Microbiële screeningstesten voor antibioticaresiduen in vlees:

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2011-2012 Microbiële screeningstesten voor antibioticaresiduen in vlees: vergelijking van de Europese technieken door Nico COPPENS Promotor : dr. L. Okerman Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

De auteur en de promotor geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor. Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotor zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

VOORWOORD Ik bedank mijn promotor dr. L. Okerman voor de zeer goede begeleiding, het ter beschikking stellen van artikels en de snelle feedback, alsook voor het bieden van de mogelijkheid om enkele labotesten te volgen in het labo van de vakgroep Veterinaire Volksgezondheid en Voedselveiligheid te Merelbeke. Verder bedank ik ook prof. dr. L. De Zutter voor het bezorgen van interessante informatie omtrent het onderwerp. Als laatste bedank ik mijn partner, Jascha, die zo vriendelijk is geweest om deze literatuurstudie na te lezen en steun heeft geboden tijdens het maken ervan.

INHOUDSOPGAVE VOORWOORD INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING p. 1 LITERATUURSTUDIE p. 2 1. Inleiding p. 2 2. De analytische strategie p. 3 3. Microbiële screeningsmethoden p. 4 3.1. De EU vier platentest p. 4 3.2. De specifieke niertesten p. 5 3.2.1. De Belgische niertest p. 6 3.2.2. De nieuwe Nederlandse niertest p. 7 3.2.3. The Nouws antibiotic test p. 8 3.2.4. Pikkemaat et al. : Vier platenmethode p. 10 3.2.5. Nieuwe Twee Platen Test (NTPT) p. 10 3.3. Premi test p. 11 3.4. Verschillende meerplatentesten voor spierweefsel p. 12 3.4.1. Okerman et al.: drie platentest p. 12 3.4.2. Myllyniemi et al. : zes platenmethode p. 13 3.4.3. Combined Plate Microbial Assay (CPMA) p. 14 3.4.4. STAR test p. 16 3.5. Specifieke testen voor quinolonen p. 17 3.5.1. Escherichia coli plaattesten p. 17 3.5.2. Yersinia ruckeri plaattest p. 17 3.6. Specifieke testen voor tetracyclinen p. 17 4. Discussie p. 18 5. Conclusie p. 19 REFERENTIELIJST p. 20 WETGEVING p. 23 BIJLAGEN p. 24

SAMENVATTING Microbiële screeningstesten worden veelvuldig ingezet voor het detecteren van antibioticaresiduen in vlees. Deze testen zijn gebaseerd op de groei inhibitie van sensitieve geïnoculeerde bacteriën. Omwille van hun breed spectrum karakter, hoge sensitiviteit en specificiteit, eenvoudige toepasbaarheid en lage kostprijs worden microbiële testen vaak ingezet als globale screeningsmethode in de eerste stap van een driestappen plan voor de detectie en bepaling van antibioticaresiduen in vlees. De tweede stap omvat de meer specifieke immunologische testen, die steunen op het principe van antigeen-antilichaamreactie, of de receptor testen. De derde stap bestaat uit kwantitatieve testen die de exacte hoeveelheid antibioticaresidu in het product kunnen bepalen. Deze literatuurstudie geeft een vergelijkend overzicht van de microbiële screeningstesten die gebruikt worden in de Europese Unie, waarbij er voornamelijk wordt ingegaan op de opbouw, uitvoering en gevoeligheden van deze testen. De verschillende testen kunnen onderverdeeld worden in vijf categorieën: de Europese vier platentest, de specifieke niertesten, de Premi test, de meerplatentesten en de testen specifiek voor de detectie van quinolonen. Naast de bovenvermelde voordelen, zijn er ook enkele nadelen verbonden aan microbiële screeningstesten. Zo kunnen ze verstoord worden door niet-specifieke antibacteriële factoren, zoals het matrixeffect, en blijft eveneens de identiteit en concentratie van de bacteriegroeiremmende stof relatief onzeker. Bovendien liggen de detectiewaarden van bepaalde antibiotica vaak hoger dan de toegestane maximale residu limieten (MRL) en in sommige gevallen kan de actieve stof zelfs niet gedetecteerd worden. Geen enkele testmethode kan definitief als beste beschouwd worden. Meestal is een combinatie van meerdere microbiële inhibitortesten noodzakelijk om de correcte antibioticumfamilie te identificeren. Uit de literatuurstudie blijkt dat elke test continu moet geëvalueerd worden, omdat het gebruik van antibiotica bij de verschillende dieren ook niet dezelfde is en bovendien verandert in de loop van de tijd. Key words: Antibiotic residue - European Union - Food Legislation - Microbiological screening methods 1

LITERATUURSTUDIE 1. INLEIDING Het veralgemeend gebruik van antibiotica in de diergeneeskunde heeft tot gevolg dat er mogelijk residuen achterblijven in producten van dierlijke oorsprong. Deze antibioticaresiduen zouden een negatieve invloed kunnen hebben op de gezondheid van de consument. 1 Dit heeft geleid tot de invoering van maximale residu limieten (MRL s) van geneesmiddelen voor diergeneeskundig gebruik in levensmiddelen van dierlijke oorsprong door de Europese Unie. Deze MRL s werden oorspronkelijk vastgelegd in de Europese Verordening 2377/90 van de Raad van 26 juni 1990. Deze wet heeft gezorgd voor een gegeneraliseerde kijk ten opzichte van het gebruik van diergeneesmiddelen en de controle erop. In 2010 werd Ver. 2377/90 vervangen door de Europese Verordening 37/2010 van de Commissie van 22 december 2009. Deze nieuwe wetgeving verdeelt de farmacologisch werkzame stoffen in twee groepen op basis van hun maximumwaarden voor residuen in levensmiddelen van dierlijke oorsprong, namelijk toegestane stoffen met MRL s en verboden stoffen. Alle MRL s werden bekomen door middel v an toxicologische proeven, die voldoen aan de analytische, toxicologischfarmacologische en klinische normen en voorschriften betreffende proeven op geneesmiddelen voor diergeneeskundig gebruik beschreven in de Europese Richtlijn 81/852/EEG van de Raad van 28 september 1981. In deze richtlijn worden deze studies en hun voorwaarden besproken, die als doel hebben de farmacokinetische en dynamische eigenschappen van het geneesmiddel en de daaraan gekoppelde neveneffecten bij zowel het behandelde dier als bij de consumerende mens te onderzoeken. De MRL s zijn gebaseerd op de aanvaardbare dagelijkse inname (ADI), met andere woorden de dagelijkse hoeveelheid van een residu van een diergeneesmiddel (mg/kglg)dat men gedurende zijn hele leven mag innemen zonder een merkbaar risico te lopen. Onder de rubriek residuen vind men een beschrijving van de studies die onder andere gericht zijn op het nagaan van het al of niet overblijven van residuen in levensmiddelen na één of meerdere behandelingen, als ook de bepaling van de wachttijden. Deze wachttijden moeten worden gerespecteerd om het gevaar voor de menselijke gezondheid en/of nadelen voor de industriële verwerking van deze levensmiddelen uit te schakelen. Er is nood aan referentietesten voor het opsporen van antimicrobiële residuen in producten van dierlijke oorsprong. Korte tijd na de introductie van antibiotica in de veehouderij werden reeds testen uitgevoerd op melk, in eerste instantie omdat residuen van deze geneesmiddelen de fermentatieprocessen verstoorden. Deze eerste testen waren enkel gebaseerd op de algemene eigenschap van antibiotica, namelijk het kiemgroeiremmend effect. Vanaf de jaren 70 werden ook slachtdieren regelmatig gecontroleerd. In de decennia die daarop volgden, werden nieuwe analysemethoden geïntroduceerd, doch de eenvoudige screeningstesten bleven in gebruik. Ze werden wel gevalideerd en eventueel aangepast aan de nieuwe wetgeving. 2 De Europese Raad heeft op 29 april 1996 de Richtlijn 96/23/EG opgesteld, deze bevat controlemaatregelen ten aanzien van bepaalde stoffen en residuen daarvan in levende dieren en in produkten daarvan. De Europese Beschikking 2002/657/EG van de Commissie van 12 augustus 2002 werd opgesteld ter uitvoering van Richtlĳn 96/23/EG van de Raad, deze beschikking bevat de prestaties van analysemethoden en de 2

