De chemische industrie heeft in de afgelopen eeuw veel nieuwe chemicaliën ontwikkeld die prachtige toepassingen hadden, maar achteraf schadelijk voor het milieu bleken te zijn. In dat opzicht springt de groep van de gehalogeneerde koolwaterstoffen er uit. Deze verbindingen, die chloor- of broomatomen bevatten, kunnen bijvoorbeeld worden toegepast als drijfgas in spuitbussen (CFK s), als bestrijdingsmiddel (bijv. DDT en lindaan), koelvloeistof, oplosmiddel (bijv. in correctievloeistof en chemische wasserijen), of voor de productie van weer andere chemicaliën zoals plastics. De meeste halogeenverbindingen zijn giftig en slecht afbreekbaar door micro-organismen, waardoor ze zich ophopen in de natuur en bijdragen aan bodem- en grondwatervervuiling. De slechte afbreekbaarheid wordt vooral veroorzaakt door de aanwezigheid van één of meer koolstof chloor (of broom) bindingen die doorgaans zeer stabiel zijn. Toch zijn er bacteriestammen ontdekt die een manier hebben gevonden om de koolstof halogeenbindingen te verbreken en de gehalogeneerde chemicaliën als voedingsstof en energiebron te gebruiken. Een mooi voorbeeld is de bacteriestam Xanthobacter autotrophicus GJ10, die kan groeien op de haloalkaan 1,2-dichloorethaan (DCE, C 2 C 2 ). DCE is de meest geproduceerde chloorhoudende verbinding ter wereld en wordt voornamelijk gebruikt voor de productie van vinylchloride en PVC. DCE wordt door X. autotrophicus GJ10 omgezet in glycolaat en chloride, en daarmee volledig onschadelijk gemaakt. De bacterie gebruikt verschillende enzymen om het afbraakproces uit te voeren. et enzym genaamd haloalkaan dehalogenase (DhlA) is verantwoordelijk voor de eerste stap in de afbraak van DCE: het afsplitsen van één van de twee chlooratomen (dehalogenering). Met behulp van water weet het enzym DCE om te zetten in een chlooralcohol en het afgesplitste chlooratoom komt vrij in de vorm van een onschadelijk chloride-ion. aast DCE kan DhlA nog andere haloalkanen hydrolyseren, maar DCE en 1,2-dibroomethaan (DBE, Br C 2 C 2 Br) zijn de beste substraten. De reactie die gekatalyseerd wordt door DhlA speelt een centrale rol in dit proefschrift. aloalkaan dehalogenase is een globulair eiwit van 310 aminozuren met een massa van 35 kda. et enzym bestaat uit twee domeinen, een groot hoofddomein met er bovenop een kleiner capdomein. De topologie van het hoofddomein (de opvouwing van de peptideketen) wordt de α/β-hydrolase-fold genoemd en deze wordt ook aangetroffen in enkele andere enzymen, waaronder lipases (vetafbrekende enzymen). Tussen het hoofd- en capdomein bevindt zich een kleine holte waarin een DCE molecuul gebonden kan worden. Dit actieve centrum wordt omlijst door enkele aminozuren die een belangrijke rol spelen in de dehalogenase-reactie. De belangrijkste zijn Asp124, is289 en Asp260 die tezamen een katalytische triade vormen, en Trp125 en Trp175 die een specifieke bindingsplaats vormen voor halide-ionen. De omzetting van DCE naar het alcohol door DhlA verloopt grofweg in vier stappen. De eerste stap is de binding van DCE in het actieve centrum van het enzym. In de tweede stap wordt de koolstof chloorbinding in het substraat verbroken (Figuur 1A). Dit gebeurt volgens een nucleofiele substitutie-reactie, waarbij het aminozuur Asp124 aanvalt op een koolstofatoom in het substraat en het chlooratoom dat daaraan vast zit vervangt. et afsplitsen van het chlooratoom wordt vergemakkelijkt, doordat het als een magneet 119
