Inhibitie van von Willebrand Factor binding aan collageen als antitrombotische. Laboratorium voor Trombose Onderzoek, IRC, KU Leuven Campus Kortrijk

Transcriptie

1 Inhibitie van von Willebrand Factor binding aan collageen als antitrombotische strategie Karen Vanhoorelbeke en Hans Deckmyn Laboratorium voor Trombose Onderzoek, IRC, KU Leuven Campus Kortrijk Correspondentie : Prof. Dr. Hans Deckmyn Laboratorium voor Trombose Onderzoek IRC KU Leuven Campus Kortrijk E. Sabbelaan Kortrijk tel 056/ fax 056/ Hans.Deckmyn@kulak.ac.be 1

2 Trefwoorden : von Willebrand factor, collageen, antitrombotisch, bloedingstijd Samenvatting Het stoppen van een bloeding bij verwonding en het optreden van een trombose, wat o.a. hartinfarcten veroorzaakt, zijn twee uitingen van eenzelfde proces: bij bloedingen moet het lek in een beschadigd bloedvat gedicht worden door een bloedstolsel, bij een trombose wordt een analoog stolsel gevormd in een bloedvat beschadigd bijvoorbeeld door aderverkalking. Als een vervolg op deze redenering kan verwacht worden dat fouten in de bloedstolling die een bloedingsziekte veroorzaken, meteen ook een lager risico op trombose met zich meebrengen. Patiënten met de ziekte van von Willebrand hebben een bloedingsprobleem te wijten aan een slecht functionerende von Willebrand factor. Von Willebrand Factor is een eiwit dat vooral in slagaders een belangrijke rol speelt in de bloedstolling waar het een brug slaat tussen het beschadigde bloedvat en de bloedplaatjes. Wanneer daarna in een tweede stap genoeg bloedplaatjes aan elkaar vasthechten wordt een prop of trombus gevormd. Binnen het Laboratorium voor Trombose Onderzoek aan de KULAK hebben we een antilichaam gemaakt tegen von Willebrand factor (VWF) dat de binding van VWF aan de vaatwand verstoort en dus tot op zekere hoogte bepaalde vormen van de ziekte kan nabootsen. In dit artikel wordt beschreven hoe dit antilichaam werkt en hoe we hierdoor meteen beter begrijpen hoe VWF aan de vaatwand bindt. Daarnaast werd in een internationale samenwerking met Zuid-Afrika dit antilichaam uitgetest in een arterieel trombosemodel in bavianen. Vastgesteld werd dat het toedienen van het antilichaam inderdaad sterk anti-trombotisch werkt en dat dit bovendien kon zonder een toestand te creëren waarbij de dieren gingen bloeden. 2

3 Meteen werd een nieuwe manier ontdekt waarlangs trombosevorming kan worden voorkomen, en wellicht met minder risico op bloedingen dan de huidige beschikbare producten. Hiermee werd bijgevolg de weg geopend voor de ontwikkeling van een nieuwe klasse van antitrombotica bruikbaar voor het voorkomen van slagadertrombi medeoorzaak van hartinfarcten. 3

4 Inleiding Recent werd er belangrijke vooruitgang geboekt in het begrijpen van het pathogenetische proces dat leidt tot trombose en in de ontwikkeling van nieuwe en betere therapeutische strategieën om deze te voorkomen. Nochtans blijven tot nu toe de atherotrombotische accidenten nog steeds de grootste doodsoorzaak in onze westerse wereld en bijgevolg is het zoeken naar nieuwe antitrombotica voor snelle tussenkomst bij noodsituaties en als veilige profylactica nog steeds van het hoogste belang. Het breken van een atherosclerotische plaque resulteert in het blootstellen van trombogene subendotheliale bestanddelen zoals collageen, waarop het plasma eiwit von Willebrand Factor (VWF) wordt geïmmobiliseerd via zijn A3-domein (Figuur 1). Collageengebonden VWF wordt in slagaders onderworpen aan hoge schuifspanningen veroorzaakt door het snelstromende bloed. Hierdoor ondergaat VWF een conformatieverandering waarbij zijn A1-domeinbindingsplaats voor de VWF-receptor op de bloedplaatjes, het glycoproteïne (GP)Ib, vrijkomt (Figuur 1). Door deze reversiebele interactie gaan bloedplaatjes rollen over het subendothelium, waardoor ze vertragen, wat dan uiteindelijk een irreversiebele plaatjesadhesie toelaat door tussenkomst van hun directe collageenreceptoren GPVI en integrine 2 1 en van het geactiveerde integrine IIb 3 (of GPIIb/IIIa) dat eveneens collageen-gebonden VWF bindt (1) (Figuur 1). Door deze interacties worden de bloedplaatjes verder geactiveerd waarbij ze, onder andere, tromboxaan A 2 en adenosine difosfaat (ADP) vrijzetten, wat dan weer andere bloedplaatjes activeert (Figuur 1). Tijdens dit proces ondergaat ook het integrine IIb 3 een conformatieverandering waardoor zijn affiniteit voor fibrinogeen heel sterk toeneemt. Daar fibrinogeen een symmetrisch molecule is, kan het bloedplaatjes met elkaar doen aggregeren door brugvorming tussen IIb 3-moleculen op 4