interpretatie van de resultaten. Het resultaat van een screeningstest op aanwezigheid van residuen kan zijn dat het monster conform is, dus dat het geen residu bevat of dat de concentratie de MRL niet overschrijdt. In het andere geval is het monster verdacht; het opgespoorde residu is vermoedelijk aanwezig en de concentratie kan hoger zijn dan toegelaten. Een screeningsmethode is geschikt wanneer ze niet meer dan 5% vals-negatieve resultaten geeft bij de gewenste concentratie (meestal de MRL). De screeningstesten zijn meestal de eerste stap in de analytische strategie voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van antibioticaresiduen in producten van dierlijke oorsprong, vals-positieve resultaten kunnen dus wel getolereerd worden omdat de verdachte resultaten toch verder onderzocht worden. Te veel vals-positieve resultaten belasten uiteraard de bruikbaarheid van de test. Momenteel bestaan er verschillende screeningstesten, waarbij op grote schaal voornamelijk microbiële testen worden gebruikt. De microbiële screeningstesten zijn gebaseerd op de groei inhibitie van sensitieve geïnoculeerde bacteriën, en worden beoordeeld door het nagaan van al dan niet aanwezige groei, zuurvorming (ph-daling), stremming, activiteit (ATP of enzymatische activiteit) of lichtproductie. 1 Deze literatuurstudie geeft een vergelijkend overzicht van de microbiologische methoden die gebruikt worden in de Europese Unie. 2. DE ANALYTISCHE STRATEGIE Om de verder besproken microbiële testen te kunnen plaatsen in het geheel van antibioticaresidudetectie en bepaling, bespreken we eerst de volledige analytische strategie. De microbiologische inhibitortesten zijn de eerste stap in een driestappen plan voor het detecteren en identificeren van het aanwezige antibioticaresidu in een product van dierlijke oorsprong. Ook de concentratie van het aanwezig residu moet bepaald worden in het voedingsmiddel. De microbiële testen worden gebruikt voor een globale screening. De ideale screeningsmethode zou aan de volgende eisen moeten voldoen: breed spectrum zijn, een hoge sensitiviteit en specificiteit hebben, en goedkoop en gemakkelijk toepasbaar zijn op een groot aantal monsters. De microbiële testen voldoen aan bijna al deze voorwaarden. Stap twee omvat de immunologische of receptor testen. De immunologische technieken steunen op het principe van antigeen-antilichaamreactie. De sensitiviteit en specificiteit van de binding zijn afhankelijk van het antilichaam. De geschikte antilichamen worden geproduceerd door immunisatie van proefdieren met het antigeen. Het ideale antigeen moet voldoen aan de volgende eisen: lichaamsvreemd zijn, een moleculair gewicht > 10.000 Dalton hebben, en een bepaalde rigiditeit en ruimtelijke structuur bezitten. Antibiotica hebben echter een moleculair gewicht < 10.000 Dalton, maar voldoen voor de rest aan deze voorwaarden. Daarom moeten ze gebonden worden op een dragereiwit alvorens er antilichamen tegen gevormd kunnen worden. 3 De binding tussen beide moleculen zorgt ervoor dat er zowel een B-epitoop als T-epitoop aanwezig is, zodat er een efficiënte primaire immuunrespons optreedt. De uit het proefdier geïsoleerde antilichamen kunnen vervolgens gebruikt worden in een indirecte enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Bij deze test binden de primaire antilichamen op de antigenen in het monster. Na spoeling worden secundaire, 3

diersoortspecifieke, antilichamen toegevoegd. Deze secundaire antilichamen, gekoppeld aan een enzyme, binden op hun beurt aan het hierboven gevormde complex. Na een tweede spoeling wordt het substraat toegevoegd en kan de test worden afgelezen. Er zijn nog ander immunologische technieken, onder andere fluorescentie immuno-assay (FIA). Deze technieken zijn snel en eenvoudig uit te voeren met behulp van eenvoudige apparatuur. De immunologische testen hebben ten opzichte van de bacteriologische testen als voordeel dat ze een veel lagere detectielimiet hebben, een of meerdere antibiotica specifiek kunnen aantonen, en een sneller resultaat geven. Het grootste nadeel is dat er steeds gebruik moet worden gemaakt van proefdieren voor de productie van de antistoffen. 1 Naast de immunologische testen bestaan er ook commerciële receptortesten die binnen een tiental minuten producten van dierlijke oorsprong kunnen controleren op de aanwezigheid van antibiotica, onder andere tetracyclines (bijvoorbeeld tetrasensor van Unisensor) en beta-lactam (bijvoorbeeld BetaStar van Neogen USA). Hierbij wordt de receptor voor het antibioticum geïsoleerd uit een bacterie, zodat er geen proefdieren geïmmuniseerd moeten worden. De receptortesten zijn antibioticagroepspecifiek en sommige zijn perfect toepasbaar op spier- en nierweefsel. 4 Het juiste werkingsmechanismen wordt niet altijd vrijgegeven door de fabrikant. Stap drie bestaat uit kwantitatieve testen, die de exacte hoeveelheid antibioticaresidu in het product kunnen bepalen. Hierbij wordt gebruik gemaakt van chemische scheidings- en identificatiemethoden, zoals gaschromatografie (GC), gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), high performance liquid chromatografie (HPLC) en thin-layer chromatografie (TLC). Deze testen worden niet als screeningstesten gebruikt, omdat ze zeer arbeidsintensief en ingewikkeld zijn, en dus uitgevoerd dienen te worden door hoger opgeleid personeel met meestal dure apparatuur. 3. MICROBIELE SCREENINGSMETHODEN 3.1. DE EU VIERPLATEN TEST De Europese vier platentest is uitsluitend een screeningstest en identificeert het mogelijk aanwezige antibioticaresidu niet. Er wordt gebruik gemaakt van spierweefsel als testmateriaal, waarbij men zich steeds bewust moet zijn van het matrix effect. Dit effect wordt vermoedelijk veroorzaakt door meerdere factoren: de antibioticamoleculen kunnen gebonden blijven aan het weefsel, waardoor ze minder goed worden vrijgegeven, het weefsel beïnvloedt de ph van de bodem, en groeistimulerende stoffen diffunderen vanuit het weefsel in het milieu. 5 De remzone zal dus kleiner zijn bij het vleesmonster met een bepaalde concentratie van een antimicrobieel residu dan bij een papieren schijfje geïmpregneerd met dezelfde concentratie. Dit leidt tot meer valsnegatieve resultaten. 5,6 De test bevat vier testplaten met 5 ml medium, bestaande uit drie agarplaten geïnoculeerd met Bacillus subtilis BGA sporen (5x10 4 sporen/ml) bij ph 6; 7,2 en 8 voor respectievelijk plaat 1, 2 en 3, en een plaat (plaat 4) met Kocuria rhizophila (ATCC 9341), het vroegere Micrococcus luteus (5x10 4 CFU/ml). Bij het medium geïnoculeerd met B. subtilis (ph 7,2) wordt er trimethoprim (5 µg/ml) toegevoegd, zodat de sensitiviteit voor sulfonamiden verhoogd wordt. 7 4