A Trp175 B Trp175 EXIT Asp260 is289 Asp124 Trp125 Asp260 is289 Asp124 Trp125 Figuur 1. Katalytisch mechanisme van haloalkaan dehalogenase. A. Splitsing van de koolstof halogeenbinding (stap 2). B. ydrolyse van het covalente intermediair (stap 3). wordt aangetrokken door Trp125 en Trp175. et covalente alkyl enzym intermediair dat is gevormd wordt in de derde reactiestap weer gesplitst doordat een watermolecuul de esterbinding hydrolyseert (Figuur 1B). et watermolecuul wordt geactiveerd door is289, waarschijnlijk met extra hulp van Asp260. et 2-chloorethanol dat vrij komt bij de splitsing van het covalente intermediair verlaat direct het actieve centrum. et chloride-ion dat al eerder werd gevormd is echter nog in het actieve centrum aanwezig, gebonden tussen Trp125 en Trp175. De laatste, vierde stap is dus export van het halide-ion uit het enzym naar buiten. Er zijn sterke aanwijzingen dat het enzym eerst een verandering in structuur moet ondergaan voordat het halide eruit kan. Deze conformatieverandering is de traagste stap in de reeks en bepaalt daarmee de snelheid van de totale enzymreactie. oofdstuk 1 is een algemene inleiding over de voor- en nadelen van gehalogeneerde verbindingen, de mogelijkheden tot afbraak door micro-organismen en hoe de verschillende enzymatische reactiemechanismen in zijn werk gaan. Tevens wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van de resultaten die tot nu toe zijn verkregen met het DhlA onderzoek. Tenslotte wordt besproken wat onder conformatieveranderingen kan worden verstaan en hoe ze kunnen worden aangetoond. et werk dat verder in dit proefschrift staat beschreven heeft als doel meer inzicht te krijgen in de structuur functierelaties in DhlA, om zo nieuwe ideeën te krijgen over hoe de prestaties van haloalkaan dehalogenase in de toekomst gericht verbeterd zouden kunnen worden. et enzym zou dan breder en beter toegepast kunnen worden bij de opruiming van milieuvervuilingen via een biotechnologische route. De functie van verschillende aminozuren is nader bestudeerd door met plaatsgerichte mutagenese het aminozuur te veranderen en het effect op de kinetiek en structuur te bepalen. Tevens zijn de conformatieveranderingen onderzocht die optreden tijdens de katalytische cyclus van de afbraak van haloalkanen door DhlA. De rol van aspartaat 260 In oofdstuk 2 is de rol van Asp260 in het werkingsmechanisme van DhlA nader bestudeerd. et aminozuur Asp260 is het derde lid van de katalytische triade. et carbonzuur is middels een waterstofbrug gebonden aan is289 en waarschijnlijk assisteert het de histidine in de activering van het watermolecuul dat de covalente binding tussen het enzym en het substraat verbreekt. Vervanging van Asp260 door asparagine (Asn) leidde tot een inactief en instabiel enzym, hetgeen er op duidt dat Asp260 een rol speelt in het behouden van de juiste geometrie van het actieve centrum. In oofdstuk 2 wordt ook aangetoond dat de stabiliteit en een deel van de katalytische activiteit van het Asp260Asn gemuteerde enzym ten aanzien van het substraat 1,2-120
dibroomethaan kan worden hersteld door Asn148 te vervangen door aspartaat (Asp) of glutamaat (Glu). et idee voor deze extra mutatie, waardoor de Asp260 verschoven werd van β-strand 7 naar β-strand 6, kwam voort uit de kristalstructuur en uit vergelijking van de aminozuurvolgorde met die van andere dehalogenases met een α/β-hydrolase fold. De Asp260Asn+Asn148Glu dubbelmutant had slechts een tiende van de activiteit van het wild-type DhlA voor DBE. Door een analyse van de enzymkinetiek werd ontdekt dat deze veranderingen veroorzaakt werden door een afname in zowel de vormingssnelheid als de