UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar De immuunrespons van verschillende boviene coagulase-negatieve stafylokokken species in een muis mastitis door Bram KAPTEIN Promotoren: Prof. Evelyne Meyer Prof. Sarne De Vliegher Koen Breyne Onderzoek in het kader van de Masterproef 2014 Bram Kaptein

2 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar De immuunrespons van verschillende boviene coagulase-negatieve stafylokokken species in een muis mastitis door Bram KAPTEIN Promotoren: Prof. Evelyne Meyer Prof. Sarne De Vliegher Koen Breyne Onderzoek in het kader van de Masterproef 2014 Bram Kaptein

4 Voorwoord Dit onderzoek is een zeer leerrijke en leuke ervaring geweest die daarnaast ook nuttig is geweest in het aanleren van vaardigheden in zowel de proefdierkunde als in het laboratorium. Zonder de hulp van een aantal mensen zou deze masterproef niet tot stand zijn gekomen en ik wil hen dan ook bij deze heel erg bedanken. Als eerste wil ik mijn promotoren bedanken voor de zeer goede begeleiding tijdens het uitvoeren van de experimenten, het werk in het laboratorium en het schrijven van deze masterproef. Mijn grote dank ook voor het snel beantwoorden van vragen en het verbeteren van ingestuurde versies. Naast mijn promotoren wil ik mijn ouders, broers, oom en tante bedanken voor hun steun gedurende mijn studie. Als laatste een woord van dank richting mijn vrienden die altijd klaar staan om voor de nodige afleiding te zorgen.

5 Inhoudsopgave ABSTRACT INLEIDING LITERATUURSTUDIE MASTITIS BIJ VAARZEN Voorkomen van mastitis bij vaarzen Impact van mastitis bij vaarzen Preventie van mastitis bij vaarzen Huisvesting Voeding Vaarsfactoren IMMUNITEIT VAN DE UIER Anatomische factoren Cellulaire factoren Aangeboren immuuncellen Verworven immuuncellen Gesecreteerde factoren Complementsysteem Inflammatoire cytokines Immunoglobulinen Lactoferrine, lysozyme en alfa-lactalbumine MASTITIS PATHOGENEN Stafylokokken Coagulase-negatieve stafylokokken Isolatie en identificatie van coagulase-negatieve stafylokokken Interactie van coagulase-negatieve stafylokokken met de gastheer MUIS MASTITIS MODEL ONDERZOEK MATERIAAL EN METHODEN Dieren Bacteriën Model voor Intramammaire inoculatie Opoffering en staalname Bepaling van de kolonie vormende eenheden Cytokine concentraties Histopathologie Statistische analyse RESULTATEN Experimentele intramammaire infectie met coagulase-negatieve stafylokokken veroorzaakt matig ongemak in vergelijking met een S. aureus intramammaire infectie Experimentele intramammaire infectie met coagulase-negatieve stafylokokken beïnvloedt de lichaamstemperatuur niet in tegenstelling tot een intramammaire infectie met S. aureus Experimentele intramammaire infectie met coagulase-negatieve stafylokokken en S. aureus veroorzaken een kiemafhankelijke ontstekingsreactie in combinatie met een influx van neutrofielen

6 3.2.4 Een experimentele intramammaire infectie met coagulase-negatieve stafylokokken vertoont weinig in vivo groei in vergelijking met S. aureus Een experimentele intramammaire infectie met coagulase-negatieve stafylokokken induceert geen toename van de cytokines IL-6, IL-1beta en/of TNF-alfa in zowel de melkklier als in het serum, S. aureus induceert een stijging van IL-6 in de melkklier en het serum DISCUSSIE LITERATUURLIJST BIJLAGEN Kolonie vormende eenheden Lysaten Histologische coupes... 51

7 Abstract De uier staat voortdurend in contact met micro-organismen uit de leefomgeving. Kiemen die de uier infecteren, kunnen aanleiding geven tot een ontstekingsreactie die mastitis wordt genoemd. Bacteriële mastitis heeft een hoge incidentie en is nefast voor zowel de gezondheid van de koe als de opbrengst van de melk, ook al is het effect pathogeen-specifiek. Vroeg in het lactatiestadium en vooral bij vaarzen wordt mastitis zeer frequent veroorzaakt door coagulase-negatieve stafylokokken (CNS). De CNS worden altijd geclassificeerd als minor mastitis pathogenen, maar de groep is heel divers qua pathogeniciteit, waardoor hun rol in de uiergezondheid per soort nog weinig gekarakteriseerd werd. In deze scriptie worden voor het eerst drie verschillende CNS stammen vergelijkend onderzocht aan de hand van het muis mastitis model. De drie CNS stammen zijn een Staphylococcus (S.) chromogenes IM, geïsoleerd uit melk van een vaars met een chronische intramammaire infectie (IMI), een S. chromogenes ST, geïsoleerd van de speentop van een vaars, en een S. fleurettii, die bijna uitsluitend in de omgeving van koeien voorkomt. Eerst wordt de lokale groei van S. chromogenes IM vergeleken na inoculatie van de melkklier met verschillende hoeveelheden kolonie vormende eenheden (KVE). Vervolgens wordt de pathogeniciteit van drie geselecteerde CNS stammen vergeleken met een major pathogeen, namelijk S. aureus Newbould 305, bij een constant aantal KVE. Bij het muis mastitis model worden mastitis pathogenen in de melkklier geïnjecteerd wat aanleiding geeft tot groei van de kiem en een neutrofielinflux in de melkklier. Een infectie met S. chromogenes IM vertoonde een beperkte bacteriële groei na 24 uur en veroorzaakte bij een injectie van 10 5 KVE een neutrofielinflux. In het tweede experiment gaven drie verschillende CNS stammen allen aanleiding tot een neutrofielinflux en een beperkte groei van 30 uur naar 48 uur. Dit onderzoek toonde aan dat er ook in het muis mastitis model een verschil is in de pathogeniciteit van de 3 vergeleken CNS stammen. De volgorde van pathogeniciteit op basis van ontstekingsbeeld, influx van neutrofielen en KVE aan het eind van het experiment is: S. chromogenes ST >> S. chromogenes IM > S. fleurettii. Sleutelwoorden: mastisis-muismodel - Coagulase-negatieve stafylokokken - S. chromogenes - S. fleurettii - immuunrespons 1

8 1. Inleiding Mastitis is één van de meest voorkomende en schadelijke ziekten bij runderen. De kosten van mastitis voor de veehouder omvatten o.a. de daling van melkproductie, extra dierenartsbehandeling en/of opruiming van chronisch geïnfecteerde koeien. Hiernaast is de melk na de behandeling gedurende de wachttijd van het geneesmiddel ongeschikt voor consumptie en blijft het productieniveau tijdens de verdere lactatie lager dan het niveau dat behaald zou zijn zonder mastitis (Van Loo et al., 2007). De definitie van mastitis is een inflammatie van de melkklier, zo goed als steeds geassocieerd met een intramammaire bacteriële infectie. Er zijn twee vormen van mastitis, namelijk klinische en subklinische mastitis, veroorzaakt door major en minor pathogenen. De klinische vorm van mastitis komt meestal bij één of enkele koeien in de kudde voor, terwijl subklinische mastitis meestal bij een groter deel van de koppel voorkomt. Er wordt geschat dat per koe met klinische mastitis er tussen de 15 en 40 koeien in de koppel zijn met subklinische mastitis (Vanholder et al., 2012). Subklinische mastitis is een ontsteking van de uier zonder zichtbare symptomen, waardoor deze mastitiden moeilijker op te merken zijn en vaker overgaan in een chronische subklinische infectie. Dit type van infecties kunnen dan de gehele lactatie of zelfs het hele leven van de koe aanwezig blijven. De melk van een koe met een subklinische mastitis heeft geen afwijkend uitzicht, waardoor het hogere melkcelgetal van de melk de enige aanwijzing is. Daarentegen zijn bij klinische mastitiden roodheid, zwelling, warmte en pijn de lokale symptomen en kan de koe ook algemeen ziek zijn en koorts hebben. De melkproductie daalt bij klinische mastitis ook sterker dan bij subklinische mastitis (Kahn et al., 2010). Coagulase-negatieve stafylokokken (CNS) worden ingedeeld bij de minor pathogenen, omdat ze meestal een subklinische mastitis veroorzaken. Deze kan zelflimiterend zijn of chronisch worden, afhankelijk van het CNS species dat de uier infecteert. Door de toename in frequentie van CNS mastitis nemen deze pathogenen een steeds belangrijkere rol in in de uiergezondheid (Pyorala et al., 2009). De groep van de CNS is zeer heterogeen, waardoor het mogelijk is dat verschillende CNS species, verschillende effecten op de uiergezondheid hebben (Ajitkumar et al., 2008). Er zijn zowel CNS species die vooral/enkel in de omgeving voorkomen als species die eerder aan de uier aangepast zijn. De eerst genoemde veroorzaken meestal de zelflimiterende infecties, terwijl de tweede de chronische infecties veroorzaken. In recent onderzoek van Piepers, Opsomer et al. (2010) is gezien dat een infectie met een CNS ook positieve gevolgen kan hebben voor de melkkoe. Zo zijn er vaarzen gevonden die meer melk geven na een infectie met CNS en bovendien beter bestand zijn tegen een latere infectie met een major pathogeen. Aangezien de groep van de CNS zeer heterogeen is, moet nog ten gronde onderzocht worden welke CNS soorten of species verantwoordelijk zijn voor deze effecten (Piepers et al., 2010). In deze scriptie worden 3 CNS stammen onderzocht op hun pathogeniciteit. Deze stammen zijn geïsoleerd hetzij uit de omgeving van koeien, hetzij van de speentop van een vaars, hetzij uit de melk van een koe met een chronische subklinische mastitis. Het vergelijkend effect van elk van deze verschillende stammen op de melkklier wordt bestudeerd in een muis mastitis model via visuele kenmerken, histologie en immunologische parameters. 2

9 2. Literatuurstudie 2.1 Mastitis bij vaarzen De investeringskosten van kalf tot vaars worden door de opbrengst van de eerste lactatie vergoed, waardoor de preventie van mastitis bij vaarzen van groot belang is voor de boer. Oudere koeien worden door vaarzen vervangen om de kudde op peil te houden, waardoor deze vaarzen dus moeten afkalven met een gezonde, goed ontwikkelde uier die in staat is om optimaal melk te produceren van een hoge kwaliteit en dit voor een zo lang mogelijke tijd. De kosten van mastitis bij vaarzen zijn dezelfde als deze voor mastitis bij koeien. Bij vaarzen is echter ook het verlies van productie bij verdere lactatie door de minder goede uitgroei van de uier en het uitsluiten van het gebruik van de geïnfecteerde vaarzen voor reproductie een grote kost. Naast de daling van de hoeveelheid geproduceerde melk en de kwaliteit van de melk bij klinische en subklinische mastitis, geeft mastitis soms aanleiding geven tot niet functionerende kwartieren (Breen et al., 2009). Mastitis tijdens de vroege productiefase geeft ook een groter risico op het ontwikkelen van klinische mastitis, geassocieerd met meer geneesmiddelengebruik, meer onverkoopbare melk en meer kans op residuen in de tankmelk (De Vliegher et al., 2012). Een infectie van de uier geeft een inflammatoire respons, waardoor de leukocyten influx groter is in de geïnfecteerde kwartieren dan in niet-geïnfecteerde kwartieren. Deze influx leidt tot een verhoogd melkcelgetal (Capuco et al., 2003) Voorkomen van mastitis bij vaarzen Vaarzen, en met name de prepartum vaarzen, werden tot 20 jaar geleden beschouwd als een groep dieren die vrij is van mastitis. In afwezigheid van de secretie van melk zouden er in deze groep immers niet genoeg voedingsstoffen aanwezig zijn in de melkklier voor de groei van mastitis pathogenen. Aangezien onder andere het melken van koeien tijdens de lactatieperiode een groot risico is voor het ontwikkelen van mastitis, is het voorkomen van mastitis bij vaarzen dan ook opmerkelijk aangezien een vaars nog nooit eerder gemolken is (Fox, 2009). Ter illustratie, in een recente studie op 173 melkvee bedrijven in Nederland was de incidentie van subklinische mastitis bij vaarzen in de eerste 100 dagen gemiddeld 25%. Per kudde varieerde de incidentie tussen de 0 en 60%. Van deze 25% van de vaarzen met subklinische mastitis, werd 69% op de eerste testdag gediagnosticeerd. Het verhoogde melkcelgetal was in 59% van deze gevallen binnen een maand weer terug op een normaal niveau. In andere studies werden percentages tussen de 18 en 35% gevonden, wat verklaard kan worden door de grote verschillen tussen bedrijven (Santman-Berends et al., 2012). Een andere verklaring voor de grote schommeling van de percentages is dat vlak na het afkalven het celgetal in de melk verhoogd kan zijn al dan niet door een subklinische infectie (Barkema, Deluyker et al., 1999). Klinische mastitis komt bij postpartum vaarzen in de vroege lactatie meer voor dan bij koeien. Meer dan 30% komt voor in de eerste twee weken na afkalven. In 36-40% van de kuddes zijn er vaarzen aanwezig met een klinische mastitis, maar slechts minder dan 2% van alle vaarzen in de aangetaste 3

10 kuddes hebben een klinische mastitis. Hierdoor is de klinische mastitis van vaarzen verantwoordelijk voor minder dan 25% van het totaal van klinische mastitis bij alle melkvee (Fox, 2009) Impact van mastitis bij vaarzen Het effect van mastitis op individueel vaarsniveau is afhankelijk van het type (klinisch of subklinisch) van de mastitis en dus de virulentie van de mastitis pathogeen, de tijd tussen het afkalven en de start van de infectie, de persistentie van de bacterie, de mogelijkheid van een adequate behandeling, de tijd tussen de start van de infectie en de behandeling en de immuniteit van de vaars zelf. Op kudde niveau is het effect afhankelijk van de prevalentie en incidentie van mastitis, het type van mastitis, het veroorzakende pathogeen en de reactie van de veehouder via managementsaanpassingen (De Vliegher et al., 2012). Afhankelijk van de virulentiefactoren van de mastitis pathogeen (zie ook 2.3), kan er soms lyse optreden van melkkliercellen. Deze lyse kan de reden zijn tot de verminderde productie van melk tijdens de lactatie en aanleiding geven tot een vermindering van het alveolair epitheel met een toename van bindweefsel in de uier. Door de infectie kan de groei van de uier en de activiteit per cel verstoord worden, waardoor de lactatiepiek minder hoog is dan zonder infectie (Capuco et al., 2003). Voor vaarzen is het gemiddelde individuele verlies in productie geschat op 0,4kg/dag per verdubbeling van het melkcelgetal boven de cellen/ml. Op het lactatieniveau komt dit neer op een verlies van ongeveer 80kg melk per verdubbeling van het somatische celgetal (uitgedrukt als geometrisch gemiddelde). Vaarzen met een hoog melkcelgetal tijdens vroege lactatie hebben een hogere kans om klinische mastitis te ontwikkelen in deze eerste lactatie of aan het begin van hun tweede lactatie. Net als bij subklinische mastitis, is er bij klinische mastitis een inflammatoire respons met aantasting van het secretorisch epitheel. Bij klinische mastitis is de virulentie van de kiem vaak hoger, waardoor deze een grotere schade veroorzaakt in combinatie met een grotere influx van neutrofielen dan bij subklinische mastitis. Het verlies van melkproductie in de eerste lactatie wordt geschat op 50 tot 260kg melk. Hier moet wel de opmerking bij geplaatst worden dat vaarzen in geval van een klinische mastitis rond de partus in meer dan 10% van de gevallen vroegtijdig afgevoerd worden waardoor deze schatting een significante onderschatting is net als het effect op de toekomstige uiergezondheid (Waage et al., 2000, Piepers et al., 2009). Echter, de negatieve correlatie tussen een stijging in het melkcelgetal en de daling in de productie van melk gaat niet altijd op. In een studie van Piepers et al. (2010) bleek dat vaarzen geïnfecteerd met CNS meer melk produceerden en minder kans hadden op een klinische mastitis. Slechts 10% van de vroegtijdig afgevoerde vaarzen werden afgevoerd door de problemen met de uier. Bovendien bleken hoog productieve vaarzen beschermd te zijn van vroegtijdig afvoeren ook al was hun melkcelgetal in het begin van de lactatie hoog. 4

