De Nederlandse populatie van Geelbuikvuurpad in Zuid-Limburg: een genetische analyse

De Nederlandse populatie van Geelbuikvuurpad in Zuid-Limburg: een genetische analyse

Dit onderzoek is uitgevoerd in opdracht van de Provincie Limburg. Projectnummer: 5238059-01 Foto s omslag: Ben Crombaghs (buikfoto) & Martijn Dorenbosch (amplex).

De Nederlandse populatie van Geelbuikvuurpad in Zuid-Limburg: een genetische analyse Hugh A.H. Jansman 1, Arjen de Groot 1, Marinus Speelman 1,2, Ivo Laros 1, Wilbert Bosman 3, Ben Crombaghs 4 & Hans Peter Koelewijn 1 1 Alterra, onderdeel van Wageningen UR 2 Wageningen Universiteit 3 RAVON 4 Natuurbalans Limes Divergens Alterra, onderdeel van Wageningen UR Wageningen, 2012

Inhoud 1 Inleiding 6 1.1 De Geelbuikvuurpad 6 1.1.1 Ecologische en morfologische gegevens 6 1.1.2 Ontwikkeling Nederlandse populaties 8 1.1.3 Beschermingsstatus 10 1.2 Genetische processen in geïsoleerde en kleine populaties 11 1.3 Vraagstelling 13 2 Materiaal en Methode 14 2.1 Monstername 14 2.1.1 Bemonsterde populaties 15 2.1.2 Wangslijmvlies 16 2.1.3 Weefselmonsters 17 2.2 Genetische analyse 18 2.2.1 DNA isolatie 18 2.2.2 Microsatelliet-analyse 18 2.2.3 Data-analyse 19 3 Resultaten 21 3.1 Genetische diversiteit 21 3.2 Genetische verwantschap 25 3.2.1 Bayesiaanse cluster-analyse 25 3.2.2 Principale Coördinaten Analyse 26 3.2.3 Genetische differentiatie 30 4 Discussie, conclusies & aanbevelingen 32 4.1 Genetische variatie 32 4.2 Genetische differentiatie 34 4.3 Samenvatting en Conclusies 36 4.4 Aanbevelingen 37 5 Dankwoord 38 6. Referenties 39 Bijlage 1: Historie van de Geelbuikvuurpad in Nederland 40 Alterra-AltRapp GBV DNA.docx 5

1 Inleiding De Geelbuikvuurpad (Bombina variegata) is momenteel zeer zeldzaam in Nederland. Het verspreidingsgebied is beperkt tot Zuid-Limburg en bestaat uit vijf leefgebieden waar het dier in dynamische milieus (voornamelijk in mergelgroeven) leeft. Vroeger was de soort vrij algemeen en kwam verspreid over het uiterste zuiden van Limburg voor. Er zijn meerdere maatregelen genomen ter bescherming van de soort, onder andere door de ontwikkeling en instandhouding van instabiele milieus bij mergelgroeven. Om een indruk te krijgen van de huidige toestand van de Geelbuikvuurpad populaties in Zuid-Limburg is een inventarisatie uitgevoerd die zowel de demografische- als populatiegenetische aspecten van de huidige populaties meeneemt. Dit verslag bevat de voornaamste bevindingen en conclusies. 1.1 De Geelbuikvuurpad 1.1.1 Ecologische en morfologische gegevens Geelbuikvuurpad De Geelbuikvuurpad behoort tot de familie van de vuurbuikpadden (Bombinatoridae). Anders dan dat de naam doet denken, behoort deze soort tot de familie van de kikkers. Binnen de familie zijn er twee geslachten en acht soorten. Allen hebben ze een afgeplat lichaam en een pad-achtig gedrongen uiterlijk. Het geslacht Bombina staat bekend om de felle buikkleuren en kent zes soorten waarvan in Noordwest Europa de Roodbuikvuurpad (Bombina bombina), en de Geelbuikvuurpad (B. variegata), voorkomen (Bosman et al 2009). De lengte van een volwassen Geelbuikvuurpad is drie tot vijf centimeter. Vrouwtjes zijn iets groter dan de mannetjes. Gemiddeld bereiken de dieren een gewicht van 3.5 à 6.5 gram, met een maximum van circa twaalf gram (Bosman et al 2009). Zowel de buik, als de kin en de onderzijde van de ledenmaten zijn geel, met een onregelmatig patroon van zwarte vlekken. De gele kleur loopt door op de achterzijde van de dijen en de toppen van enkele vingers en tenen. Wanneer een individu zich bedreigd voelt, worden de opvallende kleur van de randen van de buik getoond, door de poten tot boven het lichaam te krommen. Dit gedrag wordt de unkenreflex genoemd. Het buikpatroon is voor ieder individueel exemplaar verschillend en veranderd nauwelijks na het eerste levensjaar, waardoor volgroeide dieren individueel herkenbaar blijven; de rugzijde is donkerbruin gekleurd en bedekt met kleine wratten (zie Figuur 1). Soms zijn er lichtbruine vlekken op de rug te zien. De ogen staan bovenop de kop en hebben een driehoekige of hartvormige pupil. De mannetjes zijn van de vrouwtjes te onderscheiden door de gespierde bovenarmen en bruinzwarte paarborstels op de binnenzijde van de onderarm en de vingers (Bosman et al 2009). 6 Alterra Geelbuikvuurpad genetica

Figuur 1: Buik- en rugzijde Geelbuikvuurpad. (foto: RAVON) De Geelbuikvuurpad maakt gebruik van twee typen wateren. Voor de voortplanting worden instabiele wateren gebruikt; poeltjes en laagtes die in een pioniersstadium verkeren en zonnig gelegen zijn. Deze bevatten in het algemeen minder predatoren en concurrerende amfibiesoorten. Voor het verblijf buiten de voortplanting, worden sterker begroeide en soms ook diepere poelen gebruikt, beter bekend als verblijfswateren. De Geelbuikvuurpad wordt voornamelijk in waterhabitat waargenomen, maar spendeert een aanzienlijk deel van het jaar op het land, bijvoorbeeld om te overwinteren. In Nederland bestaat het landhabitat voornamelijk uit nog kale groevebodems, graslanden, ruigtevegetaties en bos. Adulte dieren zijn tijdens de actieve periode zeer plaatstrouw en blijven gemiddeld binnen 35 meter van de vindplaats. Tussen seizoenen vindt er wel verplaatsing plaats, in enkele gevallen gaat het om een afstand van 250 tot 300 meter. Wanneer ze niet actief zijn in hun zomerhabitat, schuilen geelbuikvuurpadden in muizengangen, tussen boomwortels, onder stammen, stenen, afval, in steenhopen of krimpscheuren in de bodem. Geelbuikvuurpadden voeden zich doorgaans met evertebraten, zoals insecten, rupsen en duizendpoten (Bosman et al 2009). De eerste geelbuikvuurpadden worden doorgaans in april waargenomen. De meeste waarnemingen worden tussen half mei en eind augustus gedaan. Na hevige neerslag, gevolgd door hoge temperaturen tijdens het voortplantingsseizoen, verzamelen geelbuikvuurpadden zich in korte tijd om eieren in de wateren af te zetten. Het aantal eieren dat wordt afgezet, kan oplopen tot circa 130 per vrouwtje. De eieren worden afgezet, afzonderlijk of in klein klompjes, op dode takjes, stenen of planten. Een eitje is gemiddeld anderhalf tot twee millimeter groot, met een omhulsel van vijf tot acht millimeter en bruin van kleur. De larven bereiken, na een periode van zes tot tien weken, een lengte van circa vijf centimeter. Juvenielen vertonen zwerfgedrag en geen gerichte migratie. Ze kunnen binnen enkele weken tot 800 meter van hun geboorte wateren wegtrekken. Hierdoor kan de soort nieuwe leefgebieden koloniseren. Echter, als gevolg van het geringe dispersievermogen en toegenomen fragmentatie liggen risico s van, al dan niet genetische, isolatie op de loer en zijn risico s van inteelt op termijn niet uit te sluiten. Jonge dieren kunnen in hun tweede zomer geslachtsrijp worden, maar deelname aan de voortplanting vindt meestal plaats in hun derde zomer (Bosman et al 2009). Geelbuikvuurpadden kunnen relatief oud worden. Er zijn exemplaren van minstens 26 jaar gevonden in het wild, maar als een gevolg van predatie en natuurlijk verval haalt lang niet ieder individu die leeftijd. 7

