COAGULASE-NEGATIEVE STAFYLOKOKKEN ALS OORZAAK VAN MASTITIS

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar COAGULASE-NEGATIEVE STAFYLOKOKKEN ALS OORZAAK VAN MASTITIS door Floortje VERNOOIJ Promotoren: Dr. Anneleen de Visscher Prof. dr. Sarne de Vliegher Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2016 Floortje Vernooij

2

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef

4

5 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar COAGULASE-NEGATIEVE STAFYLOKOKKEN ALS OORZAAK VAN MASTITIS door Floortje VERNOOIJ Promotoren: Dr. Anneleen de Visscher Prof. dr. Sarne de Vliegher Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2016 Floortje Vernooij

6 VOORWOORD Na definitief de keuze optie herkauwers gemaakt te hebben wilde ik mij graag verdiepen in een thesisonderwerp dat hierbij aansloot. Omdat mastitis een veelvoorkomend probleem op melkveebedrijven is leek het mij interessant mij hier verder op in te lezen. In dit woord vooraf wil ik graag de mensen bedanken die mij gesteund hebben tijdens het afgelopen academiejaar. Vooreerst wil ik graag mijn promotor Dr. Anneleen de Visscher en copromotor Prof. Dr. Sarne de Vliegher bedanken om bereid te zijn mij te begeleiden met deze masterproef. Mede door het enthousiasme van Anneleen over het onderwerp uiergezondheid en haar snelle communicatie werd het maken van deze scriptie een leerrijke en prettige ervaring. Zij heeft mij richting aangegeven waar nodig, maar liet me ook vrij om zelf mijn weg te vinden. Dit heeft gezorgd voor een vlotte samenwerking. Tot slot wil ik mijn ouders Marian en Cees Vernooij, mijn zussen Maaike en Marieke, mijn broer(tje) Sjoerd en met name mijn partner Rob Buurman bedanken voor hun praktische en morele steun dit jaar.

7 INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING... 1 INLEIDING INLEIDING IDENTIFICATIE VAN CNS PREVALENTIE VAN CNS RELEVANTIE VAN CNS INVLOED OP CELGETAL INVLOED OP MELKPRODUCTIE BESCHERMEND EFFECT RESISTENTIE ANDERE VIRULENTIEFACTOREN KOE- EN OMGEVINGSGEBONDEN CNS-SPECIES... 8 CONCLUSIE REFERENTIELIJST... 11

8 SAMENVATTING Mastitis of uierontsteking is wereldwijd één van de meest voorkomende en duurste ziekten bij melkkoeien en veroorzaakt enorme economische verliezen. Mastitis kan subklinisch of klinisch verlopen en bijna steeds worden bacteriën gevonden als etiologische agentia. Coagulase- negatieve stafylokokken (CNS) zijn jarenlang beschouwd als minor pathogenen en aanzien als één homogene groep van bacteriën. De CNS groep blijkt echter zeer heterogeen met meer dan 50 verschillende species en subspecies. Om de verschillen tussen de CNS-species in kaart te brengen is een goede identificatie op speciesniveau noodzakelijk. De jarenlange fenotypische identificatie gebaseerd op biochemische en morfologische eigenschappen verschafte geen accurate resultaten. Tegenwoordig maakt men gebruik van genotypische identificatie waardoor een hogere accuraatheid en reproduceerbaarheid bereikt wordt. Gensequenering wordt als de gouden standaard beschouwd. Coagulase- negatieve stafylokokken worden regelmatig geïsoleerd uit melkstalen, van op speentoppen, en uit de omgeving van melkkoeien. De CNS- species kunnen worden onderverdeeld in koegebonden en omgevingsgebonden kiemen. Er is nog weinig onderzoek gedaan naar de distributie van specifieke CNS-species en verder onderzoek hiernaar is noodzakelijk omdat de prevalentie van CNS hoog is. De invloed van CNS-species op het somatisch celgetal (SCC) is matig tot sterk en is speciesspecifiek. Ook de impact op melkproductie verschilt per CNS-species en dit dient verder onderzocht te worden. De CNS-species verschillen bovendien in hun mogelijks beschermend effect en in hun virulentiepotentieel. Een belangrijk voorbeeld is de mogelijkheid dat sommige species in staat zijn om een biofilm te vormen en zich zo te beschermen tegen de omgeving, antimicrobiële middelen en fagocytose. Key words: Coagulase-negatieve stafylokokken, uiergezondheid, mastitis 1

9 INLEIDING Mastitis wordt gedefinieerd als een ontsteking van de melkklier (Heringstad et al., 2000). Het is wereldwijd één van de meest voorkomende en belangrijkste aandoeningen bij melkkoeien. Uierontstekingen hebben enorme economische gevolgen (Halasa et al., 2007) die te wijten zijn aan een verlies van opbrengsten door onder andere een daling van de melkproductie, een verminderde kwaliteit van de melk, de extra arbeid die een ziek dier behoeft, alsook verliezen door melk met antibioticaresiduen. Extra kosten die mastitis met zich meebrengt zijn veeartskosten, behandelkosten, en het eventueel vervangen van het dier (Heringstad et al., 2000). Mastitis komt zowel in een klinische als een subklinische vorm voor. Klinische mastitis kenmerkt zich door zichtbare abnormaliteiten in de melk bv. vlokvorming of melk met een afwijkende kleur. Wanneer de infectie verergert, kan er zwelling, roodheid, warmte en pijn optreden ter hoogte van het aangetaste uierkwartier. Eventueel is de koe ziek en heeft ze een verhoogde rectale temperatuur, systemische symptomen door bacteriëmie of septicemie en kan sterfte voorkomen (Harmon, 1994; Heringstad et al., 2000). In tegenstelling tot de klinische mastitis zijn er bij de subklinische vorm geen duidelijke zichtbare symptomen aanwezig, maar leidt dit wel tot een toename in het celgetal door de influx van o.a. neutrofielen (Piepers et al., 2007). Mastitis wordt bijna steeds veroorzaakt door bacteriën (Smith en Hogan., 2001) De kiemen kunnen worden onderverdeeld in twee grote groepen: de major en minor pathogenen. Major pathogenen kunnen een erge klinische mastitis, een wijziging in melksamenstelling, een stijging van het somatische celgetal en soms zelfs sterfte veroorzaken. De minor pathogenen veroorzaken daarentegen een milde inflammatie van de melkklier, een matig verhoogd celgetal en leiden zelden tot een gewijzigde melksamenstelling (Harmon, 1994). De laatste jaren worden de coagulase-negatieve stafylokokken of CNS het vaakst geïsoleerd als oorzaak van subklinische mastitis bij melkvee. Er werd lang aangenomen dat CNS minor pathogenen zijn en ze werden als 1 groep aanzien. Ondertussen is geweten dat deze groep zeer heterogeen is en er grote verschillen bestaan tussen de species binnen deze groep (Supré et al., 2011; De Visscher et al., 2014). Het is dus nodig een goede identificatie op speciesniveau te hanteren en onderzoek niet langer op groepsniveau uit te voeren (Trinidad et al., 1990; Taponen et al., 2007). 2