hydrolysesnelheid van het covalente enzym substraatintermediair (respectievelijk stap 2 en 3, Figuur 1). Daarentegen leidden de mutaties wél tot een versnelde export van het halide uit de holte. Structuurmodellen van de dubbelmutant lieten zien dat Glu148 inderdaad de interactie met is289 over kan nemen en ze gaven aanwijzingen waarom het halide sneller de holte kan verlaten. Klaarblijkelijk speelt Asp260 een belangrijke rol in de positionering en stabilisatie van de algemene base is289. De eigenschappen van de dubbelmutant en overeenkomsten in de aminozuurvolgordes duidden er op dat het derde residu in de katalytische triade (het zuur) in de veronderstelde α/β-hydrolase dehalogenases LinB, DhaA en Deh1 zich bevindt op een positie die overeenkomt met die van Asn148 in DhlA. De rol van tryptofaan 175 oofdstuk 3 betreft onderzoek dat was gericht op het verkrijgen van meer inzicht in de functie van tryptofaan 175 (Trp), dat samen met Trp125 een bindingsplaats voor halogeen/halide in het actieve centrum vormt. Trp175 werd gemuteerd en van het DhlA met de Trp175 naar tyrosine (Tyr) mutatie werd de kinetiek en de structuur bestudeerd. De Trp175Tyr-DhlA-mutant bleek het substraat DBE tweemaal zo snel te kunnen omzetten tot alcohol als het onveranderde (wild-type) DhlA, terwijl DCE 10 maal zo traag werd omgezet door de mutant. Stoppedflow-fluorescentie en rapid-quench experimenten werden uitgevoerd om de snelheidsen evenwichtsconstantes te bepalen van de individuele stappen in de katalytische cyclus van de Trp175Tyr dehalogenasemutant. De resultaten toonden aan dat de snelheid van zowel de binding van het substraat, als de verbreking van de koolstof broombinding, respectievelijk de eerste en tweede stap in het kinetiekschema (Figuur 2), waren afgenomen ten opzichte van het wild-type enzym, terwijl de enzym-isomerisatie die voorafgaat aan bromideafgifte versneld was in het gemuteerde dehalogenase. ierdoor is de isomerisatie niet langer de traagste stap in de omzetting van DBE, maar is de hydrolyse van het alkyl enzymintermediair dat geworden. De structuur van het veranderde dehalogenase is vrijwel identiek aan die van het wildtype enzym, en de tyrosine-zijketen ligt in hetzelfde vlak als de tryptofaan. Echter, als gevolg van de kleinere afmeting van tyrosine liggen de halide-bindende aromaatringen van residu 175 en Trp125 verder uit elkaar, en is het volume van het actieve centrum enigszins toegenomen. Kristalstructuren van wild-type en gemuteerd DhlA met een azijnzuurmolecuul in het actieve centrum tonen verder aan dat één van de zuurstofatomen van azijnzuur in het wild-type enzym zowel aan Trp175 als Trp125 bindt, terwijl in de mutant het azijnzuur alleen aan Trp125 bindt omdat de zijketen van Tyr175 is weggedraaid. Deze structurele verschillen duiden er op dat de interactie tussen residu 175 en het halogeen of halide in de mutant zwakker is dan in het wild-type enzym, hetgeen heel goed de waargenomen kinetische veranderingen kan verklaren. De resultaten in oofdstuk 3 tonen duidelijk aan dat Trp175 een zeer belangrijke rol speelt bij de binding van het substraat in het actieve centrum en in de stabilisatie van de overgangstoestand tijdens de verbreking van de koolstof halogeenbinding. Bovendien is het residu betrokken bij de enzymisomerisatie die voorafgaat aan de feitelijke ontsnapping van het halide naar buiten. 121
