NVMM-richtlijn voor Moleculaire Diagnostiek van Infectieziekten

Transcriptie

1 NVMM-richtlijn voor Moleculaire Diagnostiek van Infectieziekten Opgesteld door: Werkgroep Moleculaire Diagnostiek van Infectieziekten (WMDI) van de Nederlandse Vereniging voor Medische Microbiologie (NVMM) Versie 2.1 definitief na accordering ALV 16 april 2014 Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

2 INHOUDSOPGAVE 1. INTRODUCTIE pagina 3 2. PERSONEEL EN OPLEIDING pagina 4 3. LABORATORIUM pagina 5 4. ONDERHOUD EN SCHOONMAAK pagina 9 5. VALIDATIE pagina CONTROLES EN KWALITEITSBORGING pagina LITERATUUR pagina 16 Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

3 1. INTRODUCTIE De richtlijn voor Moleculaire Diagnostiek van Infectieziekten is een document dat door de Werkgroep Moleculaire Diagnostiek van Infectieziekten (WMDI) van de Nederlandse Vereniging voor Medische Microbiologie (NVMM) is opgesteld. In 2006 is een eerste richtlijn getiteld Basic requirements for reliable performance of nucleic acid amplification based methods for diagnosis of infectious diseases, gepubliceerd door de WMDI. Binnen de huidige moleculaire diagnostiek volgen de ontwikkelingen zich zodanig snel op, dat een revisie van voorgaande noodzakelijk is geworden. Het opgestelde document richt zich op de moderne moleculaire diagnostiek en is gebaseerd op de expertise vanuit de Nederlandse praktijk. Moleculaire technieken, in het bijzonder nucleïnezuur amplificatie- en detectie methoden, zijn een wezenlijk onderdeel van medisch microbiologische laboratoria. Het betreft hoofdzakelijk op PCR-gebaseerde methoden, maar kan ook RNA amplificatie (TMA, NASBA) omvatten. Daarnaast worden op hybridisatie en/of sequentie analyse gebaseerde technieken breed ingezet voor de identificatie, genotypering en resistentiebepaling van micro-organismen. Voor de leesbaarheid wordt in dit document de term PCR gebruikt, maar worden ook de andere detectiemethoden bedoeld. In deze richtlijn worden aanbevelingen geformuleerd met betrekking tot personeel, laboratorium infrastructuur, en de uitvoering van moleculaire testen waarmee betrouwbare moleculaire diagnostiek kan worden gerealiseerd. De richtlijn betreft laboratoriumdiagnostiek en geen bedside testing (diagnostiek bij de patiënt aan bed buiten het laboratorium). Dit stuk dient dan ook als leidraad voor laboratoria die moleculaire diagnostiek toepassen of willen implementeren Het veld is zeer sterk in beweging en ontwikkelingen binnen geautomatiseerde gesloten systemen zijn volop gaande. Daarnaast komen er steeds meer IVD en/of CE-gemarkeerde, commerciële testen beschikbaar, soms in combinatie met specifieke apparatuur. Afhankelijk van de gebruikte apparatuur en diagnostische testen, kunnen werkwijzen en maatregelen t.a.v. betrouwbare moleculaire diagnostiek verschillen per laboratorium. De richtlijn biedt hiervoor een leidraad en onderschrijft het belang van benodigde expertise om de juiste afwegingen en keuzes te kunnen maken m.b.t. noodzakelijke werkwijzen en maatregelen. Voor algemene aspecten ten aanzien van laboratoriumorganisatie, logistiek, kwaliteitsmanagement, onderhoud, validatie, etc. wordt verwezen naar de CCKL praktijkrichtlijn of de ISO17025:2005 of ISO15189:2012, naar gelang de accreditatie van het laboratorium. DOELSTELLING Definiëren van aanbevelingen voor betrouwbare uitvoering van medisch moleculaire laboratoriumdiagnostiek van infectieziekten. Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