10 LITERATUURSTUDIE EN BESPREKING 1. INLEIDING Coagulase-negatieve stafylokokken worden tegenwoordig het vaakst geïsoleerd als oorzaak van subklinische mastitis. Deze kiemen werden lang beschouwd als minor pathogenen en werden aanzien als een homogene groep van bacteriën (Nickerson en Boddie, 1994; Hogan et al, 1988). De uierontstekingen die CNS veroorzaken zijn namelijk vaak mild in vergelijking met mastitis veroorzaakt door major pathogenen (Djabri et al., 2002; Pyörälä en Taponen, 2009; Sampimon et al., 2010; Supré et al, 2011). Toch zijn er ook gevallen bekend waar CNS ook een rol spelen in het voorkomen van klinische mastitis (Taponen et al., 2006). Coagulase-negatieve stafylokokken komen ook vaak voor op speentoppen, op de speenhuid, in het tepelkanaal en in de omgeving van dieren (Devriese en De Keyser, 1979; De Vliegher et al., 2003). De CNS groep blijkt erg heterogeen te zijn met tot op heden meer dan 50 verschillende species en subspecies (Supré et al., 2011; Dufour et al., 2012; www. bacterio.net, 2015). Identificatie op speciesniveau is dus noodzakelijk in studies om deze verschillen in kaart te brengen (Taponen et al., 2006). 2. IDENTIFICATIE VAN CNS De identificatie of differentiatie van de verschillende CNS-species kan zowel met een fenotypische als een genotypische methode uitgevoerd worden. De fenotypische identificatie is gebaseerd op biochemische en morfologische eigenschappen, maar is niet gebaseerd op de detectie van het bacteriële DNA. De fenotypische testen verschaffen geen accurate resultaten en zijn oorspronkelijk ontwikkeld voor de identificatie van humane isolaten (Thorberg et al., 2009; Piessens et al., 2010). Bovendien kan een variabele expressie van fenotypische eigenschappen optreden bij de CNS-species (Zadoks en Watts, 2009). Voorbeelden van fenotypische identificatiekits die gebruikt worden zijn de API Staph ID (Hogan et al., 1999; Park et al., 2011) en de Staph-Zym (Zadoks et al., 2009). Fenotypische testen hebben bijgevolg een lagere reproduceerbaarheid, een minder goede typeerbaarheid en een zwakkere accuraatheid (Zadoks en Watts., 2009). Door middel van genotypische identificatie bekomt men een hogere accuraatheid en reproduceerbaarheid ten opzichte van fenotypische methoden (Piessens et al., 2010). Moleculaire identificatietechnieken zijn gebaseerd op de detectie van het bacteriële DNA. Gensequenering wordt als de gouden standaard beschouwd (Zadoks en Watts, 2009; Piessens et al., 2010). Verschillende genen komen in aanmerking: o.a. het 16SrRNA gen, het cpn60 gen, het soda gen, het rpob gen en het tuf gen. Technieken die gebruik maken van deze genen en gevalideerd zijn voor boviene CNS-species zijn o.a. fragment length polymorphism (AFLP), (Piessens et al., 2010) intergenic spacer length polymorphism (tdna-ilp) (Zadoks en Watts., 2009), transfer RNA-intergenic spacer polymerase chain reaction (tdna-pcr) (Supré et al., 2009) en (GTG)(5)-PCR (Braem et al., 2011). 3

11 3. PREVALENTIE VAN CNS In verschillende landen zijn studies uitgevoerd naar de prevalentie en distributie van oorzakelijke agentia van boviene mastitis. In Vlaanderen werd aangetoond dat ongeveer 40% van de melkkoeien tijdens de lactatie een subklinische infectie heeft in één of meerdere kwartieren (Piepers et al., 2007) Bij afkalven hadden 80% van de vaarzen een subklinische infectie (Piepers et al., 2010). De meeste van deze subklinische infecties werden veroorzaakt door coagulase-negatieve stafylokokken (Piepers et al., 2010; Piessens et al., 2012; Vanderhaegen et al., 2015). Staphylococcus chromogenes is het meest voorkomende species, gevolgd door S. haemolyticus, S. simulans, S. epidermis, en S. xylosus (Sampimon et al., 2009; Vanderhaeghen et al,. 2015). Tabel 1 geeft de distributie weer van de meest voorkomende CNS-species geisoleerd uit melkstalen van dieren kort na afkalven en doorheen de lactatie op Vlaamse melkveebedrijven. Tabel 1: Distributie van de meest voorkomende CNS-species bij afkalven en doorheen de lactatie op Vlaamse melkveebedrijven (Supré et al., 2011; De Visscher et al., 2016) CNS-species Distributie bij afkalven Distributie doorheen lactatie S. chromogenes 17% 46.4 % S. haemolyticus 17% 6.1% S. cohnii 4% 11.2% S. epidermidis - 0.6% S. xylosus % S. devriesei 19% 2.8% S. equorum 13% 0.6% S. auricularis 8% S. sciuri 7% 1.7% De prevalentie van mastitis veroorzaakt door CNS is vaak verschillend tussen regio s en tussen landen (Persson Waller et al., 2011) en is over het algemeen het hoogst bij melkkoeien kort na afkalven (Todhunter et al., 1993; Honkanen-Buzalski et al., 1994). Gedurende de vroege lactatie zouden melkkoeien gevoeliger zijn voor intramammaire infecties (IMI) door CNS dan in latere fases van de lactatie (Harmon en Langlois, 1989). In het onderzoek van Supré et al. (2011) werden 25.8 % van de IMI door CNS veroorzaakt. Intramammaire infecties veroorzaakt door CNS-species komen ook frequentst voor bij vaarzen (Fox, 2009). In Vlaanderen wordt geschat dat ongeveer 35% van de vaarzen een subklinische mastitis doormaken (Piepers et al., 2010). Coagulase-negatieve stafylokokken worden ook vaak geïsoleerd vanop speentoppen en uit de directe omgeving van koeien (Sampimon et al., 2007; Taponen en Pyörälä, 2008). Verschillende studies hebben de aanwezigheid van verschillende CNS species op speentoppen van lacterende melkkoeien en vaarzen aangetoond, (Taponen et al., 2008; Braem et al., 2013; De Visscher et al., 2014; 4