5 verschillende plaatjes (Figuur 1). Deze aggregaatvorming gaat gepaard met verdere activatie en resulteert dus in een zelfversterkend mechanisme dat kan ontsporen tot vorming van een occlusieve trombus wanneer de controle niet adequaat gebeurt (2). De momenteel meest gebruikte antiplaatjesmiddelen werken in op hetzij de vorming van tromboxaan A 2, zoals aspirine (3), of op de interactie tussen ADP en zijn receptor, zoals clopidogrel (4, 5) (Figuur 1). Daar deze stappen amplificatiestappen zijn, die weliswaar helpen maar niet absoluut nodig zijn voor de aggregatie, is het duidelijk dat het klinisch antitrombotisch effect van deze producten niet absoluut is. Een meer recente groep van antiplaatjesmiddelen zijn de inhibitoren van het integrine IIb 3 of GPIIb/IIIa antagonisten, zoals Reopro, Aggrastat of Integriline (6, 7) (Figuur 1). Daar deze inwerken op de binding van fibrinogeen aan IIb 3, en dit een niet-redundante stap is, absoluut nodig voor de aggregatie, is het evident dat dit soort producten een heel sterke antiplaatjeswerking heeft, waardoor de balans echter snel dreigt door te slaan en er bloedingsproblemen kunnen optreden. Dat de orale IIb 3 antagonisten dan weer compleet ontgoochelden in de chronische preventie is een ander verhaal dat ons hier te ver zou leiden. Maar mee hierdoor is er vrij recent een versterkte interesse gegroeid voor het eventuele nut van antiplaatjesmiddelen die interferen met de collageen-vwf-gpib interactie (Figuur 1), daar dit een aantal voordelen zou kunnen hebben in vergelijking met de antiplaatjesmiddelen die momenteel gebruikt worden (8, 9): 1. Daar de collageen-vwf-gpib interactie eveneens niet redundant is en dus absoluut nodig is om een trombose te kunnen vormen onder hoge schuifspanningsvoorwaarden, mag verwacht worden dat inhibitie hiervan evenzeer een vrij sterk effect zal hebben. 2. Daar de interactie bovendien enkel belangrijk is bij hoge schuifspanningen, wordt verwacht dat inhibitie een exclusief arterieel effect zal hebben, en niet, of veel minder, zal inwerken aan 5

6 de veneuze kant. Dit specifiek arterieel effect zou zich kunnen vertalen in minder bloedingsproblemen. 3. Daar de inhibitie van bloedplaatjesadhesie inwerkt op de initiële stap waardoor verdere plaatjesactivatie en vrijzetting van secretiestoffen waaronder ook groeifactoren zoals platelet derived growth factor wordt voorkomen, zouden dergelijke inhibitoren dus niet alleen de acute complicaties van plaquebreuk kunnen reduceren, maar misschien ook een lange termijn effect hebben door de progressie van atherosclerotische letsels of het proces van (re)stenose te vertragen. 6