Structurele dynamica tijdens vorming van het covalente intermediair Enkele jaren geleden werd een DhlA variant met een is289gln mutatie gebruikt om aan te tonen dat er een covalent alkyl enzymintermediair gevormd wordt tijdens katalyse in DhlA. Bij die experimenten werd opgemerkt dat de covalente binding van het substraat aan is289gln-dhla het enzym minder gevoelig maakte voor proteolytische afbraak door trypsine. m de rol te achterhalen van conformationele flexibiliteit tijdens de katalytische cyclus van DhlA hebben we de eigenschappen van vrij en substraatgebonden is289gln-dhla nader onderzocht met behulp van circulair dichroïsme (CD) en trypsine-proteolyse (oofdstuk 4). De CD techniek geeft een indruk van het gehalte aan secundaire structuurelementen (αhelices en β-strands) in een enzym en zegt derhalve iets over de vouwing en dus de structuur van een enzym. Veranderingen in de eiwitstructuur, zoals die ontstaan bij verhoging van de temperatuur, kunnen worden gemeten met behulp van deze techniek. Zonder substraat bleek de mutant thermisch minder stabiel dan het wild-type eiwit. Echter, de mutant met het covalent gebonden substraat bleek bij een hogere temperatuur te denatureren dan wanneer er geen substraat was gebonden in het actieve centrum. Dit duidt er op dat vorming van het covalente alkyl enzymcomplex gepaard gaat met stabiliserende conformatieveranderingen. Bestudering van de gevoeligheid van de drie DhlA-vormen ten aanzien van trypsine wees uit dat het vrije is289gln-dhla gevoeliger was voor proteolyse dan het wild-type enzym, maar dat een aantal knipplaatsen veel minder makkelijk te verbreken was bij de substraatbevattende mutant. Met name de peptidebindingen van Arg103, Arg112 en Arg116, die zich ver van het actieve centrum bevinden, waren moeilijker te knippen na reactie met het substraat. De resultaten van oofdstuk 4 geven aan dat vorming van het covalente intermediair in DhlA tot conformatieveranderingen leidt in het hoofddomein tussen aminozuren 88 en 140 die de algehele enzymstructuur stabiliseren. Deze stabilisatie zou wel eens één van de drijvende krachten van de katalyse in DhlA kunnen zijn. Studie naar de aard van de isomerisatiestappen bij halide-export Uit kinetiekexperimenten is naar voren gekomen dat het halide-ion het actieve centrum van DhlA kan verlaten langs een twee- en een driestapsroute (Figuur 2). In beide routes vindt eerst een langzame unimoleculaire isomerisatie plaats voor de feitelijke, snelle dissociatie van het halide-ion. In het driestapsschema vindt na de halideexport nogmaals een isomerisatie plaats. De aard van de isomerisatie is niet bekend, maar zou een verandering in structuur kunnen weergeven. m wat meer inzicht te krijgen in de structurele processen en de thermodynamische drijvingskracht achter deze isomerisaties, is de thermodynamica van bromide binding en afgifte bestudeerd van het wildtype haloalkaan dehalogenase (oofdstuk 5). Van elke stap werden de thermodynamische parameters bepaald uit de temperatuurafhankelijkheid van de snelheidsconstante van die betreffende stap. ieruit bleek dat de isomerisaties in het driestapsschema een duidelijk grotere enthalpie en entropie in de overgangstoestand hebben dan de isomerisatie in de andere route. Dit suggereert dat tijdens de driestapsroute andere en wellicht grotere conformatieveranderingen plaatsvinden dan in de tweestapsroute. Wij stellen ons dit als volgt voor (Figuur 2): de driestapsroute begint met een structuurverandering die leidt tot een meer open vorm van het actieve centrum waaruit het halide-ion gemakkelijk kan ontsnappen. a het verdwijnen van het halide sluit het actieve centrum zich weer. Daarentegen zou de isomerisatie in het tweestapsschema een verplaatsing van het halide van de sterke bindingsplaats in de holte naar een zwakke bindingsplaats aan het eiwitoppervlak kunnen voorstellen. Tijdens dit proces zouden dan geen structurele aanpassingen nodig zijn. Als de isomerisaties in de bovenste route van Figuur 2 daadwerkelijk conformatieveranderingen zijn, dan blijft de vraag waar in 122