12 Vanderhaegen et al., 2015). CNS waren zelfs de frequentst geïsoleerde microbiota (Braem et al., 2013). In het onderzoek van De Visscher et al. (2016) bleek 72% van de speentoppen van melkkoeien kort na afkalven gekoloniseerd door minstens één tot drie verschillende CNS-species. Tabel 2 geeft de distributie weer van enkele veel voorkomende CNS-species op speentoppen en in de omgeving. Tabel 2: Distributie van CNS-species (%) op speentoppen en in de omgeving (Piessens et al., 2011; Braem et al., 2013) CNS-species Speentoppen CNS- species Omgeving S. haemolyticus 50.7% S. equorum 19% S. simulans 4.8% S. sciuri 17.9% S. equorum 13.5% S. haemolyticus 16.6% S. cohnii 9.2% S. fleurettii 7.4% S. devriesei 3.9% 4. RELEVANTIE VAN CNS Wereldwijd worden coagulase-negatieve stafylokokken het vaakst geïsoleerd uit boviene melkstalen (Tenhagen et al., 2006; Piepers et al., 2007; Schukken et al., 2009). De CNS werden beschouwd als een homogene groep minor pathogenen, de groep blijkt daarentegen zeer heterogeen te zijn en uit meer dan 50 diverse species en subspecies te bestaan (www. bacterio.net, 2015). De kiemen zijn veelvuldig aanwezig in de melk, op de uier en in de omgeving van de koe (Sampimon et al., 2007; Taponen en Pyörälä., 2009). Alhoewel CNS normaal een subklinische of mild klinische mastitis veroorzaken (Taponen et al.,2006), wordt in sommige gevallen een sterkere inflammatoire reactie uitgelokt en kan zelfs een persisterende infectie ontstaan (Piessens et al., 2012Een CNS infectie kan negatieve gevolgen hebben voor het celgetal, de melkkwaliteit, en melkproductie (Jones et al., 1984; Piessens et al., 2012). De CNS species verschillen echter in hun impact op de uiergezondheid als ook in de gevoeligheid voor antimicrobiële middelen (Piessens et al., 2012). 4.1 INVLOED OP CELGETAL Het somatisch celgetal (SCC) is de meest gebruikte parameter om de melkkwaliteit en uiergezondheid te bepalen (Piepers et al., 2007). Wanneer een koe een celgetal boven de cellen/ml heeft, is er sprake van een subklinische infectie (Piepers et al., 2007). Bij een vaars ligt de grens op cellen/ml (Santman-Berends et al., 2012). Hoewel CNS als minor pathogenen beschouwd worden, is de meerderheid geïsoleerd uit kwartieren van koeien met een hoog SCC (Piepers et al., 2007). De stijging van het SCC ontstaat door een immunologische respons op een CNS infectie, (Taponen et al., 2007) met een toename van o.a. het aantal leukocyten ter hoogte van de uier (Trinidad et al., 1990). Verschillende studies tonen een significant maar matige stijging van het SCC in kwartieren die geïnfecteerd zijn met CNS. Deze stijging is eerder mild vergeleken met een infectie door major pathogenen (Gillespie et al., 2009; Schukken et al., 2009). Studies rapporteren echter ook een tienvoudige stijging ten opzichte van niet geïnfecteerde uiers (Taponen et al., 2007). De grote variatie 5