7 De ontwikkeling van het monoklonaal antilichaam 82D6A3 dat interfereert met de interactie tussen collageen en von Willebrand factor als nieuw antitrombotisch agens In vitro karakterisatie van mal 82D6A3 Inhiberende eigenschappen van mal 82D6A3 mal 82D6A3 werd bekomen na immunisatie van muizen met opgezuiverd humaan VWF. Het IgG en de Fab fragmenten inhiberen de binding van opgezuiverd humaan VWF aan humaan collageen type I in een specifieke en dosis afhankelijke manier met een IC 50 (de concentratie waarbij 50% inhibitie waargenomen wordt) van 20 ng/ml en 1 µg/ml respektievelijk. Dat mal 82D6A3 het A3-domein in VWF herkent, bleek uit de vinding dat het het individueel A3-domein van VWF herkent en dat het niet reageert met het VWF waaruit het A3-domein gedeleteerd werd ( A3-VWF). De conformatie van VWF is belangrijk voor herkenning door mal 82D6A3 daar het mal gedenatureerd VWF herkent maar niet wanneer het en gereduceerd en gedenatureerd is. mal 82D6A3 inhibeert eveneens de bloedplaatjesadhesie onder condities van hoge schuifspanning (shear rate) zoals waargenomen in de arteries en dit bij verschillende schuifspanningen. Bij een schuifspanning van 2600 s -1 inhibeert 82D6A3 de bloedplaatjesadhesie volledig bij een concentratie van 2.3 µg/ml. Dit effect is bovendien shear afhankelijk wat in overeenstemming is met VWF afhankelijkheid van de reactie (10). Epitoop bepaling van mal 82D6A3 7

8 Daar uit vorige studies bleek dat mal 82D6A3 het A3-domein in VWF herkent, werd vervolgens gezocht naar de precieze bindingsplaats (epitoop) van dit mal in het A3-domein. Hiervoor werd gebruik gemaakt van de phage display technologie, van constructie en analyse van VWF mutanten en van peptide modelering om dit epitoop op te helderen (10). Uit deze studie kon afgeleid worden dat een belangrijk deel van het epitoop van mal 82D6A3 bestaat uit de aminozuren serine (S), proline (P), tryptofaan (W) en arginine (R), welke in de drie dimensionele structuur van het A3-domein dicht in elkaars buurt liggen (Figuur 2). De structuur van een cyclisch 6-meer peptide (CMTSPWRC) dat deze sequentie bevat werd gemodeleerd en via computeranalyse kon aangetoond worden dat dergelijke peptide inderdaad de structuur van de SPWR sequentie in het A3-domein aanneemt en dat deze sequentie dus het epitoop van mal 82D6A3 in het A3-domein van VWF uitmaakt (10). In vivo karakterisatie van mal 82D6A3 : antitrombotisch effect Daar mal 82D6A3 in vitro de interactie tussen collageen en VWF blokkeert onder condities van hoge schuifspanning zoals deze voorkomen in arteries en op deze manier bloedplaatjesadhesie en aggregatie inhibeert, werd vervolgens onderzocht of het inhiberen van deze interactie in vivo zou leiden tot een antitrombotisch effect. Daar mal 82D6A3 enkel kruisreageert met VWF van bavianen en varkens en niet met VWF van kleine laboratoriumdieren zoals ratten, hamsters en honden, werden de in vivo experimenten uitgevoerd op bavianen en dit in samenwerking met onze collega s in Zuid-Afrika. Als trombosemodel werd een gemodificeerd Folts model (11) gebruikt waarbij een occluderende trombus gevormd wordt in een beschadigde en gestenoseerde arterie. Door het mechanisch losschudden van de trombus kan men dit proces steeds opnieuw laten optreden. 8