1.1.2 Ontwikkeling Nederlandse populaties Een uitgebreide beschrijving van de historie van de Nederlandse populaties, met betrekking tot zowel de natuurlijke populatieontwikkeling als menselijke ingrepen door de jaren heen, is opgenomen in bijlage 1. Hieronder volgt een kort overzicht van de meest relevante historische gebeurtenissen. Algemeen In de eerste helft van de twintigste eeuw, komen alle waarnemingen van geelbuikvuurpadden uit de streek ten oosten van de Maas en ten zuiden van de lijn Kerkrade-Maastricht. Waarnemingen buiten Zuid-Limburg worden als buiten het natuurlijke verspreidingsgebied gerekend. De soort lijkt algemeen voor te komen in Zuid- Limburg. Door onderzoek ontstaat in de jaren 60 een nauwkeuriger beeld van de verspreiding van de soort. Tijdens de jaren 70 wordt een drastische terugloop vastgesteld van het aantal locaties waar de soort wordt waargenomen; de soort wordt nog maar in 17 poelen waargenomen in tegenstelling tot de circa 80 poelen uit de jaren 60. In de jaren 80 worden er nog maar vijf poelen vermeld, waarbij slechts sprake is van één populatie met een redelijk aantal dieren (circa 25) (Bosman et al 2009; Bijlage 1). De drastische achteruitgang van de Geelbuikvuurpad leidde in 1982 tot de oprichting van de zogenaamde Overleggroep poelenbeheer. In de volgende jaren nam het aantal nieuw aangelegde en herstelde poelen in het Mergelland weer toe tot 550 in 1990. Veel soorten reageerden positief op deze actie, maar de Geelbuikvuurpad echter niet. Ondanks de graaf- en herstelwerkzaamheden waren er in 2000 nog maar vier vindplaatsen van de Geelbuikvuurpad, waarvan slechts één vitale populatie (in groeve t Rooth) (bijlage I). Vanaf 1997 is er structureel populatieonderzoek verricht aan de Geelbuikvuurpad in Zuid-Limburg. In het begin alleen in groeve t Rooth, vanaf 2000 ook in de vier andere gebieden, namelijk Julianagroeve, Wahlwiller, Berghofwei en Gerendal (Bijlage 1). Recente situatie per subpopulatie Groeve t Rooth. In de jaren 80 was de populatie in groeve t Rooth de grootste in Nederland. De populatiegrootte werd in die tijd geschat op 97 dieren (adulten en subadulten). Vanaf 2000 zijn in de groeve basishabitats aangelegd. Basishabitats hebben naast een voortplantingsgedeelte ook een verblijfsgedeelte waar de dieren kunnen foerageren. Van 41 dieren in 1997 groeide de populatie in 2003 naar 166 dieren. In de jaren daarna schommelen de aantallen tussen de 100 en 120 dieren. In 2010 betrof de populatiegrootte 115 volwassen dieren. Julianagroeve. Eind jaren 90 stierf de Geelbuikvuurpad uit in de Julianagroeve. Voorheen was de soort er ook al schaars. In juni 2001 werd er weer een dier gevonden. De herkolonisatie heeft vrijwel zeker plaatsgevonden vanuit groeve t Rooth. Voor 2010 kwam de schatting uit op 11 dieren. In de Julianagroeve is op dit moment geen sprake van een levensvatbare populatie. Wahlwiller. De populatie in Wahlwiller is het resultaat van een introductie in 1982. In 2000 bestond de populatie uit 16 dieren. De aanleg van vier basishabitats in 2005 zorgde voor een enorm reproductiesucces wat leidde tot een populatieomvang van meer dan 70 dieren. In jaren daarna fluctueert het aantal en omvat in 2010 63 dieren. Berghofwei. Tussen 2000 en 2003 werden er in de Berghofweide nog maar sporadisch geelbuikvuurpadden gezien. De aanleg van een basishabitat in 2004 bleek van groot belang. Er bleken nog een aantal dieren aanwezig te zijn in het gebied die zich in 2004 succesvol voortplantte. Aanleg van meer basishabitats zorgde voor een groei van de populatie die in 2009 zijn voorlopig hoogte punt bereikte met 76 dieren. In 2010 daalde het aantal weer licht naar 72 dieren. Gerendal. De populatie in het Gerendal was jaren lang kwakkelend. In 2000 bestond deze nog uit 18 dieren, maar nam in de jaren daarna af tot slechts enkele exemplaren in 2004 en 2005. De populatie groeide in 2009 8 Alterra Geelbuikvuurpad genetica