13 in de beïnvloeding van het celgetal kan te wijten zijn aan de verschillen die er tussen de CNS-species bestaan, (Supré et al., 2011). Bepaalde CNS- species hebben een groter effect op het SCC dan andere (Fry et al., 2014). Recent onderzoek op speciesniveau toonde aan dat S. chromogenes, S. simulans, en S. xylosus een significante stijging van het celgetal veroorzaken, vergelijkbaar met S.aureus (Supré et al,. 2011; Fry et al., 2014; De Visscher et al., 2015). 4.2 INVLOED OP MELKPRODUCTIE Een stijging van het SCC zorgt normaal voor een daling van de melkproductie (Seegers et al., 2003). Een uierontsteking veroorzaakt namelijk een toename van de leukocyten infiltratie en een toename van het interalveolair stroma van de uier wat een afname van het alveolair lumen met verminderde melksecretie en daarmee gepaard gaande melkproductie tot gevolg heeft (Trinidad et al., 1990). Sommige studies toonden een daling van de melkproductie aan bij een CNS infectie (Simojoki et al., 2009). Andere studies vonden geen correlatie tussen de melkproductie en de aanwezigheid van CNS (Eberhart et al., 1982). Er zijn echter ook studies die aantonen dat subklinische mastitis veroorzaakt door CNS een licht verhoogde dagelijkse melkproductie tot gevolg heeft (Schukken et al., 2009). Vaarzen of koeien geïnfecteerd met CNS vertonen een hogere melkproductie dan dieren die geïnfecteerd zijn met een major pathogeen (Schukken et al., 2009; Piepers et al., 2013). De diverse CNS-species kunnen ook een verschillende impact hebben op de melkproductie en dit dient verder onderzocht te worden. 4.3 BESCHERMEND EFFECT Kwartieren geïnfecteerd met CNS kunnen een groter risico hebben om geïnfecteerd te worden met een major pathogeen (Hogan et al., 1988; Lam et al., 1997). In andere studies werd echter een beschermend effect gevonden van CNS-infecties (Matthews et al., 1990; De Vliegher et al., 2003, 2004; Piepers et al., 2011). De reden die wordt aangedragen voor dit beschermende effect is dat CNS bacteriocines kunnen produceren (Matthews et al., 1990, De Vliegher et al., 2004). In verschillende studies werd aangetoond dat een aantal CNS-species in staat zijn deze bacteriocines te kunnen produceren (Ceotto et al., 2010; Fagundes et al., 2011; Braem et al., 2014). In een in vitro studie van De Vliegher et al. (2004) werd aangetoond dat de groei van major pathogenen geremd kan worden door de aanwezigheid van S. chromogenes. Verder onderzoek op species- en stamniveau zal meer inzicht verwerven in het beschermend effect van sommige CNS-isolaten. 4.4 RESISTENTIE Op melkveebedrijven worden antimicrobiële middelen het frequentst toegediend voor de behandeling en controle op mastitis (Piessens et al., 2012; Stevens et al., 2009). Ook tijdens de droogstandsperiode worden in veel landen routinematig antimicrobiële middelen gebruikt om bestaande infecties te elimineren en nieuwe infecties te voorkomen (Rajala-Schultz et al., 2009). Het is van belang om een optimale werking van het antibioticum te bekomen met een minimum risico tot ontwikkeling en spreiding van antimicrobiële resistentie (Persson Waller et al., 2011). Onderzoeken over antimicrobiële middelen en CNS- species gebaseerd op genotypering zijn schaars (Sampimom et 6

14 al., 2009). De mogelijkheid tot antimicrobiële resistentie bij CNS is echter een reden tot zorg (Gentilini et al., 2002; Botrel et al., 2010). In het onderzoek van Persson Waller et al. (2011) blijkt dat CNS species tegen meerdere antimicrobiële middelen resistentie kunnen vertonen. Verschillende CNSspecies, zoals S. epidermidis en S. haemolyticus, zijn in staat β-lactamase te produceren (Persson Waller et al., 2011). Piessens et al. (2012) concluderen in hun studie dat de meeste antimicrobiële resistentie voorkomt bij CNS-species die uit de omgeving geïsoleerd werden, en minder bij CNSspecies die uit melk geïsoleerd werden. Desinfectie van de spenen na het melken is een veel gebruikte methode in de preventie van mastitis. Resistentie tegen een desinfectiemiddel kan optreden bij onjuist gebruik ervan, bijvoorbeeld door onjuiste dosering waardoor de concentratie van het te gebruiken desinfectiemiddel te laag is en de bacterie tolerant wordt voor deze dipcomponenten (Bjorland et al., 2005, 2006). In een onderzoek naar resistentie tegen biocides bij CNS-species vertoonden S. chromogenes en S. simulans een hogere tolerantie tegen biocides waardoor zij eventueel in staat zijn de uier beter te koloniseren (Piessens et al., 2012). 4.5 ANDERE VIRULENTIEFACTOREN Coagulase-negatieve Staphylococcus-species verschillen ook van elkaar in andere virulentiefactoren. Een belangrijk voorbeeld is de mogelijkheid dat sommige species in staat zijn om een biofilm te vormen en zich zo te beschermen tegen de omgeving, tegen antimicrobiële middelen en tegen fagocytose (Melchior et al., 2006, Piessens et al., 2012). Het vormen van een biofilm is een complex en dynamisch proces waarbij de bacterie na adhesie aan een oppervlak gaat groeien, gevolgd door de productie van extracellulaire polymeren waarmee ze een beschermende matrix vormen (Clutterbuck et al., 2007). Het vormen van een biofilm kan een belangrijke stap zijn bij het koloniseren van de gastheer (Pace et al., 2006), en de verspreiding van stafylokokken (Costerton et al., 1999; Fey en Olson, 2010). Een hypothese is dat een aantal CNS- species deze eigenschap bezitten om de uier te koloniseren en zo in staat zijn persisterende IMI te veroorzaken (Cucarella et al., 2004; Tormo et al, 2005). Biofilmvorming bij staphylococci wordt o.a. gereguleerd door twee oppervlakte componenten: polysaccharide intercellular adhesin (PIA) en biofilm-associated protein (bap). Zowel bap als PIA zorgen voor de adhesie, de cel-cel interacties en de bacteriële accumulatie van stafylokokken (Cucarella et al., 2004; Tormo et al., 2005). Piessens et al. (2012) onderzochten de rol van deze genen bij CNS-species. De genen die coderen voor biofilmvorming werden vooral bij CNS-species uit de omgeving teruggevonden (Piessens et al., 2012). Dit is in overeenstemming met een recente studie van Simojoki et al. (2012) waar ook geen link werd gevonden tussen persisterende IMI door CNS-species en biofilmvorming. Bepaalde componenten die aanwezig zijn in mastitismelk zouden de vorming van een biofilm kunnen beïnvloeden, waaronder lactoferrine. De concentratie aan lactoferrine stijgt bij aanwezigheid van mastitis en zou zo de biofilmvorming door stafylokokken voorkomen (Simojoki et al., 2012). 7