4 2. PERSONEEL EN OPLEIDING De vakinhoudelijke verantwoordelijkheid voor de uitvoering van de moleculaire diagnostiek ligt bij een vakspecialist in de moleculaire diagnostiek van infectieziekten, zijnde een medisch moleculair microbioloog (MMM), dan wel een arts-microbioloog. De medische verantwoordelijkheid voor moleculaire diagnostiek van infectieziekten ligt bij de arts-microbioloog. De analisten zijn voldoende opgeleid, ingewerkt en bekwaam in de moleculaire diagnostiek. Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

5 3. LABORATORIUM 3.1 Algemeen Gezien de hoge sensitiviteit van de moleculaire diagnostiek en het daarmee samenhangende risico voor fout-positieve resultaten als gevolg van contaminatie, vinden de moleculair diagnostische activiteiten plaats in verschillende van elkaar gescheiden laboratoriumruimten, die zijn onder te verdelen in, maar niet noodzakelijk als zodanig beschikbaar in elk laboratorium: - Schone ruimte (Ruimte 1). - Nucleinezuur isolatie ruimte en PCR set up (Ruimte 2). Hierin wordt DNA en RNA geïsoleerd. - PCR en Post-PCR analyse ruimte (Ruimte 3 of gescheiden in Ruimten 3a en 3b. Ruimte 3a bevat gesloten amplificatiesystemen, terwijl in Ruimte 3b met onder andere amplicons wordt gewerkt). Er komen meer gesloten systemen op de markt die het hele proces van isolatie, amplificatie en detectie combineren. Met deze CE/IVD gesloten systemen wordt hier bedoeld het gebruik van één gesloten cartridge (bijvoorbeeld GeneExpert en FilmArray), maar ook systemen die met een robotarm het proces uitvoeren (bijvoorbeeld de COBAS AmpliPrep - COBAS TaqMan combinatie), of die beperkte manuele handelingen vereisen maar toch de platen automatisch sealen (bijvoorbeeld de COBAS4800 en LC480). Het is te verwachten dat meer van dit soort all-in-one systemen de markt zullen bereiken. De ervaring hiermee is beperkt en het laboratorium moet hier zelf een risico-inschatting voor maken. Ruimten en apparatuur: Een laboratorium heeft een schone PCR ruimte (ruimte 1) waar stocks van de primers en probes en de reagentia zijn opgeslagen en worden uitgevuld. Indien niet met zogenaamde gesloten systemen wordt gewerkt, is het aan te bevelen om tenminste 3 afzonderlijke ruimten beschikbaar te hebben. Idealiter wordt er in een één-directionele werkrichting van schone ruimte (ruimte 1) naar monsteropwerking (ruimte 2) en (post)-pcr (ruimte 3a en 3b) gewerkt, maar dit is afhankelijk van de risico inschatting van het laboratorium. Aantal monsters, bepalingen, en prevalentie kunnen hierbij worden betrokken. In laboratoria waar met gesloten systemen gewerkt wordt waarin het hele proces van isolatie tot en met amplificatie en detectie wordt uitgevoerd, kan met 1 ruimte worden volstaan. In laboratoria waar met amplificatieproducten, virus-isolaten of bacteriestammen gewerkt wordt, zijn 3 afzonderlijke ruimten beschikbaar. In dit geval moet rekening gehouden worden met een verhoogd risico op contaminatie. Elke ruimte is voorzien van eigen apparatuur, pipetten, centrifuge, koelkast en vriezer. Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

6 Werkwijze: Er dienen maatregelen genomen te worden om fout-positieve resultaten te voorkomen, zoals tenminste: o Bij het inzetten van een PCR (bereiden reagentia, nucleïnezuurisolatie en assay set-up) wordt met filtertips of positieve displacement tips gewerkt.. o Gebruik van handschoenen, handen wassen en gebruik van aparte laboratoriumjassen per ruimte. o Voor het schoonhouden van ruimtes zie paragraaf 4.2. Een goed gedocumenteerde instructie van de werkwijze moet plaatsvinden alvorens medewerkers starten met het uitvoeren van moleculaire diagnostische methoden. Er is een procedure waarin is vastgelegd hoe te handelen bij calamiteiten zoals contaminatie. Gewenst: De schone ruimte (ruimte 1) heeft overdruk, de post-pcr ruimte (ruimte 3b) heeft onderdruk. In deze ruimte 3b wordt met amplificaten verder gewerkt. Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