Op iedere plaat worden twee vleesschijfjes (tegenover elkaar) en één controleschijfje (centraal) gelegd. Deze vleesschijfjes hebben een diameter van 8 mm en zijn 2 mm dik. Ze worden met behulp van een specifiek toestel uit het half bevroren vlees geboord. Elke testplaat heeft een specifiek controleschijfje: een papieren schijfje geïmpregneerd met 10 µl penicilline oplossing (0,02 IU/ml) op plaat 1, 10 µl sulfadimidine oplossing (20 µg/ml) op plaat 2, 10 µl dihydrostreptomycine oplossing (5 µg/ml) op plaat 3 en 10 µl erythromycine oplossing (0,25 µg/ml) op plaat 4. De platen geïnoculeerd met B. subtilis worden geïncubeerd bij 30 C gedurende 18-24 uur, en de plaat geïnoculeerd met K. rhizophila bij 37 C gedurende 24 uur. 8 Na incubatie van de testplaten kunnen de remzones worden gemeten met een geijkte schuifmeter, zoals bij alle microbiële testen. Alvorens de remzones van de monsters af te lezen moet men eerst nagaan of de remzones rond de hierboven beschreven controleschijfjes de vereiste diameters vertonen. De monsters worden positief bevonden wanneer op minstens één van de vier platen rond beide vleesschijfjes een remzone wordt gemeten van minstens 2 mm. Indien er slechts één van de vier platen positief is, kan men best de test herhalen ter controle. 8 Wanneer geen enkele remzone waargenomen wordt op elk van de vier platen, wordt het monster als conform beschouwd. De dikte van de bodem is minimaal, waardoor de detectielimieten optimaal zijn. De verklaring hiervoor is dat het antibioticaresidu zich slechts in twee dimensies zal verdelen, waardoor de remzone dus groter wordt. Dit technisch aspect treedt op bij alle testen die gebruik maken van een vaste voedingsbodem, uitgezonderd de Premi test. 4 Deze methode werd lang gebruikt als standaard screeningstest, doch uit verder onderzoek blijkt dat de EU vier platentest niet zo gevoelig is. Okerman et al. 6 toonden aan dat de test ongevoelig is voor sulfonamiden en quinolonen. Uit dit onderzoek bleek ook dat plaat 2 en 3 overbodig zijn. Plaat 1 is gevoelig voor tetracyclinen en β-lactams, en plaat 4 aan β-lactams en sommige macroliden. Voor de detectie van dit beperkt aantal antibiotica is deze methode te complex. Overigens kan deze test slechts worden gebruikt voor het screenen van vleesmonsters, vermits er bij niermonsters te veel vals positieven optreden. Deze vals positieven worden veroorzaakt door de aanwezigheid van lysozyme, een kiemgroeiremmende stof, in het nierweefsel. Lysozyme diffundeert ook in de agar, net zoals het antibiotica residu en er wordt dus een remzone gevormd. Omdat de EU4pt te omslachtig is, werden in België en Nederland de voorkeur gegeven aan oneplate niertesten. 6 3.2. SPECIFIEKE NIERTESTEN Niertesten hebben algemeen als voordeel dat er in nierweefsel en nierbekkenvocht gemiddeld hogere antibioticaresidu gehaltes aanwezig zijn, dit in vergelijking met de aanwezige gehaltes in vlees. 9 Een nadeel is dat nierweefsel een hoge concentratie aan lysozyme bevat, een endogeen component die microbiële inhibitie veroorzaakt. Deze inhibitie heeft een verhoogd percentage aan vals positieve resultaten tot gevolg. 10 Het grootste nadeel van de niertesten is dat er geen verband bestaat tussen de gedetecteerde renale concentratie en de MRL in vlees. 5

3.2.1. Belgian kidney test De Belgische niertest bestaat uit één testplaat met als testorganisme B. subtilis. Als cultuurmedium wordt een standaard II nutriënt agar (Merck 7883)gebruikt waaraan trimethoprim (0,2 µg/ml agar) en B. subtilis BGA sporen (5 x 10 4 sporen/ml) worden toegevoegd. De agarplaten kunnen tot zeven dagen na bereiding nog gebruikt worden, indien ze in een plastiekzak bij 4 C bewaard worden. 11 Na verwijdering van het nierkapsel wordt een incisie gemaakt van nierschors tot nierbekken. Hierna worden twee papieren schijfjes in het nierbekkenvocht gelegd. Indien dit niet aanwezig is, worden de schijfjes op de medulla geplaatst. Wanneer beide schijfjes verzadigd zijn met nierbekkenvocht, worden ze op de agarbodem geplaatst samen met een stukje cortexweefsel (diameter 8 mm, dikte 2 mm). 12 Op iedere testplaat worden vier controleschijfjes met een diameter van 12,7 mm geplaatst, die elk een ander antibioticum bevatten: 1 µg tylosine, 1 µg sulphadimidine, 1 µg oxytetracycline of 1 µg streptomycine. Zonder pre-incubatie worden de platen overnacht geïncubeerd bij 30 C. Na controle van de remzone rond de controleschijfjes, worden de remzones rond de geïmpregneerde papierschijfjes en het stukje niercortex, indien aanwezig, gemeten. De monsters worden positief bevonden wanneer de remzone rond minstens één geïmpregneerd schijfje en cortexschijfje respectievelijk 20 mm en 2 mm bedraagt. 11 Dit is een breed spectrum screeningstest die gevoelig is aan de meeste antibiotica van de volgende families: β-lactams, tetracyclinen, sulphonamiden, aminoglycosiden, macroliden en quinolonen. De gevoeligheid voor sulfonamiden wordt verhoogd door de toevoeging van trimethoprim aan de testagar. 7 Als men de detectielimieten van de Belgische niertest vergelijkt met de door Europa opgestelde MRL s en de Europese microbiële referentietest (EU4pt), komen Koenen-Dierick et al. 11 tot de volgende conclusies: De detectielimieten van de β-lactam antibiotica (ampicilline en benzylpenicilline) zijn gelijkaardig voor beide testen en liggen rond de bijhorende MRL s. Deze van tetracycline, oxytetracycline en streptomycine zijn ook ongeveer gelijk aan deze van EU4pt, doch doxycycline wordt aangetoond in lagere concentraties dan de MRL. De éénplaattest is daarentegen veel minder gevoelig voor macroliden, vermits er geen gebruik wordt gemaakt van het testorganisme K. rhizophila en omwille van de smalle ph-marge van deze groep van antibiotica. De Belgische niertest heeft een breed spectrum en is eenvoudiger en goedkoper den de EU4pt. Deze test wordt al sinds 1989 gebruikt in België, momenteel enkel nog in geval van noodslachtingen. 11 (bijlage ǁ) 6