k 1 k 2 k 3 E 1 X - E 1 k 4 k -4 E+S E S E-R X - E X - E k -1 R k -7 X - k 7 X - K 5 (E X - ) * k 6 k -6 K 8 Figuur 2. Kinetiekschema van haloalkaan dehalogenase. Stap 1, substraatbinding in het actieve centrum; stap 2, splitsing van de koolstof halogeenbinding in het substraat; stap 3, hydrolyse van het covalente intermediair en vrijkomen van het gevormde alcohol; stap 4 and 7, conformatieveranderingen voorafgaand aan halide-export. het enzym en hoe deze bewegingen plaatsvinden. De resultaten in oofdstuk 3 met de Trp175Tyr dehalogenasemutant, maar ook eerdere studies met een Phe172Trp mutant, wijzen in de richting van een helixlus-helix gedeelte in het capdomein dat de actieve holte afschermt van de buitenwereld. Mogelijkerwijs zou ook rotatie van de aromatische ring van aminozuur 175, zoals waargenomen voor Tyr175 in oofdstuk 3, een overgang van dicht naar open enzymconformatie kunnen weergeven. ok is voorheen vanuit moleculaire-dynamica simulaties geopperd dat een cis-trans isomerisatie van een proline residu ten grondslag zou kunnen liggen aan een structuurverandering in het capdomein. De relatief hoge activeringsenthalpieën die werden gevonden in oofdstuk 5 voor de isomerisaties in de bovenste halide-exportroute van Figuur 2, komen inderdaad overeen met de waarden voor een cis-trans isomerisatie van een proline. aar aanleiding van het bovenstaande is gesuggereerd dat Pro168 een rol zou kunnen spelen in de isomerisatie van de driestapsroute voor halide-export. Pro168 bevindt zich in het capdomein, het is een cis-proline dat een cistrans isomerisatie kan ondergaan, en er is ooit een spontane mutant van DhlA met een Pro168Ser verandering gevonden die langere substraten sneller kan omzetten. Voor langere substraten is een grotere of flexibelere holte nodig, die blijkbaar kan worden verkregen door Pro168 te veranderen. De rol van Pro168 in DhlA is nader onderzocht in oofdstuk 6. Veranderingen van Pro168 naar een threonine (Thr) of alanine (Ala) leken niet erg veel effect te hebben op de dehalogenase-activiteit, maar de Pro168Ser mutant kon DBE en DCE sneller omzetten dan het wild-type enzym. ok hier bleek weer dat de halide-export versneld was als gevolg van een snellere isomerisatie van het enzym, wat duidt op een flexibeler enzymstructuur. Toch is de mutant een minder efficiënte katalysator doordat de affiniteit van de mutant voor het substraat verminderd is. Dit wijst indirect op een vertraagde splitsing van de koolstof broombinding. Wederom kan worden geconcludeerd dat een flexibeler capdomein een voordeel is voor halide export, maar een nadeel voor de splitsing van de koolstof halogeenbinding, want splitsing vereist een stevige binding en polarisatie van het halogeenatoom door Trp175 en Trp125. oewel uit deze proeven niet direct blijkt dat een proline cis-trans isomerisatie het achterliggende proces van de isomerisatie in 123