11 2.1.3 Preventie van mastitis bij vaarzen Mastitismanagement hoort gericht te zijn op de minimalisatie van de risico factoren voor mastitis en het optimaliseren van de beschermende factoren tegen mastitis. Dit management is gebaseerd op het principe van het zo snel mogelijk genezen van bestaande infecties in combinatie met de maximale preventie van nieuwe infecties Huisvesting Het effect van de huisvesting op vaarzenmastitis blijkt afhankelijk te zijn van de infectiedruk die in de kudde aanwezig is. De incidentie van klinische mastitis bij vaarzen is positief geassocieerd met klinische mastitis bij koeien als de twee groepen samen op dezelfde weide grazen (De Vliegher et al., 2012). Het huisvesten van vaarzen in aanbindstallen vanaf een maand voor de partus in plaats van in een loopstal is geassocieerd met een daling van het aantal vaarzen met mastitis. Dit kan verklaard worden door het feit dat het contact tussen dieren onderling in een aanbindstal veel kleiner is dan in een loopstal, waardoor de infectiedruk daalt. Bij uitbreiding van dit principe, zullen vaarzen die samen met droogstaande koeien in dezelfde loopstal gehuisvest zijn, een hoger risico hebben op mastitis na afkalven dan vaarzen die niet met droogstaande koeien gehuisvest zijn (Barkema, schukken et al., 1999). De hygiëne in de afkalfstal moet optimaal zijn om het risico op mastitis na afkalven te minimaliseren. Het gebruik van schavelingen of zaagsel in vergelijking met stro in de afkalfruimte is geassocieerd met een vuilere uier en dus een hogere kans op mastitis na afkalven. Mastitis pathogenen kunnen zowel in stro als in zaagsel goed groeien, waardoor de frequentie van het verschonen van de afkalfruimte nog een groter effect heeft op het minimaliseren van het risico dan het type strooisel. Het verplaatsen van vaarzen uit de afkalfruimte na meer dan twee dagen is geassocieerd met een stijging in het melkcelgetal. Vaarzen moeten binnen de dag verplaatst worden om het risico op mastitis te minimaliseren. Het melken van de vaarzen na afkalven in deze afkalfruimte verhoogt het risico op mastitis en een hoger melkcelgetal. Dit kan worden verklaard doordat de mobiele middelen in de afkalfruimte minder geschikt zijn voor het hygiënisch melken van de vaars en door de minder goede melkroutines in vergelijking met het melklokaal. Spoelen, wassen en desinfecteren van de mobiele melkeenheid voor het melken van de vaars, heeft zeer weinig effect op het aantal aanwezig bacteriën. Hetzelfde geldt voor de melkeenheid in de melkput (Nyman et al., 2009) Voeding Een ongebalanceerd dieet samen met een minder goede hygiënische kwaliteit van het voer, is geassocieerd met een hogere kans op vaarzenmastitis. Ook heeft plotse verandering in het dieet een negatieve invloed op de functionaliteit van het rumen waardoor de gezondheid van het rund negatief beïnvloed wordt (Dirksen et al., 1985). Bij een ongebalanceerd dieet kan een tekort aan eiwit aanleiding geven tot een lage concentratie van ureum in de melk wat geassocieerd is met een hoger melkcelgetal aan het begin van de lactatie 5

12 (Brandt et al., 2010). Voederen van suikerbietpulp geeft een verhoogde kans op mastitis en een hoger melkcelgetal aan het begin van de lactatie. Ook maïskuil voeren is geassocieerd met een hoger melkcelgetal aan de start van de lactatie. De reden hiervoor is nog niet bekend, maar kan te maken hebben met de lagere hygiënische kwaliteit van zowel suikerbietpulp als maïskuil. Een tweede mogelijke verklaring is dat maïskuil en bietenpulp beide een laag gehalte aan eiwitten bevatten. Een eiwitsupplement gecombineerd met het standaard-voeder, geeft een minder ernstige negatieve energie balans bij vaarzen, waardoor minder klinische mastitis optreedt door het positieve effect op de immuniteit en de uiergezondheid (Nyman et al., 2009). Selenium en vitamine E bevorderen de fagocytotische capaciteit van leukocyten en zijn daardoor geassocieerd met een verlaging van het risico op klinische mastitis (Plozza et al., 2011, Politis, 2012). Parenteraal toedienen voor het afkalven blijkt nochtans geen effect te hebben op het voorkomen van mastitis bij vaarzen (Leblanc et al., 2002). Echter, een tekort aan vitamine E en selenium is wel geassocieerd met een minder goede uiergezondheid. Een supplement van vitamine en mineralen is aangewezen als er in het voer een tekort is, maar heeft geen bijkomend positief effect als er voldoende aanwezig is in het voer. Waar nodig moet het rantsoen van vaarzen dus aangevuld worden, zodat er tijdens de eerste lactatie een goede reserve aanwezig is van mineralen en vitaminen (De Vliegher et al., 2012) Vaarsfactoren Vaarzen ouder dan 27 maanden hebben een hogere kans op een verhoogd melkcelgetal aan de start van de lactatie en op een mastitis. Dit kan veroorzaakt worden door de langere periode dat deze vaarzen het risico lopen om geïnfecteerd te worden of door hun andere metabole status. Hiernaast is er bij een oudere vaars een grotere kans op dystocie en daardoor een hogere incidentie van klinische mastitis na de partus (De Vliegher et al., 2004). Het verlies van de keratineplug voor afkalven maakt het tepelkanaal toegankelijk voor microorganismen wat het risico op mastitis verhoogt. In totaal zijn 77% van de mastitiden aan het begin van de lactatie te wijten aan pathogenen die al voor het afkalven in de uier aanwezig zijn. De kans dat de mastitis zich zal ontwikkelen tot een klinische mastitis stijgt evenredig met de lengte van de periode tussen de initiële infectie en het afkalven (Kromker et al., 2009). Oedeem van de uier en de tepel, bloed in de melk en het lekken van melk tijdens het afkalven zijn significante risicofactoren voor de ontwikkeling van een klinische mastitis tijdens de eerste twee weken van de lactatie. Het melken van de vaars voor het afkalven kan dit risico verlagen, doordat het oedeem afneemt en het lekken minder voorkomt (Waage et al., 2001). Holstein-Friesian koeien hebben een hoger risico om mastitis te ontwikkelen dan andere rassen. Dit verschil kan een basis hebben in de verschillen in de prevalentie van genen die de gevoeligheid voor mastitis negatief beïnvloeden. De minder belangrijke risicofactoren voor klinische mastitis zijn tenslotte de speenpositie, het voorkomen van ziekte tijdens het peripartum en de mate van bevuiling van de vaarsuier (Breen et al., 2009). 6

13 2.2 Immuniteit van de uier Het immuunsysteem van de uier bestaat uit de aangeboren en de verworven immuniteit. De aangeboren immuniteit is de belangrijkste verdediging in de vroege (acute) fase van de infectie, de verworven immuniteit neemt in belang toe naarmate de infectie aanhoudt en wanneer deze vaker voorkomt. De immuniteit in de uier wordt gevormd door anatomische, cellulaire en een gesecreteerde factoren (Figuur 1). Anatomische factoren zijn onderdeel van de aangeboren immuniteit, cellulaire en gesecreteerde factoren zijn zowel onderdeel van de aangeboren als van de verworven immuniteit. De aangeboren immuniteit bestaat uit fysische, chemische en cellulaire barrières. De fysische barrières van de uier zijn het tepelkanaal en de tepelsfincter, de chemische barrières uit de keratine plug en lactoferine en de cellulaire uit macrofagen, neutrofielen, dendritische cellen, mastcellen, eosinofielen en natural killer (NK-) cellen (Riollet et al., 2000). Deze cellen zijn in staat om de evolutionair geconserveerde micro-organisme geassocieerde moleculaire patronen (MAMP) te herkennen via pathogeen herkenningsreceptoren. De verworven immuniteit is in staat om specifieke pathogenen te herkennen via antistoffen en receptoren gericht naar een specifiek epitoop op de buitenkant van een pathogeen. Na de herkenning van een pathogeen door het verworven immuunsysteem via antistoffen, is het mogelijk om meer specifiek en efficiënt deze bepaalde pathogeen te elimineren (Sordillo, 2005) Anatomische factoren Het slotgat (Figuur 1A) is de eerste barrière tegen het binnendringen van pathogenen. Na elke melkbeurt heeft de tepelsfincter enkele minuten de tijd nodig om het slotgat weer te sluiten, waardoor de kans op infectie van de uier in die periode het grootst is. De tweede barrière wordt gevormd door het tepelkanaal. Het epitheel produceert keratine dat een plug kan vormen na het sluiten van het slotgat. Deze plug verdwijnt aan het begin van de lactatie, maar bij de 60% van de vaarzen is deze op 60 dagen pre-partus al verdwenen (Braem et al., 2013). Naast deze fysische bariere heeft keratine ook antimicrobiële eigenschappen via kationische proteïnes die bacteriën binden en via de vetzuren palmitoleïnezuur, myristinezuur en linolzuur die een bacteriostatische werking bezitten (Oviedo-boyso et al., 2007). Het beschadigen van het slotgat en het tepelkanaal door het melkproces en door infecties vormt een belangrijke risicofactor in het ontstaan van mastitis (Sordillo, 2005) Cellulaire factoren In melk van gezonde koeien is een residente populatie van leukocyten aanwezig (Figuur 1B). De meerderheid van deze leukocyten zijn macrofagen, een minderheid, 5 tot 20%, bestaat uit neutrofielen, eosinofielen, dendritische cellen, plasmacellen en NK-cellen (Rainard et al., 2003). Bacteriën die niet buiten de uier gehouden worden door de anatomische barrières, komen in aanraking met de neutrofielen, macrofagen en lymfocyten. 7

14 Figuur 1. De immuniteit van de uier. A: Schematische weergave van de uier. B: Cellulaire en gesecreteerde moleculen die een rol vertonen in de aangeboren en verworven immuniteit in een alveolus. C: Endotheelcellen brengen adhesiemoleculen tot expressie onder invloed van cytokines geproduceerd door macrofagen. Neutrofielen binden aan deze adhesiemoleculen, waardoor de influx in de uier gefaciliteerd wordt. De richting van migratie in de uier wordt door chemokines gereguleerd. Op de plaats van de infectie secreteren neutrofielen ROS en antibacteriële peptiden naast het fagocyteren van bacteriën (naar Oviedo-boyso et al., 2007). ROS = reactieve zuurstof (oxygen) species, TNF = Tumor necrosis factor, IL = interleukine Aangeboren immuuncellen Na de binding van pathogenen aan de epitheelcellen van de uier en aan de residerende macrofagen in de melk en het uierweefsel, wordt de aangeboren immuunrespons reactie geïnitieerd via de proinflammatoire cytokines TNF-α, interleukine-6 (IL-6) en IL-8. Deze cytokines zorgen in eerste instantie voor een stijging in de influx van neutrofielen in de uier, waardoor de neutrofielen de meerderheid gaan vormen van de populatie leukocyten in de melk (Figuur 1B/C). De bacteriocidale kracht van neutrofielen wordt verhoogd door de secretie van TNF-α en IL-1β door de residente macrofagen( detailbespreking cytokines, zie ) (Stelwagen, 2009). Geactiveerde neutrofielen fagocyteren op hun beurt bacteriën en produceren reactieve zuurstof (oxygen) species (ROS) en antibacteriële peptiden, zoals perforine en granzyme, die een groot deel van de verschillende mastitis pathogenen uitschakelen (Oviedo-boyso et al., 2007). In de periode vlak na het afkalven is de bactericiede activiteit van de neutrofielen echter verlaagd, waardoor de kans dat een bacterie aanwezig blijft in de uier groter is en de acute infectie daardoor een chronisch karakter kan krijgen. Een infectie van de uier tijdens de droogstand geeft normaal geen 8

15 symptomen, maar kan tijdens de start van de lactatie de oorzaak zijn van een klinische mastitis (Pieper et al., 2013) Verworven immuuncellen Tijdens de chronische fase van de infectie zakt het aandeel van de neutrofielen van 95% naar 70-80% waarmee ze de grootste fractie van leukocyten in de melk blijven, maar hun influx wordt beperkter dan deze van monocyten en lymfocyten (Rainard et al., 2003). Lymfocyten herkennen antigenen op een pathogeen via membraan receptoren. Deze receptoren zijn de reden voor de diversiteit, specificiteit en het geheugen van het verworven immuunsysteem. Lymfocyten worden onderverdeeld in NK-cellen, B- en T-lymfocyten. T-lymfocyten presenteren verschillende transmembraanproteines en krijgen daardoor een meer specifieke naam: differentiatiecluster (CD) 4 + op T-helpercellen en CD8 + op cytotoxische T-cellen. In gezonde melk zijn de CD8 + lymfocyten in de meerderheid, terwijl in mastitis melk de CD4 + lymfocyt primeert. Deze laatsten binden via het major histocompatibiliteitscomplex II (MHC-II) aan antigen presenterende cellen, zoals macrofagen, dendritische cellen en B-lymfocyten waardoor ze geactiveerd worden. Het CD40 ligand (CD40L) komt tot expressie op CD4 + lymfocyten na de binding van het MHC-II, waarna CD8 + lymfocyten die CD40 tot expressie brengen geactiveerd worden. Naast deze CD40-CD4-L activatie, kunnen CD4 + lymfocyten ook de cytotoxiciteit van CD8 + lymfocyten verhogen via cytokines, zoals IL-2, IFN-γ en IL-12. De CD4 + lymfocyten bevorderen eveneens de maturatie van B-lymfocyten naar antistofproducerende plasmacellen en later naar B-geheugencellen (Zhang et al., 2009). Geactiveerde CD8 + lymfocyten elimineren op hun beurt geïnfecteerde cellen meer efficiënt en ruimen ook oude en beschadigde cellen en hun secreten op. NK-cellen zijn grote, granulaire lymfocyten die net als CD8 + een cytotoxische activiteit bezitten. Het verschil met CD8 + lymfocyten is dat NK-cellen geactiveerd worden door binding met het MHC-I complex op een lichaamseigen cel die een lichaamsvreemd epitoop presenteren. Hiernaast zijn NKcellen in staat om muramyl dipeptide, aanwezig op zowel gram positieve als gram negatieve bacteriën, te herkennen via Nucleotide-bindende oligomerizerend domein receptor 2 (NOD-2), waarna NK-cellen in staat zijn deze bacteriën te vernietigen (Athie-morales et al., 2008). Door de mogelijkheid vormen NK/cellen mogelijks een belangrijke factor in de preventie van mastitis (Oviedo-boyso et al., 2007, Sordillo, 2005, Schukken et al., 2011) Gesecreteerde factoren De gesecreteerde factoren bestaan uit het complement systeem dat aanwezig is in zowel serum als in de melk, pro-inflammatoire cytokines, immunoglobulinen en antibacteriële peptiden. De peptiden met antibacteriële werking in de melk zijn lactoferrine, lysozyme en α-lactalbumin Complementsysteem Het complement is een groep eiwitten die zowel in serum als in melk aanwezig is en zowel het verworven als het aangeboren immuunsysteem kan beïnvloeden. Hepatocyten produceren het grootste deel van de complementeiwitten, maar ook macrofagen en monocyten kunnen ze 9

16 produceren. Complement eiwitten kunnen bloedneutrofielen aantrekken richting de infectie, doden bacteriën en kunnen bacteriën opsoniseren waardoor de fagocytose door macrofagen en neutrofielen verbeterd wordt. Vooral gram positieve bacteriën zijn gevoelig aan het complementsysteem, terwijl gram-negatieve bacteriën meer resistent zijn. Elke bacterie is gevoelig voor opsonisatie via de complementeiwitten C3b en C3bi. De intensiteit van de activiteit van het complement is gerelateerd aan de mate van de inflammatoire respons (Sordillo, 2005, Schukken et al., 2011) Inflammatoire cytokines Inflammatoire cytokines worden ingedeeld in pro- en anti-inflammatoire cytokines. Pro-inflammatoire cytokines verhogen zoals vermeld onder de bacteriocide activiteit van macrofagen en neutrofielen, trekken neutrofielen aan naar de plaats van de infectie, stimuleren de maturatie van dendritische cellen en controleren hiernaast de verworven immuunrespons. De belangrijkste proinflammatoire cytokines zijn Tumor necrosisfactor (TNF)-α en IL-1β. Deze cytokines zijn sleutelmoleculen in zowel de lokale als de systemische imuunrespons, ze reguleren de expressie zowel van genen die betrokken zijn bij de immuunrespons waardoor andere cytokines en enzymen geproduceerd worden als van genen betrokken bij cel proliferatie en apoptose (Schukken et al., 2011). Pro-inflamatoire cytokines zoals IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8 en IL-12, interferon (IFN)-γ en TNF-α, kunnen teruggevonden worden in melk van gezonde koeien en van koeien met gram-positieve en/of gramnegatieve mastitis zoals blijkt uit het overzicht (Tabel 1) (Oviedo-boyso et al., 2007). Tabel 1. Cytokines geassocieerd met de immuunrespons in de uier geïnfecteerd met Escherichia coli of Staphylococcus aureus (naar Oviedo-boyso et al., 2007) Cytokine Bron functie type mastitis en pathogeen IL-1β Macrofagen en Recruitering van neutrofielen naar Klinische mastitis, E. Coli epitheelcellen de plaats van ontsteking Subkl. mastitis, S. aureus IL-2 CD4+ Inductie van groei en differentiatie lymfocyten van B-lymfocyten, activatie van NB NK-cellen en CD8+ lymfocyten IL-6 Macrofagen Regulatie van acute fase proteinen Klinische mastitis, E. coli synthese, recruitering van monocyten IL-8 Monocyten, Recruitering van neutrofielen naar de Klinische mastitis, E. coli T-lymfocyten, plaats van ontsteking macrofagen, epitheel- en endotheelcellen IL-12 Dendritische cel Regulatie van de differentiatie van NB en T-lymfocyten T-lymfocyen 10