3.2.2. Nieuwe Nederlandse Niertest De nieuwe Nederlandse niertest (NNNT) toont met behulp van het testorganismen Bacillus subtilis BGA aan of er al dan niet antibioticaresidu s aanwezig zijn in het gecollecteerde nierbekkenvocht. 13-15 Het kapsel wordt kort voor de keuring verwijderd (maximaal 72 uur na het slachten). De nier moet in tussentijd koel (4 C) bewaard worden. Het insnijden van de nier gebeurt met een proper mes van nierschors naar nierbekken. Vervolgens worden er vier papieren schijfjes in het nierbekken gelegd en de nier terug gesloten en aangedrukt. Na 30 minuten worden twee schijfjes diagonaal op een voedingsbodem gelegd, die werd geïnoculeerd met B. subtilis BGAsporensuspensie (10 7 sporen/ml). De twee andere schijfjes worden in een cupje bewaard bij - 20 C voor mogelijke herkeuring tot 24 uur na de officiële keuringsuitspraak. Op de testplaat worden in het midden 3 controleschijfjes geplaatst, respectievelijk geïmpregneerd met 2 µg tylosine, 0,5 µg sulfadimidine en 2 µg oxytetracycline. Er wordt vervolgens 25 µl trimethoprim oplossing (2 µg TMP/ml NaCl (10%) oplossing) gedruppeld op elk papieren schijfje. De testplaat wordt geïncubeerd bij 37 C gedurende 13-18 uur. Na incubatie worden de remzones rond alle schijfjes gemeten, zowel die van de standaardcontroleschijfjes als deze van de met nierbekkenvocht geïmpregneerde schijfjes. De remzones rond de controleschijfjes moeten overeenkomen met de vooropgestelde waarden door het RIKILT. De test is positief wanneer de remzones rond beide met nierbekkenvocht geïmpregneerde schijfjes 20 mm zijn. Indien er rond één van beide schijfjes geen remming optreedt, dan is de test negatief. 13-15 Tabel 1: In vivo detectielimieten (µg/g) van de NNT en de NNNT (varkens) (uit Nouws et al., 1988) Antibioticum NNT (nierschors) penicilline > 0,1* > 0,1 ampicilline > 0,05 > 0,3 amoxycilline > 0,05 > 0,3 chlooramfenicol nt > 10 oxytetracycline > 8 > 1 doxycycline > 8 > 0,3 neomycine > 50* > 50 kanamycine > 100** > 50 dihydrostreptomycine > 100** > 100 spiramycine > 100** > 8 tylosine > 8 > 4 erythromycine > 5 > 2 sulfadimidine nt > 1 sulfadimethoxine nt > 0,3 sulfadiazine nt > 0,3 sulfadoxine nt > 0,3 NNNT (nierbekken) nt = niet traceerbaar, * literatuurgegevens, ** geschatte waarden op basis van in vitro gegevens verkregen met weefselhomogenaten 7

De detectielimieten van NNNT liggen lager dan die van de eerder gebruikte NNT en is bijgevolg gevoeliger. (tabel 1) Uit de vergelijking van de detectieniveaus van de NNNT en de EU4pt kon worden vastgesteld dat wanneer de EU4pt positief was, de NNNT ook positief of verdacht was. In een aantal gevallen echter was de NNNT positief en de EU4pt negatief. Dit impliceert dat de NNNT in vivo veel gevoeliger is dan de standaard EU4pt, wat o.a. wordt veroorzaakt door een hogere concentratie aan antibioticaresidu in het nierbekkenvocht dan in het spierweefsel. Door toevoeging van NaCl aan de voedingsbodem en trimethoprim aan zowel voedingsbodem als de met nierbekkenvocht geïmpregneerde schijfjes werd een verhoogde detectiecapaciteit voor sulfonamiden verkregen. De detectielimieten van aminoglycosiden zijn echter hoger ten opzichte van de EU4pt. 16,17 Er kan geconcludeerd worden dat de Nieuwe Nederlandse Niertest even eenvoudig wordt uitgevoerd als de originele Nederlandse Niertest en het detectiespectrum van de EU4pt benadert. Het is een gestandaardiseerde test die routinematig kan gebruikt worden voor detectie van antibioticaresiduen bij slachtdieren. 3.2.3. The Nouws antibiotic test (NAT-screening): The Nouws antibiotic test werd ontwikkeld omdat uit honderdduizenden screeningstesten bleek dat de NNNT de MRL s niet kon waarborgen. In plaats van de één plaattest werd een vijf platentest ontwikkeld, met als testorganismen: B. cereus (ATCC 11778), Yersinia ruckeri (NCIM 13282), K. rhizophila (ATCC 9341), B. subtilis BGA sporen en Bacillus pumilus (CN 607). De verschillende testorganismen worden geïnoculeerd op verschillende agars bij verschillende ph s. 18 (tabel 2) Plaat Testorganismen agar medium supplement T Bacillus cereus ATCC 11778 (10 5 CFU/ml) Tabel 2: compositie van de NAT-screening testplaten (uit Pikkemaat et al., 2008) iso-sensitest agar (Oxoid) ph 6 + 625 µg/l CAP 200 µl 0,1M fosfaatbuffer ph 6 + 2 µg/ml CAP incubatie Temp. ( C) 30 Q B&M A Yersinia ruckeri NCIM 13282 (10 6 CFU/ml) Kocuria rhizophila ATCC 9341 (10 6 CFU/ml) Bacillus subtilis BGA spores (10 5 CFU/ml) plate count agar (Difco) ph 6,5 200 µl 0,1M fosfaatbuffer ph 6,5 30 iso-sensitest agar (Oxoid) ph 8 200 µl 1,5M fosfaatbuffer ph 8 37 plate count agar (Difco) ph 8 200 µl 0,1M trisbuffer ph 8,5 37 S Bacillus pumilus CN 607 (10 6 CFU/ml) DST-agar (Oxoid) ph 7 + 7 µg/l TMP 300 µl 0,133M fosfaatbuffer ph 8 37 De test maakt, net zoals bij de NNNT, gebruik van papieren schijfjes geïmpregneerd met nierbekkenvocht. Deze schijfjes worden in punch holes in een agarbodem geplaatst, waarna er een plaat-specifieke buffer wordt toegevoegd. Er worden ook papieren controleschijfjes in 8