7 Specifieke opmerkingen per ruimte: Ruimte 1: Schone ruimte Activiteiten: - Opslag en aliquoteren van stock-reagentia, primers en probes Aanbeveling: - Uitvullen en opslag in batches - Geen klinische materialen en geïsoleerd DNA of RNA en amplificaten bewaren - Werk in PCR- of flowkasten Ruimte 2: Nucleïnezuurisolatie en PCR set up Activiteiten: - Opslag van gebruiksoplossingen van primers, probes en PCR mixen voor dagelijks gebruik. - Opslag van klinische materialen en controles. - Werken met klinisch materiaal in laminair flow kast (klasse II). - Voorbehandeling van klinische materialen (bv proteïnase-k, bead-beating). - Nucleïnezuurextractie van klinische materialen. - Toevoegen DNA/RNA aan PCR mix. - Uitvoeren cdna reactie en toevoegen cdna aan mix. - Toevoegen van interne, negatieve en positieve controles aan de PCR plaat. Aanbeveling: In Ruimte 2 worden geen post-pcr handelingen verricht. Indien in ruimte 2 gebruik wordt gemaakt van een volledig gesloten systeem (het gehele proces van isolatie tot en met amplificatie en detectie in één cartridge) dienen de cartridges na gebruik ongeschonden en ongeopend vernietigd te worden. Het opwerken van viruskweek en bacteriestammen voor zowel moleculaire diagnostiek en typering als voor gebruik als positieve of interne controle, dient bij voorkeur in een andere fysiek gescheiden ruimte (aparte labruimte of speciaal daarvoor gereserveerd PCR-kabinet) plaats te vinden. Na titratie van de controles tot aanvaardbare (bv Cq > 30) loads (risico analyse) kunnen ze naar ruimte 2. Dit geldt ook voor cellijnen die hoog-positief zijn voor een bepaalde target, en plasmide-constructen die als controles gebruikt worden. Opmerking: Volledig gesloten systemen kunnen geplaatst worden in ruimte 2, vooropgesteld dat deze na amplificatie dicht blijven. Hetzelfde geldt voor NA extractieapparatuur die gekoppeld is met assay set-up en gesloten amplificatie apparatuur. Men dient zich te realiseren dat van de risico s van deze systemen ten aanzien van fout-positiviteit nog weinig bekend is! Ruimte 2 kan gecombineerd worden met een ruimte waarin ook andere niet moleculaire testen worden uitgevoerd, zoals bijvoorbeeld serologie. Ruimte 3 (PCR, Post-PCR): Ruimte 3a (PCR) en 3b (post-pcr) kunnen gescheiden zijn of samengevoegd Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

8 Activiteiten: Ruimte 3a (gesloten PCR apparatuur ruimte): Amplificatie van nucleïnezuur geïsoleerd uit klinische monsters die plaats vindt in gesloten PCR systemen. Na amplificatie worden de reactievaatjes niet geopend. Ruimte 3b (PCR + Post-PCR): - Amplificatie en analyse van nucleïnezuur. Na amplificatie kunnen de reactievaatjes geopend worden voor nadere analyse. - Hier bevinden zich thermocyclers, apparatuur voor gel-electroforese, hybridisatie en sequentieanalyse. Ruimte 3a: Apparatuur voor amplificatie/detectie reacties in gesloten systemen. Hierin wordt gesloten amplificatieapparatuur geplaatst en vinden geen post-pcr activiteiten plaats. Post-PCR handelingen met PCR producten mogen alleen in ruimte 3b plaatsvinden! Ruimte 3b: Amplificatie met post-pcr processing en/of detectie in open systemen. Aanbeveling: Er dient een risico-inschatting gemaakt te worden van activiteiten in deze ruimte om te bepalen of personeel werkzaamheden in ruimte 1 en/of 2 kan uitvoeren na verblijf in een post-amplificatie ruimte. Dit is mede afhankelijke van de werkzaamheden en de aard en de hoeveelheid van te analyseren monsters en de prevalentie van positieve resultaten. 3.2 Andere niet-diagnostische activiteiten Vanwege het hoge risico op contaminatie dienen werkzaamheden voor niet diagnostische doeleinden, zoals studies met gekweekte micro-organismen voor epidemiologische doeleinden of hoge concentraties van gekloneerde fragmenten in plasmiden in ruimte 3b of andere ruimtes buiten de moleculair diagnostische laboratoriumruimtes te worden uitgevoerd. 3.3 Ruimte voor extra amplificatiestappen Bij het uitvoeren van extra amplificatiestappen, bijvoorbeeld bij een zogenaamde nested-pcr of bij pre-amplificatie voor MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) bestaat altijd een verhoogd contaminatierisico. Indien men een dergelijke techniek uitvoert dient de tweede stap na de eerste ronde amplificatie, te worden uitgevoerd in een fysiek (van ruimte 1 en 2) gescheiden ruimte. Dit kan een aparte labruimte zijn, maar ook een daartoe toegewezen PCR kabinet binnen ruimte 3b met o.a. eigen pipetten en apparatuur. Een risico analyse is hierbij een hulpmiddel. Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