17 Tabel 1. Vervolg Cytokine Bron functie type mastitis en pathogeen IFN-γ CD4+ en CD8+ Activatie van T-lymfocyten, inducering NB lymfocyten en van de productie van IL-12, neutrofiel NK-cellen activatie TNF-α Macrofagen, inducering van de expressie van Klinische mastitis, E. coli Neutrofielen en adhesine moleculen in epitheelcellen endotheelcellen Interleukine (IL), Interferon (IFN), Tumor necrosis factor (TNF), NB = niet bepaald Anti-inflammatoire cytokines zijn immunoregulerende moleculen die de pro-inflammatoire cytokine respons controleren. Tussen de pro- en anti-inflammatoire cytokines bestaat er een dynamisch evenwicht dat constant beweegt en zo de immuunrespons reguleert. Een te grote afwijking van het evenwicht geeft een te sterke of te zwakke inflammatoire respons, waardoor er meer schade aan het weefsel ontstaat door respectievelijk de te sterke inflammatie of door te lage inperking van de infectie (Opal et al., 2000). Onder de anti-inflammatoire cytokines die tijdens mastitis in de uier en de melk voorkomen horen IL-4, IL-10, IL-13 en het transformerende groeifactor (TGF)-β (Schukken et al., 2011) Immunoglobulinen Immunoglobulinen (Ig) zijn de hoofdcomponent van de verworven immuniteit in de uier met IgG 1 als meest voorkomende isotype in de melk van runderen. De moleculen IgA en IgM zijn in veel lagere concentraties aanwezig in colostrum en melk. Immunoglobulinen worden geproduceerd door intramammaire plasmacellen of vanuit het bloed in de melk gesecreteerd via selectieve receptorgemedieerde intracellulaire wegen. IgA wordt alleen door intramammaire plasmacellen in de melk gesecreteerd, doordat gesecreteerd IgA niet meer opgenomen kan worden door cellen en de vloeistof waarin het zich bevindt daardoor niet meer kan verlaten. Jonge dieren zijn minder in contact geweest met verschillende pathogenen dan oudere dieren, waardoor de diversiteit van immunoglobulinen in het colostrum en de melk van jonge dieren minder groot is (Stelwagen et al., 2009) Lactoferrine, lysozyme en alfa-lactalbumine Lactoferrine is een glycoproteine o.a. aanwezig in melk met een antibacteriële activiteit door zijn chelerende vermogen van ijzer, waardoor dit laatste niet meer beschikbaar is voor bacteriële groei. Lactoferrine kan rechtstreeks binden aan de wand van bacteriën en zo met een grotere effectiviteit ijzer onbeschikbaar maken voor de bacterie. Vooral tijdens de droogstand heeft lactoferrine een rol in de preventie van mastitis, doordat de concentratie 50 keer verhoogd in vergelijking met de concentratie tijdens de lactatie. Tijdens de eerste 5 dagen van de lactatie is er een hoge concentratie van lactoferrine in de melk aanwezig en ook tijdens een IMI stijgt de concentratie van lactoferrine (Chaneton et al., 2013). Sommige bacteriën zijn resistent tegenover de werking van lactoferrine via de secretie van sideroforen. Deze laatste staan in directe competitie met lactoferrine voor de chelatie van ijzer, waardoor gebonden ijzer ter beschikking staat voor de bacterie. Een andere methode is het tot 11

18 expressie brengen van lactoferrine receptoren die de tertiaire structuur van lactoferrine verstoren, waardoor ijzer dissocieert (Adlerova et al., 2008). Net als lactoferrine, komt lysozyme voor in meerdere lichaamsvloeistoffen, waaronder melk, tranen en speeksel. De antibacteriële activiteit van lysozyme is vooral toe te schrijven aan de hydrolyse van de celwand van bacteriën. Naast deze enzymatische activiteit, vertoont gedenatureerd lysozyme ook een niet-enzymatische antibacteriële activiteit. De verandering in de conformatie veroorzaakt een verhoging van de hydrofobiciteit, waardoor de normale elektrostatische interacties van gram-negatieve bacteriën verstoord worden (Expósito et al., 2006). Een mutant van lysozyme die geen enzymatische activiteit meer vertoonde, bleek zowel antibactericidaal te zijn tegen gram-negatieve als grampositieve bacteriën (Ibrahim et al., 2001). α-lactalbumin is gelijkaardig qua aminozuur sequentie aan lysozyme, waardoor de structuur van α- Lactalbumine lijkt op de structuur van lysozyme. Ondanks deze structurele gelijkenis, verschilt α-de functie van beide eiwiten toch sterk. Intact α-lactalbumine vertoont geen antibacteriële werking tegenover bacteriën (Pellegrini et al., 1999). De hoofdfunctie van α-lactalbumine komt pas tot uiting na de hydrolyse door pepsine of trypsine, waardoor er drie metabolieten ontstaan. Deze metabolieten zijn bactericidaal tegenover gram-positieve bacteriën en zwak bactericidaal tegenover gram-negatieve bacteriën (Ibrahim et al., 2001). 2.3 Mastitis pathogenen Virussen, schimmels of algen kunnen mastitis induceren, maar bacteriën zijn hoofdzakelijk gekend als ziekteverwekkers van de uier, borst of melkklier en zullen daarom besproken worden als de mastitis pathogenen. Diverse bacteriespecies zijn in staat om mastitis te veroorzaken, maar Escherichia coli en Staphylococcus aureus zijn de twee meest gediagnosticeerde veroorzakers van mastitis (Wellnitz et al., 2012). De mastitis pathogenen zijn op te delen in primaire bacteriën of rundspecifieke bacteriën en secundaire of opportunistische bacteriën (Tabel 2). Primaire bacteriën zijn in staat om een gezonde uier te infecteren, terwijl opportunistische kiemen alleen de uier infecteren onder bepaalde omstandigheden zoals een hoge infectiedruk door een lage hygiëne op het bedrijf en immunosuppressie van de koe. Tabel 2. Primaire en secundaire mastitis pathogenen. Primaire mastitis pathogenen Coagulase-negatieve stafylokokken Staphylococcus aureus Streptococcus agalaciae Secundaire mastitis pathogenen Streptococcus uberis Escherichia coli Klebsiella Rundspecifieke bacteriën kunnen zijn gastheer afhankelijk en blijven buiten de koe niet lang infectieus. Ze vermeerderen op de uier, huid en slijmvliezen en kunnen door de melkmachine of manipulaties van de uier tijdens het melken van koe naar koe overgedragen worden. Omgevingskiemen zijn opportunistische kiemen die aanwezig zijn in de omgeving van de koe, bijvoorbeeld op het stro, zaagsel en in de mest. Ze vermeerderen goed in de omgeving en kunnen 12

19 lang infectieus blijven in organisch materiaal, maar minder goed in de koe zelf, waardoor overdracht via de melkmachine en manipulaties van de uier tijdens het melken zeldzaam is. De opdeling in primaire en secundaire mastitis pathogenen werd bevestigd door moleculaire diagnostiek en is daardoor bruikbaar voor het instellen van een behandeling, maar is niet correct als gekeken wordt naar de moleculair epidemiologische indeling van verschillende species bacteriën door de onderverdeling in verschillende subspecies. Er zijn bijvoorbeeld S. aureus-stammen die niet volledig rundspecifiek zijn en zich meer gedragen als omgevingskiem en S. uberis-kiemen die zich gedragen als rundspecifieke kiemen. Hierdoor wordt de voorkeur gegeven aan de glijdende schaal (Figuur 2) waarop zichtbaar gemaakt wordt dat subspecies meer of minder primair of secundair kunnen zijn (Van Loo et al., 2007, Zadoks et al., 2006) Op de glijdende schaal wordt duidelijk gemaakt dat bacteriestammen niet volledig als species ingedeeld kunnen worden als primaire of secundaire kiem. Afhankelijk van de stam van de bacterie die in de kudde voorkomt, is er een ander patroon van overdracht. Dit heeft vooral effect op de preventieve maatregelen die genomen moeten worden en minder op het type behandeling (Zadoks et al., 2006). Figuur 2: De glijdende schaal voor primaire en secundaire mastitis pathogenen, gebaseerd op moleculaire epidemiologische inzichten. De verticale as is een weergave in hoeverre de kiem zich gedraagt als primaire (zwart) of secundaire (wit) kiem. SAG: Streptococcus agalactiae, SAU: Staphylococcus aureus, SDY: Streprococcus dysgalactiae, SUB: Streptococcus uberis, ECO: Escherichia coli (Zadoks et al., 2006). Naast de indeling van rundspecifieke en opportunistische kiemen, kunnen kiemen geclassificeerd worden volgens hun pathogeniciteit. Er zijn wederom twee groepen, de minor en major pathogenen. Tot de minor pathogenen horen alle CNS stammen en Corynebacterium bovis. Minor pathogenen verhogen het melkcelgetal licht, maar veroorzaken zelfden klinische mastitis. Tot de major pathogenen behoren Escherichia coli, Staphylococcus aureus en de streptokokken. Deze bacteriën geven een sterke stijging van het celgetal in de melk en tasten de uiergezondheid van het dier aan (Bradley et al., 2011). De vorm van mastitis en de species van bacteriën die de hoogste incidentie geven is afhankelijk van de leeftijd van de runderen. De incidentie van klinische mastitis de eerste dagen na de partus is bij 13

20 vaarzen hoger dan bij koeien en wordt veroorzaakt door andere species bacteriën. Vaarzen hebben een hogere incidentie van mastitis door Streptococcus uberis en CNS en een lagere incidentie van mastitis door Staphylococcus aureus dan koeien. De kiemen die het meest geïsoleerd worden uit de melk van vaarzen met een klinische mastitis zijn de major pathogenen Streptococcus dysgalactiae, streptococcus uberis, Staphylococcus aureus en Escherichia coli. Uit de melk van vaarzen met een subklinische mastitis worden CNS het vaakst aangeduid als de veroorzaker (De Vliegher et al., 2012) Stafylokokken Stafylokokken zijn gram positief, hebben geen flagellen, zijn niet mobiel, vormen geen sporen en zijn aeroob of facultatief anaeroob. Stafylokokken zijn in staat om lang te overleven in de omgeving in variërende omstandigheden. Alle stafylokokken die negatief testen in de coagulasetest worden ingedeeld in de coagulasenegatieve stafylokokken groep (Longo et al., 2011). Mastitis veroorzaakt door stafylokokken varieert van een mild subklinische mastitis tot een gangreneuze infectie. Dezelfde stam kan in een andere diersoort een andere vorm van mastitis veroorzaken. S. aureus Newbould 305 bijvoorbeeld geeft een chronische mastitis met milde symptomen bij runderen, terwijl bij muizen een acuut klinische mastitis gezien wordt (Bouchard et al., 2012) Coagulase-negatieve stafylokokken Meer dan 50 verschillende species van stafylokokken testen negatief in de coagulasetest, waardoor de diversiteit binnen de coagulase-negatieve stafylokokken (CNS) groep groot is. In tegenstelling tot Staphylococcus aureus produceren CNS geen α-toxine, exfoliatine en geen van de StaphSAg toxines. CNS hebben oppervlakte adhesines en bezitten de mogelijkheid om extracellulaire polysaccharide biofilms te produceren (Figuur 3). Een groot deel van de CNS zijn resistent tegen penicilline en sommige ook tegen methicilline. Resistentie tegen meerdere antibiotica, meestal actief tegen de gram-positieve kokken, komt vaker voor bij CNS dan bij Staphylococcus aureus. Het verwijderen van CNS van bijvoorbeeld katheters wordt door de resistentie en het vormen van de biofilm erg lastig (Ryan et al., 2010). De meest frequent geïsoleerde bacteriën uit de uierkwartieren van koeien met en zonder verhoogd melkcelgetal zijn CNS (Supre et al., 2011). CNS zijn commensalen op de uier, tepeltop en de huid van de koeien die de uier kunnen infecteren als de infectiedruk te hoog wordt of de immuniteit van de gastheer daalt. Via manipulaties tijdens het melken, zoals het droog voorbehandelen van de tepels, en instrumentarium, zoals de melkklauw, kunnen CNS overgedragen worden naar andere koeien (Christensen et al., 1985). 14

21 Figuur 3: CNS slijmvorming. A: Staphylococcus epidermis kokken op het oppervlakte van een katheter starten met het produceren van het extracellulaire polysaccharide slijm. B: Na 48 uur zijn de bacteriën volledig in het slijm ingebed. Een klinische mastitis met milde symptomen kan door een CNS veroorzaakt worden, maar een subklinische mastitis komt veel vaker voor. Een subklinische mastitis door een CNS reageert, ondanks het feit dat antibioticum resistentie meer voorkomt bij de CNS groep dan bij Staphylococcus aureus, beter op antimicrobiële behandeling dan een S. aureus mastitis (Taponen et al., 2009). S. chromogenes is geassocieerd met mastitis bij vaarzen rond de partus, terwijl S. simulans vaker geïsoleerd wordt uit melk van vaarzen met mastitis tijdens de lactatie (Taponen et al., 2009). Naast deze drie CNS species, wordt S. haemolyticus ook regelmatig uit de melk geïsoleerd. S. haemolyticus en S. simulans worden veel in de omgeving aangetroffen, waardoor de kans op een IMI met S. haemolyticus en S. simulans verhoogt. Andere CNS soorten werden sporadisch uit de melk geïsoleerd zonder dat ze aanleiding gaven tot IMI. CNS soorten die voor % alleen in de omgeving van de koeien aangetroffen worden zijn S. equorum, S. sciuri, S. fleurettii, S. cohnii, S. devriesei, S. xylosus, S. arlettae en S. succinus (Piessens et al., 2011) Isolatie en identificatie van coagulase-negatieve stafylokokken CNS komen voor in de melk, maar ook op de speentop, huid en uier van runderen. Van een melkstaal wordt 0.01ml gespreid over het oppervlak van een aesculine bloed agar plaat, waarna deze geïncubeerd wordt bij 37 C in een aerobe omgeving. Na 24 en 48 uur kunnen de platen bekeken worden op de aanwezigheid en sterkte van de groei. Voor de isolatie van bacteriën op swabs van de tepel wordt gebruik gemaakt van Colombia bloed agar platen. Deze platen worden 24 uur geïncubeerd bij 37 C. Om stafylokokken te herkennen wordt gebruik gemaakt van de morfologie van de kolonies, catalase en coagulase productie en de detectie van hemolyse (Tabel 3, Figuur 4) (Supre et al., 2009). Voor de identificatie van de verschillende species van CNS kunnen verschillende moleculaire technieken gebruikt worden, maar het en sequenering van genen en typeren via tdna-pcr is de gouden standaard. Het DNA wordt uit de bacterien geëxtraheerd door de geïsoleerde bacteriën toe te voegen aan een lyse buffer bestaande uit 0,25% natrium dodecyl sulfaat en 0,05N natriumhydroxide voor 5 minuten bij 95 C. Het lysaat wordt kort afgedraaid bij toeren en verdund met gedistilleerd water, waarna de celresten worden verwijderd door 5 minuten te centrifugeren bij

22 toeren. Het supernatans wordt direct gebruikt als DNA extracten voor zowel de tdna-pcr en de sequenering van de genen (Baele et al., 2000). Elk isolaat wordt vergeleken met een GenBank om te bepalen welk species het isolaat bevat (Supre et al., 2009). Figuur 4. Morfologie van de kolonies van de CNS stammen, S. chromogenes IM, S. fleurettii en S. chromogenes ST, en S. aureus Newbould 305 geïncubeerd op een TSA plaat gedurende 24 uur op 37 C. Tabel 3. Fenotypische identificatie van Staphylococcus epidermidis, S. chromogenes, S. simulans, S. fleurettii en S. aureus (Kloos et al., 1975, Hajek et al., 1986, Holt et al., 1994, Waage et al., 1999, Vernozy-Rolandz et al., 2000, Moroni et al., 2005, Vos et al., 2009). S. epidermidis S chromogenes S. simulans S. fleurettii S. aureus Grootte 0,5-1,5 µm 0,8-1 µm 0,8-1,5 µm 0,8-1,4 µm 0,8-1 µm Groei In paren of Enkelvoudig, Paren of twee Enkel, paren clusters twee aan twee twee aan twee, aan twee, kettingen, clusters soms enkel clusters Groei T C C 37 C 37 C C >15 C, <45 C >22 C, <45 C >15 C, <45 C >15 C, <45 C Kolonies 2,5-4 mm ø, 3-8 mm ø, 5-7,5 mm ø 8-12 mm ø, 0,5-2 mm ø, grijswit - grijs, oranje of crème Grijs-wit wit, troebel gelig, troebel, soms geel regelmatig, doorzichtig, onregelm. hemolyse op glinsteren glinsteren randen bloedagar 16

23 Tabel 3. Vervolg S. epidermidis S chromogenes S. simulans S. fleurettii S. aureus Resistentie Penicilline, Penicilline, Penicilline, *Oxacilline, *Penicilline, oxacilline, Lysozyme *lysozyme, lysozyme, *methicilline, stretomycine, tetracycline *chloramphenicol, *erythromycine, neomycine, bacitracin, *teracycline kanamycine, novobiocine. Linezolid erythromycine, oleandomycine, lincomycine, tetracycline, cephalothine, novobiocine S. = Staphylococcus, > = meer dan, < = minder dan, Ø = Diameter, onregelm. = onregelmatige, * = meer dan 50% Interactie van coagulase-negatieve stafylokokken met de gastheer In vergelijking met koeien hebben vaarzen eerder een mastitis veroorzaakt door Streptococcus uberis en CNS en minder vaak mastitis veroorzaakt door Staphylococcus aureus. Het verschil komt waarschijnlijk door de verschillen in management en fysiologie tussen vaarzen en koeien. De meeste IMI veroorzaakt door CNS komen voor in pinken, in de postpartum periode van vaarzen en in koeien met een hoge melkproductie. Het celgetal in de melk stijgt door een infectie met CNS tot drie keer het melkcelgetal van gezonde koeien. Tijdens een infectie met CNS is er een hogere infiltratie van leukocyten en een verdikking van het bindweefsel van de stroma, wat kan zorgen voor een mindere melkproductie in de toekomstige lactaties (Braem, 2012). De prevalentie van een IMI veroorzaakt door een CNS varieert tussen de 5,5 en 27,1% op kwartierniveau en doordat de stijging in melkcelgetal meestal het enige symptoom is bij een CNS mastitis, kan het gemiddelde melkcelgetal in de tankmelk sterk kan variëren in de tijd op hetzelfde bedrijf (Reksen et al., 2012, De Vliegher et al., 2012). Desondanks frequente desinfectie en een goede hygiëne, is er een grote diversiteit van bacteriële species aanwezig op en rond de tepels van koeien en in hun omgeving. Na het melken blijft de sfincter van de tepel tijdelijk toegankelijk, waardoor bacteriën de uier kunnen infecteren. De bacteriën op en rond de tepel hebben de grootste kans om de uier binnen te dringen (Braem, 2012). De meest geïsoleerde soort bacterie is de CNS uit de melk van koeien met en zonder verhoogd melkcelgetal, maar desondanks de grote variëteit van CNS op de uier, is IMI veroorzaakt door CNS slechts de oorzaak van de kolonisatie van één soort CNS (Supre et al., 2011). Binnen de CNS species geïsoleerd uit de melk van deze koeien, vormde S. haemolyticus de overgrote meerderheid. Deze CNS wordt niet vaak geassocieerd met mastitis en is ook niet geassocieerd met een hoge antibiotica resistentie. CNS species die wel geassocieerd zijn met intramammaire infectie (IMI) kunnen zowel op gezonde als subklinisch geïnfecteerde uiers voorkomen. In de studie van Braem et al in 2013 werden S. simulans en S. epidermidis op gezonde en geïnfecteerde uiers aangetroffen, terwijl S. chromogenes en S xylosus alleen geïsoleerd werden van geïnfecteerde uiers (Braem et al., 2013). Alle CNS species, met uitzondering van S. fleurettii, zijn in staat om persisterende IMI te veroorzaken met S. chromogenes als veroorzaker van de meest persistente infecties. De schade die een CNS 17

24 veroorzaakt in de uier is afhankelijke van de virulentiefactoren van de species. De adhesie capaciteit bijvoorbeeld van Staphylococcus chromogenes, S. hemolyticus, S. cohnii en S. simulans is gelijk aan die van S. aureus, maar hun capaciteit om cellen binnen te dringen is veel zwakker. De productie van cytotoxische proteasen is in de meeste CNS genera niet aanwezig in tegenstelling tot major pathogenen (Supre et al., 2011). Hierdoor is de schade meestal minder groot dan de schade door major pathogenen zoals S. aureus en Streptococcus uberis (Reyher et al.,2012). Desondanks de afwezigheid van deze virulentiefactoren, zijn er studies die CNS aangetoond hebben in melkstalen van koeien met klinische mastitis. In deze gevallen is het is niet duidelijk of de CNS de veroorzaker is van die klinische mastitis. Bij S. chromogenes, S.xylosus en S. simulans was de inflammatoire response, gemeten via het celgetal in de melk, gelijkaardig aan de respons tegenover S. aureus, maar zelfs deze drie CNS species waren niet in staat om een klinische mastitis te veroorzaken (Supre et al., 2011). Naast de normale IMI, kunnen CNS tijdelijk het tepelkanaal en de tepelcysterne koloniseren. De CNS stam die tijdelijk de tepel en of tepelcysterne infecteert is makkelijker te verwijderen via antibiotica dan dezelfde CNS stam in een IMI. In een studie van Piessens et al (2011) bleek S. haemolyticus de enige CNS te zijn die zowel tijdelijke als persistente infecties kon veroorzaken. Om een verschil te maken tussen een tijdelijke kolonisatie van het tepelkanaal en een IMI blijkt het celgetal in de melk geen goede parameter, waardoor isolatie van dezelfde CNS uit opeenvolgende melkstalen nodig is om het verschil te bepalen. Verschillende kuddes hebben verschillende verdelingen van de CNS species, waardoor er ook kudde afhankelijke effecten zijn door CNS IMI (Supre et al., 2011). Door verschillen in management en CNS genera, zijn er grote verschillen tussen de verspreiding van CNS IMI tussen boerderijen. In een studie van Reksen et al (2012) bleef de prevalentie van CNS IMI bij de twee bestudeerde boerderijen tijdens de lactatieperiode gelijk. Verspreiding door de bacterie zelf bleek volgens de simulaties niet voldoende te zijn om de prevalentie op peil te houden, waardoor andere mechanismen van verspreiding, buiten de lactatieperiode, nodig zijn om de resultaten te verklaren. In de ene boerderij kan de CNS IMI een besmettelijke vorm aannemen, terwijl in de andere boerderij er geen aanwijzing is voor een verspreiding via besmetting of via de omgeving. Meerdere studies hebben opmerkelijke verschillen aangetoond in de transmissieparameters van mastitis pathogenen. In de studie van Reksen et al (2012) bleek de overdracht van een CNS infectie van een geïnfecteerd kwartier naar een gezond kwartier in dezelfde koe, afhankelijk van het bedrijf en was de kans twee keer zo groot dan de overdracht naar een andere koe. Een goed melkmanagement en hygiëne voor, tijdens en na het melken zijn nog steeds goed om verspreiding van IMI pathogenen te voorkomen (Reksen et al., 2012). Na een CNS IMI is er geen hogere kans op een tweede CNS IMI in het genezen kwartier dan in een naïef kwartier volgens Reksen et al (2012) en is er ook geen beschermend effect tegen een volgende IMI na een CNS IMI. Bevindingen door Piepers et al (2010) spreken dit tegen. De laatstgenoemde rapporteert dat vaarzen die geïnfecteerd waren met CNS een hogere dagelijkse melkproductie hadden dan niet geïnfecteerde vaarzen. In 2007 werd door Compton et al. deze merkwaardige associatie ook al gemaakt en in 2009 wederom door Schukken et al. Het tweede positieve effect van 18

25 een CNS IMI is de negatieve correlatie met klinische mastitis tijdens de eerste lactatie na een CNS IMI (Piepers et al., 2010). 2.4 Muis mastitis model Het bestuderen van mastitis in runderen, geiten of schapen brengt veel kosten en managementproblemen met zich mee. Hierdoor is er al in 1970 een model opgesteld met muizen, waardoor er slechts basisfaciliteiten nodig zijn om mastitis te kunnen bestuderen. Muizen hebben 5 paar melkklieren, waarvan er twee paar, net als bij koeien, in de abdominale regio te vinden zijn. Het vierde paar melkklieren is het grootste paar en daarom de meest gebruikte in onderzoeken. Bij beide diersoorten zijn de klieren functioneel en anatomisch onafhankelijk van elkaar, hebben 1 tepelopening en 1 primaire afvoergang. Verdere overeenkomsten zijn dat bij beide melk aanwezig is als voedingstof voor de groei van pathogenen en dat de histologische veranderingen, bacteriële en neutrofielen aantallen bijournal of Infection.ies gelijkaardig zijn. Het aantal residente fagocytotisch actieve cellen in de melk van runderen is vele malen hoger dan bij muizen en ook de melksamenstelling is significant verschillend. Mede door deze verschillen kunnen resultaten gekregen door de toepassing van dit model niet direct geëxtrapoleerd worden en moeten er dus vervolgstudies bij runderen uitgevoerd worden, maar zijn ze wel suggestief voor gelijkaardige bevindingen in runderen. Het introduceren van pathogenen in de melkklier kan via een druppel bacteriesuspensie direct op de tepel, via een micropipet gedeponeerd in het slotgat, via een geblunte naald, 32 gauge of in het tepelkanaal. Bij niet-lacterende en/of niet-drachtige dieren kan de melkklier chirurgisch blootgelegd worden, waarna er direct in de primaire afvoergang via een naald, 30 gauge, geïnjecteerd kan worden. Bij de eerst genoemde techniek moet de concentratie van bacteriën in de druppel zeer groot zijn, omdat slechts een klein deel de melkklier zal infecteren. Voor de laatste twee technieken kunnen specifieke aantallen KVE gebruikt worden om een infectie te veroorzaken. Het volume dat geïnjecteerd kan worden neemt toe met de leeftijd van het dier, maar is meestal niet groter dan 100µl. Normaal wordt de melkklier geïnjecteerd in de eerste twee weken van de lactatie. Tijdens de necropsie kan de correctheid van de injectie gecontroleerd worden als er bij de injectie steriele Oost-Indische inkt toegevoegd is aan het inoculum (Notebaert et al., 2006). 3. Onderzoek 3.1 Materiaal en methoden Dieren 70 CD1 muizen, 40 vrouwtjes en 30 mannetjes, van zeven weken oud werden door Harlan geleverd. De muizen werden gehuisvest in filtertop kooien met ad libitum water en voedsel en een dag/nacht cyclus van 12u licht, 12u donker. Sentinel muizen werden gebruikt om te verifiëren dat de leefruimte van de muizen pathogeen vrij waren. Het experiment heeft de richtlijnen voor verzorging en gebruik van laboratoriumdieren zoals beschreven door FELASA gevolgd (EC2013/166). Naast de monitoring van de lichaamstemperatuur, werd het lichaamsgewicht van alle vrouwtjes tijdens het experiment 19

26 meermaals gemeten om te bepalen of ze het humane eindpunt bereikt hadden. De humane eindpunten zijn een gewichtsverlies van meer dan 20%, sterk verminderde opname van voedsel en water, verlies van gewaarwording van de omgeving, afwezigheid van zelfverzorging, agressiviteit, zelfverminking, gekromde houding en rechtop staande haren Bacteriën Staphylococcus aureus Newbould 305 (ATCC 27940) werd gebruikt als major pathogeen en S. chromogenes, S. chromogenes ST en S. fleurettii zijn de gebruikte CNS species. De S. aureus Newbould 305 werd geïsoleerd uit de mastitismelk (Bouchard et al., 2012), de CNS stammen zijn op de universiteit van Gent geïsoleerd uit de melk van een vaars met een chronische IMI, de tepel van een vaars en uit de omgeving van koeien. De bacteriële groeicurve bestaat uit 4 stappen: Lag fase, exponentiële groei fase, stationaire fase en de afstervingsfase (Figuur 5). S. aureus Newbould 305 en de CNSen werden ingevroren op het moment dat de stam middenin de exponentiële groeifase bevond bij -80 C in Dulbecco s fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS) en 15% glycerol. De procedure om deze bacteriële oplossing aan te maken wordt hieronder beschreven. Figuur 5. De bacteriële groeicurve. De primaire stock van bacteriën werd bewaard bij -80 C in een emdium met volgende samenstelling: 25ml BHI (Brain Heart Infusion), 75ml paardenserum en 7.5g glucose. Uit deze stock werd 20µl op een TSA (Tryptic Soy Agar) plaat geënt en overnacht bij 37 C geplaatst. De volgende dag werden 40 kolonies met een entoog opgepikt en in 10ml BHI gebracht, gevortexed en op 37 C gezet. Na 2 uur incubatie werden de falcontubes elke 30minuten gevortexed en werd de optische densiteit (OD) bepaald via spectrofotometrie bij 450nm tot een OD van 0,55 bereikt was. Deze OD komt ongeveer overeen met 10 8 KVE S. aureus Newbould 305. De falcontubes werden 10 minuten op 2700g bij 4 C gecentrifugeerd, waarna de pellet twee keer gewassen werd met telkens 10ml steriele PBS. De pellet werd dan opnieuw gesuspendeerd in 10ml steriele koude PBS met 15% glycerol en op ijs geplaatst om de groei te stoppen. De OD waarde werd nogmaals gemeten om het aantal KVE/ml te bepalen aan de hand van de standaardcurve (Figuur 6). 20

27 Figuur 6. De standaardcurve voor de bepaling van het aantal KVE/ml S. aureus Newbould 305 aan de hand van de optische densiteit. Vervolgens werd 20µl uit de suspensie genomen om het kiemgetal te bepalen. Hiervoor werd een verdunningsreeks gemaakt in een 96well plaat (Figuur 7), waarna er van de -4, -5 en -6 verdunning per verdunning 6 bolletjes van 20µl geënt werden op TSA platen. Figuur 7. Schematische weergave van de verdunningsreeks op een 96 wellplaat De rest van de verdunde finale bacterie-oplossing werd verdeeld over epjes, maximaal 500µl per epje, en bewaard bij -80 C. De volgende dag werden de platen afgelezen en de KVE/ml bepaald Model voor Intramammaire inoculatie Vijf weken voor de injectie werd elke vrouwelijke muis van 7 weken oud bij een mannelijke muis van 10 weken oud geplaatst. Na 2 weken werden de vrouwtjes van de mannetjes gescheiden en in een aparte kooi gehuisvest waar ze hebben geworpen. Twee uur voor de injectie werden de pups gespeend en geëuthanaseerd. Voor de inoculatie werden de vrouwtjes verdoofd via een gasanesthesie-toestel met 3% isofluraan voor de inductie in een afgesloten box en 2% tijdens de inoculatie via een masker. De muis werd op 21

28 haar rug gelegd en de tepels werden gedesinfecteerd met een hibitane oplossing. De tepels van het vierde klierpaar werden omhoog getrokken met een pincet en de tepeltoppen werd afgeknipt, waarna de tepels opnieuw opgetrokken werden en aan 1 kant gefixeerd werden zonder het tepelkanaal af te sluiten. Een 32-gauge naald, waarvan de scherpe punt geblund is met schuurpapier, werd voorzichtig in het tepelkanaal geschoven voor 2/3 van de lengte (Figuur 8). Figuur 8. Links: het opheffen van de tepel en het afknippen van de tepeltop. Rechts: het inbrengen van de 32 Gauge naald in het tepelkanaal. De tepel werd losgelaten, waarna ze opnieuw vastgepakt wordt waarbij de naald gefixeerd werd in het tepelkanaal. Er werd 100µl PBS of bacteriesuspensie per klier geïnjecteerd, waarna een paar seconden gewacht werd voordat de naald verwijderd werd. Na het inoculeren van de klieren, werd de muis terug in haar kooi geplaatst op schoon papier. Tabel 4. Schematische weergave van de proefopzet voor de bepaling van de hoeveelheid KVE. inoculatie aantal muizen PBS S. aureus Newbould S. chromogenes IM S. chromogenes IM S. chromogenes IM S. chromogenes IM 3 PBS = fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, S = Staphylococcus Tabel 5. Schematische weergave van de proefopzet voor de vergelijking van de drie CNS stammen met Staphylococcus (S.) aureus Newbould 305 inoculatie klierpaar aantal muizen opoffering na 24u opoffering na 48u 10 2 S. aureus Newbould muizen 10 5 S. chromogenes IM muizen 3 muizen 10 5 S. chromogenes ST muizen 3 muizen 10 5 S. fleurettii muizen 3 muizen PBS 5 alle muizen 12 muizen 9 muizen 22