de agar geplaatst met respectievelijk 0,06 µg oxytetracycline (T-plaat); 0,04 µg flumequine (Qplaat); 0,05 µg tylosin (B&M-plaat); 0,05 µg DH-streptomycine (A-plaat) en 0,05 µg sulfadiazin (S-plaat). Vervolgens worden de platen geïncubeerd gedurende 18-24 uur bij de vooropgestelde temperatuur (tabel 2). Tenslotte worden alle remzones, ook deze van de controle schijfjes, gemeten. De test is geslaagd indien de remzone rond de controleschijfjes 15 mm bedraagt. De testmonsters zijn positief bij een remzone > 1 mm rond de punchopening en negatief bij een remzone < 1 mm. 18 Iedere testplaat heeft een hogere specificiteit voor een bepaalde groep van antibiotica: de T- plaat detecteert tetracyclinen, de Q-plaat quinolonen, de B&M-plaat β-lactam antibiotica en macroliden, de A-plaat aminoglycosiden en de S-plaat sulfonamiden. Uit onderzoek blijkt dat vier van de vijf testen een gelimiteerde of geen cross-reactiviteit hebben met antibiotica uit ander groepen, waardoor de identificatie van het residu zeer accuraat kan gebeuren. De S- plaat is de minst specifieke van de vijf, vermits deze ook gevoelig is aan alle β-lactam antibiotica (behalve cefquinome) en de macroliden. Het resultaat van de B&M plaat kan uitsluitsel geven over de antibioticagroep, vermits deze ongevoelig is voor sulfonamiden. (tabel 3) Bij onzekerheid over de antibiotica groep waartoe een residu behoort, wordt gekeken naar de plaat met de grootste remzone. 18,19 Familie penicillinen cephalosporinen sulfonamiden tetracyclinen macroliden Tabel 3: The Nouws Antibiotic Test (rund) - detectielimieten (µg/kg) (naar Pikkemaat et al., 2008) MRL NAT NAT NAT NAT NAT NAT (µg/kg) plate 1 (T) plate 2 (B&M) plate 3 (Q) plate 4 (S) plate 5 (A) Algemeen benzylpenicilline 50 40 25 100 40 ampicilline 50 50 75 200 50 amoxicilline 50 100 75 75 cloxacilline 300 1500 400 1500 cefalexine 1000 1500 > 2000 1500 ceftiofur 6000 100 2000 6000 100 cefapirine 100 200 100 200 200 sulfadiazine 100 200 200 sulfadimidine 100 200 200 sulfadimethoxine 100 100 100 tetracycline 600 75 1500 700 75 oxytetracycline 600 75 1500 1000 75 chlortetracycline 600 50 1000 400 50 doxycycline 600 50 1000 200 50 erythromycine 200 150 200 200 150 tylosine 100 400 400 400 tilmicosine 1000 300 500 500 300 lincosamiden lincomycine 1500 700 1200 700 quinolonen Component danofloxacine 400 100 350 300 100 enrofloxacine 200 25 350 750 50 flumequine 1500 150 7500 150 streptomycine 1000 100 a 100 a gentamycine 750 50 50 aminoglycosiden neomycine 5000 4000 100 100 apramycine 20000 10000 1500 1500 a : dihydrostreptomycine 9

3.2.4. Pikkemaat et al. : Vier platenmethode Deze niertest verloopt analoog met de NAT screening, echter in plaats van nierbekkenvocht wordt gebruikt gemaakt van gehomogeniseerd nierweefsel. De S-plaat zit niet vervat in de test, omdat deze plaat het minst specifiek is en niet gebruikt kan worden voor de identificatie van het antibiotica residu. De Pikkemaat vier platenmethode wordt beschouwd als een postscreening methode, die instaat voor de identificatie van het antibiotica residu na een algemene microbiële screeningsmethode. 19 3.2.5. Nieuwe Twee Platen Test (NTPT) De nieuwe twee platen niertest werd ontwikkeld door Dang et al. en bestaat uit twee verschillende voedingsbodems met een verschillende ph die geïnoculeerd worden met hetzelfde testorganisme, namelijk B. subtilis. Deze screeningstest wordt uitgevoerd op vleesextracten, maar kan ook toegepast worden op garnaalextracten. Deze vleesextracten (1,5 g/ 50 µl) worden bekomen na uitvoering van onderstaand protocol. 12 g vlees wordt gehomogeniseerd met 12 ml acetonitrile/acetone (70/30) gedurende 10 minuten, gevolgd door centrifugatie (1500 g / 10 min / 15 C). Het supernatans wordt vervolgens overgebracht naar twee steriele tubes. Het solvent wordt geëvaporeerd in een bad van 40 C, waarna de droge residuen worden opgelost in respectievelijk water en ethanol. De met vleesextract geïmpregneerde papieren schijfjes worden op de geïnoculeerde voedingsbodems aangebracht: vier schijfjes op plaat 1 (test agar ph 6) en drie schijfjes op plaat 2 (standaard II nutriënt agar ph 7,5). Op plaat 1 zijn schijfje 1 en 2 geïmpregneerd met de waterige oplossing en schijfje 3 en 4 met de methanol oplossing. Schijfje 2 en 4 worden bedruppeld met 20 µl NaOH (1%). De drie schijfjes (5 t/m 7) op plaat 2 zijn geïmpregneerd met de methanol oplossing, waarbij schijfje 5 wordt bedruppeld met 20 µl NaOH (1%), schijfje 6 met 10 µl trimethoprim (10 µg/ml), en schijfje 7 met 10 µl TMP en 10 µl PABA oplossing (100 µl/ml). De platen worden geïncubeerd bij 30 C gedurende 18 uur. De test is positief wanneer de remzone 1.5 mm bedraagt. 20 Uit de studie van Dang et al. 21 blijkt dat de aminoglycosiden en macroliden een grotere remzone geven op plaat 2. Tetracyclinen, fluoroquinolonen, sulfonamiden, florfenicol en β- lactam antibiotica geven een grotere remzone op plaat 1. Sulfonamiden kunnen enkel gedetecteerd worden in aanwezigheid van TMP en de β-lactam antibiotica worden enkel gedetecteerd in de waterige vleesextracten. De fluoroquinolonen, met uitzondering van oxoline zuur en flumequine, worden beter gedetecteerd in de aanwezigheid van NaOH, omdat zij actiever zijn bij een alkalische ph. Een beperkte identificatie van het residu is afhankelijk van de schijfjes waarrond de remzone optreedt. De NTPT detecteert bovenstaande zes antibioticagroepen bij concentraties rond of gelijk aan de respectievelijke EU MRL s. 21 (bijlage ǁ) 10

3.3. PREMI TEST: De Premi Test is een commerciële test afgeleid van een algemeen toegepaste melktest, de Delvotest, die aangepast werd voor toepassing op allerlei voedingsmiddelen van dierlijke oorsprong. De test detecteert een breed spectrum van de meest gebruikte antibiotica en dit op een relatief eenvoudige manier binnen de vier uur. De detectielimieten worden per antibioticum en per product van dierlijke oorsprong beschreven in een door het bedrijf opgestelde tabel. (bijlage ǀ en ǁ) De test bevat een ampul met een vast groeimedium geïnoculeerd met Bacillus stearothermophilus, waaraan een indicator voor groei werd toegevoegd. In deze ampul wordt bijvoorbeeld vleesvocht gebracht dat werd uitgeperst met behulp van een lookpers. Na incubatie van het mengsel gedurende 20 min bij kamertemperatuur wordt het vleesvocht verwijderd. Vervolgens wordt na enkele wasstappen de ampul geïncubeerd bij 64 C gedurende 3 uur. Na kleurverandering van de negatieve controle kan het resultaat worden afgelezen. 22 Wanneer de bodem geel gekleurd is, dan is er bacteriegroei en wordt het monster negatief verklaard. Wanneer daarentegen het buisje paars blijft (met andere woorden niet van kleur veranderd is), is er geen bacterie groei en is het monster positief. Er is echter geen identificatie van het aangetoonde antibioticaresidu. 22 (figuur 1) Figuur 1: kleuromslag bij Premi test (uit R-biopharm, 2010) Uit vergelijkende studies bleek dat de detectielimiet voor tetracycline te hoog is (> 200 µg/kg) en dat hierdoor 50% van de positieve monsters niet werden gedetecteerd. Gezien de hoge tetracycline consumptie bij voedselproducerende dieren, is de Premi Test dus minder geschikt als screeningstest. 4,23 Stead et al. 24 toonden aan dat wanneer men vleesextract gebruikt in plaats van vleesvocht de sensitiviteit voor tetracyclinen en sulfonamiden steeg. Het vleesextract wordt als volgt bekomen: multiresidu extractie solvent (70:30 eacetonitrile/aceton) wordt toegevoegd aan 2 g vlees en het mengsel wordt gehomogeniseerd gedurende 45 seconden. Na centrifugatie wordt het supernatant geëvaporeerd onder stikstofgas bij 40-45. Vervolgens wordt 250 µl Lab Lemco broth (8 g/l) toegevoegd. Dit proces is omslachtiger en dient uitgevoerd te worden in een laboratorium. Omwille van praktische redenen wordt bij routine screening dan ook meestal vleesvocht gebruikt in plaats van vleesextract. 24 Uit onderzoek van Stead et al. bleek ook dat de test gevoeliger is voor antibiotica met een grampositief spectrum dan voor antibiotica met een gram-negatief spectrum zoals aminoglycosiden. 24 11