en 2010 uit naar een populatie van 69 en respectievelijk 118 dieren. Hoe deze spectaculaire groei na succesvolle voortplanting in 2008 ineens tot stand is gekomen, is niet duidelijk. Uitzet en bijplaatsingen De afname leidde tot de uitvoering van een reeks onderzoeken, betreffende de actuele status en de omvang van de laatste populaties en het veilig stellen van het voortbestaan van deze populaties. De resultaten van die onderzoeken resulteerde onder meer in een tweetal beschermingsplannen (Lenders, 2000; Crombaghs & Bosman, 2006). Daarnaast leidde de ernstig bedreigde status van de soort tot het (zowel legaal als op particulier initiatief) uitzetten van geelbuikvuurpadden in de hoop op de ontwikkeling van nieuwe populaties. Zowel volwassen dieren, als juvenielen en larven zijn op diverse plaatsen in Zuid-Limburg uitgezet. Door middel van interviews is hiervan een zo goed mogelijk beeld geschetst voor de periode 1970-2010. Uit de interviews blijkt dat hierbij ook dieren uit het buitenland zijn uitgezet. Een overzicht van locaties waar Geelbuikvuurpad is uitgezet, of van eenmalige waarnemingen van de soort op afwijkende locaties, wordt gepresenteerd in tabel 1 en figuur 2. Voor een uitgebreide beschrijving van de uitzetting wordt verwezen naar bijlage 1. In overleg met de Provincie Limburg en het Ministerie van LNV is in de periode 2005-2010 een herintroductie uitgevoerd in drie groeves in Zuid-Limburg: Groeve Blom (2005), Meertensgroeve (2006) en Curfsgroeve (2008). Als bronmateriaal voor de uitzettingen werd een kweekgroep gebruikt (in het vervolg van dit rapport aangeduid met Nederlandse kweekgroep of kweekgroep BC (Ben Crombaghs) ). De kweekgroep is in eerste instantie tot stand gekomen door het opkweken van larven, die in 2000 werden verzameld van de locatie Wahlwiller. Deze larven waren in 2000 laat in het seizoen (oktober) nog niet gemetamorfoseerd. Larven van de Geelbuikvuurpad overleven de winterperiode niet. De larven zijn daarom in gevangenschap door de winter geholpen. Rond 2005 zijn er onder soortgelijke omstandigheden enkele larven verzameld van Berghofwei en t Rooth, opgekweekt en toegevoegd aan de kweekgroep. Ook tijdens de herintroducties in de Meertensgroeve en de Curfsgroeve (2005-2010) werden enkele malen larven de winter doorgeholpen en in het voorjaar als subadult uitgezet. In 2008 is er een drietal subadulten aan de kweekgroep toegevoegd die werden aangetroffen in het gebied Lange Akkers, op circa 500 meter ten westen van de Meertensgroeve. De kweekgroep bestaat gemiddeld uit 15 tot 20 individuen. Tabel 1: Overzicht van bekende uitzettingen en waargenomen individuen op onverwachte locaties, in de periode 1970-2010; voor meer informatie zie Bijlage 1. Locatie of gebied Tijdstip Ontwikkelings-stadium Herkomst (indien bekend) Indicatie aantallen Uitzettingen en waarnemingen buiten het natuurlijke areaal, periode 1970-2010 1 Retraitehuis Spaubeek Jaren 70 Larven/juvenielen Kranske Gora (Slovenië) onbekend 7 Bemelerberg + omgeving Jaren 70 Larven/juvenielen Kranske Gora (Slovenië) onbekend 11 Simpelveld 1972 Adult Mogelijk natuurlijk voorkomen één 9 Gerendal 1974 & 1975 Juvenielen Zuid-Limburg 1860 14 Slenaken/Schilberg Eind jaren 70 Adult Mogelijk natuurlijk voorkomen één 5 Meertensgroeve 1985 Adult onbekend één 9 Gerendal Eind jaren 80 Volgroeide larven en juvenielen Waarschijnlijk variëteit uit Balkan enkele honderden 10 Keuteberg Eind jaren 90 juvenielen Rooth enkele tientallen 8 Rooth 1997 Volgroeide larven en juvenielen Opgekweekt uit eitjes uit t Rooth enkele honderden 2 Bunderbos Omstreeks 1995 Adulten onbekend drie adulten waargenomen 4 Curfsgroeve 1998 Adulten onbekend Vier Uitzettingen in kader van een herintroductieproject, periode 2005-2010 6 Groeve Blom 2005-2007 Larven en juvenielen kweekgroep > 3000 in drie jaren 5 Meertensgroeve 2006-2008 Larven en juvenielen kweekgroep > 1000 in drie jaren 4 Curfsgroeve 2008-2011 Larven, juvenielen en subadulten kweekgroep > 1000 in drie jaren 9

Figuur 2: Locaties in Limburg waar in de periode 1970-2010 uitzetting van de Geelbuikvuurpad bekend is. Op vijf locaties betreft het met zekerheid uitzetting van Geelbuikvuurpadden uit voormalig Joegoslavië. In drie gevallen is de herkomst van de uitgezette Geelbuikvuurpadden onbekend. De overige uitzettingen hebben, voor zover bekend, betrekking op inheems materiaal. De nummers in de figuur corresponderen met de nummers in de tekst. Op een aantal locaties is de Geelbuikvuurpad inmiddels weer verdwenen. Voor meer informatie, zie Bijlage 1. 1.1.3 Beschermingsstatus De Geelbuikvuurpad valt onder de Europese regelgeving van de Conventie van Bern, die zich bezig houdt met het behoud van soorten en hun natuurlijk leefomgeving. Daarnaast is de diersoort opgenomen in bijlage 2 (soorten met lidstaat-overstijgend belang) en bijlage 4 (soorten die strikte bescherming vereisen) van de Habitatrichtlijn, die zich richt op de instandhouding van natuurlijke habitats, de wilde flora en fauna en het behoud van biodiversiteit door bescherming van (semi)natuurlijke landschappen en soorten met Europees belang. Deze gebiedsbescherming wordt in Nederland verwerkelijkt via Natura 2000. In Nederland is de soort overgenomen in de Flora en Fauna-wet. Daarnaast zijn er natuurgebieden als Habitatrichtlijngebied voor de Geelbuikvuurpad aangewezen. De vereiste bescherming is landelijk geregeld, mede doordat de soort is aangewezen als beschermde inheemse diersoort in de Natuurbeschermingswet; een wet die zowel de soortbescherming als de gebiedsbescherming omvat d.m.v. het aanwijzen van gebieden als Staats- of Beschermd Natuurmonument. Als laatste is de Geelbuikvuurpad ook nog opgenomen in de Rode lijst van reptielen en amfibieën, met als status ernstig bedreigd (Platform Geelbuikvuurpad en Vroedmeesterpad, 2006). 10 Alterra Geelbuikvuurpad genetica

1.2 Genetische processen in geïsoleerde en kleine populaties Biodiversiteit wordt vaak op drie niveaus gedefinieerd: op het niveau van ecosystemen en habitats, op soortsniveau en op populatie- en individu niveau (genetische biodiversiteit). Om genetische diversiteit te analyseren, zijn verschillende technieken ontwikkelt (Bijlsma, 1995). Cellen bevatten nucleair- en mitochondriaal DNA. DNA bevat de genetische informatie die nodig is om een organisme te maken. DNA is opgebouwd uit vier zogeheten baseparen (A, T, G en C) die in verschillende volgorden voorkomen. Het DNA is dan een lange keten van baseparen. Door de volgorde van de baseparen tussen individuen te vergelijken, kan gekeken worden of er variatie is en wat de frequentie van de verschillende varianten binnen een populatie is. Omdat het onnodig duur en complex is om de code van het hele genoom van elk individu te bepalen, wordt meestal gekeken naar de variatie op een aantal kleine stukjes van het DNA. Zulke stukjes DNA, die gezamenlijk een beeld geven van de totale variatie, worden loci (enkelvoud: locus) of merkers genoemd. Afhankelijk van de vraagstelling, worden merkers gebruikt in meer of minder variabele regionen van het genoom. Zo is voor een studie naar de genetische structuur in heel Europa een minder variabele merker voldoende en zelfs geschikter (bv markers uit het mitochondriale DNA, ofwel mtdna), terwijl voor een studie naar sterk verwante individuen binnen één populatie markers nodig zijn met een hogere resolutie, zoals microsatellieten. De twee standaard parameters voor het weergeven van genetische diversiteit, zijn de mate van polymorfisme en het percentage heterozygositeit. Polymorfisme betekent dat er meerdere varianten of allelen (nucleair DNA) of haplotypen (mitochondriaal DNA) van een merker aanwezig zijn in een populatie. Indien een individu van de vader een andere allel heeft meegekregen dan van de moeder, is dit individu heterozygoot voor deze merker. Indien het twee dezelfde allelen bezit is het homozygoot. Hoe groter het aantal verschillende allelen van een merker binnen een populatie, des te groter de genetische variatie van die populatie. Hoe groter het aantal merkers waarvoor een individu heterozygoot is, des te groter is de genetische variatie in dat individu. Het belang van genetische diversiteit laat zich het beste verklaren door genen als pakketjes informatie te beschouwen. Bij een grote variatie aan allelen is er dus veel informatie binnen het individu of populatie aanwezig. Een gebrek aan variatie hoeft niet direct tot uitsterven te leiden, maar verhoogd wel de kans daartoe. Een eventueel achteruitgaan van een populatie zal een samenspel zijn van genetische en nietgenetische factoren. Een overzicht van de processen die hierbij betrokken zijn wordt gegeven in Figuur 3. Een proces dat bij kleine populaties een belangrijke rol speelt is genetische drift. Bij het doorgeven van de genetische variatie van de ene generatie naar de volgende, kan verlies van variatie optreden. Dit effect zal sterker zijn naarmate de populatie omvang kleiner is. Genetische drift kan optreden als gevolg van willekeurige sterfte van individuen, maar ook als gevolg van migratie of bottlenecks (Nei 2005). Een demografische bottleneck is het proces waarbij een populatie in korte tijd sterk in aantal achteruitgaat. Indien dit een sterke afname van de genetische variatie tot gevolg heeft (als deze bottleneck niet snel door populatiegroei wordt gevolgd) dan spreekt men van een genetische bottleneck. Naast genetische drift kan verlies van variatie ook het resultaat zijn van selectie, of van paring tussen verwanten, oftewel inteelt (Frankham et al. 2010). Organismen beschikken dan ook over verschillende mechanismen om inteelt te voorkomen. Bij veel zoogdieren is een veel voorkomend mechanisme geslachtsafhankelijke dispersie, waarbij de mannetjes verder wegtrekken dan de vrouwtjes of juist andersom. Bij kleine, geïsoleerde populaties kan aan een belangrijke voorwaarde voor het behoud van genetische variatie, het min of meer willekeurig kiezen van een partner niet worden voldaan, omdat er daarvoor te weinig potentiële partners zijn. Op basis van populatie-genetische data kan worden nagegaan in hoeverre binnen een populatie willekeurige paring plaatsvindt, door te kijken naar de verhouding tussen het theoretisch verwachte aantal heterozygote individuen in geval van willekeurige paring en het daadwerkelijke aantal heterozygoten. Afname van de genetische variatie en een gebrek aan heterozygotie kan leiden tot een verlaagde fitness. Onder fitness wordt verstaan het reproductieve succes gedurende het leven van een individu. Hoewel dit niet eenvoudig te analyseren is, wordt het vaak gemeten aan de grootte en groei van individuen, vruchtbaarheid, levensverwachting, groeisnelheid en eventueel de metabolische efficiëntie van stoffen. 11