9 4. ONDERHOUD EN SCHOONMAAK 4.1 Apparatuur Aanbeveling: Thermocyclers, extractieapparatuur, pipetten, pipetteerrobots en dergelijke, worden regelmatig gekalibreerd en onderhouden. Voor real-time PCR dient zowel een thermische als een optische kalibratie te worden verricht. 4.2 Schoonmaak Aanbeveling: Er dienen met het schoonmaakpersoneel afspraken gemaakt te worden betreffende het unidirectioneel betreden van en het schoonmaken van vooral vloeren en werkoppervlakken in moleculaire diagnostiek ruimtes. Leg dit vast in een (laboratorium brede) schoonmaak procedure en bij voorkeur in een DVO (Dienst- Verlenings-Overeenkomst). - (Tafel)oppervlakken, buizenrekken en dergelijke, na gebruik en bij voorkeur 1x per week schoonmaken met een hiervoor geschikt middel (zoals hypochloriet en Extran). - Het uitvoeren van veegtesten kan een hulpmiddel zijn om te bepalen of er amplificaten aanwezig zijn. Opmerkingen: - Let op, kleine fragmenten zoals gebruikelijk bij real-time PCR blijven ook na bv. chloorbehandeling nog amplificeerbaar. - Gebruik van 0,1 N HCl werkt heel goed om nucleïnezuren af te breken maar is erg corrosief. Direct naspoelen met water. Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

10 5. VALIDATIE 5.1 Algemeen Alvorens een test in gebruik te nemen in de laboratoriumdiagnostiek, worden de aan de methode gerelateerde parameters, zoals specificiteit, sensitiviteit, precisie, accuraatheid en reproduceerbaarheid onderzocht. Hiervoor dient volgens de CCKL praktijkrichtlijnen of andere ISO normen, een validatieplan opgesteld te worden met gestelde acceptatiecriteria. De resultaten worden in een validatieverslag vastgelegd. Bruikbare procedures zijn onder andere beschreven in Nolte et al, 2006 en Rabenau et al, Commerciële testen CE/IVD testen - Bij commerciële CE/IVD (In Vitro Diagnostics) testen zijn de karakteristieken zoals sensitiviteit en specificiteit reeds gevalideerd door de fabrikant. Hierover dienen rapporten en/of peer reviewed literatuur beschikbaar en opvraagbaar te zijn bij de fabrikant. - Het laboratorium dient voor de invoering van de test een verificatie uitvoeren om te onderzoeken of de test en/of het apparaat na installatie beantwoordt aan de verwachtingen. Gebruik hiervoor bij voorkeur bekende, goed gedefinieerde materialen, zoals internationale standaarden en kwaliteitspanels (hoewel deze laatste per definitie niet gebruikt dienen te worden voor validatie en verificatie). - Indien modificaties aan een CE/IVD test aangebracht zijn, gelden de validatierichtlijnen van de in-house ontwikkelde testen. Bij afwijking van de aanbevelingen van de fabrikant (bv. een andere nucleïnezuurextractie), moet aangetoond worden dat de nieuwe werkwijze een gelijke dan wel betere performance heeft dan de aanbevolen methode CE testen Voor CE testen (niet-ivd) gelden dezelfde richtlijnen als CE/IVD testen indien de fabrikant beschikbare studies verricht heeft om de testkarakteristieken vast te stellen. Voor CE-testen waarmee door de fabrikant geen verdere studies zijn verricht, gelden de validatie-richtlijnen zoals voor in-house ontwikkelde testen (zie 5.3) Overige testen Voor overige testen gelden dezelfde richtlijnen als voor in-house ontwikkelde testen (zie 5.3). Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