15 5. KOE- EN OMGEVINGSGEBONDEN CNS-SPECIES Mastitisverwekkers kunnen klassiek worden ingedeeld in twee groepen: koegebonden pathogenen en omgevingspathogenen (Blowey en Edmondson, 1995). Koegebonden matitisverwekkers kunnen overleven en vermeerderen in en op de uier en spenen van de koe (Bradley, 2002). Omgevingsgebonden matitisverwekkers leven in de omgeving van de koe zoals stro, mest en ligboxen en kunnen vanuit de omgeving de koe infecteren (National Mastitis Council, 1999). De opdeling van mastitispathogenen in koegebonden en omgevingsgebonden kiemen is na de introductie van diagnostische technieken minder zwart-wit door stamverschillen, maar blijft in de praktijk wel bruikbaar (Sampimon et al., 2009). Omdat de preventie- en controlemaatregelen verschillen voor koe- en omgevingsgebonden kiemen is het belangrijk om te weten met welke kiem we te maken hebben. Besmetting met koegebonden kiemen zal voornamelijk plaatsvinden tijdens het melkproces door een besmet melkstel of via de handen van de melkers (Thorberg et al., 2006). Waar CNS eerst als groep als omgevingsgebonden kiemen beschouwd werden (Piepers et al., 2007; Sampimon et al., 2009), is nu geweten dat de species verschillen en dat er ook koegebonden CNS-species voorkomen. De koegebonden species komen voornamelijk in de melk en op de speentopen voor, (De Visscher et al., 2014) maar speentopkolonisatie kan ook ontstaan door contaminatie vanuit de omgeving (Piessens et al., 2011). Bepaalde CNS-species worden als koegebonden beschouwd: S. chromogenes, S. simulans, S. xylosus en S. epidermidis. Deze species komen veel voor in de melk. Staphylococcus chromogenes en S. epidermidis kunnen persisterende infecties veroorzaken (Thorberg et al., 2009; Piessens et al., 2011). Staphylococcus chromogenes heeft zich goed aangepast aan de uier en is zowel geïsoleerd uit het tepelkanaal als op de speenhuid (Devriese en De Keyser, 1979). Staphylococcus simulans blijkt ook een specifiek uiergebonden pathogeen te zijn (Taponen et al., 2008), en wordt dikwijls uit kwartieren geïsoleerd van oudere koeien (Pyörälä en Taponen, 2009) Omgevingsgebonden kiemen zijn minder aangepast om te overleven op de gastheer. Rechtstreekse overdracht van deze kiemen afkomstig van de uier van geïnfecteerde koeien naar niet-geïnfecteerde koeien en/of kwartieren is daarom eerder zeldzaam (Hogan en Smith, 2003). Ze veroorzaken vooral intramammaire infecties door vanuit de omgeving rechtstreeks het tepelkanaal binnen te dringen. Mastitis veroorzaakt door omgevingsgebonden bacteriën zijn soms moeilijker te voorkomen, omdat de kiemen permanent en massaal in de omgeving van koeien aanwezig zijn (Zdanowicz, 2002). Er is nog weinig onderzoek gedaan naar de transmissie van CNS via omgevingsbronnen op een melkveebedrijf (Piessens et al., 2012). De belangrijkste omgevingsbron waaruit CNS-species geïsoleerd kunnen worden zijn de ligbedden. Andere bronnen zijn gecontamineerde speenbekers, strooisel, vliegen enz. (Harmon, 1994; Piessens et al., 2011). De voornaamste omgevingsgebonden species zijn S. equorum, S. sciuri, S. cohnii, en S. saprohyticus (Piessens et al., 2011). Staphylococcus equorum werd het meest frequent in de 8

16 omgeving teruggevonden terwijl voor de andere CNS-species de distributie bedrijfsafhankelijk was (Piessens et al., 2011) Staphylococcus haemolyticus is een heel heterogeen species. Diverse genotypes werden op verschillende locaties geïsoleerd, zoals in zaagsel dat nog niet in direct contact geweest was met koeien, in melkmonsters, in de lucht (Piessens et al., 2012). Staphylococcus haemolyticus werd daarnaast ook veelvuldig op speentoppen van drachtige vaarzen gevonden (De Visscher et al., 2016). Deze wijdverspreide aanwezigheid en genoomflexibiliteit duidt erop dat S. haemolyticus een commensale kiem is met een sterk adaptief vermogen om te overleven in variabele habitats (Piessens et al., 2012). 9

17 CONCLUSIE De coagulase-negatieve stafylokokken werden lang als minor pathogenen en als homogene groep beschouwd. Verschillende studies toonden echter aan dat ze een zeer heterogene groep vormen en reeds meer dan 50 species zijn geïdentificeerd. De hoge prevalentie van CNS in zowel de melk als stalomgeving van Vlaamse melkveebedrijven toont aan hoe belangrijk onderzoek naar deze groep pathogenen is. Ze worden meest frequent uit boviene melkstalen geïsoleerd en kunnen o.a. een invloed op het celgetal hebben. Accurate identificatie op speciesniveau is noodzakelijk om de verschillen tussen de CNS-species in kaart te brengen waardoor meer informatie over bv. de impact van de verschillende species kan verkregen worden. Staphylococcus chromogenes, S. simulans, en S. xylosus veroorzaken bijvoorbeeld een significante stijging van het celgetal. Staphylococcus chromogenes, S. simulans, S. xylosus en S. epidermidis komen veel voor in de melk en lijken meer koegebonden species. Staphylococcus chromogenes en S. epidermidis kunnen persisterende infecties veroorzaken. Staphylococcus haemolyticus is een genotypisch zeer divers species en gedraagt zich wellicht meer als opportunist. Antibioticagevoeligheidstesten hebben aangetoond dat CNS meer en meer resistentie ontwikkelen tegenover antimicrobiële middelen en desinfectiemiddelen. Dit is een reden tot zorg omdat een optimale werking van het antibioticum nodig is met een minimum risico tot ontwikkeling en spreiding van antimicrobiële resistentie. Omdat uierontstekingen wereldwijd voorkomen en voor grote economische verliezen kunnen zorgen is identificatie is uitgebreidere kennis over de impact van CNS-species noodzakelijk om deze groep bacteriën in de melkveebedrijven onder controle te krijgen. 10