Van populaties die geïsoleerd raken, kunnen als gevolg van selectie en genetische drift de genetische eigenschappen zich wijzigen. De mate waarin deze locale adaptatie plaats vindt, is enigszins gerelateerd aan de populatieomvang, de duur van de isolatie en de mate waarin het nieuwe leefmilieu verschilt van het oorspronkelijke. Genen met voordelige eigenschappen voor het speciale leefmilieu gaan frequenter voorkomen dan de minder gunstige genen. Daarnaast kan co-adaptatie plaatsvinden. Dit betekent dat bepaalde genen elkaars werking kunnen verbeteren indien zij in hetzelfde individu aanwezig zijn en dus tegelijkertijd tot expressie kunnen komen. Indien een lokaal geadapteerde populatie weer in contact wordt gebracht met soortgenoten uit een andere populatie, hetzij natuurlijk door het opheffen van een migratiebarrière, hetzij kunstmatig door het uitwisselen van individuen, kan dit leiden tot uitteelt of outbreeding depression. Hiermee wordt bedoeld het opheffen van de locale adaptatie en co-adaptatie wat resulteert in een afnemende fitness (Frankham et al. 2002). Figuur 3. De uitsterfspiraal of extinctie curve (uit: Buiteveld & Koelewijn 2006). Een gesimplificeerde weergave van processen die in gang worden gezet als een populatie in omvang afneemt. Twee feedback-loops zijn zichtbaar, die beiden hun weerslag hebben op de geboorte en sterftecijfers van de populatie. Deze loops kunnen elkaar versterken, wat tot een snelle afname in populatiegrootte kan leiden, en daarmee een verhoogde kans op uitsterven. De zwarte pijlen geven de richting van het effect aan (d.w.z. groter of geringer). 12 Alterra Geelbuikvuurpad genetica

1.3 Vraagstelling De drastische afname van de populatiegroottes van de Geelbuikvuurpad in Limburg heeft waarschijnlijk meerdere oorzaken (Platform Geelbuikvuurpad en Vroedmeesterpad, 2006). Een langdurig kleine populatieomvang heeft vrijwel altijd een afname van de genetische variatie tot gevolg. Genetische variatie is van belang voor overleving en aanpassingsvermogen van individuen en populaties. Ook is het niet uitgesloten dat vanwege de mogelijk geïsoleerde ligging van de Nederlandse Geelbuikvuurpad-populatie aan de rand van het verspreidingsgebied (in samenhang met mogelijk andere leefomstandigheden, zoals habitat of klimaat) er selectie en/of adaptatie heeft plaatsgevonden, waardoor de Nederlandse populatie mogelijk is gedifferentieerd van andere populaties. Dit is van belang indien geschikte individuen geselecteerd moeten worden, wanneer er bijplaatsing of herintroductie ter versterking van de populatie wordt overwogen. Het mengen van buitenlandse individuen met inheemse varianten is beslist niet zonder risico (zowel genetisch als wat betreft het risico op verspreiding van ziekten) (Smulders et al, 2006). In opdracht van Provincie Limburg is door Alterra onderzoek verricht naar de genetische variatie en genetische differentiatie van de Nederlandse populaties van de Geelbuikvuurpad. Het doel van dit onderzoek is het verkrijgen van inzicht in de genetische structuur van de populaties van de Geelbuikvuurpad in Nederland in vergelijking met omliggende Europese landen (België, Frankrijk en Duitsland, ook wel omschreven als Europese regio s). Dit inzicht leidt tot mogelijke verklaringen van de genetische structuur van populaties en uiteindelijk tot aanbevelingen met betrekking tot het beheer van de Nederlandse populaties in Zuid-Limburg. Voor dit onderzoek zijn de volgende vragen geformuleerd: 1) Is de algehele Nederlandse populatie vanuit genetisch oogpunt levensvatbaar en, indien niet, hoe zou deze ondersteund kunnen worden? 2) Hoe verhoudt de genetische variatie en genetische differentiatie van de Nederlandse populaties zich onderling en ten opzichte van referentie populaties uit de Europese regio s? 3) Zijn er vanuit genetisch oogpunt indicaties voor (illegale) bijplaatsing, en zijn deze tot een mogelijke herkomst te herleiden? Deze vragen zullen worden beantwoord door de uitvoering van populatie-genetische analyses op basis van bemonsterde populaties uit zowel Nederland als de Europese regio s. 13