9 In de femorale vene van de geanestetiseerde bavianen wordt een katheter geplaatst voor het toedienen van mal 82D6A3 en voor bloednames (12). Een segment van de femorale arterie wordt vrij gemaakt en een perivasculaire ultrasone flowprobe wordt op de distale dissectieplaats geplaatst. De bloedflow wordt constant gemeten gedurende het experiment. De proximale dissectieplaats van de femorale arterie wordt 3 keer beschadigd d.m.v. een Kocher klem die gedurende 10 sec aangebracht wordt op 3 verschillende plaatsen met een tussenafstand van 2 mm. Op de plaats van beschadiging wordt een plastieken ring, welke mechanisch kan losgemaakt worden, geplaatst waarmee een externe stenose gecreeërd wordt die een bloedtoevoerreduktie van 60-70% veroorzaakt. Door deze beschadiging en vernauwing van het bloedvat treedt trombusvorming op die gemeten wordt met behulp van de flow probe. Wanneer een trombus gevormd wordt, wordt een daling in de bloedflow gemeten en wanneer een reductie van minimum 50% gemeten wordt, wordt de trombus los geschud door het mechanisch losmaken van de ring, waardoor de bloedflow zich herstelt. Dit achtereenvolgens optreden van afname en het zich herstellen van de bloedflow wordt cyclische flow reductie (CFR) genoemd. Het aantal keer dat een trombus moet los gemaakt worden, bepaalt het aantal CFRs per tijdseenheid. Na een periode van ongeveer 60 min waarin stabiele CFRs waargenomen worden, wordt ofwel een fysiologische zoutoplossing ofwel mal 82D6A3 als bolus injectie toegediend en wordt het aantal CFRs gemeten gedurende 60 min. Vergelijken van het aantal CFRs voor en na bolusinjectie geeft een idee van het antitrombotisch effect (Figuur 3A). Bloedstalen voor de verschillende laboratoriumtesten werden genomen op verschillende tijdstippen, tot 48h na het beschadigen van de vaatwand. Injectie van een fysiologische zoutoplossing had geen effect op de CFRs terwijl een dosis van 600 µg/kg mal 82D6A3 resulteerde in een volledig verdwijnen van de CFRs (Figuur 3B) en dus in een antitrombotisch effect. Dit antitrombotisch effect was dosis 9

10 afhankelijk daar bij administratie van 100 µg/kg mal 82D6A3 een reductie van 58.3 % in CFRs bekomen werd terwijl een dosis van 300 µg/kg mal 82D6A3 resulteerde in een volledige inhibitie van CFRs (Figuur 3B). Analyse van de plasmastalen genomen op verschillende tijdstippen toonde geen significante veranderingen in PT en aptt, noch in bloedplaatjesaantallen. Interessant echter was de waarneming dat op de verschillende tijdstippen geen significante verlenging van de bloedingstijd waargenomen werd. Deze bloedingstijd werd bepaald met een Simplate II device (Organin Teknika, Durham, NC). In een andere studie van onze groep (13) waar een GPIIbIIIa antagonist werd uitgetest in hetzelfde model in bavianen, werd wel een significante verlenging van de bloedingstijd waargenomen bij dosissen die een antitrombotisch effect vertoonden (13). Het toedienen van mal 82D6A3 had weinig invloed op de VWF-concentratie in het bloed gedurende het experiment. Plasmawaarden van mal 82D6A3 bleven vrij constant gedurende de eerste 3 uren van het experiment waarna ze daalden tot 69%, 23% en 7.6 % na 300 min, 24h en 48h respectievelijk na toedienen van 300 µg/kg mal 82D6A3. Het ex vivo bepalen van de bezettingsgraad van VWF met mal 82D6A3 en van de inhibitie van de VWF binding aan collageen toonde dat beide fenomenen correleerden. Bij een dosis van 300 µg/kg mal 82D6A3 was VWF voor meer dan 80 % bezet met mal 82D6A3 wat overeenkwam met een afwezigheid van VWF binding aan collageen gedurende de eerste 5 uur van het experiment (12) (Figuur 3B). Samengevat werd hier aangetoond dat het inhiberen van de VWF-collageen interactie door mal 82D6A3 resulteert in een inhibitie van de vorming van een bloedplaatjestrombus in de beschadigde en gestenoseerde femorale arterie van de bavianen en dit op een dosis afhankelijke manier. Daar geen significante verlenging van de bloedingstijd waargenomen werd, in tegenstelling tot wat gebeurt tijdens het gebruik van een GPIIb/IIIa antagonist, is dit 10

11 een interessant agens om als antitromboticum te ontwikkelen voor het behandelen van acute arteriële trombosen. 11