De test is dus wel gevoelig voor macroliden (onder andere tylosine) en zeer gevoelig voor β- lactam antibiotica, en ook voor sulfonamiden. 25 Quinolonen worden helemaal niet aangetoond. De Premi test kan gebruikt worden als screeningstest, maar slechts in combinatie met een test specifiek voor het opsporen van tetracyclines. Het grote voordeel van deze test is dat ze eenvoudig uit te voeren is en heel snel resultaat geeft (binnen 4 uur). Dit weegt echter niet op tegen de lage detectie capaciteit. 4,23 Toch wordt deze test in Frankrijk gebruikt als prescreeningstest, waarna de positieve monsters hertest worden met de EU4pt. 26 De producent verklaart ook dat deze test toepasbaar is op nierweefsel, vis, eieren en voeder. Dit wordt echter nog niet ondersteund door wetenschappelijke gegevens. 22 3.4. VERSCHILLENDE MEERPLATENTESTEN 3.4.1. Okerman et al.: drie platentest De Okerman 27 drie platentest werd ontwikkeld voor de detectie van antibioticaresiduen in kippenvlees. De platen (tryptone soya agar, ph 6) worden geïnoculeerd met respectivelijk K. rhizophila (ATCC 9341), B. cereus, en een Escherichia coli (Bayer 14 suspensie). Hierop worden de te onderzoeken stukjes vlees aangebracht, samen met een controleschijfje. Op de voedingsbodems geïnoculeerd met B. cereus en E. coli wordt een papieren schijfje geplaatst geïmpregneerd met oxytetracycline (2 µg/ml) of flumequine (2 µg/ml), en op deze geïnoculeerd met K. rhizophila een schijfje met penicilline G (2 IU/ml). De platen geïnoculeerd met B. cereus en E. coli worden geïncubeerd bij 30 C gedurende 12-16 uur en de voedingsbodem met K. rhizophila bij 37 C gedurende 20-24 uur. De test is positief wanneer er complete remzones zijn van > 2 mm. Deze test is voornamelijk gevoelig voor residuen van tetracyclines, β-lactam antibiotica en fluoroquinolonen. Ieder testorganisme is bij ph 6 optimaal gevoelig voor één van de bovenstaande antibioticagroepen en de combinatie vertoont een typisch inhibitie patroon voor elke antibiotica familie. Zo is K. rhizophila gevoelig voor β-lactam antibiotica, B. cereus voor tetracyclines en E. coli voor (fluoro)quinolonen. De detectielimieten(lod) van de eerder vermelde antibioticagroepen is met deze test lager dan of gelijk aan de wettelijk vastgelegde MRL. 27 (bijlage ǀ en ǁ) Uit vergelijkende studies (tabel 4) bleek dat de detectielimieten voor residuen van tetracyclines, β-lactam antibiotica en/of fluoroquinolonen lager liggen ten opzichte van de oneplate B. subtilis (ph 6). Het verschil tussen de detectielimieten van de tetracyclines was echter minimaal. De gebruikte testorganismen in de drie platentest van Okerman zijn echter niet gevoelig voor aminoglycosiden en sulfonamiden en deze worden bijgevolg niet gedetecteerd. Er is ook geen adequate detectie van macroliden, die een hogere ph vereisen. Zoals de auteurs zelf al concludeerden is dit een eng spectrum methode. Hierbij moet gezegd worden dat de aangetoonde antibiotica het meest gebruikt worden in de pluimveehouderij. 27 12

Familie penicillinen tetracyclinen quinolonen Tabel 4: vergelijking tussen de Okerman 3pt en B. subtilis (ph 6) (naar Okerman et al., 2001) Component MRL Okerman* B. subtilis* (µg/kg) 3pt 1pt penicilline G 50 9 4 ampicilline 50 6 30 amoxicilline 50 10 30 tetracycline 100 40 50 oxytetracycline 100 30 80 chlortetracycline 100 3 5 doxycycline 100 6 10 enrofloxacine 100 15 40 flumequine 200 15 40 ciprofloxacine 400 5 100 * de concentratie (ng/g) die zorgt voor een remzone met een diameter van 12 mm 3.4.2. Myllyniemi et al. : zes platenmethode De Myllyniemi zes platenmethode maakt gebruik van zowel nier- als spierweefsel voor het aantonen van antibioticaresiduen. Er wordt gebruik gemaakt van vier verschillende soorten voedingsbodems, nl. antibioticum medium No. 1 (ph 6,55; Difco Laboratories), test agar ph 6 (Merck), test agar ph 7,2 (Merck) en test agar ph 8 (Merck). Twee agarbodems worden geïnoculeerd met B. subtilis (ph 6 en 7.2), twee met K. rhizophila (ph 6 en 8), één met E. coli en een laatste bodem met B. cereus. De ph op iedere bodem wordt op peil gehouden door de toevoeging van een bodemspecifieke buffer. Bij drie van de bovenstaande testplaten wordt een supplement toegevoegd, namelijk penicillinase (200 ku/ml) of trimethoprim (0,05 µg/ml). 28 (tabel 5) Tabel 5: compositie van de Myllyniemi testplaten (uit Myllyniemi et al., 2001) Plaat Testorganismen Agar medium Supplement 1 Bacillus cereus ATCC 11778 antibioticum medium (Difco) ph 6,55 2 Bacillus subtilis BGA spores testagar (Merck) ph 6 penicillinase 200 ku a /ml 3 Bacillus subtilis BGA spores testagar (Merck) ph 7,2 trimethoprim 0,05 µg/ml 4 Kocuria rhizophila ATCC 9341 testagar (Merck) ph 6 5 Kocuria rhizophila ATCC 9341 testagar (Merck) ph 8 penicillinase 200 ku a /ml 6 a Kersey units Escherichia coli ATCC 11303 testagar (Merck) ph 7,2 13