2 Materiaal en Methode 2.1 Monstername Vaak wordt er voor genetisch onderzoek gebruik gemaakt van bloed- of weefselmonsters. Het probleem van deze monstertypes is echter dat deze niet altijd eenvoudig voor handen zijn, of dat het vanuit dierwelzijn niet wenselijk is om bloed of weefsel af te nemen. Om deze reden wordt dan ook vaak uitgeweken naar andere, vaak kwalitatief mindere monstertypes, zoals haren, veren, eischalen, wangslijmvlies en zelfs uitwerpselen. Tijdens dit onderzoek is gekozen om voornamelijk te werken met wangslijmvlies. De dieren zijn namelijk vrij gemakkelijk te vangen, en, in tegenstelling tot andere bekende methoden als teenknippen, beperkt bemonstering van wangslijmvlies de kans op schade aan de dieren tot een minimum. Naast wangslijmvlies zijn ook enkele weefselmonsters gebruikt. Dit betrof monsters van enkele doodgevonden exemplaren, exemplaren uit een museumcollectie, en monsters van gestorven larven uit een kweekgroep. Hieronder zal eerst een overzicht worden geschetst van de bemonsterde populaties. Daarna zal de wijze van bemonstering van wangslijmvlies en weefsel in meer detail worden omschreven. Een overzicht van alle bemonsterde populaties, het aantal monsters per populatie en het type bemonstering is weergegeven in Tabel 2. Tabel 2. Herkomst, aantal gebruikte monsters (n), tijdstip van verzamelen, en type verzameld materiaal van de in deze studie onderzochte populaties van Geelbuikvuurpad. Populatie n Periode Type monster Nederland Meertensgroeve 10 Juni-2010 Wangslijmvlies Wahlwiller 17 Juli-Augustus 2010 Wangslijmvlies Gerendal 37 Juli-Augustus 2010 Wangslijmvlies Berghofwei 36 Juli-Augustus 2010 Wangslijmvlies t Rooth 33 Juli-Augustus 2010 Wangslijmvlies Museum 35 1898-1961 Weefsel Duitsland, regio Aken Binsfelthammer 16 Augustus-2010 Wangslijmvlies Brockenberg 15 Augustus-2010 Wangslijmvlies Bärenstein 7 Augustus-2010 Wangslijmvlies België (kweekprogramma Luik) 11 Augustus-2010 Wangslijmvlies Duitsland, region Hannover Liekwegen 5 2007 (zie Weimann et al., 2009) Wangslijmvlies Oberkircher Sandsteinbrüche 5 2007 (zie Weimann et al., 2009) Wangslijmvlies Messingberg 5 2007 (zie Weimann et al., 2009) Wangslijmvlies Doberg 5 2007 (zie Weimann et al., 2009) Wangslijmvlies Frankrijk (Creuse) 23 Augustus-2010 Wangslijmvlies Blijdorp (Slovenië?) 10 Augustus-2010 Wangslijmvlies NL kweekprogramma 18 Juni-2010 Wangslijmvlies (15x) Weefsel (3x) 14 Alterra Geelbuikvuurpad genetica

2.1.1 Bemonsterde populaties Het verzamelen van monsters van Nederlandse populaties is uitbesteed aan RAVON (Wilbert Bosman) en Natuurbalans - Limes Divergens (Ben Crombaghs). Het veldwerk is uitgevoerd in de periode van Juli-Augustus 2010. Dit is gedaan door de vijf Limburgse lokaties te bezoeken waarvoor de aanwezigheid van een populatie van Geelbuikvuurpad op dat moment bekend was, en padden uit elk van de daar aanwezige poeltjes apart te bemonsteren. Vanwege het droge voorjaar is het veldwerk vertraagd omdat de voortplantingswateren vroegtijdig droogvielen. De bezochte populaties waren Julianagroeve, Meertensgroeve, Wahlwiller, Gerendal, Berghofwei, t Rooth. Een overzicht van de ligging van de bemonsterde Limburgse populaties is te vinden in Figuur 4. In de Julianagroeve werden echter op het moment van monsteren geen individuen aangetroffen, en deze komt dan verder niet terug in de genetische analyses. Alle individuen aanwezig in een poeltje werden gevangen en in een emmer gedaan. Als werd aangenomen dat de poel zo goed als leeg was, werd bij ieder individu wat wangslijmvlies afgenomen. Hierna werd de Geelbuikvuurpad gefotografeerd voor individuele herkenning en in een andere emmer gezet. Als alle padden waren bemonsterd, werd nog eenmaal een ronde rond het poeltje gelopen om te kijken of er mogelijk nog meer individuen aanwezig waren die tijdens de eerste ronde gemist waren. Als dit het geval was werden deze ook nog bemonsterd. Indien dit niet het geval was werden alle dieren weer los gelaten bij dezelfde poel. Cu rfsgroeve Groeve Blom Meerten sgroeve Ro oth Julianagroeve Gerend al Berghof Wahlwiller Bemonsterd e populaties Overige bestaande populaties in 2010 Figuur 4: Overzicht van de bestaande populaties van Geelbuikvuurpad in Limburg in 2010, en de populaties die daarvan gedurende dat jaar werden bemonsterd. Voor dit onderzoek werden de huidige Nederlandse populaties ook vergeleken met monsters van diverse andere populaties. Hieronder volgt een overzicht van deze populaties, en de wijze waarop monsters werden verkregen. 15

Historische monsters Voor een vergelijking met de historische situatie binnen Nederland, werden weefselmonsters verzameld van exemplaren uit de collectie van Nationaal Natuurhistorisch museum Naturalis te Leiden. Naburige populaties Door Wilbert Bosman en Ben Crombaghs werden ook wangslijmvliesmonsters verzameld van enkele naburige populaties rond Aken (Binsfelthammer, Brockenberg en Bärenstein, zie Tabel 2), volgens het hierboven besproken protocol. Verder is door Arnaud Laudelot (Natagora) een aantal Belgische monsters aangeleverd uit een kweekprogramma, met als herkomst een populatie in de regio Luik. Van de populaties in deze regio is bekend dat ze sterk bedreigd worden door fragmentatie en zeer beperkt zijn in omvang. De naburige populaties rond Aken en Luik werden als referentie gebruikt om te kijken in hoeverre de hoeveelheid variatie in Nederlandse populaties afwijkend is en om de genetische structuur in en rond Nederland te onderzoeken (zijn populaties genetische verschillend van elkaar). Referentiepopulaties Verder werd materiaal verzameld van enkele vermeende gezonde populaties, waarvan verwacht wordt dat deze niet genetisch verarmd zijn. Deze populaties dienden ter referentie om na te gaan in hoeverre de genetische status in de Nederlandse populaties reden is tot zorg. Het betrof een populatie in de Franse Creuse, waarvoor wangslijmvlies bemonsterd werd door Ben Crombaghs (Tabel 2), en monsters vanuit een Duits studie aan Geelbuikvuurpad voor de regio rond het Duitse Hannover (Weimann et al. 2009). Deze Duitse monsters werden beschikbaar gesteld door Heike Pröhl van de Duitse Universiteit van Veterinary Medicine in Hannover. Zij heeft van enkele monsters ook aangegeven wat de allellengtes zijn voor de verschillende monsters per merker, zodat deze gebruikt kunnen worden als referenties om in de toekomst datasets uit te wisselen. Overige populaties Ben Crombaghs leverde swabs en enkele weefselmonsters van gestorven larven aan, van individuen uit zijn eigen kweekgroep. Uit hetzelfde kweekprogramma leverde hij drie dode juvenielen aan. Verder zijn er via RAVON ook wangslijmvlies-monsters aangeleverd van de Geelbuikvuurpad uit de dierentuin van Blijdorp. Deze monsters dienen ter verificatie van het mogelijk bijplaatsen of uitzetten van dieren afkomstig uit Slovenië en/of de Balkan in Nederlandse populaties, naar aanleiding van verschillende verklaringen daaromtrent (zie paragraaf 1.1.2). Om het eventuele bijplaatsen van Balkan/Sloveense dieren in Limburg gedurende de afgelopen decennia beter te kunnen testen is DNA onderzocht van dieren die door een particuliere eigenaar in de handel werden aangeboden en waarbij werd vermeld dat ze oorspronkelijk afkomstig zijn uit Slovenië (persoonlijke mededeling Wilbert Bosman). Onder hoge druk is (een deel van?) deze kweekgroep afgestaan aan Diergaarde Blijdorp en DNA monsters daarvan zijn in dit onderzoek als de populatie Blijdorp opgenomen. 2.1.2 Wangslijmvlies Bemonstering van gevangen dieren gebeurde met behulp van een katoenen swab (cotton dry swab; producent: VWR International B.V., Amsterdam) of een wattenstaaf (zie Figuur 5). Om dit mogelijk te maken, werd het individu voorzichtig in de hand genomen en werd met een stomp element voorzichtig de mond geopend en open gehouden. De zwab of wattenstaaf werd vervolgens voorzichtig in de mond rondgedraaid. Hierna werden de staafjes in een bijbehorende buisje (met daarin toegevoegd enkele silica-korrels) geconserveerd en genummerd. De Franse monsters (Cruese, zie Tabel 2) zijn, in tegenstelling tot de andere monsters, opgeslagen in 2ml epjes gevuld met 96%-ethanol. 16 Alterra Geelbuikvuurpad genetica

