VERSLAG SKML, sectie IMCD, KWALITEITSCONTROLE Leukemie/lymfoom typering NAJAAR 2013 Aan de 53e rondzending namen 60 laboratoria deel. Op volgorde van plaatsnaam betrof dit de volgende instituten: Aalst: OLVkliniek, Alg.Stedelijk ZH; Alkmaar: MC Alkmaar; Amersfoort: Meander MC; Amsterdam: AMC, VUMC, OLVG, St Lucas Andreas ZH,Slotervaart ZH, Ned. Kanker Instituut/AvL, Sanquin Diagnostiek; Antwerpen: ZNA Middelheim; Apeldoorn: Gelre ZH; Arnhem: ZH Rijnstate; Breda: Amphia ZH; Brugge: AZ St Jan; Brussel: UZ Brussel, CU St Luc, St Pieters ZH; Delft: Reinier de Graaf Groep; Den Bosch: Jeroen Bosch ZH; Den Haag: Haga ZH, SKION; Deventer: Deventer ZH; Doetichem: Slingeland ZH; Dordrecht: A. Schweitzer ZH; Ede: ZH Gelderse Vallei; Edegem: UZ Antwerpen; Eindhoven: Catherina ZH; Enschede: Med. Spectrum Twente; Gent: UZ Gent; Groningen: UMCG; Haine-Saint-Paul: Hôpital de Jolimont; Hasselt: VZW Jessa ZH; Heerlen: Atrium MC; Hoofddorp: Medial; Kortrijk: AZ Groeninge; Leeuwarden: Stichting KCL; Leiden: LUMC; Leuven: UZ Leuven; Maastricht: MUMC; Nieuwegein: St Antonius ZH; Nijmegen: Canisius Wilhelmina ZH, UMC St. Radboud; Roermond: Laurentius ZH; Roeselare: Heilig Hart ZH; Ronse: AZ Zusters van Barmhartigheid; Roosendaal: Franciscus ZH; Rotterdam: Erasmus MC (Immunologie en DdHK), St Fransiscus GH, Maasstad ZH; Sittard: Orbis MC; Tilburg: St Elisabeth ZH/Tweesteden ZH; Turnhout: AZ Turnhout; Utrecht: UMCU; Veldhoven: Maxima MC; Vlissingen: Adm de Ruyter ZH; Wilrijk: St AugustinusZH/St Vincentius ZH; Zwolle: Isala klinieken. WOORD VOORAF: 1. Verzending van de monsters: De verzending van de testmonsters (verse bloedmonsters) wordt verzorgd door door E. Marijt, LUMC. 2. Deadline v.w.b. terugrapportage: Er dient door alle deelnemers gebruik gemaakt te worden van Qbase voor de rapportage van de uitslagen. Dit houdt in dat, naast een automatisering van de uitslagverwerking, de terugrapportage binnen de gestelde deadline verricht moet zijn. Indien dit niet het geval is wordt de uitslag niet in de beoordeling meegenomen. Dit houdt ook in dat er geen invoerfouten gemaakt kunnen worden bij het verwerken van de resultaten. 3. Beoordeling van de resultaten: a. Niet alleen de analyse van de afwijkende populatie(s) wordt beoordeeld maar ook de evaluatie van de totale celpopulatie waarin de afwijkende populatie zich bevindt. b. De WHO-klassificering is leidend in de beoordeling. De NC-cie heeft nieuwe richtlijnen gepubliceerd voor deze beoordeling die gebaseerd zijn op de WHO-klassificering 2008. Deze zijn te vinden zijn op de website (www.cytometrie.nl). c. Bij de afwijkende populatie worden alle merkers beoordeeld, maar alleen de verplichte merkers worden in de score betrokken. De overige merkers worden wel besproken tijdens de nabespreking. d. In principe is het resultaat van de deelnemersgroep maatgevend voor de expressie van een bepaalde merker. Hierbij wordt het resultaat aangehouden dat door meer dan 75% van de deelnemers wordt gerapporteerd. e. De IF-expressie van merkers wordt wel geënqueteerd maar nog niet in de beoordeling betrokken. f. De NCcie behoudt zich het recht voor om in specifieke gevallen van deze regels af te wijken, met duidelijke vermelding van de daarvoor gebruikte argumenten.
4. Rapportageformulier in Qbase: De rapportage van de rondzendingen dient via Qbase verzorgd te worden. Alle items van het rapportageformulier, behalve de fluorescentie-intensiteit, worden meegenomen in de beoordeling van de analyses. De fluorescentie intensiteit wordt echter in toenemende mate belangrijk voor de interpretatie van de flowcytometrische analyse. Daarom heeft de NC-cie aanvullende richtlijnen opgesteld voor de panels van MoAbs die minimaal toegepast dienen te worden voor het aantonen van bepaalde rijpingsstadia. Hierin zijn de intensiteiten, die gerapporteerd dienen te worden, gemerkt. Deze staan ter inzage op de website (www.cytometrie.nl). Op de website staat een overzicht van de WHO-naamgeving. In dit overzicht is aangegeven welke entiteiten als conclusie mogen worden gegeven in het conclusieveld. Wanneer men van mening is dat een verdere klassificatie mogelijk is kan deze worden aangegeven in het toelichtingenveld. 5. Richtlijn voor de bepaling van de samenstelling van het testmonster: Er wordt beoordeeld 1. of de samenstelling totaal ±100% is en 2. of de percentages van de subpopulaties juist zijn. Dit geschiedt aan de hand van de richtlijnen van de NC-cie (zie www.cytometrie.nl). Wanneer klonale B-cellen aantoonbaar zijn, dienen deze onder het kopje afwijkende populatie vermeld te worden. Eventueel nog aanwezige polyklonale B-cellen kunnen dan onder het kopje B-cellen vermeld worden. Blastaire cellen en plasmacellen komen normaal gesproken niet voor in perifeer bloed. Wanneer deze cellen wel aanwezig zijn, dan maken zij meestal deel uit van de afwijkende populatie en dienen dan ook te worden vermeld onder dit kopje. De totale immunologische differentiatie moet ±100% zijn. In Qbase wordt aangegeven wanneer deze limiet (±10%) gehaald is. 6. Richtlijn voor de bepaling van de afwijkende celpopulatie(s) in het testmonster: De panels van MoAbs die minimaal toegepast dienen te worden voor het aantonen van bepaalde rijpingsstadia (zie www.cytometrie.nl) worden bij de beoordeling als leidraad gehanteerd. 7. Richtlijn voor de Conclusie en het Scoringssysteem: Met ingang van 2013 wordt het SIHON scoringssysteem (zie www.cytometrie.nl) vervangen door het MUSE systeem. De verschillende fases uit het SIHON scoringssysteem (pre-analytische, analytische en post-analytische fase) zijn af te leiden uit de waarden % gerapporteerd en de score ten opzichte van de MAP max. De conclusie of post-analytische fase is momenteel nog een onderdeel van de totale score. In de kwaliteitsrondes van 2014 zal de conclusie apart beoordeeld en gerapporteerd worden. Wanneer alle markers ingezet zijn volgens het van toepassing zijnde minimale panel dan geeft dit een percentage gerapporteerd van 100%. Voor iedere merker of subpopulatie in de samenstelling wordt bij een goed resultaat 2 punten gegeven. Wanneer het resultaat meer dan 10% afwijkt van de referentiewaarde (bijvoorbeeld referentiewaarde 40%, afwijkend bij <30% en >50%) wordt bij de subpopulaties van de samenstelling 1 punt in mindering gebracht en bij de merkers 2 punten. Een score die overeenkomt met de MAP max is vergelijkbaar met de A score uit het SIHON scoringssysteem, een score die maximaal 4 punten lager is dan MAP max komt overeen met een B score en scores die meer dan 4 onder de MAP max ligt komt overeen met een C. In de beoordeling van de post-analytische fase moet de conclusie gefundeerd zijn. In die gevallen waarin de deelnemer duidelijk op onjuiste gronden een conclusie gegeven heeft wordt dit fout gerekend en worden 0 punten toegekend. Wanneer wel materiaal ontvangen is maar geen resultaten worden gerapporteerd, wordt een rapport gegenereerd met alleen de expertwaarden. 8. Nabespreking van de resultaten van de rondzendingen: De SKML sectie IMCD hanteert sinds juni 2007 een vorm van nabesprekingen van de leukemie/lymfoom typeringen waarin de deelnemers aan de hand van een aantal tevoren gestelde vragen de rondzendingen kunnen bediscussiëren. Voor een optimale en interactieve participatie van de deelnemers worden een aantal specifieke probleemstellingen, die geformuleerd zijn aan de hand van de beoordelingen van de rondzendingen of die van algemene aard (± 6 vragen) zijn, in een negental groepen ter discussie gesteld voorafgaande aan de uitreiking van de resultaten van de rondzendingen.
Voor de discussie op 21 november 2013 heeft de NC-cie slechts 1 discussiepunt opgesteld. Er is een beschrijving uit de WHO 2008 van het immunofenotype van een B-ALL/LBL alsook een overzicht waaraan een blastenpopulatie moet voldoen om tot een bepaalde lineage te behoren. Zou u casus 2013-4 op basis van deze beschrijving als B-ALL/LBL benoemen? - zo ja: waarom? - zo nee: waarom niet? Bij deze casus zijn diverse merkers (CD19, CD22, CD117, cycd79a en TdT) zeer heterogeen gerapporteerd. Hoe denk u dat dit verbeterd kan worden: - harmonisatie van de bepaling - uniformering van de bepaling - centralisatie van de bepaling - uniformering van de interpretatie -. -. De moeilijkheid bij deze casus is het expressieniveau van de B-celmerkers CD19, CD22 en cycd79a. Daarnaast lijken deze merkers slechts in een subpopulatie aantoonbaar. Al met al is dit een casus met een hoge moeilijkheidsgraad. Of de aangegeven mogelijkheden de beoordeling makkelijker kunnen maken is niet goed aan te geven. CASUSBESPREKING: Score-systeem en resultaatoverzichten: Tijdens de nabespreking worden 3 cases besproken. Van de 60 deelnemers hebben respectievelijk 53, 55 en 57 deelnemers de rondzendingen teruggerapporteerd. De resultaten van de zes leden van de nomenclatuurcommissie (E. Marijt, A. Mulder, P. De Schouwer, A. Bloem, V. van der Velden en C. Homburg) zijn gebruikt om referentiewaarden te bepalen. Waarden die meer dan 10% afwijken van deze referentiewaarden worden als foutief beoordeeld (bijvoorbeeld referentiewaarde 40%, afwijkend bij <30% en >50%). Bij afwijkingen bij de subpopulaties van de samenstelling wordt in het MUSE systeem 1 punt in mindering gebracht en bij de merkers 2 punten. Een overzicht van deze scores wordt door de nomenclatuurcommissie beoordeeld. Wanneer de referentiewaarde teveel afwijkt van het groepsgemiddelde zal de score aangepast worden en geldt het groepsgemiddelde als referentiewaarde. Wanneer meer dan 25% van de deelnemers een foutieve beoordeling krijgt wordt de merker als heterogeen beschouwd en niet meegenomen in de score. Wel telt de merker mee voor het % gerapporteerd. Sample 2013.4 (53 deelnemers) Klinische gegevens: 18-jarige jongeman, met in de voorgeschiedenis: homozygote beta thalassemie waarvoor een 5/6 HLA antigeen gematchte navelstrengtransplantatie op 12-jarige leeftijd; wegens rejectie 2de transplantatie met haploidentieke vader een jaar later; status na splenectomie voorafgaand aan de eerste transplantatie ivm verhoogde transfusiebehoefte.recentelijk heeft patient een pneumonie gehad en nu naar huisarts vanwege een perianaal abces. Bij bloedonderzoek wordt een pancytopenie gevonden. Labgegevens: WBC 2.0*10 9 /l Thrombo s 96*10 9 /l Hb 6.0 mmol/l neutro s 2% lymfo s 65% mono s <1% eo s 1% baso s 0% myelocyten 1% overige cellen 31% 24 erytroblasten/100 WBC
Vraagstelling: verklaring voor de pancytopenie? Samenstelling populatie: T B NK Myelo Mono Afwijkende populatie Totaal 32 7 3 7 2 44 ±100 Tabel 1: Immunologische differentiatie per cellijn weergegeven als gemiddelde van de groep deelnemers in %. Toelichting bij score-beoordeling sample 2013-4. Pre-analytische fase: Er is geen eenduidige conclusie. Hierdoor is het niet mogelijk een enkel minimaal panel aan te geven dat ingezet had moeten worden. Gekozen is om alleen de differentiatie mee te nemen in de score samen met de merkers die voorkomen in zowel het AML als het B-ALL panel: CD19, CD34, CD45, cycd3 en MPO. Er zijn 40 deelnemers die al deze merkers hebben ingezet (100% gerapporteerd, A), 11 deelnemers die 1 of 2 merkers niet hebben meegenomen (82-91% gerapporteerd, B) en 2 deelnemers die meer dan 3 merkers niet hebben gerapporteerd. CyCD3 is door 12 deelnemers niet gerapporteerd (meestal in combinatie met de conclusie AML) en MPO is door 5 deelnemers niet gerapporteerd (ook met conclusie AML). Analytische fase: Door 38% van de deelnemers werd een juiste typering gerapporteerd (score=map, A), bij 49% van de deelnemers viel de rapportage van 1 of 2 merkers buiten de consensus (score>map-4, B) en bij 13% van de deelnemers werden 3 of meer foutieve merkers gevonden (score<map-4, C). De typering was als volgt: Positief voor CD34, CD45 en negatief voor cycd3 en MPO. Frequent fout zijn CD13 (9x), CD33 (5x) en MPO (9x) Diverse merkers zijn heterogeen gerapporteerd: CD11c, CD19, CD22, CD64, CD117, cycd79a en TdT. Post-analytische fase: De conclusies B-ALL/LPL en AML zijn beide goedgekeurd. Vanwege de moeilijkheid van deze casus en de verschillen binnen de nomenclatuurcommissie zijn ook voor AUL en het niet geven van een conclusie 2 punten gegeven. MPAL daarentegen is fout gerekend en heeft dus ook 0 punten gekregen. Mogelijk vanwege de complexiteit is door 7 deelnemers geen conclusie gerapporteerd. Toelichting bij deze casus vanuit de kliniek: Er is een zeer complex karyotype gevonden (verlies chromosomen 5, 7 en 12p, amplificatie van het MLL gen) en dit wordt voornamelijk beschreven bij (therapie-gerelateerde) AML. Bij therapie-gerelateerde B-ALL is dit slechts in enkele gevallen beschreven. Bij diagnose zijn alle cellen van de haplo-identieke donor en er zijn geen aanwijzingen voor de aanwezigheid van cellen vanuit het navelstreng-bloed van de eerste transplantatie. Patient wordt behandeld volgens HOVON100 (ALL studie) waarbij complicaties optraden vanwege een reeds aanwezige fistel. Na behandeling van deze infectie is de therapie hervat. Sample: 2013-5 (55 deelnemers) Klinische gegevens: Een 69-jarige man met een uitgebreide cardiale voorgeschiedenis wordt door de cardioloog doorverwezen wegens een leukocytose. Patient heeft behoudens zijn cardiale klachten geen andere problemen. Hij heeft geen B-symptomen. Bij lichamelijk onderzoek worden geen afwijkingen gevonden. Labgegevens: WBC 9.8*10 9 /l Thrombo s 261*10 9 /l
Hb 7.7 mmol/l; neutro s 48% lymfo s 42% mono s 8% eo s 1% baso s 0.5% Vraagstelling: Aanwijzingen hematologische maligniteit? Samenstelling populatie: T-cel B-cel NK-cel Myelo Mono Overig Totaal 16 0 2 54 7 19 ±100 Tabel 2: Immunologische differentiatie per cellijn weergegeven als gemiddelde van de groep deelnemers in %. Toelichting bij score-beoordeling 2013-5. Pre-analytische fase: Te gebruiken minimale panel: rijpe B-cel 42 deelnemers scoren maximaal (100% gerapporteerd, A), terwijl 12 deelnemers 1 of 2 merkers missen (89-94% gerapporteerd, B) en 1 deelnemer meer dan 2 merkers mist (61% gerapporteerd, C). Opvallend is dat er door 5 deelnemers geen percentage B-cellen wordt gerapporteerd. Als de afwijkende populatie uit B- cellen bestaat dan dient hier 0% (of <1%) ingevoerd te worden; er zijn immers geen normale B-cellen aantoonbaar. Daarnaast wordt CD25 door 4 labs niet gerapporteerd. Analytische fase: De maximale score is door 34 laboratoria gerapporteerd. Deze is als volgt: Positief voor CD19, CD20, CD45 en sigkappa, negatief voor CD5, CD23, CD103. Door 19 laboratoria zijn 1 of 2 merkers verkeerd gerapporteerd (score>map-4, B) en 2 deelnemers hebben meer dan 2 foutieve merkers (score<map-4, C). Er is 1 deelnemer die naast deze klonale B-celpopulatie een afwijkende T-celpopulatie heeft gezien. Post-analytische fase: De juiste conclusie is een MBCN. Dit werd door 52 van de deelnemers gegeven. Vanwege de negativiteit voor CD5 en CD103 zijn de conclusies HCLv en CLL fout gerekend. Toelichting bij deze casus vanuit de kliniek: Morfologisch worden meerdere afwijkende lymfocyten gezien van wisselende celgrootte, deels klein met (zeer) grof chromatine, soms gekliefde kernomtrek en deels middelgroot celtype met matig grof chromatine, soms een nucleolus en vrij ruime soms flardige cytoplasmazoom.
Met FISH wordt een deletie van het p53 gen aangetoond en tevens een kleine kloon met een deletie van chromosoom 13. Vanwege de toevalsbevinding en het niet aanwezig zijn van lichamelijk afwijkingen is er het beleid van wait-and-see. Sample: 2013-6 (57 deelnemers) Klinische gegevens: Patiënte wordt door de huisarts doorverwezen naar de poli Interne. Sinds een half jaar is er sprake van algemene malaise. Sinds een maand recidiverende infecties waarvoor antibiotica kuren via de huisarts. Patiente is de afgelopen maanden ongeveer 4 kg afgevallen. Geen koorts, sinds een week wel nachtzweten. Eetlust sterk afgenomen. Intoxicaties: rookt sinds 25e levensjaar 1 pakje sigaretten per dag. Geen alcohol gebruikt, nooit drugs gebruikt. Lichamelijk onderzoek laat behoudens een WHO performance score van 3 geen andere afwijkingen zien. Labgegevens: WBC 33*10 9 /l Thrombo s 34*10 9 /l Hb 6.3 mmol/l; neutro s 32% lymfo s 35% mono s 10% overige cellen 23% Vraagstelling: Er wordt bloedonderzoek verricht : is er sprake van een hematologische maligniteit? Samenstelling populatie: T-cel B-cel NK-cel Myelo Mono Overig Totaal 5 1 2 34 9 48 ±100 Tabel 3: Immunologische differentiatie per cellijn weergegeven als gemiddelde van de groep deelnemers in %. Toelichting bij score-beoordeling 2013-6. Pre-analytische fase: Te gebruiken minimale panel: AML Het volledige minimale panel is ingezet door 22 deelnemers (100% rapportage, A), door 28 deelnemers is 1 of 2 merkers niet gerapporteerd (90%-95% rapportage, B), terwijl 7 deelnemers 3 of meer merkers niet hebben gerapporteerd (62%-86% gerapporteerd, C). De volgende merkers zijn frequent niet meegenomen: CD64 (31x), cycd3 (10x), CD36 (9x) en CD56 (7x). CD64 is sinds kort opgenomen in het minimale panel en zal nog niet door alle labs zijn opgenomen in hun protocollen. CD56 wordt vaak in combinatie met CD16 bepaald en als combinatie gerapporteerd. Bij de beoordeling in MUSE is het lastig deze gecombineerde merkers te beoordelen en zijn derhalve buiten de beoordeling gelaten. Analytische fase: Een A score oftewel alles juist werd door 22 laboratoria behaald, 31 labs hadden 1 of 2 fouten en 4 labs hadden 3 of meer fouten. De juiste typering: positief voor CD13, CD33, CD34, CD45 en HLA-Dr. CD13, CD33 en CD117 leveren echter een heterogeen resultaat. Dit uit zich vooral in het gerapporteerde percentage positiviteit dat varieert van 30 tot 100%. Frequent fout is het percentage myeloid (13x), MPO (10x), CD11c (8x), CD19 (7x) en het percentage van de afwijkende populatie (6x). Post-analytische fase:
Bijna unaniem wordt de conclusie AML gegeven (56x, 2 punten). Slechts 1 deelnemer trekt de conclusie AUL (0 punten). Toelichting bij deze casus vanuit de kliniek: Er is een translocatie t(12;22) aangetoond. Patiente heeft te kennen gegeven geen intensieve kuren te willen en wordt behandeld met decitabine, een middel dat vaker wordt gegeven bij MDS. Samenvatting: 2013-4 2013-5 2013-6 Pre Ana Post Pre Ana Post Pre Ana Post %A 75 38 98 76 59 95 39 39 98 %B 21 49-22 39-49 54 - %C 4 13 2 2 2 5 12 7 2 #A 40 20 52 42 34 52 22 22 56 #B 11 26-12 19-28 31 - #C 2 7 1 1 2 3 7 4 1 #D 7 5 3 MUSE scores zijn vertaald naar SIHON scores : Een score die overeenkomt met de MAP is vergelijkbaar met de A score uit het SIHON scoringssysteem, een score die maximaal 4 punten lager is dan MAP komt overeen met een B score en scores die meer dan 4 onder de MAP ligt komt overeen met een C. Met de komst van het MUSE systeem komt het oude SIHON scoresysteem te vervallen. Onze wensen zijn echter (nog) niet doorgevoerd en rapportage via MUSE is derhalve niet mogelijk. Vooralsnog is gekozen om een tussenvorm aan te houden bij het beoordelen van de resultaten. De wijze waarop dit is gedaan is aan het begin van dit verslag beschreven. Het gebruik van Qbase is nu behoorlijk ingeburgerd. Voor de rondzendingen van 2014 zullen nog enkele wijzigingen worden doorgevoerd in Qbase: merkers die vermeld zijn in de minimale panels kunnen niet meer als combinatie ingevoerd worden (bijvoorbeeld CD13/33 of CD16/56). Uitzondering hierop zijn de merkers die als alternatief worden aangegeven in de minimale panels (bijvoorbeeld CD11b/11c en CD38/VS38C). Ook komen er voor het invoeren van de conclusie twee velden: het eerste veld waar een algemene conclusie met behulp van een pull-down menu moet worden ingevuld; en een tweede conclusieveld waarin de deelnemer wordt uitgedaagd een specifiekere entiteit in te voeren, wederom door een keuze te maken uit een pull-down menu. Namens de nomenclatuurcommissie van de SKML sectie Immunologische en Moleculaire Celdiagnostiek (leukemie/lymfoom typering), Christa Homburg, Sanquin Diagnostiek, Amsterdam, Januari 2014. Referenties:
1. Kluin-Nelemans JC, van Wering ER, van der Schoot CE, Adriaansen HJ, van t Veer MB, van Dongen JJM and Gratama JW on behalf of the Dutch Co-operative Study Group on Immunophenotyping of Haematological Malignancies (SIHON). SIHONSCORE: a scoring system for external quality control of leukaemia/lymphoma immunophenotyping measuring all analytical phases of laboratory performance. Br. J. Haemaol. 2001: 112, 337-343. 2. WHO Classification of Tumours: Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Ed by Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. IARC Press, Lyon 2001. 3. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, Fourth Edition. Volume 2. Ed by Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, Thiele J, Vardiman JW. WHO Press, Geneve 2008. 4. www.cytometrie.nl of www.skml.nl