12 Conclusie en Perspektieven Voor de verdere ontwikkeling van 82D6A3 tot een eventueel klinisch bruikbaar product, dient het antilichaam in eerste instantie gehumaniseerd te worden, zodat bij toedienen van het antilichaam aan patiënten geen afweerreactie wordt opgewekt. Hiertoe wordt zoveel mogelijk van de oorspronkelijke muissequentie vervangen door corresponderende humane aminozuursequenties, zonder de inhiberende functie aan te tasten uiteraard. Als een eerste stap hiertoe hebben we ondertussen de sequentie van het antilichaam opgehelderd en zijn we aan de mutagenese nodig voor de humanisatie begonnen. Als eerste mogelijke klinische toepassingen wordt uiteraard gedacht aan acute en voorspelbare protrombotische situaties zoals bij PTCA of als adjunctieve therapie tijdens trombolyse, waarbij inderdaad dit antilichaam in competitie zal moeten gaan met de GPIIb/IIIa antagonisten. Daar echter, zoals reeds gemeld, 82D6A3 nagenoeg geen invloed heeft op de bloedingstijd, in tegenstelling tot GPIIb/IIIa blokkers, zou het eventueel minder voorkomen van bloedingsproblemen een duidelijk voordeel zijn. Indien 82D6A3 in die zin een veilig product is, zou bovendien behandeling van beroertes als een extra en bijzonder interessante toepassing mogelijk zijn, daar het gebruik van de huidige antitrombotica inderdaad niet zonder risico op hersenbloedingen is. Een laatste vraag die moet worden bekeken is of inhibitie van bloedplaatjesadhesie eventueel ook een antistenotisch effect zou kunnen hebben, aangezien verwacht kan worden dat ook de secretie door de bloedplaatjes van groeifactoren voor gladde spiercellen (platelet derived growth factor) zal worden verhinderd. De resultaten die we bekomen hebben met 82D6A3 dienen verder vergeleken te worden met deze bekomen met antilichamen die eveneens bloedplaatjesadhesie inhiberen, maar dit door de interactie tussen VWF en GPIb te verhinderen, zoals 6B4 (13, 14), een anti-gpib 12

13 antilichaam, of AJvW-2 (15, 16), een anti-vwf A1-domein antilichaam, welke eveneens een goed antitrombotisch effect hebben met nagenoeg geen invloed op de bloedingstijden. De eventuele klinische resultaten bekomen met de antilichamen zullen alvast aangeven of de gevolgde strategie al dan niet valabel is. Anderzijds zijn niet antilichamen, maar oraal beschikbare producten nodig voor langdurige toediening ter preventie van cardiovasculaire incidenten. Ook hiervoor kunnen we echter weer starten vanuit het antilichaam: nauwkeurige bepaling van de vouwing van het antilichaam en van zijn contacten met zijn epitoop, zal toelaten de relevante inhiberende strukturen te identificeren, waarmee dan de eerste stappen kunnen gezet worden in de rationele design van nieuwe peptide lead producten. 13

14 Legenden voor figuren Figuur 1 : Schematisch overzicht van de verschillende interacties tussen bloedplaatjes en de beschadigde vaatwand en tussen bloedplaatjes onderling die aan de basis liggen van een trombusvorming. De antiplaatjesmiddelen die tegenwoordig in de kliniek gebruikt worden, zijn in het rood aangegeven, de nieuwe antiplaatjes middelen die met de collageen- VWF-GPIb/IX/V interactie interfereren en momenteel in een préklinische fase getest worden zijn in het rood en schuin gedrukt. Deze laatste zijn het monoklonaal antilichaam (mal) 82D6A3 gericht tegen het A3-domein van von Willebrand factor (VWF) (12), mal AJvW2 gericht tegen het A1-domain van VWF (15) en mal 6B4 gericht tegen de bloedplaatjes receptor glycoproteïne (GP)Ib/IX/V (14). Tx-R : tromboxaan receptor, TXA2 : tromboxaan A2, PLC : fosfolipase C, ADP-R : adenosine difosfaat receptor Figuur 2 : Situering van het epitoop van mal 82D6A3 in de crystalstructuur van het A3- domein van VWF. Kristalstructuur van het A3-domein van VWF met aminozuren serine (Ser) 1020, proline (Pro) 981, tryptofaan (Trp) 982 en arginine (Arg) 1016 die geïdentificeerd werden via de phage display technologie en die een belangrijk deel uitmaken van het epitoop van mal 82D6A3. De aminozuren histidine (His) 1023, asparaginezuur (Asp) 1009 en methionine (Met) 1022 maken eveens deel uit van het epitoop van mal 82D6A3 en werden geïdentificeerd via mutagenese studies (10). Figuur 3 : In vivo antitrombotisch effect van mal 82D6A3 (12). (A) Het patroon van CFRs voor en na toedienen van mal 82D6A3. (B) Ex vivo data na analyse van de plasmastalen. Het % CFR geeft het in vivo antitrombotisch effect van mal 82D6A3 weer. Deze data 14