29 3.1.4 Opoffering en staalname De muizen worden geïnjecteerd met ketamine/xylazine, waarna er van elke muis via cardiale punctie bloed afgenomen werd. Dit werd één uur geïncubeerd bij 37 C, waarna het 60 minuten gecentrifugeerd werd op RPM bij 4 C. Het supernatant (=serum) werd bewaard bij -80 C. Na het afnemen van het bloed, werden de muizen geëuthanaseerd via cervicale dislocatie. Het vierde klierpaar werd van alle muizen geëxtraheerd, het vijfde klierpaar werd alleen van de muizen gebruikt voor de vergelijking van S. aureus Newbould 305 met de drie CNS stammen geëxtraheerd. In totaal zijn 120 melkklieren van 39 muizen geanalyseerd, waarvan er 30 geïnjecteerd waren met PBS, 12 met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305, 6 met 10 2, 10 3 en 10 4 KVE S. chromogenes IM, 18 met 10 5 KVE S. chromogenes IM, 12 met 10 5 KVE S. chromogenes ST en 12 met 10 5 KVE S. fleurettii Bepaling van de kolonie vormende eenheden Om de KVE te bepalen werden de geïnjecteerde klieren geïsoleerd en in vooraf gewogen epjes geplaatst. Deze werden achteraf opnieuw gewogen om het gewicht per klier te bepalen. De klieren werden daarna gehomogeniseerd, waarna 20µl werd verdund in 180µl PBS in een 96-well plaat. 20µl van deze oplossing werd toegevoegd aan de volgende rij met 180µl PBS in de well. Dit wordt nog 6 keer herhaald waardoor 7 verdunningen, onverdund, 1/10 1, 1/10 2, 1/10 3, 1/10 4, 1/10 5, 1/10 6 en 1/10 7 verkregen werden (Figuur 9). 12 homogenaat stalen 20 µl µl PBS 7 verdunningen 20 µl µl PBS etc. Figuur 9. Schematische weergave van de verdunningsstappen op de 96 wellplaat. Van elke verdunning werd 20µl op een TSA plaat gespot, waarna deze platen één dag bij 37 C geïncubeerd werden. Het aantal KVE werd de volgende dag geteld bij de verdunning waar dit mogelijk is en via de volgende formule werd het aantal KVE/ml berekend: KVE/ml = #KVE * 50 * 10 Y, met Y = verdunningsstap. Elke spot bevat 20µl, waardoor vermenigvuldigd moet worden met 50 om het aantal KVE per 1ml te kennen. Deze waarde moet dan vermenigvuldigd worden met de verdunningsstap om terug naar de originele suspensie te komen. Bijvoorbeeld 30 spots geteld in de derde verdunning, uit rij D en dus 1000 keer verdund, geeft: 30*50*10 3 = 1,5*10 6 KVE/ml 23

30 3.1.6 Cytokine concentraties De bepaling van de cytokine concentraties werd uitgevoerd via een cytometrische bead array (CBA, Figuur 10) met de CBA Mouse/Rat Soluble Protein Master Buffer Kit en de CBA Mouse Soluble Protein Flex Set voor IL-6, IL-1β en TNF-α. De methode berust op de ELISA techniek waarbij we cytokines simultaan kunnen bepalen via unieke beads met een flowcytometer. De beads bevatten een unieke combinatie van 2 interne fluorescente merkers en zijn gekoppeld aan verschillende antistoffen. Afhankelijk van hun ligging binnen het raster van 2 interne fluorochromen krijgen ze een alphanumerische identificatie, bijvoorbeeld E5, C8 en D9 (Figuur 11). Op Zo zijn de E5 beads gekoppeld aan IL-6, C8 beads aan IL-1β en D9 beads aan TNF-α antilichamen. Op deze manier kan men de verschillende beads apart identificeren en meerdere cytokines simultaan meten. Secundaire antistoffen tegenover IL-6, L-1β of TNF-α gekoppeld aan de fluorescente molecule phycoerythrine (PE) werden gebruikt om te bepalen hoeveel cytokine er gebonden is aan de beads (Figuur 10). Hoe meer antigenen aanwezig, hoe meer secundaire antistoffen gebonden aan PE de antigenen binden en dus hoe hoger de gemiddelde fluorescentie intensiteit voor PE. Figuur 10. Het principe van een cytometrische bead array. Verschillende beads gekoppeld aan een bepaalde antistof worden toegevoegd aan een staal, met een onbekende concentratie antigenen. Secundaire antistoffen gekoppeld aan de fluorescente molecule phycoerythrine (PE) worden toegevoegd, waardoor deze antistoffen indirect via de antigenen aan de beads gekoppeld worden. Na het wegwassen van de overmaat aan secundaire antistoffen, wordt de unieke interne fluorescentie bepaald van de beads en de daaraan gekoppelde gemiddelde fluorescentie intensiteit van PE. Deze intensiteit word via een standaardcurve omgezet in een concentratie. 24

31 Figuur 11. Weergave van het fluorescente signaal van verschillende beads. De naam van de beads is afhankelijk van het rasterpunt waarin ze vallen. 100µl van het homogenaat van de klieren werd gemengd met 200µl lysebuffer (5mM EDTA, 1mM geoxideerd L-gluthation, 1% Nonidet P-40, 100µM PMSF, 2,1µM leupeptine en 1mM aprotinine). Deze buffer lyseert de cellen waardoor proteïnen vrij komen en inhibeert de vrijgekomen proteasen. De suspensie werd een nacht bewaard bij -20 C om de lyse van de cellen te bevorderen door het invriezen. De volgende dag werden de lysaten 60 minuten gecentrifugeerd op RPM bij 4 C. Door het centrifugeren ontstaan er drie fracties, namelijk een witte vetfractie op een waterige fractie die de eiwitten bevat en een pellet met de celwand en het kernmateriaal. Na het afzuigen van de vetfractie werd de waterige fractie overgebracht naar een nieuw epje en nogmaals 60 minuten gecentrifugeerd op RPM bij 4 C om de waterige fractie nog verder op te zuiveren. De vetfractie werd wederom verwijderd en de nieuwe waterige fractie werd overgepipetteerd in een nieuw epje. Op deze waterige fractie werd via spectrofotometrie de concentratie van eiwitten bepaald via een commerciële BIO-rad Proteïn assay. Er werd van elke concentratie een standaardconcentratie van 5µg/µl gemaakt (addendum: tabel 8 en 9), waarna alles opgeslagen werd bij -80 C. Een 96well plaat werd bevochtigd met de wasbuffer, waarna 10µl van de 5µg/µl oplossing en 15µl assay dilluent in een well toegevoegd werden. 25µl van de oplossing met de beads wordt hierna toegevoegd (3 tot 5 keer op en neer pipetteren), waarna 1 uur geïncubeerd werd in het donker, bij kamertemperatuur. Hierna werd 25µl van de oplossing met de secundaire antistoffen toegevoegd (3 tot 5 keer op en neer pipetteren) en nogmaals 1 uur in het donker, bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na deze incubatie werd de oplossing 5 minuten aan 960 RPM (200g) gecentrifugeerd. Het supernatant werd afgegoten, waarna 150µl wasbuffer aan elke well toegevoegd werd. Na 3 tot 5 keer op en neer pipetteren werd de analyse gestart met behulp van een flowcytometer. Voor meer details, zie manual van de kit met categorienummer van BD Biosciences ( Histopathologie Uit elke groep van muizen zijn voor elk tijdstip twee representatieve stalen genomen voor histologie, waardoor er 96 coupes gemaakt zijn van 27 klieren. De stalen werden in embedding cassettes geplaatst tussen twee viltjes om de klieren te strekken en gedurende 24 uur op kamertemperatuur in 25

32 gebufferde formaldehyde gefixeerd. De stalen werden in een weefselprocessor van Microm/Thermoscientific met type STP420D ontwatert door baden van achtereenvolgens 50%, 70%, 90% en 100% ethanol, waarna ze doordrenkt werden met paraffine De klieren geselecteerd uit de muizen voor de bepaling van de hoeveelheid KVE werden in drie stukken verdeeld (Figuur 12), opgeblokt in paraffine en van elk stuk werden coupes gemaakt en gekleurd met haematoxylineeosine-kleuring (H&E). De muriene melkklier wordt op deze manier opgeblokt om zo coupes te hebben van de verschillende delen van de klier. De eerste coupes worden van de top van de klier genomen dicht bij de tepel, de tweede coupes worden genomen ter hoogte van de lymfeknoop en de derde coupes worden genomen in het onderste derde deel van de klier. Figuur 12. Schematische afbeelding van de manier van opblokken van een muriene melkklier tijdens dit experiment. Het rode stipje is de plaats waar de tepel zich bevind, het zwarte stipje is de lymfeknoop. De lijnen aangeduid met A en B zijn de plaatsen waar de klier doorgesneden is om ze in de juiste richting te kunnen opblokken. Een mandje is aangegeven met blauw op de vaste paraffine dat aangegeven is met de grijze lijn. Het weefsel wordt aan de onderkant van het blokje aangesneden, de plaats waar de snede zat is aangegeven met dezelfde letter. De klieren geselecteerd uit de muizen voor de vergelijking van S. aureus Newbould 305 met de CNS stammen werden over de lengte opgeblokt in paraffine (Figuur 13), waarna er van elk blok coupes gemaakt werden die gekleurd zijn met H&E. Figuur 13. Schematische afbeelding van de manier van opblokken van een muriene melkklier uit een muis voor de vergelijking van S. aureus Newbould 305 met de drie CNS stammen. Het rode stipje is de plaats waar de tepel zich bevind, het zwarte stipje is de lymfeknoop. De lijn van A naar B is de plaats waar de klier doorgesneden is om ze in de juiste richting te kunnen opblokken. Een mandje is aangegeven met blauw op de vaste paraffine dat aangegeven is met de grijze lijn. Het weefsel wordt aan de onderkant van het blokje aangesneden. Rechts boven is een zijaanzicht van de opgeblokte klier, rechtsonder is een onderaanzicht van de opgeblokte klier. 26

33 3.1.8 Statistische analyse Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 22 voor Windows. Analyse van de KVE werd gedaan via het algemeen lineaire model (General Linear Model) met de KVE als afhankelijke waarde en de behandeling als onafhankelijke waarde. Voor de analyse van de daling in temperatuur was het nodig om de data te transformeren om een normale verdeling te krijgen. De data is eerst omgezet in absolute waardes, waarna de vierkantswortel van deze absolute waardes is genomen. Ook hier is de analyse via het algemeen lineaire model (General Linear ModeL) uitgevoerd met de temperatuur als afhankelijke waarde en de behandeling als onafhankelijke waarde. De cytokine concentratie van IL-6 werden logaritmisch getransformeerd om een normale verdeling van de residuals te krijgen, waarna de analyse via het algemeen lineaire model uitgevoerd werd met de cytokine concentratie als afhankelijke waarde en de behandeling als onafhankelijke waarde. Interacties tussen het tijdstip van opofferen en de behandeling werden ook bekeken, maar bleken afwezig te zijn voor alle drie de analyses en zijn dus niet meegenomen in de statistische analyse. 3.2 Resultaten In experiment A werd de hoeveelheid KVE aan CNS bepaald die intramammair geïnjecteerd moet worden om een neutrofiel respons na 24 uur te krijgen in het muis mastitis model met behulp van S. chromogenes IM. Deze hoeveelheid KVE werd gebruikt in experiment B om drie verschillende CNS stammen, S. chromogenes IM, S. chromogenes ST en S. fleurettii, te vergelijken op twee verschillende tijdstippen, 30 en 48 uur post-imi. In beide experimenten vergeleken we met S. aureus Newbould 305, een coagulase-positieve mastitis stam Experimentele intramammaire infectie met coagulase-negatieve stafylokokken veroorzaakt matig ongemak in vergelijking met een S. aureus intramammaire infectie. In alle dieren van zowel experiment A als experiment B veroorzaakte de sham injectie (PBS) geen ongemak, de IMI met elk van de drie CNS stammen matig ongemak en de IMI met S. aureus Newbould 305 (positieve controle) ernstig ongemak. In de CNS groepen werden er geen klinische symptomen van ongemak waargenomen, met uitzondering van twee dieren geïnjecteerd met S. chromogenes ST die vermoedelijk door lokale irritatie op respectievelijk 30 en 48 uur post-injectie huidwonden vertoonden ter hoogte van de geïnfecteerde melkklier na intensief krabben. De dieren geïnjecteerd met S. aureus Newbould vertoonden allemaal klinische verschijnselen van ongemak, zoals het in elkaar gedoken zitten, weinig bewegen en het opzetten van de haren (Figuur 14). Daarenboven hadden de dieren harde melkklieren die uitwendig een groen-bruine kleur vertoonden. 27

34 Figuur 14. Een muis geïnjecteerd met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305 na 28 uur. Het in elkaar gedoken zitten, weinig bewegen en het opzetten van de haren zijn tekenen van ongemak Experimentele intramammaire infectie met coagulase-negatieve stafylokokken beïnvloedt de lichaamstemperatuur niet in tegenstelling tot een intramammaire infectie met S. aureus. In experiment A is er geen significant verschil aangetoond tussen de daling in temperatuur van de verschillende groepen na 24 uur (Figuur 15A). In experiment B is er wel een significant verschil aangetoond tussen de groep geïnjecteerd met PBS en de CNS stammen met de groep geïnjecteerd met S. aureus Newbould 305 na 28 uur. De lichaamstemperatuur van een muis met een S. aureus Newbould 305 infectie zakte gemiddeld met 7,03±2,83 C ten opzichte van de lichaamstemperatuur vóór de infectie. (Figuur 15B). Pas in de laatste 4 uur werden de symptomen van ongemak duidelijk zichtbaar, waardoor deze muizen in experiment A geen symptomen vertoonden en in experiment B wel. De daling in lichaamstemperatuur na een infectie met S. aureus Newbould 305 ten opzichte van dieren die respectievelijk PBS, S. chromogenes IM, S. chromogenes ST en S. fleurettii kregen is 6,67±0,95 C, 6,32±0,92 C, 6,37±0,92 C en 5,68±0,92 C (alle P-waardes < 0,001). In alle dieren van zowel experiment A als experiment B, waren de veranderingen in lichaamsgewicht post-imi met PBS, met elk van de 3 CNS stammen en met S. aureus Newbould 305 niet significant verschillend, noch binnen een groep, noch tussen de groepen (Figuur 16A en 16B). Figuur 15A. De temperatuursverandering in C in de muizen voor de vergelijking van de verschillende inoculi van S. chromogenes IM met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305 per groep muizen na 24 uur. De verandering is niet significant verschillend tussen de verschillende groepen. 28

35 Figuur 15B. De temperatuursverandering in C de muizen voor de vergelijking van de verschillende CNS stammen, 10 5 KVE S. chromogenes IM, S. chromogenes ST en S. fleurettii, met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305 op 30u en 48u na inoculatie. De temperatuurdaling geïnduceerd door de inoculatie met S. aureus Newbould 305 is significant verschillend van de temperatuurdaling geïnduceerd door de CNS stammen (P < 0,001) Figuur 16A. De gewichtsverandering in gram in de muizen voor de vergelijking van de verschillende inocula van S. chromogenes IM met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305 per groep muizen na 24 uur. De verandering in gewicht is niet significant verschillend tussen de groepen. 29

36 Figuur 16B. De gewichtsverandering in gram in de muizen voor de vergelijking van de verschillende CNS stammen, 10 5 KVE S. chromogenes IM, S. chromogenes ST en S. fleurettii, met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305 op 30u en 48u na inoculatie. De verandering in gewicht is niet significant verschillend tussen de groepen Experimentele intramammaire infectie met coagulase-negatieve stafylokokken en S. aureus veroorzaken een kiemafhankelijke ontstekingsreactie in combinatie met een influx van neutrofielen. Het verspenen van de pups voor de intramammaire injectie, geeft een opstapeling van de melk en daardoor een wit uitzicht van de klier. De klieren geïnjecteerd met PBS zien er 24 uur na de injectie wit uit door deze opstapeling en de afwezigheid van tekenen van inflammatie. Microscopisch is de afwezigheid van inflammatie bevestigd na 24 uur door de afwezigheid van influx van neutrofielen en het behoudt van de alveolaire structuur. In experiment A werd dit op drie verschillende delen van de melkklier bestudeerd om na te gaan of dit effect homogeen verdeeld is (Figuur 17). In experiment B werd hetzelfde beeld verkregen 48 uur na de injectie (Figuur 18), door 1 coupe te nemen over de lengte van de klier. Klieren geïnoculeerd met S. aureus Newbould 305 kleuren rood, zijn hard en er is exudaat aanwezig,. Dit zijn tekenen van sterke inflammatie. De bruine kleur wordt veroorzaakt door de bacteriën. In tegenstelling tot de PBS controles bevestigen microscopische beelden de sterke influx van neutrofielen op en is zelfs bacteriële groei aantoonbaar (Figuur 17). 30