18 REFERENTIELIJST Bjorland, J.; Steinum, T.; Kvitle, B.; Waage, S.; Sunde, M.; Heir, E. (2005) Widespread distribution of disinfectant resistance genes among staphylococci of bovine and caprine origin in Norway. Journal of Clinical Microbiology, 43, Bjorland, J.; Steinum, T.; Sunde, M.; Waage, S.; Sviland, S.; Oppegaard, H.; Heir, E. (2006) Deletion of pt181-like sequence in an smr-encoding mosaic plasmid harboured by a persistent bovine Staphylococcus warneri strain. Journal of Antimicrobrial Chemotherapy, 57, Blowey, R.W.; Edmondson, P.W. (1995) Mastitis control in dairy herds. Farming Press, Ipswich, England. Botrel, M.A.; Haenni, M.; Morignat, E.; Sulpice, P.; Madec, J.Y.; Calavas, D. (2010) Distribution and antimicrobial resistance of clinical and subclinical mastitis pathogens in dairy cows in Rhone-Alpes, France. Foodborne Pathogoly, 7, Bradley, A. J. (2002) Bovine mastitis: An evolving disease. Veterinary Journal, 164, Braem, S.; Abrahamse, E. L.; Duthoo, W.; Notebaert, W. (2014). What determines the specificity of conflict adaptation? a review, critical analysis, and proposed synthesis. Frontiers in Psychology, 5, 3-13 Braem, G.; De Vliegher, S.; Supré, K.; Haesebrouck, F.; Leroy, F.; De Vuyst, L. (2011) (GTG)5-PCR fingerprinting for the classification and identification of coagulase-negative Staphylococcus species from bovine milk and teat apices: A comparison of type strains and field isolates. Veterinairy Microbiology, 147, Braem, G.; De Vliegher, S.; Verbist, B.; Piessens, V.; Van Coillie, E.; De Vuyst, L.; Leroy, F. (2013) Unraveling the microbiota of teat apices of clinically healthy lactating dairy cows, with special emphasis on coagulase-negative staphylococci. Journal of Dairy Science, 96, Ceotto, H.; Holo, H.; Costa, K.F.S.; Nascimento, J.S.; Salehian, A.; Nes, I.F.; Bastos, M.C.F. (2010) Nukacin 3299, a lantibiotic produced bij Staphylococcus simulans 3299 identical to nukacin ISK-1. Veterinary Microbiology, 146, Clutterbuck, A.L.; Woods, E.J.; Knottenbelt, D.C.; Clegg, P.D.; Cochrane, C.A.; Percival, S.L. (2007) Biofilms and their relevance to veterinary medicine. Veterinairy Microbiology, 121, 1-17 Costerton, J.W.; Stewart, P.S.; Greenberg, E.P. (1999) Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science (New York, N. Y.) 284, Cucarella, C.; Tormo, M.A.; Ubeda, C.; Trotonda, M.P.; Monzon, M.; Peris, C.; Amorena, B.; Lasa, I.; Penades, J.R (2004) Role of biofilm-associated protein bap in the pathogenesis of bovine Staphylococcus aureus. Infection and Immuntiy. 72,

19 De Visscher, A.; Piepers, S.; Haesebrouck, F.; De Vliegher, S. (2016) Teat apex colonization with coagulase-negative Staphylococcus species before parturition: Distribution and species-specific risk factors. Journal of Dairy Science, 99, De Visscher, A.; Piepers, S.; Supré, K.; Haesebrouck, F. De Vliegher, S. (2015) Species Group- Specific Predictors at the Cow and Quarter Level for Intramammary Infection with Coagulase-Negative Staphylococci in Dairy Cattle Throughout Lactation. Journal of Dairy Science, 98, De Visscher, A.; Supré, K.; Haesebrouck, F; Zadoks, R.N.; Piessens, V.; Coillie,; Piepers, S.; De Vliegher, S.(2014) Further evidence for the existence of environmental and host-associated species of coagulase-negative staphylococci in dairy cattle. Veterinary Microbiology, 172, De Vliegher.; S.; Laevens, H.; Devriese, L.A.; Opsomer, G.; Leroy, J.L.; Barkema, H.W.; de Kruif, A. (2003) Prepartum teat apex colonization with Staphylococcus chromogenes in dairy heifers is associated with lowsomatic cell count in early lactation. Veterinairy Microbiology, 92, De Vliegher, S.; Opsomer, G.; Vanrolleghem, A.; Devriese, L.A.; Sampimon, O.C.; Sol, J.; Barkema, H.W.; Haesebrouck, F. (2004) In vitro growth inhibition of major mastitis pathogens by Staphylococcus chromogenes originating from teat apices of dairy heifers. Veterinary Microbiololgy, 101, Devriese, L.A.; Keyser, H.; (1979) Prevalence of different species of coagulase-negative staphylococci on teats and in milk samples from dairy cows. Journal of Dairy Research, 47, Djabri, B.; Bareille, N.; Beaudeau, F.; Seegers, H. (2002) Quarter milk somatic cell count in infected dairy cows: a meta-analysis. Veterinairy Research, 33, Dufour, S.; Dohoo, I.R.; Barkema, H.W.; DesCôteaux, L.; DeVries, T.J.; Reyher, K.K.; Roy, J.-P.; Scholl, D.T. (2012) Epidemiology of coagulase-negative staphylococci intramammary infection in dairy cattle and the effect of bacteriological culture misclassification. American Dairy Science Association, 95, Eberhart, R.J.; Hutchinson, L.J.; Spencer, S.B. (1982) Relationships of bulk somatic cell counts to prevalence of intramammary infections and to indices of herd production. Journal of Food Protection, 45, Fagundes, P.C.; Ceotto, H.; Potter, A.; Brito, M.A.V.P.; Brede, D.; Nes, I.F.; Bastos, M.C.F. (2011) Hyicin 3682, a bioactive peptide produced by Staphylococcus hyicus 3682 with potential applications for food preservation. Research Microbiology, 162, Fey, P.D.; Olson, M.E. (2010) Current concepts in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Future Microbiology, 5, Fox, L.K. (2009) Prevalence, incidence and risk factors of heifer mastitis. Veterinairy Microbiology, 134,