15 corresponderen goed met de ex vivo VWF-binding aan collageen en de bezettingsgraad van VWF. Ook de bloedingstijden en de plasma waarden van mal 82D6A3 werden weergegeven. 15

16 References 1. Cauwenberghs N, Vanhoorelbeke K, Vauterin S, Deckmyn H. Structural determinants within platelet glycoprotein Ibalpha involved in its binding to von Willebrand factor. Platelets 2000; 11: Ruggeri ZM. Structure and function of von Willebrand factor. Thromb Haemost 1999; 82: Schror K. Aspirin and platelets: the antiplatelet action of aspirin and its role in thrombosis treatment and prophylaxis. Semin Thromb Hemost 1997; 23: Sharis PJ, Cannon CP, Loscalzo J. The antiplatelet effects of ticlopidine and clopidogrel. Ann Intern Med 1998; 129: Jarvis B, Simpson K. Clopidogrel: a review of its use in the prevention of atherothrombosis. Drugs 2000; 60: Tcheng JE. Platelet glycoprotein IIb/IIIa integrin blockade: recent clinical trials in interventional cardiology. Thromb Haemost 1997; 78: Cohen M. Glycoprotein IIb/IIIa receptor blockers in acute coronary syndromes: Gusto IV-ACS. Lancet 2001; 357: Vanhoorelbeke K, HU HU, Schoolmeester A, Deckmyn H. Inhibition of platelet adhesion to collagen as a new target for antithrombotic drugs. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord 2003; 3: Vanhoorelbeke, K. and Deckmyn, H. The role of vwf-collagen interaction in acute platelet thrombus formation. Drugs of the Future 28, Vanhoorelbeke K, Depraetere H, Romijn RAP, Huizinga EG, De Maeyer M, Deckmyn H. A consensus tetrapeptide selected by phage display adopts the conformation of a dominant discontinuous epitope of a monoclonal Anti-VWF 16

17 antibody that inhibits the von Willebrand factor-collagen interaction. Journal of Biological Chemistry 2003; 278: Folts J. An in vivo model of experimental arterial stenosis, intimal damage, and periodic thrombosis. Circulation 1991; 83:IV Wu D, Vanhoorelbeke K, Cauwenberghs N, Meiring M, Depraetere H, Kotze HF et al. Inhibition of the von Willebrand (VWF)-collagen interaction by an antihuman VWF monoclonal antibody results in abolition of in vivo arterial platelet thrombus formation in baboons. Blood 2002; 99: Wu D, Meiring M, Kotze HF, Deckmyn H, Cauwenberghs N. Inhibition of platelet glycoprotein Ib, glycoprotein IIb/IIIa, or both by monoclonal antibodies prevents arterial thrombosis in baboons. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22: Cauwenberghs N, Meiring M, Vauterin S, van W, V, Lamprecht S, Roodt JP et al. Antithrombotic effect of platelet glycoprotein Ib-blocking monoclonal antibody Fab fragments in nonhuman primates. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20: Kageyama S, Yamamoto H, Nagano M, Arisaka H, Kayahara T, Yoshimoto R. Antithrombotic effects and bleeding risk of AJvW-2, a monoclonal antibody against human von Willebrand factor. Br J Pharmacol 1997; 122: Kageyama S, Matsushita J, Yamamoto H. Effect of a humanized monoclonal antibody to von Willebrand factor in a canine model of coronary arterial thrombosis. Eur J Pharmacol 2002; 443: