Detectiemethoden voor antibiotica

Transcriptie

1 Detectiemethoden voor antibiotica Ronald Niemeijer

2 Detectiemethoden voor antibiotica One sometimes finds what one is not looking for" (Sir Alexander Fleming)

3 Detectiemethoden voor antibiotica From: Microbial screening methods for detection of antibiotic residues in slaughter animals ; M.G. Pikkemaat, Anal. Bioanal. Chem Oct; 395(4):

4 Gebruik van antibiotica - veehouderij heavier, faster, meatier Veterinaire toepassing als behandeling voor bacteriele infecties Misbruik als antibimicrobiele groeibevorderaar Compensatie voor slechte hygiene

5 Natuurlijk voorkomende antibiotica? Artemisia vulgaris Actinomycetes Streptomyces in de bodem Chlorampenicol Natural ways of antibiotics ingress into organisms of agricultural animals; D. Yanovych, M. Rydchuk, O. Korobova, Z. Zasadna The State Scientific Research Control Institute of Veterinary Medicinal Product and Feed Additives, Lviv, Ukraine, presented on RAFA 2013

6 De eerste detectiemethoden voor antibiotica Kwaliteitsparameter grondstoffen (zuivel, vleesproducten) X X X Schadelijke effecten gezondheid consument: Directe (sommige antibiotica zijn toxisch, mutageen of carcinogeen) Indirecte (resistentie) effecten op de gezondheid consument

7 Detectiemethoden voor antibiotica relevante matrices Producten van dierlijke oorsprong

8 U Wetgeving U-lidstaten dienen levensmiddelen van dierlijke oorsprong te monitoren op de aanwezigheid van residuen: Directive 96/23/C - stablishing residue monitoring plans, sampling frequency and range of substances to be tested for Decision 97/747/C - Additional sampling frequencies for milk, eggs, honey, rabbits and game meat Decision 98/179/C - Rules for taking official samples and accreditation requirements for official laboratories Decision 2002/657/C - Rules for the validation of analytical methods used in the residue monitoring plan (Plus: Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines)

9 U Wetgeving VRORDNING (U) No 37/2010 betreffende farmacologisch werkzame stoffen en de indeling daarvan op basis van maximumwaarden voor residuen in levensmiddelen van dierlijke oorsprong (MRL s) COMMISSI BSCHIKKING (2003/181/C) tot wijziging van Beschikking 2002/657/G wat betreft de vaststelling van minimaal vereiste prestatielimieten (MRPL's) voor bepaalde residuen in levensmiddelen van dierlijke oorsprong. Maximum Residue Limit (MRL) definieert de hoeveelheid van een residue dat nog aanwezig mag zijn in levensmiddelen Minimum Required Performance Limits (MRPL) definieert hoe goed een methode dient te presteren om een zo betrouwbaar mogelijk antwoord te krijgen dat er geen residuen in het betreffende levensmiddel meer aanwezig zijn.

10 Voorbeelden van MRL vs. MRPL MRL MRPL

11 In de U gebruikte antibiotica Legislation

12 Jaarapport U Rapid Alert System antibiotica Legislation

13 Detectiemethoden voor antibiotica Officiele methodes / Bevestigingsmethodes: Fysisch-chemische methodes (vloeistof- of gaschromatografie plus keuze uit diverse detectiemethodes zoals MS, UV-VIS, IR voorafgegaan door sample clean-up) Screeningsmethodes: Microbiologische testen Immunoassays Receptorassays Biosensors (Groeiremming / -inhibitie van microörganismen) (LISA, FIA, RIA, LFIA, Micro-array, SPR) (MTP formaat, LFD formaat)

14 Detectiemethodes op basis van microbiologie Voorbeeld: Premi Test Voorbeeld: DSM Delvotest

15 Detectiemethodes op basis van microbiologie NGATIF POSITIF H + H + H + H + H + ph-indicator Bromocresol Bacillus stearothermophilus antibiotica residuen

16 Detectiemethodes op basis van microbiologie negative control negative (c < LOD) positive (c > LOD) doubtful (c = LOD)

17 Detectiemethodes op basis van microbiologie Voordelen: Lage prijs per test Relatief snel (± 3 uur) Automatiseerbaar Voor zowel lage als zeer hoge monsteraantallen Uitgebreid gevalideerd principe Breed spectrum Nadelen: Breed spectrum Gevoeligheid per parameter kan sterk fluctueren Niet echt geschikt voor on-site testen Kwalitatief

18 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Voorbeeld van een microtiterplaat formaat (LISA) Voorbeelden van lateral flow assays (LFIA)

19 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Principe (Voorbeeld: competitieve LISA) Microwell gecoat met antilichamen Antilichamen (receptoren)

20 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Principe (Voorbeeld: competitieve LISA) Voeg Standaard of Monster toe

21 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Principe (Voorbeeld: competitieve LISA) Voeg nzyme Conjugate toe

22 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Principe (Voorbeeld: competitieve LISA) Reactie start venwicht tussen target molecuul en enzym conjugaat

23 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Principe (Voorbeeld: competitieve LISA) Wassen

24 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Principe (Voorbeeld: competitieve LISA) Na het wassen Ongebonden regentia verwijderd

25 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Principe (Voorbeeld: competitieve LISA) S P Voeg substraat + chromogeen toe

26 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Principe (Voorbeeld: competitieve LISA) Stop de reactie Reactie wordt gestopt en de kleurintensiteit wordt gemeten met een spectrofotometer

27 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Principe (Voorbeeld: competitieve LISA)

28 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Voorbeeld: LISA Voordelen: Bij grotere aantallen relatief lage prijs per test / per parameter Relatief snel (± 3 uur) Automatiseerbaar Kwantitatief Specifiek & Gevoelig Geringe investering in apparatuur Nadelen: Duurder als meerdere parameters tegelijk bepaald moeten worden Afhankelijk van de matrix min of meer bewerkelijke monstervoorbehandeling Kruisreacties en aspecifieke reacties komen voor (vals positieven) Soms te specifiek verwante parameters worden niet altijd aangetoond

29 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Automatisering

30 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Alternatief: Microarray - Multiplexing Per meting meerdere parameters tegelijkertijd (kwantitatief) (Semi) In-line testing mogelijk

31 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Voorbeeld: Luminex's xmap (Multi-Analyte Profiling) technology - Multiplexing Antilichamen op beads i.p.v. vaste drager Detectie in oplossing In line testing mogelijk

32 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Lateral Flow Immunoassay)

33 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Werkingsmechanisme (Voorbeeld: Lateral Flow Immunoassay) Y Y Latex Beads Target Anti-Target Antibody Capture Antibody

34 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Voorbeeld: Lateral Flow Reader - Documentatie

35 Detectiemethodes op basis van antilichamen / receptoren Lateral flow immunoassay Voordelen: Snel enkele minuten On-site testing mogelijk snelle beslissing envoudig uit te voeren Geen of beperkte apparatuur noodzakelijk Multi-parameter bepalingen mogelijk Relatief lage prijs per test Nadelen: Huidige tests op de market zijn kwalitatief / semi-kwantitatief Afhankelijk van de matrix min of meer bewerkelijke monstervoorbehandeling Kruisreacties en aspecifieke reacties komen voor (vals positieven) Soms te specifiek verwante parameters worden niet altijd aangetoond

36 Detectiemethodes op basis van biosensoren (?) Definitie biosensor (Bron: Wikipedia): en biosensor is een meetsysteem opgebouwd uit 3 delen: 1. en gevoelig biologisch element (enzym, DNA, antilichaam, eiwit, celcomponenten of ander biologisch materiaal) 2. en transducer (geeft het signaal door) 3. en fysicochemische detector (optisch, piezoelektrisch, ph etc.) Veel publicaties, tot nu toe weinig commerciele toepassingen: Meest geciteerd systeem: Antilichamen + SPR Potentieel zeer interessant in-line testing mogelijk Beschreven nadelen: Duur, aspecifieke reacties

37 Hartelijk dank voor uw aandacht!