20 Fry, P.R.; Middleton, J.R.; Dufour, S. Perry, J.; Scholl, D.; Dohoo, I. (2014) Association of coagulasenegative staphylococcal species, mammary quarter milk somatic cell count, and persistence of intramammary infection in dairy cattle. Journal of Dairy Science, 97, Gentilini, E.; Denamiel, G.; Betancor, A.; Rebuelto, M.; Fermepin, M.R.; De Torres, R.A (2002) Antimicrobial susceptibility of coagulase-negative staphylococci isolated from bovine mastitis in Argentina. Journal of Dairy Science, 85, Gillespie, B.E.; Headrick, S.I.; Boonyayatra, S.; Oliver, S.P. (2009) Prevalence and persistence of coagulase-negative Staphylococcus species in three dairy research herds. Veterinary Microbiology, 134, Halasa, T.; Huijps, K.; Østerås, O.; Hogeveen, H. (2007) Economic effects of bovine mastitis and mastitis management: a review. Veterinairy Quarterly, 29, Harmon, R. J. (1994) Physiology of mastitis and factors affecting somatic cell counts. Journal of Dairy Science, 77, Heringstad, B.; Klemetsdal, G.; Ruane, J. (2000) Selection for mastitis resistance in dairy cattle: a review with focus on the situation in the Nordic countries. Livestock Production Science, 64, Hogan, J.S.; Gonzalez, R.N.; Harmon, R.J.; Nickerson, S.C.; Oliver, S.P.; Pankey, J.W.; Smith, K.L.; (1999) Laboratory Handbook on Bovine Mastitis. National Mastitis Council Inc., Madison, WI Hogan, J.S.; Smith, K.L. (2003) Coliform mastitis: Review Article. Veterinary Research, 34, Hogan, J.S.; Smith, K.L.; Todhunter, D.A.; Schoenberger, P.S. (1988) Rate of environmental mastitis in quarters infected with Corynebacterium bovis and Staphylococcus species Journal of Dairy Science, 71, Honkanen-Buzalski, T.; Myllys, V.; Pyorala, S. (1994) Bovine clinical mastitis due to coagulasenegative staphylococci and their susceptibility to antimicrobials Journal of Veterinairy Medicine, 41, Jones, G.M.; Pearson, R.E.; Clabaugh, G.A.; Heald, C.W. (1984) Relationships between somatic cell counts and milk production. Journal of Dairy Science, 67, Lam, T.J.G.M.; van Vliet, J.H.; Schukken, Y.H.; Grommers, F.J.; van Velden-Russcher, A.; Barkema, H.W.; Brand, A. (1997) The Effect of Discontinuation of Postmilking Teat Disinfection in Low Somatic Cell Count Herds. II. Dynamics of Intramammary Infections. Veterinairy Quarterly, 19, Matthews, K.R.; Harmon, R.J.; Smith, B.A. (1990) Protective effect of Staphylococcus chromogenes infection against Staphylococcus aureus infection in the lactating bovine mammary gland. Journal of Dairy Science, 73,

21 Melchior, M.B; Vaarkamp, H.; Fink-Gremmels, J. (2006) Biofilms: A role in recurrent mastitis infections? Veterinairy Journal, 171, National Mastitis Council, (1999) Laboratory Handbook on Bovine Mastitis. National Mastitis Council Inc. Madison, WI. Nickerson, S.C.; Boddie, R.L. (1994) Effect of naturally occurring coagulase-negative staphylococcal infections on experimental challenge with major mastitis pathogens. Journal of Dairy Science, 77, Pace, J. L.; Rupp, M.E.; Finch, R.G. (2006). Biofilms, infection, and antimicrobial therapy.5-7 Persson Waller, K.; Aspán, A.; Nyman, A.; Persson, Y.; Grönlund Andersson, U. (2011) CNS species and antimicrobial resistance in clinical and subclinical bovine mastitis. Veterinairy Microbiology, 152, Piepers, S.; De Meulemeester, L.; de Kruif, A.; Opsomer, G.; Barkema, H. W.; De Vliegher, S. (2007) Prevalence and distribution of mastitis pathogens in subclinically infected dairy cows in Flanders, Belgium. Journal of Dairy Research, 74, Piepers, S.; Opsomer, G.; Barkema, H.W.; de Kruif, A., De Vliegher, S. (2010) Heifers infected with coagulase-negative staphylococci in early lactation have fewer cases of clinical mastitis and higher milk production in their first lactation than noninfected heifers. American Dairy Science Association, 93, Piepers, S.; Peeters, K.; Opsomer, G.; Barkema, H.W.; Frankena, K.; De Vliegher, S. (2011) Pathogen group specific risk factors at herd, heifer and quarter levels for intramammary infections in early lactating dairy heifers. Preventive Veterinairy Medicine, 99, Piepers, S.; Schukken, Y.H.; Passchyn, P.; De Vliegher, S. (2013) The effect of intramammary infection with coagulase-negative staphylococci in early lactating heifers on mild yield throughout first lactation revisited. Journal of Dairy Science, 96, Piessens, V.; De Vliegher, S.; Verbist, B.; Braem, G.; Van Nuffel, A.; De Vuyst, L.; Heyndrickx, M.; Van Coillie, E. (2012) Characterization of coagulase- negative staphylococcus species from cow s milk and environment based on bap, icaa, and meca genes and phenotypic susceptibility to antimicrobials and teat dips. American Dairy Science Association, 95, Piessens, V.; Supré, K.; Heyndrickx, M; Haesebrouck, F.; De Vliegher, S.; Van Coillie, E. (2010b) Validation of amplified fragment length polymorphism genotyping for species identification of bovine associated coagulase-negative staphylococci. Journal of Microbiological Methods, 80, Piessens, V.; Van Coillie, E.; Verbist, B.; Supré, K.; Braem, G.; Van Nuffel, A.; De Vuyst, L.; Heyndrickx, M.; De Vlieghert, S. (2011) Distribution of coagulase-negative Stahylococcus species from 14

22 milk and environment of dairy cows differs between herds. American Dairy Science Association, 94, Pyörälä, S.; Taponen, S. (2009) Coagulase-negative staphylococci- Emerging mastitis pathogen. Veterinairy Microbiology, 134, 3-8 Rajala-Schultz, P.J.; Torres, A.H.; DeGraves, F.J.; Gebreyes, W.A.; Patchanee, P. (2009) Antimicrobial resistance and genotypic characterization of coagulase-negative staphylococci over the dry period. Veterinairy Microbiology, 134, Sampimon, O.C.; Barkema, H.W.; Berends, I.M.G.A.; Sol, J.; Lam, T.J.G.M. (2009) Prevalence and herd-level risk factors for intramammary infection with coagulase-negative staphylococci in Dutch dairy herds. Veterinairy Microbiology, 134, Sampimon, O.C; van den Borne, B.H.P.; Santman-Berends, I; Barkema, H.W.; Lam, T.J.G.M. (2010) Effect of coagulase-negative staphylococci on somatic cell count in Dutch dairy herds. Journal of Dairy Research, 77, Sampimon, O.C.; Vernooij.; J.C.A.; Mevius, D.J.; Sol, J. (2007) Sensitivity for various antibiotics of coagulase-negative staphylococci, isolated from milk samples of Dutch dairy cattle. Tijdschrift Diergeneeskunde, 132, Santman-Berends, I.M.G.A.; Olde Riekerink, R.G.M.; Sampimon O.C.; van Schaik, G.; Lam, T.J.G.M. (2012) Incidence of subclinical mastitis in Dutch dairy heifers in the first 100 days in lactation and associated risk factors. Journal of Dairy Science, 95, Schukken, Y.H.; González, R.N.; Tikofsky, L.L.; Schulte, H.F.; Santisteban, C.G.; Welcome, F.L.; Bennett, G.J.; Zurakowski, M.J.; Zadoks, R.N. (2009) CNS mastitis: Nothing to worry about? Veterinairy Microbiology, 134, 9-14 Seegers, H.; Fourichon, C. Beaudeau, F. (2003) Production effects related to mastitis and mastitis economics in dairy cattle herds. Veterinairy Research, 34, Simojoki, H.; Hyvönen, P.; Plumed, C.; Ferrer, S.; Taponen, S.; Pyörälä, S. (2012) Is the biofilm formation and slime producing ability of coagulase-negative staphylococci associated with the persistence and severity of intramammary infection? Veterninary Microbiology, 158, Simojoki, H.; Orro, T.; Pyörälä, S. (2009) Bovine experimental infection induced by coagulasenegative staphylococci. Veterinairy Microbiology, 134, Smith, K.L; Hogan, J.S. (2001) The world of mastitis. In: Proceedings of the Second International Symposium Mastitis and Milk Quality, Vancouver, BC, Canada, September 13-15,

23 Stevens, N.T.; Greene, C.M.; O Gara, J.P.; Humphreys, H. (2009) Biofilm characteristics of Staphylococcus epidermidis isolates associated with device-related meningitis. Journal of Medical Microbiology, 58, Supré, K.; De Vliegher, S.; Sampimon, O.C.; Zadoks, R.N.; Vaneechoutte, M.; Baele, M.; De Graef, E.; Piepers, S.; Haesebrouck, F. (2009) Technical note: Use of transfer RNA-intergenic spacer PCR combined with capillary electrophoresis to identify coagulase-negative Staphylococcus species originating from bovine milk and teat apices. American Dairy Science Association, 92, Supré, K.; Haesebroeck, F; Zadoks, R.N.; Vaneechoutte, M.; Piepers, S.; De Vliegher, S. (2011) Some coagulase-negative Staphylococcus species affect udder health more than others. American Dairy Science Association, 94, Taponen, S.; Bjorkroth, J.; Pyörälä, S. (2008) Coagulase-negative staphylococci isolated from bovine extramammary sites and intramammary infections in a single dairy herd. Journal of Dairy Research, 75, Taponen, S.; Koort, J.; Bjorkroth, J.; Saloniemi, H.; Pyorala, S. (2007) Bovine intramammary infections caused by coagulase-negative staphylococcimay persist throughout lactation according to amplified fragment length polymorphism-based analysis. Journal of Dairy Science, 90, Taponen, S.; Pyörälä, S. (2009) Coagulase-negative staphylococci as cause of bovine mastitis Not so different from Staphylococcus aureus? Veterinairy Microbiology, 134, Taponen, S.; Simojoki, H.; Haveri, M.; Larsen, M.D.; Pyörälä, S. (2006) Clinical characteristics and persistence of bovine mastitis caused by different species of coagulase-negative staphylococci identified with API or AFLP. Veterinary Microbiology, Tenhagen, B.A.; Koster, G.; Wallmann, J.; Heuwieser, W. (2006) Prevalence of mastitis pathogens and their resistance against antimicrobial agents in dairy cows in Brandenburg, Germany. Journal of Dairy Science, 89, Thorberg, B.M.; Danielsson-Tham, M.L.; Emanuelson, U.; Persson Waller, K. (2009) Bovine subclinical mastitis caused by different types of coagulase- negative staphylococci. American Dairy Science Association, 92, Tormo, M. A.; Knecht, E.; Gotz, F.; Lasa, M.; Penades, J.R. (2005) Bap-dependent biofilm formation by pathogenic species of Staphylococcus: evidence of horizontal gene transfer? Microbiology society, 151, Trinidad, P.; Nickerson, S.C.; Alley, T.K.; (1990) Prevalence of intramammary infection and teat canal colonization in unbred and primigravid dairy heifers. Journal of Dairy Science, 73,

24 Todhunter, D.A.; Cantwell, L.L.; Smith, K.L.; Hoblet, K.H.; Hogan, J,S. (1993) Characteristics of coagulase-negative staphylococci isolated from bovine intramammary infections Veterinairy Microbiology, 34, Vanderhaeghen, W.; Piepers, S.; Leroy, F.; Van Coillie, E.; Haesebrouck, F.; De Vliegher, S. (2015) Identification, typing, ecology and epidemiolgy of coagulase negative staphylococci associated with ruminants, The Veterinary Journal, 203, Zadoks, R.N.; Watts, L. (2009) Species identification of coagulase-negative staphylococci: Genotyping is superior tot phenotyping. Veterinary Microbiology, 134, Zdanowicz, M.(2002) Sand and sawdust bedding affect populations of Coliforms, Klebsiella spp. and Streptococcus spp. on teat ends of dairy cows housed in freestalls. A thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Science in The Faculty of Graduate Studies. The University of British Columbia 17