Figuur 5. Afname van wangslijmvlies-materiaal bij een Geelbuikvuurpad met behulp van een takje, het achtereind van een theelepeltje en een swab (Foto: Marinus Speelman). 2.1.3 Weefselmonsters Weefselmonsters werden verkregen van de historische exemplaren uit de museumcollectie van Naturalis, als ook van de gestorven larven en juvenielen uit het kweekprogramma van Ben Crombaghs (voor aantallen zie Tabel 2). De collectie van Naturalis bestaat uit individuen die werden gefixeerd in formaline en vervolgens in ethanol bewaard. Van deze individuen zijn de tongen voor een deel verwijderd zonder de collectie te beschadigen. Dit is gedaan door met een pincet voorzichtig de bek te openen en de tong voorzichtig los te maken van de onderkaak met behulp van een scalpel (Figuur 5). Wanneer de tong eenmaal los was werd deze met behulp van het pincet gefixeerd en werd er voorzichtig een snede gemaakt in de tong, waardoor hier een stukje van los kwam (zie figuur 6). Het afgenomen tongweefsel is voor transport en opslag bewaard in 2 ml epjes gevuld met ethanol (96%). Van de gestorven larven en juvenielen uit het kweekprogramma werd een stukje weefsel verzameld en in ethanol opgeslagen. 17

Figuur 6. Het verwijderen van een stukje tongweefsel bij in Geelbuikvuurpad uit de collectie van het Nationaal Natuurhistorisch museum Naturalis (foto: Ivo Laros). 2.2 Genetische analyse 2.2.1 DNA isolatie Afhankelijk van het type materiaal werd DNA-isolatie uitgevoerd met behulp van de D neasy Blood and Tissue Kit, QIAamp DNA Investigator Kit en QIAamp DNA Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Kit (Qiagen), volgens het protocol van de producent. Voorafgaand aan de isolatie zijn van de droog bewaarde swabs de toppen afgeknipt welke in 2ml epjes werden gedaan voor verdere isolatie. Op ethanol bewaarde swabs werden voorafgaand aan de isolatie droog gedraaid. De weefselmonsters werden drooggedept om zo veel mogelijk ethanol te verwijderen en overgezet in 2 ml epjes. De D Neasy Blood and Tissue Kit is gebruikt om DNA te isoleren uit weefselmonsters (verkregen van de dode dieren uit het kweekpgramma). Zowel uit droge als uit op ethanol bewaarde swabs werd DNA geïsoleerd met behulp van de QIAamp DNA Investigator Kit. De laatst genoemde kit, de QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, is toegepast op de historische weefselmonsters, omdat deze kit specifiek ontworpen is voor dergelijk materiaal. 2.2.2 Microsatelliet-analyse Zes microsatelliet primerparen voor respectievelijk loci Bobom1A, Bobom5F, Bobom8A, Bobom9H, Bobom10F, Bobom12F, ontwikkeld voor de Roodbuikvuurpad Bombina bombina (Hauswaldt et al., 2007), zijn in dit onderzoek gebruikt. De zes primerparen zijn verdeeld over twee multiplexen, namelijk multiplex A en multiplex B (zie Tabel 3). Een multiplex is een Polymerase Ketting Reactie (PCR) mix welke meerdere primerparen bevat. Stukjes van het DNA zijn met behulp van de Polymerase Ketting Reactie (PCR) vermenigvuldigd, zodat ze zichtbaar konden worden gemaakt. De PCR-reacties werden uitgevoerd met 10 maal verdund DNA-isolaat voor de weefsels en onverdund DNA-isolaat voor de swabs in een totaal volume van 10 µl met een Biometra T3000 Thermocycler. Zowel multiplex A als multiplex B werden in PCR gezet met 2 µl 5x Flexi Buffer, 0.80 µl 25 mm MgCl 2, 0.22 µl 10 mm dntp s-cocktail, 1 µl 10X Primer Mix, 0.05 µl 5 U/µl GoTaq-DNA polymerase. De PCR condities bestonden uit een initiële denaturatie van 70 seconden bij 96 o C gevolgd door 30 cycli van 30 18 Alterra Geelbuikvuurpad genetica

seconden van 96 o C, 30 seconden bij een annealingtemperatuur (T a ) van 58 o C (welke per cycli 0.3 o C lager werd), 30 seconden bij 72 o C en een final elongation van 15 minuten bij 72 o C. De 5 -end van elke Forwardprimer is gesynthetiseerd met een IRD 700 of een IRD 800 nm label (zie tabel 3). Voor multiplex A werd 1 µl van het amplicon na denaturatie zowel met 29 µl loading buffer (Formamide, Na 2 EDTA en Broomphenol blauw) als met 9 µl loading buffer samengevoegd (om alle loci goed zichtbaar te maken). Voor multiplex B werd 1 µl van het amplicon na denaturatie in 9 µl loading buffer gedaan. Alle drie de mengsels werden vervolgens voor 4 minuten bij 95 o C opgekookt, waarna het voor minimaal 10 minuten in de vriezer werd gezet. Dit werd vervolgens geanalyseerd op een 25 cm lange sequencing gel (6,5 % polyacrylamide premix gel en 0.8xTBE) met behulp van de LICOR 4300 DNA analyser. Tijdens de electroforese werden consequent referentiemonsters gebruikt om de globale allellengtes van de monsters te kunnen bepalen (voor het volledige protocol zie bijlage IV). De monsters uit de regio Hannover zijn gebruikt om de exacte allellengtes te kunnen bepalen en daarmee alle monsters eenduidig met de Duitse studie te kunnen scoren (Hauswaldt et al., 2007). Multiplex Tabel 3. Beschrijving van de twee multiplexen en de zes gebruikte primerparen. De primerparen staan genoteerd in de 5 naar de 3 richting met hun nucleotide repeat, de toegepaste annealing temperatuur (T a o C) en fragmentlengte. T a ( o C) Locus Primer sequentie (5 3 ) Nucleotide repeat Label Fragment A 58,0 Bobom9H AACAGCCATTATTTAAAACCATTAG Bobom8A Bobom12F CAATAAAGCAGTATTTCCCAAAATG AATTTCTTAGTGCTGCCAACTTGC GGGGAAGGGACATTTTAGCTACATAC ATAGGAGGTTTATAATGAAAGGGCAAC GATTGGATTTGGGCTATGATATTCTG B 58,0 Bobom5F ATGAATTGGAAGGTAAGAACTTACACC Bobom1A Bobom10F CAAATGATACAAATCAAGTGGAATGG ATGTGGCTTCCATTGACCTTTGC CATGCCAAGAAGGATTGAGTCTGTC ATCCAACTTCAAATTCACAGGTCAC ACAAGGGATACCAGGAGAACAAAGC Range (bp) (GATA)9TAAA(GATA)2GAAA(GATA)6 800 147 223 (AGAT)7AAAGAGAT(GATA)9 700 314 354 (GATA)9 700 206 226 (GACA)13GGCA(GACA)7(GATA)14 700 130 153 (GATA)12 700 320 354 (GATA)12 800 189 229 2.2.3 Data-analyse Voor de data-analyses zijn de monsters verwijderd welke voor meer dan twee loci niet gescoord konden worden. Alle zes de loci bleken een afwijking te hebben in de score (tussen de +1 en +4 baseparen) in vergelijking met de scores van de referentiemonsters van Heike Pröhl. Er is gekeken of het mogelijk is om de Alterra scores zo aan te passen dat ze in overeenstemming zijn met de scores van Heike Pröhl maar aangezien de verschuiving in de scores niet 100% consequent is, is dit niet mogelijk gebleken. Om fouten uit te sluiten binnen het lab van Alterra zijn alle referentie een tweede keer geanalyseerd, bij deze herhaling bleken de scores 100% reproduceerbaar te zijn. Dit resulteerde in een betrouwbare dataset die in totaal 246 monsters omvatte, afkomstig uit 16 populaties. Genetische variatie is gekarakteriseerd door het gemiddelde aantal allelen (N a ), het aantal effectieve allelen (N e ), het percentage verwachtte heterozygoten (H e ), het percentage waargenomen heterozygoten (H o ),de fixatie index (F) en het percentage polymorfisme in de verschillende populaties te bepalen (programma GenAlEx, Peakall & Smouse 2001). Het aantal allelen per microsatelliet is een maat voor het aantal varianten dat van 19