halide export is, kan wel worden gezegd dat Pro168 belangrijk is voor het handhaven van structurele stabiliteit in het capdomein en voor een optimale positie van Trp175 in het actieve centrum. et is duidelijk dat meer onderzoek nodig is om de dynamische processen te doorgronden die plaatsvinden tijdens halideexport. Verder is bijvoorbeeld ook niet bekend wat er met het proton gebeurt dat aan is289 gebonden blijft na vertrek van het gevormde alcohol. Tenslotte blijft het een uitdaging om haloalkaan dehalogenase actiever en efficiënter te maken. Zoals blijkt uit de resultaten van dit proefschrift, zal dit niet eenvoudig gaan voor korte substraten als DBE en DCE, omdat de snelheden van splitsing van de koolstof halogeenbinding en halide export nauw met elkaar in balans zijn: versnellen van de laatstgenoemde stap leidt altijd tot vertraging van de eerstgenoemde stap. De beste mogelijkheden om het enzym te verbeteren liggen bij substraten die moeilijk kunnen binden in het actieve centrum. 124
Dankwoord Zooooo, mijn proefschrift is eindelijk af! Dat ging natuurlijk niet zonder de hulp van anderen, dus is de tijd aangebroken om wat mensen te bedanken. Beste Dick, bedankt voor je grenzeloze enthousiasme en optimisme, het razendsnel corrigeren van mijn manuscripten, en je goede ideeën. Ik had mij geen betere begeleider kunnen wensen. Andries en Margot, bedankt voor jullie gastvrijheid en de hulp bij het LC/MS werk. ok denk ik met veel plezier terug aan de samenwerking met de kristallografie, MR, en moleculaire dynamica afdelingen: Ivo, enriëtte, Koen, Bauke, Matteo, Ruud, Ton, Jiri en erman: bedankt voor de inspirerende discussies. Mijn studenten Edwin, enner, Jan Jacob (JJ), Arjen, en Armand, en vanuit de MR hoek Jonna en Peter: hartelijk bedankt voor jullie inzet, de resultaten en de plezierige samenwerking. Piet wil ik bedanken voor de vakkundige hulp bij de PLC, Maldi-TF, GC en andere lastige apparaten; ico voor allerlei andere technische klussen en het kijkplezier tijdens de Tour en lympische Spelen; en Margriet en Sandra voor de secretariële beslommeringen. Mijn (ex-)labgenoten Astrid, Christine, Erik, Frens, Gerrit, elen, Inez, Jeffrey, Johan, Jolanda, Joost, Jos, Marko, Mariël, Marijn, Martin, anne, Qi, René, Rick, Roland, Tjibbe, Uwe, Wim, Wouter, en Wynand wil ik bedanken voor de fijne samenwerking, hun goede ideeën, en de vele leuke dingen op het lab en daarbuiten. Wat ik ook zeker niet zal vergeten zijn de biochemie-borrels die ik samen met Rick en Erik heb georganiseerd, zoals de Paasborrel met fanatieke eierzoekactie en de cocktailborrel als absoluut hoogtepunt. Mannen, bedankt voor de lol! Wynand en Rob: ik ben erg blij dat jullie mijn paranimfen hebben willen zijn. De professoren Dijkhuizen, Dijkstra, en Mark bedank ik voor de positieve beoordeling van dit manuscript. ok ben ik dank verschuldigd aan mijn nieuwe collega s bij het RIVM, voor de belangstelling en de geweldige leuke sfeer. Zonder die sfeer overdag zou ik mij s avonds en in het weekend nooit tot schrijven hebben kunnen bewegen. Wilma, bedankt voor je hulp met het voorkantje; Germie, voor het mij direct thuis laten voelen bij LVR; Rudy, voor de grandioze samenwerking op het pneumo-project; en de bijrijders van carpool nr 4 voor de leuke uurtjes in de file. Uiteraard was er buiten de scheikunde nog een ander leven. Bernard, Jolande, Maaike, Peter, en René (de Ameland-club) en Sandhia: heel hartelijk bedankt voor jullie gezelligheid en voor de bijzondere steun in donkere tijden. Verder bedank ik ook mijn (schoon-)ouders, Rob, Marc, en overige familie en vrienden buiten Groningen voor hun interesse en de nodige plezierige afleiding. Last, but not least bedank ik Rolf, voor alles, want woorden schieten te kort. Straks is eindelijk alle vrije tijd voor onszelf. et is de hoogste tijd voor een leuk feest. Iedereen tot ziens op 10 maart! 125