11 5.3 In house ontwikkelde testen Zelf ontwikkelde testen (Nolte et al., 2006; Bustin et al., 2009; Rabenau et al., 2007) Het laboratorium heeft een validatieprocedure beschreven met hierin (een of meerdere van) de volgende aandachtspunten: - In silico analyse van primers en probes m.b.t. specificiteit - Optimaliseer de efficiëntie van de PCR met behulp van verdunningsreeksen van een positief materiaal. - Bepaal de analytische detectielimiet (Lower Limit of Detection, LLOD) van de bepaling, bij voorkeur op een gestandaardiseerd materiaal. - Bepaal de specificiteit van de primers en probes door analyse van de kruisreactiviteit met DNA (of RNA) van relevante microorganismen die in de te testen klinische materialen verwacht kunnen worden. Zowel stammen als klinisch materiaal dienen als uitgangsmateriaal. - Optimaliseer het voorbehandelen en NA extractiemethode voor de klinische materialen waarin het target moet worden aangetoond. - Valideer de klinische prestaties van de test: o Gebruik klinische materialen. Het aantal is afhankelijk van de beschikbaarheid (zeldzame materialen) en de prevalentie. o Vergelijk de resultaten met de huidige diagnostiek op basis van vooraf vastgestelde criteria (zoals sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende waarde en negatief voorspellende waarde) - Andere mogelijkheden: o monsters uit een erkend kwaliteitsprogramma worden getest o bij afwezigheid van klinische materialen kan het target in de te testen matrix worden gespiked In-house test door een ander laboratorium ontwikkeld - Indien de test is gevalideerd in het laboratorium dat de test heeft ontwikkeld, kan het validatierapport of de daaruit voortgekomen wetenschappelijke publicatie opgevraagd worden en volstaat een beperkte validatie waarbij wordt aangetoond dat de assay in het eigen lab aan de verwachte specificaties voldoet. Externe rondzendingen kunnen hierbij een goed hulpmiddel zijn. Daarnaast moeten een beargumenteerd aantal klinische materialen bij een dergelijke validatie getest worden. - Indien geen validatierapport of publicatie beschikbaar is, zal de test volgens moeten worden gevalideerd. - Indien wijzigingen aangebracht zijn aan de oorspronkelijke test, zoals bijvoorbeeld het toevoegen van een extra target, dan moet uitgebreider gevalideerd worden conform zelf ontwikkelde testen (zie ) Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

12 5.4. Kwantitatieve analyses - Voor kwantitatieve analyses gelden dezelfde eisen als voor kwalitatieve testen zoals beschreven onder 5.2. en 5.3. Daarnaast wordt verwezen naar de MIQE richtlijnen (Bustin, 2009). Zowel de LLOD als upper-lod dienen vastgesteld te worden. Er is specifieke aandacht noodzakelijk voor de gebruikte standaarden (ijklijn) op basis waarvan gekwantificeerd wordt. Indien beschikbaar dienen hiervoor internationaal geaccepteerde standaarden gebruikt te worden (bijvoorbeeld WHO standaarden voor HIV-1, HBV, HCV, CMV, EBV en dergelijke). Eigen standaarden kunnen ook gebruikt worden, maar dienen dan op de internationale standaard te zijn gekalibreerd. Kwantitatieve data uit andere laboratoria, voor bijvoorbeeld behandeling en monitoring, kunnen niet zonder kalibratie naar de eigen test vertaald worden, tenzij de uitslagen in beide laboratoria op basis van een internationale standaard worden gegenereerd. Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