een gen aanwezig is. N e is in vergelijking met N a een maat voor het aantal allelen gecorrigeerd voor populatie grootte en is daardoor beter geschikt voor onderlinge vergelijking. Het percentage heterozygoten geeft een indruk van het aantal individuen in de populatie dat over twee verschillende varianten van een gen beschikt (tegenover de individuen die voor een gen twee dezelfde varianten bezitten: homozygoten). De fixatie index F is een indicator voor afwijkingen van random paring: F = 1- Ho/He. Een F>0 geeft aan dat er meer homozygoten zijn dan verwacht, dit kan bijv. komen door inteelt. Een F<0 geeft aan dat er een heterozygoten overschot is. Het percentage polymorfisme is het percentage van het aantal loci welke meerdere verschillende varianten kennen (tegen een monomorf locus wat dus maar een variant kent). Om de relatie tussen populaties te onderzoeken is een Bayesiaanse clusteranalyse toegepast. Het programma Structure (Pritchard et al. 2000) veronderstelt een verdeling in K populaties, welke gekarakteriseerd worden door de allel frequenties van een set van onafhankelijke merkers. De waarde voor K is vooraf op te geven, zodat resultaten voor een aantal verschillende K-waarden kunnen worden vergeleken, en het optimale aantal clusters kan worden bepaald aan de hand van een kwaliteitsscore van het berekende model. Het resultaat is een onderverdeling van de totale dataset in een optimaal aantal clusters (genenpoelen), waarbij voor elk van de 16 vooraf gedefineerde populaties wordt aangegeven welk percentage van de monsters aan een bepaald cluster worden toegewezen. Naast deze Bayesiaanse cluster-procedure is op de dataset een PCO analyse uitgevoerd. Voor de Principale Coördinaten Analyse (PCO) is gebruik gemaakt van het programma GenAlEx (Peakall & Smouse, 2001). Hierbij wordt eerst de onderlinge genetische afstand tussen alle 246 individuen bepaald en vervolgens is daar met behulp van de PCO structuur in aangebracht. De PCO is een multivariate analyse die probeert de variatie in een dataset zo te combineren en te groeperen dat een inzichtelijker patroon ontstaat. Vaak wordt een PCO analyse grafisch weergegeven door de score van de individuele monsters op de eerste en tweede coördinaten-as weer te geven. Foto: DNA analyse op het Alterra laboratorium (Foto Ivo Laros). 20 Alterra Geelbuikvuurpad genetica

3 Resultaten Van de meeste populaties zijn voldoende monsters verzameld, welke ook kwalitatief goed DNA opleverden om een helder inzicht in de genetische status van die populaties te krijgen. Van enkele populaties zijn minder dan 10 monsters verzameld of succesvol geanalyseerd, wat de betrouwbaarheid van de berekende waarden voor genetische variatie en heterozygositeit negatief beïnvloedt. Dit betreft Oberkircher Sandsteinbrüche (nabij Hannover), met slechts 3 monsters, als ook de andere Duitse populaties rond Hannover (5 monsters) en Bärenstein (Aken). Omdat ze wel indicatief zijn, worden ze wel als volwaardige populaties in dit hoofdstuk meegenomen. Echter, met betrekking tot de conclusies dient voor deze populaties dus een slag om de arm te worden gehouden. Naast enkele Duitse populaties waarvan te weinig monsters zijn verkregen, zijn helaas helemaal geen bruikbare monsters beschikbaar van het Nationaal Natuurhistorisch Museum Naturalis. De dode exemplaren in de collectie zijn naar alle waarschijnlijkheid oorspronkelijk geconserveerd in formaline, wat als bijeffect heeft dat het DNA afbreekt. 3.1 Genetische diversiteit Nederlandse populaties De waarden voor de verschillende parameters van genetische diversiteit zijn weergegeven in tabel 4. Het aantal aangetroffen allelen per locus zit voor de Nederlandse populaties in de range van 2,0 tot 3,3. Het aantal effectieve allelen per subpopulatie is iets lager, met een range van 1,8-2,1 allel per locus. De waargenomen heterozygositeit ligt met een range van 0,45-0,51 iets hoger dan de verwachte heterozygositeit (range 0,41-0,45), wat resulteerde in een negatieve fixatie-index F. In drie subpopulaties was het percentage polymorfisme geen 100%. Dit heeft met name betrekking op het weinig variabele locus Bobom 1A waarvan maar 3 allelen zijn aangetroffen in de gehele studie en het merendeel van de onderzochte populaties slechts 1 variant bevat. Naburige populaties De diversiteit en heterozygositeit voor de populaties rond Aken valt in dezelfde range als voor de Nederlandse populaties. De populatie Bärenstein laat een sterk negatieve fixatie-index zien. Dit houdt mogelijk verband met de kleine steekproefgrootte. De Belgische kweekpopulatie is van alle onderzochte populaties in deze studie genetisch het meest verarmd. Het aantal aangetroffen allelen per locus (Na en Ne) is zeer gering, en dat is dan ook direct terug te zien in de heterozygositeit (Ho en He), welke ook de laagste is van deze studie. Referentiepopulaties Van de populaties rond Hannover zijn Doberg en Oberkircher Sandsteinbrüche weinig heterogeen (lage heterozygositeitswaarden). Voor Oberkircher Sandsteinbrüche zal de geringe steekproefgrootte daarbij een rol kunnen spelen (zie ook discussie in paragraaf 4.1). Voor de populatie Liekwegen werd de hoogste diversiteit (Na = 3.33; Ne = 2.52) en heterozygositeit (Ho = 0.60) waargenomen van alle onderzochte populaties. De Franse populatie zit qua aantal allelen aan de lage kant. Dit vertaalt zich ook in de heterozygositeit, welke ook gering is. Overige populaties Het Nederlandse kweekprogramma en ook de dieren van Blijdorp zitten qua genetische diversiteit in dezelfde range als de Nederlandse subpopulaties. In het kweekprogramma zijn vijf maal twee identieke genotypen, of te wel, vijf dieren hebben een genetisch identieke tegenhanger. Waarschijnlijk gaat het hier om eiklomp- 21

