentratie 1698 µg/kg ENN B. In tarwe werd in een studie van Jestoi et al. (2004) maximaal µg/kg ENN B teruggevonden. Ook daar werd een significante correlatie teruggevonden tussen de aantastingsgraad van F. avenaceum op Finse granen en de concentratie van ENN B. Hier werd echter wel enkel 60

68 rekening gehouden met de hoeveelheid graan aangetast, niet met de mate van aantasting van de graankorrels zelf. Stepien et al. (2013) vonden zelfs µg/kg ENN B in graankorrels van tarwe terug. De hoeveelheid totale metabolieten correleerde hier echter niet met het percentage door Fusarium aangetaste graankorrels (Stepien et al., 2013). In prei geïnfecteerd met F. culmorum werd maximaal µg/kg NIV teruggevonden. Gezien de toxiciteit van NIV (zie ) wordt een concentratie in granen van 500 tot 2000 µg/kg getolereerd, afhankelijk van land tot land (Escrivá et al., 2015) Testen van fytotoxiciteit enniatine B Bij beide testen (zie 2.4.2) vond geen aantasting plaats door ENN B en was geen verschil te zien tussen de verschillende concentraties. Er kan met andere woorden besloten worden dat de geteste concentraties aan ENN B geen duidelijk fytotoxische effecten hadden. Mogelijks is enniatine niet fytotoxisch wat in strijd is met de eerdere bevindingen. Een andere verklaring kan voortvloeien uit een onderzoek van Lemmens-Gruber et al. (2000). In dat onderzoek werd bij toevoegen van BEA (een structuuranaloog van ENN B) aan hartspiercellen wel toxiciteit waargenomen. BEA en ENN kunnen namelijk dankzij hun ionofore eigenschappen complexen vormen met kationen en hen transporteren in de lipofiele fase (Jestoi, 2008). Wanneer echter ATP werd toegevoegd, verminderde de impact van BEA. Dit wordt ook bevestigd door Dornetshuber et al. (2009), zij stellen dat exogeen ATP de impact van ENN en BEA op de Ca 2+ -homeostase kan omkeren. Er werd geconcludeerd dat BEA toxisch is, maar dat de hartcel een ATP-afhankelijk mechanisme heeft om zichzelf te beschermen, zoals ABC transporters. ABC transporters kunnen menselijke cellen beschermen tegen de impact van de mycotoxinen ENN en BEA (Dornetshuber et al., 2009). Veel Fusarium species, waaronder ook F. avenaceum produceren MON. Door zijn structurele gelijkenis met pyruvaat kan MON in de mitochondriën ATP synthese blokkeren (Escrivá et al., 2015). Een mogelijke verklaring voor het uitblijven van fytotoxiciteit, kan hier dus zijn dat ENNs synergistisch werken met MON (Lemmens, persoonlijke communicatie). Dit is tegengesteld aan onderzoek van Kamyar et al. (2006) waarin vastgesteld wordt dat MON geen synergie vertoont met de cyclohexadepsipeptiden BEA en ENN. 61

69 3.5 Sequenering enniatine synthase gen Alignering van een 467 bp fragment De bedoeling van dit experiment was het in kaart brengen van de divergentie van het esyn1 gen tussen F. avenaceum isolaten van verschillende oorsprong. Het gen esyn1 codeert voor enniatine synthase, een non-ribosomaal peptide synthase dat verantwoordelijk is voor de productie van enniatine (Jestoi, 2008). Er werd tweemaal een partiële sequentie van het esyn1 gen uitgevoerd. Figuur 29 geeft een fragment van 137 bp weer, geselecteerd uit een contig van 467 bp groot, bekomen na sequenering en alignering van een fragment uit het esyn1 gen. Via alignering met een functioneel esyn1 gen bleek dat bij de isolaten 1, 2 en 7 en de referentiesequenties van Fusarium oxysporum, Fusarium scirpi en KF_3704 een extra aminozuur (AZ) aanwezig was op positie Isolaat 7 bezit op positie 1008 een threonine in plaats van een alanine. De andere isolaten hadden drie nucleotiden en dus één AZ minder. De verschillen zijn zeer consistent in de drie groepen van isolaten hierboven beschreven Dendrogram gebaseerd op vergelijking van de contig Het dendrogram, gebaseerd op vergelijking van deze sequenties met de referentiesequenties (zie 2.5) wordt weergegeven in figuur 30. Op dit dendrogram kunnen drie clusters onderscheiden worden. De ene cluster omvat de isolaten 1, 2 en 7. Deze isolaten zijn allen afkomstig van Dentergem en bezitten dus een AZ meer. Binnen de cluster wordt een opsplitsing gemaakt tussen isolaat 7 en isolaat 1 en 2, om redenen in uitgelegd. De derde cluster omvat de isolaten 6, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22 en 23. Hierbij is isolaat 6 het enige isolaat dat afkomstig is van Dentergem, de rest werd geïsoleerd in Passendale. Dit zijn de isolaten met een AZ minder dan isolaten 1, 2 en 7. In beide clusters horen ook enkele referentiesequenties. Zo behoort Fusarium oxysporum, Fusarium scirpi, lysoeesyn1 en KF_3704 bij de eerste cluster met een extra AZ. Bij de tweede cluster behoren KF_3719, KF_2805 en KF_

70 A B Figuur 29. Fragment uit contig van esyn1 gen (A) (Fusariumox: Fusarium oxysporum GU ; Fuariumsc: Fusarium scirpi Z ; lysoeesyn1: volledig genoom esyn1 (Lysoe et al., 2015); KF2805, KF3704, KF3718 en KF3719: zie tabel 9); grafische weergave van het esyn1 gen (B) 63

71 Figuur 30. Dendrogram van sequenties bekomen met primerparen Esyn_1/Esyn_2 en ES_BeaF/ES_BeaR (tabel 8) en referentiesequenties (Fusariumox: Fusarium oxysporum GU ; Fuariumsc: Fusarium scirpi Z ; lysoeesyn1: volledig genoom esyn1 (Lysoe et al., 2015) ; KF2805, KF3704, KF3718 en KF3719: zie tabel 9; nummer bij vertakking wijst op bootstrapping met 1000 herhalingen) 64

72 3.5.3 Proteïnesequentie esyn1 Hoewel met de sequenering enkel beoogd werd een idee te krijgen van de diversiteit binnen het esyn1 gen, werd nog een extra analyse doorgevoerd en werd nagegaan of de kleine wijzigingen in de nucleotide sequentie ook leidden tot veranderingen op AZ niveau. In figuur 31 wordt het volledige esyn1 proteïne met al zijn functionele domeinen uit F. equiseti weergegeven (A). De bekomen sequenties van drie isolaten werden omgezet naar proteïne sequenties en worden weergegeven in figuur 31 (B). Eén isolaat uit elke cluster (isolaat 1, 7 en 23) werd hiervoor gebruikt en vergeleken met de esyn1 proteïnesequentie van F. equiseti, F. avenaceum, F. oxysporum (twee maal) en de proteïnesequentie op basis van onderzoek van Lysoe et al. (2015). Hieruit kon afgeleid worden dat het gesequeneerde fragment van esyn1 in een functioneel domein ligt, namelijk in één van de twee AMP binding sites. Een rode lijn op deze figuur duidt op een geconserveerd AZ, met ander woorden een AZ dat cruciaal is voor het functioneren van het eiwit. Een voorbeeld hiervan is het met rood kader omcirkelde lysine. Dit is duidelijk geconserveerd in alle drie de isolaten en de referentiesequenties. Verder bleek dat de AZ sequentie van de verschillende isolaten een homologie vertoonde tussen de 89 en 96 %. Er kan geconcludeerd worden dat er in dit fragment van het esyn1 gen geen aanwijzingen zijn dat er verschillen bestaan met andere isolaten of species. A B Figuur 31. Esyn1 proteïne uit F. equiseti (A); fragment van proteïnesequentie van esyn1 voor elk isolaat en referentie (B) (rode lijn: geconserveerd AZ; blauwe lijn duidt op positie gesequeneerd fragment) 65