Na het aanbrengen van een cilindrisch stukje nier, dat zowel cortex als medulla bevat, en een stukje spierweefsel op de agarplaten, worden deze geïncubeerd bij 20 C gedurende 1 uur en vervolgens bij 30 C gedurende 18-24 uur. Tenslotte worden de remzones gemeten en vergeleken met de referentiewaarden. Indien de remzone < 2 mm bedraagt op alle testplaten of < 4 mm op de plaat geïnoculeerd met K. rhizophila (ph 6), dan wordt de test beschouwd als niet-specifiek. Met de Myllyniemi zes platentest detecteert en identificeert men de meest frequent gebruikte antibiotica onder de MRL: penicilline G als penicillinase-gevoelige penicilline, enrofloxacine en ciprofloxacine als fluoroquinolones, en oxytetracycline als lid van tetracycline groep. 28 (Bijlage ǀ) 3.4.3. Combined Plate Microbial Assay (CPMA) De Combined Plate Microbial Assay test bevat zes testplaten en is geschikt voor de screening van de monsters en voor de identificatie van de mogelijk gevonden residuen. De zes platen worden geïnoculeerd met één van volgende testorganismen: B. cereus sporen (ATCC 11778), B. subtilis BGA sporen, K. rhizophila (ATCC 9341) of E. coli (ATCC 11303). 29 (tabel 6) Tabel 6: de samenstelling van de CPMA testplaten (naar Ferrini et al., 2006) Plaat Testorganismen Agar medium Supplement Incubatie temp. ( C) 1 Bacillus cereus ATCC 11778 (5x10 4 CFU/ml) antibioticum medium No. 2 ph 5,9-30 2 3 Bacillus subtilis BGA spores (5x10 4 CFU/ml) Bacillus subtilis BGA spores (5x10 4 CFU/ml) testagar (Merck) ph 6-30 testagar (Merck) ph 7,2 0,12 µg/ml TMP 30 4 Bacillus subtilis BGA spores (5x10 4 CFU/ml) antibioticum medium No. 5 ph 8 0,12 µg/ml TMP 30 5 Kocuria rhizophila ATCC 9341 (5x10 4 CFU/ml) testagar (Merck) ph 8-37 6 Escherichia coli ATCC 11303 (5x10 4 CFU/ml) testagar (Merck) ph 7,2-37 Alvorens de monsters aan te brengen in de punch holes, wordt het gepreleveerde stukje weefsel ingevroren en versneden tot de juiste grootte (8 mm diameter en 2 mm dik). De testplaten worden verder voorbereid volgens tabel 7, waarna controleschijfjes worden 14

geplaatst op de voedingsbodems. Deze controleschijfjes zijn specifiek voor elke testplaat: chloortetracycline hydrochloride (0,001 µg/schijfje) op plaat 1, penicilline G sodium zout (0,002 IU/schijfje) op plaat 2, sulfadiazine sodium zout (0,005 µg/schijfje) op plaat 3, streptomycine sulfaat (0,005 µg/schijfje) op plaat 4, erythromycine (0,0025 µg/schijfje) op plaat 5 en ciprofloxacin (0,001 µg/schijfje) op plaat 6. Vervolgens worden de testplaten geïncubeerd gedurende 18-24 uur bij de temperatuur beschreven in tabel 6. 29 Tabel 7: Gebruik en interpretatie van de CPMA testplaten (uit Ferrini et al., 2006) Plaat Aantal monsters/plaat Monsterverdeling Gevoelige antbiotica familie 1 2 2 2 3 4 4 2 5 2 6 2 S: monster S S + 20 µl/schijfje MgSO 4 S S + 20 µl/schijfje penicillinase S S + 20 µl/schijfje penicillinase S + 20 µl/schijfje MgSO 4 S + 20 µl/schijfje 4-aminobenzoëzuur S S + 20 µl/schijfje MgSO 4 S S + 20 µl/schijfje penicillinase S S + 20 µl/schijfje MgSO 4 tetracyclinen β-lactams β-lactams aminoglycosiden en/of quinolonen sulfonamiden aminoglycosiden macroliden en/of β-lactams quinolonen Op basis van het al dan niet aanwezig zijn van een remzone en de grootte ervan kan bepaald worden tot welke groep het mogelijke antibioticaresidu behoort. Een testplaat waarop een remzone waarneembaar is rond het zuivere monster, maar niet rond het monster met supplement, is een indicatie voor aanwezigheid van een residu dat behoort tot de antibioticagroep waaraan deze plaat specifiek gevoelig voor is. Plaat 1 t/m 6, met uitzondering van plaat 3, zijn gevoelig voor respectievelijk tetracyclines, β-lactams, aminoglycosiden, macroliden (aanwezigheid remzone rond gesupplementeerd monster) en β-lactams (geen remzone rond gesupplementeerd monster), en quinolones. Plaat 3 wordt geïnoculeerd met B. subtilis, die gevoelig is aan de meeste antibiotica. Daarom worden op deze plaat vier monsters aangebracht waarvan drie bedruppeld zijn met een verschillend supplement. Indien er een remzone aanwezig is rond het zuivere monster, maar niet rond één van de gesupplementeerde monsters, dan is dit indicatief voor aanwezigheid van sulfonamiden (geneutraliseerd door PABA), aminoglycosiden/quinolonen (geneutraliseerd door MgSO 4 ), of β-lactams (geneutraliseerd door penicillinase). De detectielimieten zijn kleiner of gelijk aan de vooropgestelde MRL s voor vlees. 29 (bijlage ǀ) 15

3.4.4. STAR test De STAR test (Screening Test for Antibiotic Residues) is samengesteld uit vijf verschillende agarplaten, elk geïnoculeerd met een verschillend testorganisme. Zoals voorgaande testen combineert deze test zowel de kwalitatieve bepaling als de groepsidentificatie van het mogelijk aanwezige antibioticaresidu. Hij werd oorspronkelijk ontwikkeld voor antibioticaresidu detectie in melk. 30 De vijf testorganismen zijn: B. subtilis (BGA sporen, Merck), K. rhizophila (ATCC 9341), B. cereus (ATCC 11778), E. coli (ATCC 11303) en B. stearothermophilus (ATCC 10149). De respectievelijk bijhorende groeimedia zijn: Antibiotic medium II (ph 8; Bs8), test agar ph 8 (Merck; Kv8), test agar ph 6 (Merck; Bc6), test agar ph 8 (Merck; Ec8) en diagnostic sensitive test (Bst). Op iedere plaat worden twee schijfjes van het te onderzoeken monster geplaatst (diameter 8 mm, dikte 2 mm), alsook een controleschijfje geïmpregneerd met een antibioticum, meer bepaald streptomycine (2 µg/ml) voor plaat Bs8, tylosine (1 µg/ml) voor plaat Kv8, oxytetracycline (0,8 µg/ml) voor plaat Bc6, enrofloxacine (0,8 µg/ml) voor plaat Ec8 en amoxicilline (0,04 µg/ml) voor plaat Bst. Vervolgens worden de platen geïncubeerd bij de volgende condities: Bs8 en Bc6 bij 30 C gedurende minstens 18 uur, Kr8 en Ec6 bij 37 C gedurende respectievelijk 24 en 18 uur, en Bst bij 55 C gedurende 15-16 uur. De test is positief wanneer één van de remzones rond het monster 2 mm bedraagt. Een beperkte identificatie van het residu is afhankelijk van de plaat waarop de remzone optreedt. 31 (tabel 8) Plaat Testorganismen Agar medium 1 2 3 4 5 Bacillus subtilis BGA spores Kocuria rhizophila ATCC 9341 Bacillus cereus ATCC 11778 Escherichia coli ATCC 11303 Tabel 8: compositie van de STAR testplaten (naar Gaudin et al., 2010) Bacillus stearothermophilus ATCC 10149 antibioticum medium No. 2 ph 8 Incubatie temp. ( C) Gevoelige antbiotica (familie) 30 florfenicol (en doxycycline) testagar (Merck) ph 8 37 cefquinome en erythromycine testagar (Merck) ph 6 30 tetracyclinen (en florfenicol) testagar (Merck) ph 8 37 diagnostische testagar 55 quinolonen (enrofloxacine) (en cephalosporinen) penicillinen, sulfonamiden, aminoglycosiden, tylosine, lincomycine, ceftiofur en TMP De STAR test is een breed spectrum test voor antibioticaresidudetectie in spierweefsel van verschillende diersoorten en heeft een goede specificiteit. De detectie werd voor 16 antibiotica gecorreleerd aan hun respectievelijke MRL s, meer bepaald voor β-lactam ( MRL), tetracyclines ( MRL), macroliden (2 MRL), quinolonen ( 2 MRL), sommige sulfonamiden ( 3 MRL) en trimethoprim (2 MRL). De test is echter niet gevoelig voor aminoglycosiden en florfenicol (>> MRL). 31 16