13 6. CONTROLES EN KWALITEITSBORGING 6.1 Algemeen - Conform de praktijkrichtlijn CCKL of vergelijkbare normen die in Nederlandse laboratoria worden gehanteerd, zoals: - Gebruikte reagentia en ook de oorsprong en validatie van home-made reagentia (inclusief ontvangen primers en probes) moeten herleidbaar zijn. o Registreer lotnummers, data van houdbaarheid en datum van bereiding van kritische reagentia. Een lijst van kritische componenten dient te zijn vastgesteld. - Elke nieuwe batch van primers, probes, buffers, enzymen of amplificatiemix moet worden getest ten opzichte van de oude batch middels een vastgelegd protocol waarin acceptatiecriteria zijn beschreven. Deze ingangscontrole kan bij commercieel verkregen (en geteste) reagentia ook via de acceptatiecriteria van de controles plaatsvinden. - Om achteruitgang door vriesdooi stappen te beperken en om het risico van contaminatie te verkleinen, is het raadzaam om adequate gebruikshoeveelheden uit te vullen. 6.2 Controles - Bij elke test moet tenminste een positieve controle, een negatieve controle en een interne controle worden meegenomen. Voor genotyperingstesten is een remmingscontrole niet vereist. - Testen worden als valide aangemerkt op basis van acceptatiecriteria die zijn vastgelegd voor de vastgestelde Cq waarden van zowel de positieve controle (PCR bepaling is valide) als de (interne) remmingscontrole (valide negatief resultaat van het betreffende materiaal). - Er dienen procedures te zijn waarin is vastgelegd hoe men handelt als de verschillende controles niet aan de acceptatiecriteria voldoen Positieve controles -Als positieve controle wordt een positieve opwerkingscontrole (POC) gebruikt, bestaande uit positief materiaal (gekweekt of klinisch materiaal) met een vastgestelde hoeveelheid van het betreffende target, dat de hele analyseprocedure mee doorloopt. Op deze wijze wordt zowel de PCR reactie als de targetspecifieke extractieprocedure gecontroleerd. - Indien het target niet te kweken is en klinisch materiaal schaars is: - is het gebruik van een positieve DNA controle (PDC), i.e. een DNA/RNA controle van het specifieke target (bijvoorbeeld plasmide of run-off transcripten) vaak de enige mogelijkheid om als positieve controle te dienen. Dit is echter alleen een amplificatiecontrole. -Bij kwantitatieve bepalingen wordt de pathogeen load bepaald op basis van een (bij voorkeur Internationale) Standaard. Indien deze standaard vooraf is bepaald en de Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

14 load op basis daarvan wordt berekend dienen een Hoog Positieve en Laag Positieve controle meegenomen te worden. Deze dienen binnen vastgelegde acceptatiecriteria te liggen en er moet een procedure beschikbaar zijn die beschrijft hoe te handelen bij afwijkingen. Opmerkingen: - Gebruik van een PDC naast een POC geeft bij afwijkingen direct informatie over de oorzaak van de afwijking (extractie of amplificatie). - Monitoring van de POC (door het loggen van de Cq waarden) is een belangrijk instrument om reproduceerbaarheid van de test te controleren. Logging van de Cq waardes van de POC maakt periodieke trendanalyse mogelijk om de reproduceerbaarheid van de test in de tijd te vervolgen Negatieve controles Omdat contaminatie tijdens de voorbehandeling op kan treden is er altijd tenminste één negatieve controle per run nodig die de gehele opwerking en amplificatie doorloopt (negatieve opwerkingscontrole, NOC). Bij grote runs (aantal door het lab te bepalen) kunnen meerdere negatieve controles verspreid tussen de klinische monsters gebruikt worden. Naast een NOC kan ook een negatieve DNA controle (NDC) meegenomen worden, zodat in geval van afwijkende resultaten direct achterhaald kan worden of dit het gevolg is van contaminatie in de PCR of extractie-procedure Interne controle op remming en correcte NA isolatie Een interne controle (IC) is een target dat in een vaste concentratie aan het monster wordt toegevoegd en de extractie en amplificatie/detectiestappen doorloopt. Indien de procedure accuraat is verlopen en geen remming optreedt, zal de Cq waarde van de IC bij de monsters rond dezelfde Cq liggen. - De toegevoegde IC mag niet of beperkt interfereren met de detectie-gevoeligheid van het beoogde target en heeft altijd een bepaalde vastgestelde Cq in de gebruikte klinische materiaalsoort. - De Cq-waarde van de controle dient binnen een gedefinieerde grens te vallen. Indien een, door opgestelde remmingscriteria bepaalde, afwijkende (hogere) Cq waarde wordt gevonden is het monster geremd. - Er dient een vastgelegde procedure te zijn die beschrijft wat te doen na het vinden van een geremd materiaal. 6.3 Continue en externe kwaliteitscontrole van laboratoriumdiagnostiek - Conform de praktijkrichtlijn CCKL of vergelijkbare normen die in Nederlandse laboratoria worden gehanteerd wordt. Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