verwanten, met dezelfde ouders. Dit heeft wel tot gevolg dat de genetische diversiteit en -differentiatie enigszins beïnvloed kan worden doordat de onderlinge verwantschap verhoogd is. Tabel 4. Genetische variatie in de Geelbuikvuurpad populaties gebaseerd op zes microsatelliet loci. n, aantal individuen; Na, gemiddeld aantal allelen per locus; Ne, effectieve aantal allelen per locus; He, verwachtte heterozygositeit; Ho, waargenomen heterozygositeit; F, Fixatie-index; %P, percentage polymorfisme. Populatie n Na Ne He Ho F %P Nederland Meertensgroeve 10 3.00 2.07 0.44 0.48-0.08 100.00 Wahlwiller 17 2.33 2.00 0.45 0.47-0.04 83.33 Gerendal 36 3.33 2.10 0.45 0.51-0.09 100.00 Berghofwei 35 2.33 2.04 0.44 0.45-0.01 83.33 t Rooth 33 2.00 1.83 0.41 0.45-0.10 83.33 Museum (weefsel) 0 - - - - - - Duitsland, regio Aken o Binsfelthammer 16 3.00 2.19 0.46 0.49-0.07 83.33 o Brockenberg 15 2.83 1.80 0.36 0.36 0.05 83.33 o Bärenstein 7 2.50 2.10 0.45 0.60-0.33 83.33 België (kweekprogramma Luik) 11 1.83 1.37 0.22 0.27-0.21 66.67 Duitsland, regio Hannover o Liekwegen 5 3.33 2.52 0.52 0.60-0.13 100.00 o Oberkircher Sandsteinbrüche 3 2.00 1.76 0.27 0.39-0.41 50.00 o Messingberg 5 2.83 2.24 0.47 0.44 0.09 83.33 o Doberg 5 1.83 1.58 0.26 0.37-0.40 50.00 Frankrijk (Creuse) 23 2.67 1.68 0.34 0.32 0.01 83.33 Blijdorp (Slovenië?) 10 2.67 1.95 0.41 0.50-0.21 83.33 NL kweekprogramma 15 3.00 1.91 0.41 0.43-0.09 100.00 In tabel 5 is het aantal allelen (varianten) per locus weergegeven. Locus Bobom 10F is met 10 aangetroffen allelen het meest variabel, locus Bobom 1A is met slechts 3 allelen het minst variabel. In tabel 5 is ook de lengte van de fragmenten weergegeven in baseparen (bp). Figuur 7 laat per locus zien welke allelen in welke populaties zijn aangetroffen. Kwam een allel voor in een populatie, dan is deze aangeven met een zwart blok. Dit geeft een indicatie van de aanwezige variatie (maar let op: het is mogelijk dat een bepaald allel slechts eenmaal is aangetroffen, en dat andere allelen veel algemener in de populatie voorkomen). Daarnaast geeft dit overzicht een beeld van de aanwezigheid van kenmerkende of unieke varianten in bepaalde populaties. Voor locus Bobom 10F is bijvoorbeeld allel 201 in alle Nederlandse subpopulaties aangetroffen, maar in geen enkele andere populatie. Daarmee is deze variant kenmerkend voor de Nederlandse populatie. Opvallend is verder dat de populatie van Gerendal voor de loci Bobom 10F, 12F, en 8A allelen kent die nergens anders worden aangetroffen (unieke allelen). Het Nederlandse kweekprogramma heeft voor Bobom 9H een variant die 22 Alterra Geelbuikvuurpad genetica

uniek is. Daarnaast deelt de kweekgroep voor Bobom 1A en 8A gemeenschappelijke allelen met de populaties van Gerendal en Meertensgroeve. Duidelijk is ook dat de geërodeerde populatie van België nog maar weinig varianten kent voor de verschillende loci, zoals ook al bleek uit de zeer beperkte waarden voor het aantal allelen en de heterozygositeit (N en Na, Ho en He; Tabel 4). Tabel 5. Allel diversiteit van zes microsatelliet loci gebaseerd op 246 individuen. Zie ook tabel 3. Locus Allelen aantal Range (min max) per populatie Fragment Range (bp) Bobom 9H 8 2-4 141-201 Bobom 8A 9 1-5 288-332 Bobom 12F 6 1-5 212-232 Bobom 5F 7 1-4 90-154 Bobom 1A 3 1-2 320-340 Bobom 10F 10 1-5 185-225 23

Bobom 10F Bobom 12F 185 189 193 201 205 209 213 217 221 225 212 216 220 224 228 232 Berghofweide (NL) x x x x x x x Gerendal (NL) x x x x x x x x x Meertensgroeve (NL) x x x x x x x x t Rooth (NL) x x x x x Wahlwiller (NL) x x x x x x x NL kweekprogramma (Ben Crombaghs) x x x x x x x Bärenstein (DU; Aken) x x x x x x x Binsfelthammer (DU; Aken) x x x x x x x x Brockenberg (DU; Aken) x x x x x x Doberg (DU; Hannover) x x x x Liekwegen (DU; Hannover) x x x x x x x x Messingberg (DU; Hannover) x x x x x x Obernkirchner Sandsteinbrüche (DU; Hannover) x x x x België (kweekprogramma Luik) x x x Frankrijk (Creuse) x x x x x Blijdorp (Slovenië?) x x x x x x x Bobom 1A Bobom 5F 320 336 340 90 114 118 138 142 146 154 Berghofweide (NL) x x x Gerendal (NL) x x x x x Meertensgroeve (NL) x x x x t Rooth (NL) x x x Wahlwiller (NL) x x x NL kweekprogramma (Ben Crombaghs) x x x x Bärenstein (DU; Aken) x x x Binsfelthammer (DU; Aken) x x x Brockenberg (DU; Aken) x x x Doberg (DU; Hannover) x x x Liekwegen (DU; Hannover) x x x x x Messingberg (DU; Hannover) x x x x x Obernkirchner Sandsteinbrüche (DU; Hannover) x x België (kweekprogramma Luik) x x x Frankrijk (Creuse) x x x x Blijdorp (Slovenië?) x x x x Bobom 8A 288 292 296 304 316 320 324 328 332 141 149 153 157 161 165 169 201 Berghofweide (NL) x x x x Gerendal (NL) x x x x x x Meertensgroeve (NL) x x x x x x t Rooth (NL) x x x x Wahlwiller (NL) x x x x NL kweekprogramma (Ben Crombaghs) x x x x x x x Bärenstein (DU; Aken) x x x x x Binsfelthammer (DU; Aken) x x x x x x x Brockenberg (DU; Aken) x x x x x x x x Doberg (DU; Hannover) x x x x Liekwegen (DU; Hannover) x x x x x x x Messingberg (DU; Hannover) x x x x x x Obernkirchner Sandsteinbrüche (DU; Hannover) x x x x x x België (kweekprogramma Luik) x x x x x Bobom 9H Frankrijk (Creuse) x x x x x x x Blijdorp (Slovenië?) x x x x x Figuur 7. Aan of afwezigheid van allelen van zes microsatelliet loci in 16 populaties. Zwarte blokjes duiden op aanwezigheid van een allel en witte blokjes op afwezigheid. Zie tabel 5 voor specifieke informatie. 24 Alterra Geelbuikvuurpad genetica