37 Figuur 17. Beeld van een muriene melkklier geïnjecteerd met PBS (links) naast drie histologische coupes gekleurd met H&E van deze klier 24 uur na de inoculatie naast een beeld van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305 (rechts) naast drie histologische coupes gekleurd met H&E van deze klier 24 uur na inoculatie. De groene A en B komen overeen met de groene A en B in figuur 12. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. De bovenste coupe is genomen nabij de tepel, de middelste nabij de lymfeknoop en de onderste nabij de rug. De linker melkklier is wit door de melk, vertoond geen roodheid en is niet bruin verkleurd door bacteriën, terwijl de rechter melkklier rood is door de inflammatie en bruin door de bacteriën. Microscopisch is er links geen influx van immuuncellen zichtbaar terwijl dit rechts duidelijk is (zwarte cirkels). De blauwe cirkel toont bacteriële groei. Figuur 18. Beeld van een muriene melkklier geïnjecteerd met PBS naast een histologische coupe gekleurd met H&E van deze klier 48 uur na de inoculatie. De blauwe A en B komen overeen met de blauwe A en B in figuur 13. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. De melkklier is wit door de melk en vertoond geen ontstekingsbeeld. Microscopisch is er geen influx van immuuncellen zichtbaar. Een intramammaire infectie met S. chromogenes IM geeft na 24 uur een minder ernstig ontstekingsbeeld dan S. aureus Newbould 305. Op 48 uur na de inoculatie is het ontstekingsbeeld ernstiger, maar nog altijd minder ernstig dan bij een S. aureus Newbould 305 infectie na 24 uur. De 31

38 influx van immuuncellen, met name neutrofielen, is zichtbaar, maar de bacteriële groei is minder uitgesproken dan bij S. aureus Newbould 305 (Figuur 19 en 20). Figuur 19. Beeld van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes IM naast drie histologische coupes gekleurd met H&E van deze klier 24 uur na de inoculatie. De groene A en B komen overeen met de groene A en B in figuur 12. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. De bovenste coupe is genomen nabij de tepel, de middelste nabij de lymfeknoop en de onderste nabij de rug. De klier is roze door de combinatie van de witte melk en de roodverkleuring door de ontsteking. Een lichte bruine kleur is zichtbaar veroorzaakt door bacteriën. Op alle drie de coupes zijn immuuncellen zichtbaar (zwarte cirkel). Figuur 20. Beeld van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes IM naast een histologische coupe gekleurd met H&E van deze klier 48 uur na de inoculatie. De blauwe A en B komen overeen met de blauwe A en B in figuur 13. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. De klier is roder door de ontstekingsreactie en op de coupe zijn immuuncellen zichtbaar (zwarte cirkel). Een intramammaire infectie met S. chromogenes ST heeft op twee verschillende manieren de melkklier beïnvloed. Vier van de zes muizen reageerde minder sterk op de inoculatie (Figuur 21 en 23) 32

39 dan de overige 2 (Figuur 22 en 24). Bij deze 2 muizen is de inflammatoire reactie macroscopisch veel sterker en microscopisch is er een grotere influx van neutrofielen zichtbaar. Figuur 21. Beeld van een muriene melkklier afkomstig van 1 van de 4 muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes ST die minder sterk gereageerd hebben naast een histologische coupe gekleurd met H&E van deze klier 30 uur na de inoculatie. De blauwe A en B komen overeen met de blauwe A en B in figuur 13. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. De klier is wit door de melk en iets roder door de milde ontstekingsreactie. Op de coupe zijn immuuncellen zichtbaar (zwarte cirkel). Figuur 22. Beeld van een muriene melkklier afkomstig van 1 van de 2 muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes ST die sterker gereageerd hebben naast een histologische coupe gekleurd met H&E van deze klier 30 uur na de inoculatie. De blauwe A en B komen overeen met de blauwe A en B in figuur 13. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. De klier is rood door de sterke ontstekingsreactie en op de coupe zijn immuuncellen zichtbaar (zwarte cirkel). 33

40 Figuur 23. Beeld van een muriene melkklier afkomstig van 1 van de 4 muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes ST die minder sterk gereageerd hebben naast een histologische coupe gekleurd met H&E van deze klier 48 uur na de inoculatie. De blauwe A en B komen overeen met de groene A en B in figuur 13. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. De klier toont een mild ontstekingsbeeld en op de coupe zijn immuuncellen zichtbaar (zwarte cirkel). Figuur 24. Beeld van een muriene melkklier afkomstig van 1 van de 2 muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes ST die sterker gereageerd hebben naast een histologische coupe gekleurd met H&E van deze klier 48 uur na de inoculatie. De blauwe A en B komen overeen met de blauwe A en B in figuur 13. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. De klier toont een sterk ontstekingsbeeld en op de coupe zijn immuuncellen zichtbaar (zwarte cirkel). 34

41 Een intramammaire infectie met S. fleurettii geeft zowel na 24 als 48 uur een lichte ontstekingsreactie in combinatie met een influx van neutrofielen (Figuur 25 en 26). Figuur 25. Beeld van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 5 KVE S. fleurettii naast een histologische coupe gekleurd met H&E van deze klier 30 uur na de inoculatie. De blauwe A en B komen overeen met de blauwe A en B in figuur 13. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. De klier is licht roze door de combinatie van de witte melk met een lichte ontstekingsreactie en op de coupe zijn immuuncellen zichtbaar (zwarte cirkel). Figuur 26. Beeld van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 5 KVE S. fleurettii naast een histologische coupe gekleurd met H&E van deze klier 48 uur na de inoculatie. De blauwe A en B komen overeen met de blauwe A en B in figuur 13. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. De klier toont een ontstekingsbeeld en op de coupe zijn immuuncellen zichtbaar (zwarte cirkel) Een experimentele intramammaire infectie met coagulase-negatieve stafylokokken vertoont weinig in vivo groei in vergelijking met S. aureus In experiment A is er weinig bacteriële groei zichtbaar van S. chromogenes IM in vivo en deze observatie is onafhankelijk van het inoculum dosis. De injectie van 250 KVE S. aureus Newbould 305 geeft na 24 uur een stijging van het aantal KVE met een factor De stijging in KVE door de verschillende aantallen KVE van S. chromogenes is slechts met een factor 2-5 gestegen. De verschillen in KVE na 24 uur tussen de groepen muizen geïnjecteerd 35

42 met 10 2, 10 3, 10 4 en 10 5 KVE S. chromogenes IM zijn niet significant. Deze groepen, met uitzondering de groep muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes IM, zijn wel significant verschillend van de groep muizen geïnjecteerd met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305. S. aureus Newbould werd geïnjecteerd met 250 KVE en gaf na 2 uur aanleiding tot 8,15(±0,37) log KVE. Voor 10 2, 10 3, 10 4 en 10 5 KVE S. chromogenes IM geïnjecteerd werd na 24 uur respectievelijk 2,8(±0,72) log KVE, 3,05(±0,25) log KVE, 4,1(±0,84) log KVE en 3,93(±1,50) log KVE gevonden. Het lineaire model 1,478(±0,687)+0,567(±0,195)inoculum = logkve na 24 uur verklaard voor 30,7% de observaties In experiment B is de bacteriële groei van S. chromogenes, S. chromogenes ST en S. fleurettii significant verschillend van elkaar en van S. aureus Newbould 305 na 48 uur. Na 48 uur zijn de verschillen in KVE tussen alle groepen onderling significant, behalve tussen de groep muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes en de groep muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes ST (Figuur 27). Het gemiddelde verschil in logwaarde KVE tussen de S. aureus Newbould 305 groep met de groepen muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes, S. chromogenes ST en S. fleurettii is respectievelijk 2,21(±0,47), 2,03(±0,62) en 4,74(±0,31). De KVE van S. aureus Newbould 305 aan het eind van experiment A en B waren vergelijkbaar. De KVE logwaarde van de S. fleurettii groep verschilt 2,53(±0,54) en 2,71(±0,68) log van de logwaarde van respectievelijk de S. chromogenes groep en de S. chromogenes ST groep. Figuur 27. Het aantal KVE na 30 uur voor S. aureus Newbould 305 in vergelijking met het aantal KVE na 30 en 48 uur voor S. chromogenes IM, S. chromogenes ST en S. fleurettii. De stijging van S. aureus Newbould 305 is significant verschillend ten opzichte van de stijging van de drie CNS stammen. Voor de CNS stammen onderling is de stijging van S. fleurettii significant verschillend van de stijging van zowel S. chromogenes IM als S. chromogenes ST. De stijging van S. chromogenes is niet significant verschillend ten opzichte van de stijging van S. chromogenes ST. SA = S. aureus Newbould 305, S. CHR IM = S. chromogenes IM, S CHR ST = S. chromogenes ST S. Fleur = S. fleurettii. 36

43 3.2.5 Een experimentele intramammaire infectie met coagulase-negatieve stafylokokken induceert geen toename van de cytokines IL-6, IL-1beta en/of TNF-alfa in zowel de melkklier als in het serum, S. aureus induceert een stijging van IL-6 in de melkklier en het serum. De concentraties van de cytokines IL-6, IL-1β en TNF-α in zowel de melkklier als in het serum van de groepen muizen geïnjecteerd met de 10 5 KVE van de verschillende CNS stammen bleef onder de detectie limiet. Alleen S. aureus Newbould 305 gaf een positief signaal voor IL-6 na 24 uur. In het serum is IL-6 significant gestegen bij S. aureus Newbould 305 geïnjecteerde muizen ten opzichte van de groep muizen geïnjecteerd met PBS, maar niet significant ten opzichte van de groepen geïnjecteerd met de verschillende CNS stammen. In de melkklier is de stijging van IL-6 door S. aureus Newbould 305 significant groter dan de stijging door PBS en de CNS stammen aantoonbaar (Figuur 28). In de melkklier is de concentratie van IL-6 voor S. aureus Newbould 305 geïnjecteerde dieren 3,11(±0,17) Pg / ml in 50µg totaal eiwit. Dit is significant verschillend ten opzichte van de 0,99(±0,83) Pg / ml IL-6 in 50µg totaal eiwit van de met CNS geïnjecteerde groepen en de 0,93(±0,19) Pg / ml IL-6 in 50µg totaal eiwit van de met PBS geïnjecteerde groepen. In het serum is de concentratie van IL-6 voor S. aureus Newbould 305 geïnjecteerde dieren 3,96(±0,52) Pg / ml in 50µg totaal eiwit en significant verschillend van de 1,33(±0,22) Pg / ml in 50µg totaal eiwit voor PBS geïnjecteerde dieren. De concentratie van IL-1β in de melkklier was gestegen bij de dieren geïnjecteerd met S. aureus Newbould en de twee muizen die sterker gereageerd hadden op de S. chromogenes ST injectie. In het serum is deze stijging niet waargenomen. TNF-α is voor geen van de groepen op geen van de tijdstippen in zowel de melkklier als het serum niet gestegen. Figuur 28. De concentratie van IL-6 in Pg / ml (in 50µg totaal eiwit) in de melkklier van muizen geïnjecteerd met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305 en 10 5 KVE S. chromogenes IM, S. chromogenes ST en S. fleurettii. Er is een significant verschil tussen de concentratie IL-6 in de melkklier van muizen geïnjecteerd met S. aureus Newbould 305 ten opzichte van de drie CNS groepen. Er is geen significant verschil in de concentratie van IL-6 tussen de CNS groepen onderling. SA = S. aureus Newbould 305, PBS = fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, S. CHR IM = S. chromogenes IM, S CHR ST = S. chromogenes ST S. Fleur = S. fleurettii 37

44 4. Discussie Deze scriptie bestudeert de pathogenese van drie boviene CNS stammen, S. chromogenes IM, S. chromogenes ST en S. fleurettii, via een vergelijkende studie met S. aureus als positieve controle in een muis mastitis model. De keuze voor deze drie CNS stammen is gebaseerd op de verschillende niches en hun verschillende virulentie en immuunrespons bij de melkkoe: er werden één kiem die een chronische infectie veroorzaakt (S. chromogenes IM), één commensaal die de tepel koloniseert (S. chromogenes ST) en één omgevingskiem (S. fleurettii) met elkaar vergeleken. In het eerste experiment, experiment A, is de hoeveelheid KVE aan CNS bepaald die intramammair geïnjecteerd moet worden om een neutrofiel respons na 24 uur te krijgen met behulp van S. chromogenes IM. Deze hoeveelheid KVE is daarna gebruikt in het tweede experiment, experiment B, om de drie verschillende CNS stammen te vergelijken met elkaar op twee tijdstippen, 24 en 48 uur. De melkklieren zijn beoordeeld op het ontstekingsbeeld dat ze vertonen en aan de hand van bacteriële groei, influx van neutrofielen en concentratie van cytokines. De bacteriële groei werd vergeleken op basis van het aantal KVE van de drie verschillende CNS stammen zowel na 24 als 48 uur post-imi. De influx van neutrofielen werd eveneens 24 als 48 uur post-imi vergeleken via histologische coupes. De cytokine concentraties zijn bepaald op zowel de melkklier als in het serum via een CBA kit. De problematiek van mastitis met CNS wordt geïllustreerd door de hoge prevalentie in vaarzen en de frequente isolatie van CNS species uit zowel normale als mastitismelk. In de literatuur wordt gesproken over mogelijke negatieve en positieve effecten van een infectie door CNS (Piepers et al., 2010), maar in slechts enkele gevallen wordt de CNS getypeerd, waardoor de rol in de uiergezondheid per soort nog weinig gekarakteriseerd is. CNS mastitis pathogenen zijn een grote diverse groep van kiemen die diverse niches koloniseren, zoals in het tepelkanaal, op en rond de tepel, op de uier en in de omgeving van koeien. S. chromogenes en S. simulans zijn de meest frequent geïsoleerde CNS species en veroorzaken vaak een persisterende IMI (Taponen et al., 2006). S. simulans wordt zowel uit melk van klinische als subklinische mastitis koeien geïsoleerd en kan aangetroffen worden op de tepel van zowel geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde kwartieren, terwijl S. chromogenes niet vaak op de tepel aangetroffen wordt. S. haemolyticus daarentegen is een CNS die vaak van de tepel geïsoleerd wordt (Braem et al., 2013), maar niet geassocieerd is met het veroorzaken van een mastitis (Piessens et al., 2011). Het is niet gekend waarom de ene CNS een sterke stijging in het melkcelgetal veroorzaakt, terwijl een andere CNS in dezelfde niche het melkcelgetal nauwelijks verhoogd. Het gebruik van het muis mastitis model heeft naast de voordelen zoals minder managementproblemen en minder hoge eisen aan de faciliteiten in vergelijking met experimenten op runderen, geiten of schapen ook nadelen. De verschillen tussen de uier van runderen en de melkklieren van muizen zijn aanzienlijk en dit is met name te zien in het verschil van de reactie op S. chromogenes versus S. areus, de positieve controle in dit onderzoek. Bij koeien geïnfecteerd met S. chromogenes werd een piek in de bacteriele groei gezien op 8 uur en een eliminatie van de kiem op 46 uur (Simojoki et al., 2009). Bij muizen vertoont S. chromogenes geen groei en is de kiem na 48 uur nog aanwezig in de melkklier. S. aureus veroorzaakt een acuut klinische mastitis bij muizen via de 38

45 injectie van minder dan 100 KVE per klier binnen de 24 uur post-imi. De resulterende KVE loopt op van 10 8 tot KVE per gram klier. Dezelfde S. aureus stam geeft bij runderen eerder een chronische subklinische infectie dan een klinische infectie. Dit verschil wordt veroorzaakt door de praktisch afwezige residente fagocytaire immuuncellen in de melkklier van muizen (Brouillette, Malouin, 2005). De extrapolatie van resultaten bekomen in onderzoek op muizen naar runderen is hierdoor niet evident. Echter, met het muis mastitis model kan een groter aantal proefdieren gebruikt worden dan bij onderzoek op runderen en zo statistisch relevante data leveren. Een vervolgproef op runderen kan met informatie uit dit experiment veel gerichter zijn, waardoor minder runderen nodig zijn. In dit onderzoek hebben de verschillende CNS stammen een ander effect uitgelokt in de melkklier van de muis in vergelijking met een major mastitis pathogeen, S. aureus. Alle CNS kiemen zijn in staat om neutrofielinflux te veroorzaken bij 10 5 KVE, maar vertonen geen groei noch op 24 noch op 48 uur post- IMI. De kiem geisoleerd uit de omgeving, S. fleurettii, heeft een significant mindere groei na 48 uur dan de twee chromogenes stammen, terwijl er geen verschil is tussen de twee chromogenes stammen. Dit kan verklaard worden door het feit dat S. chromogenes beter aangepast is aan de uier dan S. fleurettii. De influx van neutrofielen is op coupes na een H&E kleuring kwalitatief beoordeeld. Via computer-geassisteerde beeldanalyse software zou het in de toekomst aangewezen zijn om de influx van neutrofielen te kwantificeren (Brouillette, Grondin et al., 2005). Deze telling van het aantal neutrofielen kan een verschil in de snelheid van influx van neutrofielen aantonen, waardoor dit vergeleken kan worden met de inoculum dosis en onderzocht kan worden of er een verband bestaat tussen het aantal KVE geïnjecteerd en de sterkte van de immuunreactie. De cytokines verantwoordelijk voor de influx van neutrofielen in de melkklier zijn IL-1β, IL-6, IL-8 en TNF-α. Mastitits met gram-negatieve kiemen, zoals Escherichia coli, geven een grotere toename van de IL-1β concentratie dan gram-positieve kiemen, zoals S. aureus. Stijging in de IL-6 concentratie is typisch voor S. aureus, terwijl de TNF-α concentratie zal stijgen bij mastitis door gram-negatieve kiemen, zoals coliformen (Alluwaimi, 2004). In het muis mastitis model is er een toename van de expressie van de genen voor dezelfde cytokines na een injectie van lipopolysacchariden (LPS) (Zheng et al., 2006). In dit onderzoek is gekozen om de concentratie van IL-6, IL-1β en TNF-α te bepalen in zowel de melkklier als in het serum. De inoculatie van S. aureus gaf 30 uur post-imi een stijging in IL-6 concentratie in zowel het serum als de melkklier in combinatie met een stijging van IL-1β in de melkklier. Bij de CNS stammen was alleen de concentratie van IL-1β in de melkklier gestegen bij de twee muizen die sterker gereageerd hebben op S. chromogenes ST. Het is mogelijk dat IL-8 verantwoordelijk is voor de influx, aangezien dit een essentieel chemotactisch cytokine is voor de influx van neutrofielen bij acute inflammatie (Harada et al., 1994). De afwezigheid van IL-6, IL-1β en TNF-α toont dat CNS stammen op een andere manier dan gram-positieve stafylokokken, zoals S. aureus, influx van neutrofielen veroorzaakt. De stijging van de concentratie van IL-6 in het serum en de melkklier heeft verband met de sterke temperatuurdaling in de dieren geïnjecteerd met S. aureus op 30 uur post-imi. Deze daling is significant groter dan de temperatuurdaling geïnduceerd door de inoculatie van elk van de drie CNS 39

46 stammen. S. aureus produceert peptidoglycaan en lipoteichoic zuur (LTA), welke ook beide een component zijn van de celwand. Deze twee componenten binden o.a. met Toll-like receptor (TLR) 2, waardoor de daarop volgende signaalcascade de productie van IL-6 stimuleert. Peptidoglycaan produceert hiernaast stikstofmonoxide, waardoor dit in combinatie met IL-6 shock en orgaan falen induceert. Deze shock, in combinatie met het minder actief worden van de muizen, induceert de snelle daling in lichaamstemperatuur (Sei et al., 2011). In muizen geïnjecteerd met elk van de drie CNS stammen is er geen stijging waargenomen van TNF-α en IL-6, waardoor deze muizen hun lichaamstemperatuur wel op peil konden houden. Uit dit onderzoek is te concluderen dat CNS stammen in vivo in het muis mastitis model geen groei vertonen, maar wel voor een influx van neutrofielen zorgen. Verder onderzoek is aangewezen om te identificeren welke cytokines de influx van neutrofielen reguleren. Dit onderzoek is een eerste stap in de richting van het ontrafelen van de pathogenese van coagulasenegatieve stafylokokken, waardoor hopelijk in de toekomst de hoge incidentie van mastitis bij runderen door deze kiem verlaagd kan worden. 40

47 5. Literatuurlijst Adlerova, L., A. Bartoskova and M. Faldyna. (2008). Lactoferrin: a review. Veterinarni Medicina Volume 53, issue 9, Ajitkumar, P., H. W. Barkema, R. N. Zadoks, D. W. Morck, F. J. van der Meer and J. De Buck. (2013). High-resolution melt analysis for species identification of coagulase-negative staphylococci derived from bovine milk. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. Volume 75, Issue 3, Alluwaimi, A. M. (2004). The cytokines of bovine mammary gland: prospects for diagnosis and therapy. Research in Veterinary Science. Volume 77, Issue 3, Athie-Morales, V., G. M. O'Connor and C. M. Gardiner. (2008). Activation of human NK cells by the bacterial pathogen-associated molecular pattern muramyl dipeptide. The Journal of Immunology. Volume 180, Issue 6, Baele, M., P. Baele, M. Vaneechoutte, V. Storms, P. Butaye, L. A. Devriese, G. Verschraegen, M. Gillis and F. Haesebrouck. (2000). Application of trna intergenic spacer PCR for identification of Enterococcus species. Journal of Clinical Microbiology. Volume 38, Issue 11, Barkema, H. W., H. A. Deluyker, Y. H. Schukken and T. J. Lam. (1999). Quarter-milk somatic cell count at calving and at the first six milkings after calving. Preventive Veterinary Medicine. Volume 38, Issue 1, 1-9. Barkema, H. W., Y. H. Schukken, T. J. Lam, M. L. Beiboer, G. Benedictus and A. Brand. (1999). Management practices associated with the incidence rate of clinical mastitis. Journal of Dairy Science. Volume 82, Issue 8, Bouchard, D., V. Peton, S. Almeida, C. Le Marechal, A. Miyoshi, V. Azevedo, N. Berkova, L. Rault, P. Francois, J. Schrenzel, S. Even, D. Hernandez and Y. Le Loir. (2012). Genome sequence of Staphylococcus aureus Newbould 305, a strain associated with mild bovine mastitis. Journal of Bacteriology. Volume 194, Issue 22, Bradley, A. J., J. E. Breen, B. Payne and M. J. Green. (2011). A comparison of broad-spectrum and narrow-spectrum dry cow therapy used alone and in combination with a teat sealant. Journal of Dairy Science. Volume 94, Issue 2, Braem, G. (2012). Prevalence of Coagulase-Negative Staphylococci on the teat skin of cows in Flemish dairy herds. Doctoraatsthesis Vrije Universiteit Brussel. Braem, G., S. De Vliegher, B. Verbist, V. Piessens, E. Van Coillie, L. De Vuyst and F. Leroy. (2013). Unraveling the microbiota of teat apices of clinically healthy lactating dairy cows, with special emphasis on coagulase-negative staphylococci. Journal of Dairy Science. Volume 96, Issue 3, Brandt, M., A. Haeussermann and E. Hartung. (2010). Invited review: technical solutions for analysis of milk constituents and abnormal milk. Journal of Dairy Science. Volume 93, Issue 2, Breen, J. E., M. J. Green and A. J. Bradley. (2009). Quarter and cow risk factors associated with the occurrence of clinical mastitis in dairy cows in the United Kingdom. Journal of Dairy Science. Volume 92, Issue 6, Brouillette, E., G. Grondin, B. G. Talbot and F. Malouin. (2005). Inflammatory cell infiltration as an indicator of Staphylococcus aureus infection and therapeutic efficacy in experimental mouse mastitis. Veterinary Immunology and Immunopathology. Volume 104, Issue 3-4,

48 Brouillette, E. and F. Malouin. (2005). The pathogenesis and control of Staphylococcus aureusinduced mastitis: study models in the mouse. Microbes and Infection. Volume 7, Issue 3, Capuco, A. V., S. E. Ellis, S. A. Hale, E. Long, R. A. Erdman, X. Zhao and M. J. Paape. (2003). Lactation persistency: insights from mammary cell proliferation studies. Journal of Animal Science. Volume 81, Issue 3, Chaneton, L., M. Bonta, M. Pol, L. Tirante and L. E. Bussmann. (2013). Milk lactoferrin in heifers: influence of health status and stage of lactation. Journal of Dairy Science. Volume 96, Issue 8, Christensen, G. D., W. A. Simpson, J. J. Younger, L. M. Baddour, F. F. Barrett, D. M. Melton and E. H. Beachey. (1985). Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. Journal of Clinical Microbiology. Volume 22, Issue 6, De Vliegher, S., L. K. Fox, S. Piepers, S. McDougall and H. W. Barkema. (2012). Invited review: Mastitis in dairy heifers: nature of the disease, potential impact, prevention, and control. Journal of Dairy Science. Volume 95, Issue 3, De Vliegher, S., H. Laevens, H. W. Barkema, I. R. Dohoo, H. Stryhn, G. Opsomer and A. de Kruif. (2004). Management practices and heifer characteristics associated with early lactation somatic cell count of Belgian dairy heifers. Journal of Dairy Science. Volume 87, Issue 4, Dirksen, G. U., H. G. Liebich and E. Mayer. (1985). Adaptive changes of the ruminal mucosa and their functional and clinical significance. The Bovine Practicioner. Volume 20, Expósito, I. L. and I. Recio. (2006). Antibacterial activity of peptides and folding variants from milk proteins. International Dairy Journal. Volume 16, Fox, L. K. (2009). Prevalence, incidence and risk factors of heifer mastitis. Veterinary Microbiology. Volume 134, Issue 1-2, Hajek, V., L. A. Devriese, M. Mordarski, M. Goodfellow, G. Pulverer and P. E. Varaldo. (1986). Elevation of Staphylococcus hyicus subsp. chromogenes (Devriese et ai., 1978) to Species Status: Staphylococcus chromogenes (Devriese et ai., 1978) comb. nov. Systematic and Applied Microbiology. Issue 8, Harada, A., N. Sekido, T. Akahoshi, T. Wada, N. Mukaida and K. Matsushima. (1994). Essential involvement of interleukin-8 (IL-8) in acute inflammation. Journal of Leukocyte Biology. Volume 56, Issue 5, Holt, J. G. and W. R. Hensyl. (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ninth edition. Ibrahim, H. R., T. Matsuzaki and T. Aoki. (2001). Genetic evidence that antibacterial activity of lysozyme is independent of its catalytic function. FEBS Letters. Volume 506, Issue 1, Kahn, C. M. and S. Line. (2010). The Merck Veterinary Manual. Kloos, W. E. and K. H. Schleifer. (1975). Isolation and Characterization of Staphylococci from Human Skin. Journal of Systematic Bacteriology. Volume 25, Issue 1, Kromker, V. and J. Friedrich. (2009). Teat canal closure in non-lactating heifers and its association with udder health in the consecutive lactation. Veterinary Microbiology. Volume 134, Issue 1-2,

49 LeBlanc, S. J., T. F. Duffield, K. E. Leslie, K. G. Bateman, J. TenHag, J. S. Walton and W. H. Johnson. (2002). The effect of prepartum injection of vitamin E on health in transition dairy cows. Journal of Dairy Science. Volume 85, Issue 6, Longo, D., A. Fauci, D. Kasper, S. Hauser and J. Jameson. (2011). Harrison's Principles of Internal Medicine. Moroni, P., G. Pisoni, M. Antonini, G. Ruffo, S. Carli, G. Varisco and P. Boettcher. (2005). Subclinical mastitis and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus caprae and Staphylococcus epidermidis isolated from two Italian goat herds. Journal of Dairy Science. Volume 88, Issue 5, Notebaert, S. and E. Meyer. (2006). Mouse models to study the pathogenesis and control of bovine mastitis. A review. Veterinary Quarterly. Volume 28, Issue 1, Nyman, A. K., U. Emanuelson, A. H. Gustafsson and K. Persson Waller. (2009). Management practices associated with udder health of first-parity dairy cows in early lactation. Preventive Veterinary Medicine. Volume 88, Issue 2, Opal, S. M. and V. A. DePalo. (2000). Anti-inflammatory cytokines. Chest. Volume 117, Issue 4, Oviedo-Boyso, J., J. J. Valdez-Alarcon, M. Cajero-Juarez, A. Ochoa-Zarzosa, J. E. Lopez-Meza, A. Bravo-Patino and V. M. Baizabal-Aguirre. (2007). Innate immune response of bovine mammary gland to pathogenic bacteria responsible for mastitis. Journal of Infection. Volume 54, Issue 4, Pellegrini, A., U. Thomas, N. Bramaz, P. Hunziker and R. von Fellenberg. (1999). Isolation and identification of three bactericidal domains in the bovine alpha-lactalbumin molecule. Biochimica et Biphysica Acta. Volume 1426, Issue 3, Pieper, J., M. Hoedemaker and V. Kromker. (2013). Significance of the dry period for the development and prevention of new infections of the bovine mammary gland. Tierárztliche Praxis, Ausgabe G, Grosstiere/Nutztiere. Volume 41, Issue 5, ; quiz 325. Piepers, S., S. De Vliegher, A. de Kruif, G. Opsomer and H. W. Barkema. (2009). Impact of intramammary infections in dairy heifers on future udder health, milk production, and culling. Veterinary Microbiology. Volume 134, Issue 1-2, Piepers, S., G. Opsomer, H. W. Barkema, A. de Kruif and S. De Vliegher. (2010). Heifers infected with coagulase-negative staphylococci in early lactation have fewer cases of clinical mastitis and higher milk production in their first lactation than noninfected heifers. Journal of Dairy Science. Volume 93, Issue 5, Piessens, V., E. Van Coillie, B. Verbist, K. Supre, G. Braem, A. Van Nuffel, L. De Vuyst, M. Heyndrickx and S. De Vliegher. (2011). Distribution of coagulase-negative Staphylococcus species from milk and environment of dairy cows differs between herds. Journal of Dairy Science. Volume 94, Issue 6, Plozza, K., J. J. Lievaart, G. Potts and H. W. Barkema. (2011). Subclinical mastitis and associated risk factors on dairy farms in New South Wales. Australian Veterinary Journal. Volume 89, Issue 1-2, Politis, I. (2012). Reevaluation of vitamin E supplementation of dairy cows: bioavailability, animal health and milk quality. Animal. Volume 6, Issue 9, Pyorala, S. and S. Taponen. (2009). Coagulase-negative staphylococci-emerging mastitis pathogens. Veterinary Microbiology. Volume 134, Issue 1-2,

50 Rainard, P. and C. Riollet. (2003). Mobilization of neutrophils and defense of the bovine mammary gland. Reprod Nutr Dev 43(5): Reksen, O., Y. T. Grohn, J. W. Barlow and Y. H. Schukken. (2012). Transmission dynamics of intramammary infections with coagulase-negative staphylococci. Journal of Dairy Science. Volume 95, Issue 9, Reyher, K. K., I. R. Dohoo, D. T. Scholl and G. P. Keefe. (2012). Evaluation of minor pathogen intramammary infection, susceptibility parameters, and somatic cell counts on the development of new intramammary infections with major mastitis pathogens. Journal of Dairy Science. Volume 95, Issue 7, Riollet, C., P. Rainard and B. Poutrel. (2000). Cells and cytokines in inflammatory secretions of bovine mammary gland. Advances in Experimental Medicine and Biology. Volume 480, Ryan, K. J., C. G. Ray and J. C. Sherris. (2010). Sherris medical microbiology. Santman-Berends, I. M., R. G. Olde Riekerink, O. C. Sampimon, G. van Schaik and T. J. Lam. (2012). Incidence of subclinical mastitis in Dutch dairy heifers in the first 100 days in lactation and associated risk factors. Journal of Dairy Science. Volume 95, Issue 5, Schukken, Y. H., J. Gunther, J. Fitzpatrick, M. C. Fontaine, L. Goetze, O. Holst, J. Leigh, W. Petzl, H. J. Schuberth, A. Sipka, D. G. Smith, R. Quesnell, J. Watts, R. Yancey, H. Zerbe, A. Gurjar, R. N. Zadoks, H. M. Seyfert and c. members of the Pfizer mastitis research. (2011). Host-response patterns of intramammary infections in dairy cows. Veterinary Immunology and Immunopathology. Volume 144, Issue 3-4, Sei, C., T. Chanturiya, J. J. Mond and J. F. Kokai-kun. (2011). Lysostaphin Reduces the Production of Inflammatory Cytokines in Staphylococcus aureus Challenged Mice, and Prevents Systemic Shock. The Open Antimicrobial Agents Journal. Volume 3, Simojoki, H., T. Orro, S. Taponen and S. Pyorala, (2009). Host response in bovine mastitis experimentally induced with Staphylococcus chromogenes. Veterinary Microbiology. Volume 134, Issue 1-2, Sordillo, L. M. (2005). Factors affecting mammary gland immunity and mastitis susceptibility. Livestock Production Science. Volume 98, Stelwagen, K., E. Carpenter, B. Haigh, A. Hodgkinson and T. T. Wheeler. (2009). Immune components of bovine colostrum and milk. Journal of Animal Science. Volume 87, Issue 13, 3-9. Supre, K., S. De Vliegher, O. C. Sampimon, R. N. Zadoks, M. Vaneechoutte, M. Baele, E. De Graef, S. Piepers and F. Haesebrouck. (2009). Technical note: use of transfer RNA-intergenic spacer PCR combined with capillary electrophoresis to identify coagulase-negative Staphylococcus species originating from bovine milk and teat apices. Journal of Dairy Science. Volume 92, Issue 7, Supre, K., F. Haesebrouck, R. N. Zadoks, M. Vaneechoutte, S. Piepers and S. De Vliegher. (2011). Some coagulase-negative Staphylococcus species affect udder health more than others. Journal of Dairy Science. Volume 94, Issue 5, Taponen, S. and S. Pyorala (2009). Coagulase-negative staphylococci as cause of bovine mastitisnot so different from Staphylococcus aureus? Veterinary Microbiology. Volume 134, Issue 1-2, Taponen, S., H. Simojoki, M. Haveri, H. D. Larsen and S. Pyorala. (2006). Clinical characteristics and persistence of bovine mastitis caused by different species of coagulase-negative staphylococci identified with API or AFLP. Veterinary Microbiology. Volume 115, Issue 1-3,

51 Van loo, H., S. De Vliegher, S. Piepers, P. Paschyn, A. De Kruif and G. Opsomer. (2007). Mastitis bij melkvee veroorzaakt door coliformen, met nadruk op Klebsiella spp. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. Volume 76, Issue 4, Vanholder, T. and M. Melchior. (2012). Mastitis bij melkkoeien. Diergeneeskundig Memorandium. Volume 59, Issue 01, Vernozy-Rozand, C., C. Mazuy, H. Meugnier, M. Bes, Y. Lasne, F. Fiedler, J. Etienne and J. Freney. (2000). Staphylococcus fleurettii sp. nov., isolated from goat's milk cheeses. International Journal of Systematic and Evolutionairy Microbiology. Volume 50, Issue 4, Vos, P., G. Garrity, D. Jones, N. R. Krieg, W. Ludwig, F. A. Rainey, K. H. Schleifer and W. B. Whitman. (2009). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 3. Waage, S., T. Mork, A. Roros, D. Aasland, A. Hunshamar and S. A. Odegaard. (1999). Bacteria associated with clinical mastitis in dairy heifers. Journal of Dairy Science. Volume 82, Issue 4, Waage, S., S. A. Odegaard, A. Lund, S. Brattgjerd and T. Rothe. (2001). Case-control study of risk factors for clinical mastitis in postpartum dairy heifers. Journal of Dairy Science. Volume 84, Issue 2, Waage, S., H. R. Skei, J. Rise, T. Rogdo, S. Sviland and S. A. Odegaard. (2000). Outcome of clinical mastitis in dairy heifers assessed by reexamination of cases one month after treatment. Journal of Dairy Science. Volume 83, Issue 1, Wellnitz, O. and R. M. Bruckmaier. (2012). The innate immune response of the bovine mammary gland to bacterial infection. The Veterinary Journal. Volume 192, Issue 2, Zadoks, R. N. and Y. H. Schukken. (2006). Use of molecular epidemiology in veterinary practice. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. Volume 22, Issue 1, Zhang, S., H. Zhang and J. Zhao. (2009). The role of CD4 T cell help for CD8 CTL activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. Volume 384, Issue 4, Zheng, J., A. D. Watson and D. E. Kerr. (2006). Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model. Infection and Immunity. Volume 74, Issue 3,

52 6. Bijlagen 6.1 Kolonie vormende eenheden Tabel 6. De KVE en het gewicht van de klier per groep muizen voor de vergelijking van verschillende hoeveelheden KVE van S. chromogenes IM. Muis Klier Mg klier KVE/g klier Log (KVE/g klier) PBS, muis 1 H2 L , PBS, muis 2 H3 R , PBS + GLYC, muis 3 H5 R , H6 L , NB 10 2, muis 1 H8 L ,6 NB 10 2, muis 2 H9 R ,42*10 8 8,4 NB 10 2, muis 3 H11 R ,96*10 8 8,3 H12 L *10 8 8,3 S. CHR 10 2, muis 1 H31 R ,289 2,5 H32 L ,256 2,3 S. CHR 10 2, muis 2 H33 R ,455 3,8 H34 L ,002 3,6 S. CHR 10 2, muis 3 H35 R ,1449 2,1 H36 L ,309 2,5 S. CHR 10 3, muis 1 H13 R ,941 3,1 H14 L ,4532 2,7 S. CHR 10 3, muis 2 H15 R ,721 3,3 H16 L ,6083 2,8 S. CHR 10 3, muis 3 H17 R ,177 3,1 H18 L ,707 3,3 S. CHR 10 4, muis 1 H19 R ,34 4,5 H20 L ,22 4,7 S. CHR 10 4, muis 2 H21 R ,03 3,6 H22 L ,1628 2,6 S. CHR 10 4, muis 3 H23 R ,5 4,7 H24 L ,58 4,5 S. CHR 10 5, muis 1 H26 L ,851 3,5 S. CHR 10 5, muis 2 H27 R ,9 5,6 S. CHR 10 5, muis 3 H29 R ,9091 2,7 H30 L ,899 2,3 PBS = Fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, GLYC = Glycerol, NB = S. aureus Newbould 305, S. CHR = Staphylococcus chromogenes IM, L4 = Linker 4 de melkklier, R4 = Rechter 4 de melkklier, 46

53 Tabel 7. De KVE en het gewicht van de klier per groep muizen voor de vergelijking van de drie verschillende CSN stammen, S. chromogenes IM, S. chromogenes ST en S. fleurettii, met S. aureus Newbould 305. Het tijdstip geeft aan hoeveel uur na de inoculatie de muis opgeofferd is. Muis Tijdstip Klier Mg klier KVE/g klier Log (KVE/g klier) NB 10 2, muis 1 30u H25 R4 548* 1,46*10 9 9, u H26 L ,67*10 9 9, NB 10 2, muis 2 30u H29 R ,16*10 9 9, u H30 L ,63*10 8 8, NB 10 2, muis 3 30u H33 R ,4*10 9 9, u H34 L ,72*10 9 9, S. CHR 10 5, muis 1 30u H37 R4 677* ,3 5, u H38 L ,2 5, S. CHR 10 5, muis 2 30u H41 R , u H42 L4 766* , S. CHR 10 5, muis 3 30u H45 R ,2*10 9 9, u H46 L ,06*10 8 8, S. CHR 10 5, muis 4 48u H49 R ,8 5, u H50 L , S. CHR 10 5, muis 5 48u H53 R4 262* ,5 5, u H54 L ,9 5, S. CHR 10 5, muis 6 48u H57 R , u H58 L ,44*10 9 9, ST 10 5, muis 1 30u H61 R4 309* , u H62 L ,7 5, ST 10 5, muis 2 30u H65 R ,6 3, u H66 L ,57108 ST 10 5, muis 3 30u H69 R ,1*10 9 9, u H70 L ,97*10 9 9, ST 10 5, muis 4 48u H73 R , u H74 L , ST 10 5, muis 5 48u H77 R ,79*10 9 9, u H78 L4 848* 3,18*10 9 9, ST 10 5, muis 6 48u H81 R4 365* , u H82 L ,59176 S. fleur 10 5, muis 1 30u H85 R ,9 5, u H86 L4 389* ,4 5,75738 S. fleur 10 5, muis 2 30u H89 R ,1 4, u H90 L ,7 4, S. fleur 10 5, muis 3 30u H93 R ,7 3, u H94 L ,9 3, S. fleur 10 5, muis 4 48u H97 R ,2 5, u H98 L4 273* ,9 5, S. fleur 10 5, muis 5 48u H101 R ,1 3, u H102 L ,6 4,

54 6.2 Lysaten Tabel 7. Vervolg Muis Tijdstip Klier Mg klier KVE/g klier Log (KVE/g klier) S. fleur 10 5, muis 6 48u H105 R ,4 3, u H106 L ,2 3, NB = S. aureus Newbould 305, S. CHR = Staphylococcus chromogenes IM, ST = Staphylococcus. chromogenes ST, S. fleur = Staphylococcus fleurettii, L4 = Linker 4 de melkklier, R4 = Rechter 4 de melkklier, * = de helft van de klier is gebruikt voor het maken van een histologische coupe. Tabel 8. Spectrofotometrische bepaling van de eiwitconcentraties van de lysaten voor de vergelijking van verschillende hoeveelheden KVE van S. chromogenes IM. Groep en nummer Klier ABS # µg/µl 5 µg # µl lysebuffer PBS, muis 1 H1 R4 0,744 17,35 3,47 49 PBS, muis 2 H3 R4 0,643 14,89 2,98 39,5 PBS + GLYC, muis 3 H5 R4 0,789 18,44 3,69 53,5 H6 L4 0,697 16,21 3,24 44,5 NB 10 2, muis 1 H8 L4 0,792 18,52 3,7 54 NB 10 2, muis 2 H9 R4 0,623 14,41 2,88 37,5 NB 10 2, muis 3 H11 R4 0,416 9,38 1,88 17,5 H12 L4 0,509 11,64 2,33 26,5 S CHR 10 2, muis 2 H33 R4 0,52 11,9 2,38 27,5 H34 L4 0,607 14,02 2,8 36 S CHR 10 3, muis 1 H13 R4 0,584 13,46 2,69 33,5 H14 L4 0,635 14,7 2,94 38,5 S CHR 10 3, muis 2 H15 R4 0,71 16,52 3,3 46 H16 L4 0,76 17,74 3,55 50,5 S CHR 10 3, muis 3 H17 R4 0,634 14,68 2,94 38,5 H18 L4 0,622 14,38 2,88 37,5 S CHR 10 4, muis 1 H19 R4 0,722 16,82 3,36 47 H20 L4 0,711 16,55 3,31 46 S CHR 10 4, muis 2 H21 R4 0,711 16,55 3,31 46 H22 L4 0,722 16,82 3,36 47 S CHR 10 4, muis 3 H23 R4 0,579 13,34 2,67 33 H24 L4 0,55 12,63 2,53 30,5 S CHR 10 5, muis 1 H26 L4 0,527 12,07 2,41 28 S CHR 10 5, muis 2 H27 R4 0,62 14,34 2,87 37 S CHR 10 5, muis 3 H29 R4 0,369 8,23 1,65 12,5 H30 L4 0,66 15,31 3,06 41 PBS = Fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, NB = S. aureus Newbould 305, S CHR = S. chromogenes, ABS = De absorptie van het staal bij 595nm spectrofotometrie, #µg/µl = Het aantal µg eiwit/µl van de lysaten per groep, 5µg = Het aantal µl staal voor 5µg eiwit, #µl lysebuffer = Het aantal µl lysebuffer dat bij 20µl staal gevoegd moet worden om de standaardconcentratie van 5µg/µl te krijgen, R4 = rechter 4de melkklier, L4 = Linker 4de melkklier, 48

55 Tabel 9. Spectrofotometrische bepaling van de eiwitconcentraties van de lysaten van de klieren voor de vergelijking van de drie CNS stammen, S. chromogenes IM, S. chromogenes ST en S. fleurettii, met S. aureus Newbould 305. Groep en nummer Tijdstip Klier ABS # µl lysebuffer S. CHR 10 5, muis 1 30u R4 L37 0,657 40,5 30u L4 L38 0, u R5 L39 0,366 12,5 30u L5 L40 0,416 17,5 S. CHR 10 5, muis 2 30u R4 L41 0, u L4 L42 0,768 51,5 30u R5 L43 0,493 24,5 30u L5 L44 0, S. CHR 10 5, muis 3 30u R4 L45 0, u L4 L46 0,537 78,5 30u R5 L47 0,368 12,5 S. CHR 10 5, muis 4 48u R4 L49 0,787 53,5 48u L4 L50 0, u R5 L51 0,593 34,5 48u L5 L52 0,982 72,5 S. CHR 10 5, muis 5 48u R4 L53 0,604 91,5 48u L4 L54 0,748 49,5 48u R5 L55 0,375 13,5 48u L5 L56 0,47 22,5 S. CHR 10 5, muis 6 48u R4 L57 0,769 51,5 48u L4 L58 0,52 27,5 48u R5 L59 0, u L5 L60 0,488 24,5 ST 10 5, muis 1 30u R4 L61 0, u L4 L62 0, u R5 L63 0, u L5 L64 0,589 88,5 ST 10 5, muis 2 30u R4 L65 0, u L4 L66 0,728 47,5 30u R5 L67 0,554 30,5 ST 10 5, muis 3 30u R4 L69 0,325 8,5 30u L4 L70 0, u R5 L71 0,565 31,5 30u L5 L72 0, ST 10 5, muis 4 48u R4 L73 0, u L4 L74 0, u R5 L75 0,

56 Tabel 9. Vervolg Groep en nummer Tijdstip Klier ABS # µl lysebuffer ST 10 5, muis 5 48u R4 L77 0,489 24,5 48u L4 L78 0, u R5 L79 0, u L5 L80 0,499 25,5 ST 10 5, muis 6 48u R4 L81 0, u L4 L82 0, u R5 L83 0, u L5 L84 0, S. fleur 10 5, muis 1 30u R4 L85 0, u L4 L86 0, u R5 L87 0,478 23,5 30u L5 L88 0, S. fleur 10 5, muis 2 30u R4 L89 0,561 31,5 30u L4 L90 0,478 23,5 30u R5 L91 0, u L5 L92 0,739 48,5 S. fleur 10 5, muis 3 30u R4 L93 0,581 33,5 30u L4 L94 0,624 37,5 30u L5 L96 0,51 26,5 S. fleur 10 5, muis 4 48u R4 L97 0,653 40,5 48u L4 L98 0, ,5 48u L5 L100 0,75 49,5 S. fleur 10 5, muis 5 48u R4 L101 0,624 37,5 48u L4 L102 0,601 90,5 48u R5 L103 0, u L5 L104 0,624 37,5 S. fleur 10 5, muis 6 48u R4 L105 0, u L4 L106 0,45 61,5 48u R5 L107 0, u L5 L108 0, S. CHR = Staphylococcus chromogenes IM, ST = Staphylococcus. chromogenes ST, S. fleur = Staphylococcus fleurettii, ABS = De absorptie van het staal bij 595nm spectrofotometrie, #µg/µl = Het aantal µg eiwit/µl van de lysaten per groep, 5µg = Het aantal µl staal voor 5µg eiwit, #µl lysebuffer = Het aantal µl lysebuffer dat bij 20µl staal gevoegd moet worden om de standaardconcentratie van 5µg/µl te krijgen, L4 = Linker 4 de melkklier, R4 = Rechter 4 de melkklier 50

57 6.3 Histologische coupes De originele beelden van de histologische coupes waaruit stukken in de resultaten weergegeven zijn op dezelfde volgorde als in de resultaten. Figuur 29. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met PBS gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De coupe is genomen nabij de tepel. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. Figuur 30. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met PBS gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De coupe is genomen nabij de lymfeknoop. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. 51

58 Figuur 31. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met PBS gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De coupe is genomen nabij de rug. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. Figuur 32. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305 gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De coupe is genomen nabij de tepel. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. 52

59 Figuur 33. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305 gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De coupe is genomen nabij de lymfeknoop. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. Figuur 34. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 2 KVE S. aureus Newbould 305 gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De coupe is genomen nabij de rug. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. 53

60 Figuur 35. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met PBS gekleurd met H&E 48 uur na de injectie. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. Figuur 36. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes IM gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De coupe is genomen nabij de tepel. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. 54

61 Figuur 37. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes IM gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De coupe is genomen nabij de lymfeknoop. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. Figuur 38. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes IM gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De coupe is genomen nabij de rug. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. 55

62 Figuur 39. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes IM gekleurd met H&E 48 uur na de injectie. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. Figuur 40. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier afkomstig van 1 van de 4 muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes ST die minder sterk gereageerd hebben gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. 56

63 Figuur 41. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier afkomstig van 1 van de 2 muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S. chromogenes ST die sterker gereageerd hebben gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. Figuur 42. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier afkomstig van 1 van de 4 muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S.chromogenes ST die minder sterk gereageerd hebben gekleurd met H&E 48 uur na de injectie. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. 57

64 Figuur 43. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier afkomstig van 1 van de 2 muizen geïnjecteerd met 10 5 KVE S.chromogenes ST die sterker gereageerd hebben gekleurd met H&E 48 uur na de injectie. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. Figuur 44. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 5 KVE S. fleurettii gekleurd met H&E 24 uur na de injectie. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. 58

65 Figuur 45. Beeld van een histologische coupe van een muriene melkklier geïnjecteerd met 10 5 KVE S. fleurettii gekleurd met H&E 48 uur na de injectie. De lengte van de streep komt overeen met 200µm. 59