15 - Periodiek deelgenomen aan externe kwaliteitsrondzendingen: deze worden bij voorkeur verzorgd door professionele organisaties zoals QCMD, NEQAS en INSTAND, maar eventueel ook door de beroepsorganisaties via SKML - Monitoren van Cq waardes van zowel positieve als remmingscontroles om continuïteit van diagnostisch proces te borgen. Regelmatige trendanalyse is een hiervoor een waardevol middel. - Als er geen externe kwaliteitsrondzending is voor bepaalde target, dan is het raadzaam om samples uit te wisselen met een ander laboratorium of commerciële materialen aan te schaffen. - Periodiek in silico checken van de specificiteit van primer- en probe-sequenties in DNA database aan de hand van de meest recente sequentie-informatie van mogelijk nieuwe strainvarianten, en indien nodig aanpassen Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

16 7. LITERATUUR Apfalter, P, U. Reischl, M.R. Hammerschlag. In house nucleid acid amplification assays in research: how much quality control is needed before one can rely upon the results? J.Clin.Microbiol. 2005;12; Borst, A, A.T.A. Box, and A.C. Fluit. False-positive results and contaminations in nucleic acid amplification assays, suggestions for a prevent and destroy strategy. Eur.J.Clin.Microbiol. Infect.Dis. 2004;23: Bustin et al, 2009 The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 2009; 55: CCKL Praktijkrichtlijnen, 4e uitgave 2005 Gunson, R.N., S. Bennett, A. Maclean, W.F. Carman. Running multiplex real time PCR in order to streamline a routine diagnostic service. J. Clin. Virol. 2008; 43: Mitchell, P.S., J.J. Germer, and R. Patel. Nucleic Acid Amplification Methods: Laboratory Design and Operations, p In: D.H. Persing (ed.) Molecular microbiology, diagnostic principles and practice ASM Press, Washington DC. Nolte, F.S. et al. Molecular diagnostic methods for infectious diseases : approved guideline second edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, MM3-A2 vol. 26 no. 8, ISBN Noordhoek G.T., S. Mulder, P. Wallace, A.M. van Loon. Multicenter quality control study for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by nucleic amplification methods. Clin.Microbiol.Infect. 2004; 10; NVMM publicatie: Veilig werken met micro-organismen, parasieten en cellen in laboratoria en andere werkruimten. 3 e druk 2009, ISBN Rabenau H.F., H. Kessler, M. Kortenbusch, A. Steinhorst, R.B. Raggam, and A. Berger. Verification and validation of diagnostic laboratory tests in clinical virology. J. Clin. Virol. 2007; 40: Raymakers, M., R. Smets, B. Maes, and R. Cartuyvels. Checklist for optimization and validation of real-time PCR assays. J. Clin. Lab Anal. 2009;23: Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17

17 Laatste pagina, bewust blanco gelaten Richtlijn Moleculaire diagnostiek versie 2.1 februari /17