3.5. TESTEN SPECIFIEK VOOR QUINOLONEN 3.5.1. Escherichia coli plaattesten Een E. coli plaat bij ph 8 of bij ph 6 wordt vaak toegevoegd aan andere microbiële screeningstesten omwille van zijn specificiteit voor quinolonen. 27-30,32 De agarbodem wordt geïnoculeerd met E. coli 14 (Bayer) en na het aanbrengen van het monster geïncubeerd bij 30 C gedurende 12-16 uur. Het resultaat is positief wanneer de remzones > 2 mm zijn. Afhankelijk van de ph is er een verschil in gevoeligheid voor de verschillende quinolonen. Bij ph 6 worden flumequine en oxoline zuur optimaal gedetecteerd en bij ph 8 zijn dit onder andere enrofloxacine en danofloxacine. De detectielimiet van difloxacine ligt op beide platen hoger dan de toegestane MRL en wordt aan een 2 4 maal lagere concentratie gedetecteerd door B. subtilis. 33 (tabel 9) In de pluimveesector wordt voornamelijk flumequine gebruikt en dus is het beter pluimveevlees te testen bij ph 6. De detectielimiet van enrofloxacine, dat eveneens vaak toegediend wordt aan pluimvee, is nog altijd voldoende laag bij ph 6. 5,33,34 3.5.2. Yersinia ruckeri plaattest De Yersinia ruckeri testplaat (ph 6,5; incubatie bij 30 C gedurende 18-24 uur) werd oorspronkelijk ontwikkeld voor de detectie van oxolinezuur in vis. Uit verder onderzoek bleek dat de test ook bruikbaar was voor eieren en kippenvlees. Pikkemaat et al. suggereren dat er een beter evenwicht zou zijn in de sensitiviteit voor enrofloxacine en flumequine, dit in tegenstelling tot de E. coli testplaat. (tabel 9) De twee species zijn echter nog niet duidelijk in één onderzoek vergeleken. Enkel in de Nouws antibiotic test wordt dit testorganisme gebruikt voor de detectie en identificatie van (fluoro)quinolonen. 5,35 Tabel 9: vergelijking detectielimieten (µg/kg) van de specifieke testen voor quinolonen en B. subtilis (ph 6 & 8) (naar Okerman et al., 2007 en Pikkemaat et al., 2007) Familie quinolonen Component MRL E. coli Y. ruck eri B. subtilis (BGA) (µg/kg) ph6 ph8 ph 6,5 ph 6 ph8 danofloxacine 200 50 12,5 50 100 25 enrofloxacine 100 12,5 6,25 25 200 100 flumequine 400 50 400 100 200 > 400 difloxacine 300 400 > 400 50 100 200 oxoline zuur 100 50 200 50 100 > 400 3.6. TESTEN SPECIFIEK VOOR TETRACYCLINEN Tetracyclinen zijn de meest gebruikte antibiotica in de diergeneeskunde en bijgevolg één van de belangrijkste groep residuen waarnaar wordt gescreend. Okerman et al. 4 verrichtten specifiek een vergelijkende studie voor de detectie van tetracyclinen. Deze studie vergeleek de sensitiviteit tussen de B. subtilis geïnoculeerde agar, de B. cereus geïnoculeerde agar, de Premi Test en de tetrasensortest. Het testorganisme B. cereus is gevoeliger voor deze groep van antibiotica dan B. subtilis. 27 Eén of beide testorganismen zijn opgenomen in eerder beschreven microbiële screeningstesten. Zo is de Bc6 plaat in de STAR en NAT specifiek voor de detectie van tetracyclinen. Alle tetracyclines worden gedetecteerd, maar de LOD s zijn onderling wel sterk verschillend. Door de 17

hoge gevoeligheid van B. cereus voor onder andere doxycycline geven monsters met zeer lage concentraties, ver beneden de MRL, met de STAR Bc6 zeer vaak positieve resultaten. Echte valspositieven zijn dit niet, maar het bemoeilijkt wel de interpretatie. Om die reden verklaren Fuselier et al. 36 de test pas positief wanneer de remzone > 4 mm bedraagt. Deze cut-off zone zorgt voor een 50% reductie van zogenaamde vals-positieven. In dit onderzoek werd ook vastgesteld dat de Premi Test ongevoelig is voor tetracyclinen, ook al wordt door de fabrikant verklaard dat dit een breed spectrum test is. Deze test kreeg eveneens het AFNOR (French Association for Normalization) certificaat. 26 4. DISCUSSIE Microbiële screeningstesten worden al sinds het begin van de jaren 90 gebruikt voor de detectie van antibiotica residuen in vlees. De testen werden in de loop van de jaren aangepast, maar de essentie ervan bleef bewaard omdat microbiële screeningstesten enkele belangrijke voordelen hebben. De monstervoorbereiding is beperkt en ze zijn eenvoudig uit te voeren door technisch geschoold personeel met een beperkte hoeveelheid materialen. Bij sommige testen kan het proces ook gedeeltelijk geautomatiseerd worden met behulp van afvulapparatuur, microtiterplaten en kleurscanners. Deze testen zijn dus geschikt voor de controle van een groot aantal monsters, want ze zijn zeer goedkoop en kunnen tegelijkertijd meerdere antibioticagroepen opsporen (breed spectrum). Er is een belangrijk nadeel verbonden aan de microbiologische screeningstesten. Ze worden namelijk verstoord door niet-specifieke antibacteriële factoren onder andere door een matrixeffect. 4 Ook blijft de identiteit van de bacteriegroeiremmende stof relatief onzeker en is er geen informatie over de aanwezige concentratie. De detectiewaarden van bepaalde antibiotica liggen vaak hoger dan de toegestane MRL of de actieve stof is niet te detecteren met deze soort testen. 4 De relatief lange incubatietijd van inhibitietesten maken ze minder geschikt als ingangscontrole in bedrijven, waar men een resultaat verwacht binnen slechts enkele minuten. Het is moeilijk om alle bovenstaande testen met elkaar te vergelijken, dit omdat in de literatuur niet altijd eenduidige proeven en resultaten worden gegeven. Zeker over de verbeterde versies van de klassieke testen zijn weinig praktijkgegevens bekend. Uit een onderzoek naar de technische bekwaamheid van de nationale EU referentie laboratoria in 2005 blijkt dat bij een groot aantal van deze laboratoria de microbiële screeningstesten niet gevoelig genoeg waren. Het permanent Europees Comité voor de Voedselketen en de Diergezondheid (SCFCAH) publiceert jaarlijks het eindresultaat van de nationale controleprogramma s op aanwezigheid van antibioticaresiduen. 37 In elke Lidstaat wordt gestart met een microbiologische screening, en alleen de verdachte monsters worden verder onderzocht. Vergelijking tussen de aantallen niet-conforme resultaten in de verschillende Europese Lidstaten is in feite niet mogelijk, omdat elke Lidstaat zijn eigen methode gebruikt. 18