Biotechnologie deel II Hand-out bij de tweede oefen- en zelftoetsmodule van Biotechnologie & maatschappij behorende bij hoofdstuk 6, 7, 8 en 11 van Introduction to Biotechnology, Thieman & Palladino, 3 e druk. januari 2014 Biotechnologie in planten Manipulatie Er wordt tegenwoordig vaak gentechnologie op planten toegepast. Echter, zonder vreemd DNA kunstmatig in te brengen kon er voordien ook al worden gemanipuleerd met het genetisch materiaal van planten. Noem twee van deze technieken. Technieken Er is tegenwoordig heel veel gentechnologie die op planten wordt toegepast. Er zijn drie technieken die gebruikt kunnen worden om een nieuw gen in een plantencel te brengen. Noem twee van deze technieken. 3. Agrobacterium Bij een techniek gebruikt men Agrobacterium, die bij het infecteren van een plant een Tiplasmide inbrengt. Wat is het nadeel van deze techniek? 4. Voordelen A. Planten zijn veel makkelijker genetisch te manipuleren dan dieren. Geef de voordelen dat planten hebben ten opzichte van dieren. 3. 4. 5.
B. Noem ook een groot nadeel dat planten hebben ten opzichte van dieren. 5. Veiligheid Bij genetisch gemanipuleerde planten is er gevaar dat ze zich verspreiden tijdens de bloei via het stuifmeel. Noem een manier van manipulatie waarbij het pollen de verworven genen niet kan verspreiden. 6. Uitschakelen genen Een insert in het DNA van een plant kan ervoor zorgen dat deze een nieuw gen krijgt en een nieuw eiwit gaat produceren. Het kan ook zijn dat zo'n insert er juist voor zorgt dat een bepaald eiwit niet meer gemaakt wordt. A. Hoe heet de techniek waarmee dat wordt gedaan? B. Op welk niveau gebeurt deze regulatie van het gen? 7. Gevaren Door tegenstanders wordt vaak gewezen op de gevaren van deze gentechnologie die gebruikt wordt voor voedselgewassen. Wat zijn de twee belangrijkste gevaren voor de menselijke gezondheid? Biotechnologie bij dieren 8. Hiv-medicijn ontwikkelen Je bestudeert hiv. Het enzym reverse transcriptase van hiv zorgt ervoor dat hiv-rna wordt omgezet in DNA en in het genoom van de gastheercellen terecht kan komen. Je hebt een eiwit gevonden dat mogelijk bindt aan de actieve site van dit enzym, en zo de werking zou kunnen remmen. A. Hoe ga je dit eerst onderzoeken? B. Je test hierna of het eiwit niet toxisch is voor weefselkweken van menselijke cellijnen. Het blijkt niet giftig te zijn. Nu moet je de toxiciteit testen in proefdieren. Noem drie veelgebruikte proefdieren uit verschillende klassen.
C. Je besluit de toxiciteit hierna testen in zebravissen. Aan welke voorwaarden moet je aanvraag voor dierproeven voldoen om goedgekeurd te kunnen worden? 3. 4. D. Het blijkt ook niet toxisch te zijn voor zebravissen. Nu wil je een stap verder gaan en weten of het eiwit ook echt de replicatie van hiv remt. Welk proefdier kies je nu? 9. Klonen Je wilt een kloon maken van een geweldig renpaard. In het begin was klonen niet meer dan het maken van eeneiïge tweelingen, met name bij koeien. Dit paard is echter al 5 jaar oud, dus moet je een andere techniek toepassen. Welke stappen ga je achtereenvolgens uitvoeren? 10. Transgene dieren In vraag 8 heb je een eiwit ontwikkeld en getest om hiv mee te remmen. Het is wel werkzaam, maar ook erg duur in de ontwikkeling. Er bestaat echter een insect (teek) dat dit eiwit zelf ook produceert. Teken kweken is echter lastig, en de winning blijft dan ook duur. Je probeert het daarom in een ander organisme te produceren. Het is een geglycolyseerd eiwit, dus het kan niet in een prokaryoot gemaakt worden. Ook in gist blijkt het echter niet goed gemaakt te kunnen worden. Je zoekt daarom als productiesysteem een dier, waarbij je het eiwit makkelijk kan opzuiveren. A. Welke dier kies je?
B. Het eindresultaat is een dier met één of meer genen van een teek. Hoe noemt men zo'n dier? C. Je kloont de genen voor het eiwit in een zoogdier. Je wilt dat deze genen alleen tot expressie komen in de melkklieren van het dier. Hoe krijg je dit voor elkaar? D. Welke technieken kun je hiervoor gebruiken? E. Je kloont de genen voor het eiwit in je proefdier met behulp van microinjectie. Wat is de eerste stap die je dan moet uitvoeren? F. Wat is de volgende stap? G. De eitjes worden teruggeplaatst in een moederdier en er worden een aantal jonkies geboren. Hoe ga je de jonkies nu testen op de aanwezigheid van het gen? H. Met welke techniek kun je bepalen of het nieuwe gen aanwezig is in de cellen van een jonkie? 1 Embryonale stamcelmethode Je wilt een proefdiermodel maken voor de taaislijmziekte (cystic fibrosis). Bij deze ziekte is het gen cftr gemuteerd, en dit gen is ook in muizen aanwezig. Je wilt het gen in de muis uitschakelen met behulp van de embryonale stamcelmethode. Je maakt eerst een construct met een geïnactiveerd cftr-gen. A. Welke stappen moet je nu achtereenvolgens doen? 3. 4. 5. 6.
7. B. Je transfecteert stamcellen hiermee en selecteert daarna de stamcellen die het geïnactiveerde gen hebben opgenomen in hun genoom. Hoe selecteer je deze cellen? C. Sommige cellen hebben het geïnactiveerde gen op een willekeurige plaats in het chromososoom. Bij andere cellen heeft het geïnactiveerde gen van plaats gewisseld met het intacte gen, en daarnaar ben je op zoek. Hoe vindt de uitwisseling tussen intact en geïnactiveerd gen plaats? D. Hoe selecteer je deze cellen? E. Je verwijdert die cellen die het hele construct hebben opgenomen. Bij de selectie op het antibioticumresistentiegen ben je er echter van uitgegaan dat ook degenen die met homologe recombinatie het gewenste gen hebben opgenomen, ook dit antibioticumresistentiegen hebben opgenomen. Waar zit dit antibioticumresistentiegen op het construct? 1 Genen inactiveren/vervangen Je wilt een proefdiermodel maken voor de taaislijmziekte (cystic fibrosis). Bij deze ziekte is het gen cftr gemuteerd, en dit gen is ook in muizen aanwezig. Je schakelt het gen in de muis uit met behulp van de embryonale stamcelmethode. A. Hoe noem je zo'n transgeen dier? B. Veel patiënten hebben een deletie van drie nucleotiden in het ctfr-gen. Je maakt een transgene muis die homozygoot is voor het menselijke cftr-gen met deze deletie. Hoe noem je het transgene dier dat nu ontstaat? Je vermoedt dat een bepaalde stof een positief effect heeft op de functionaliteit van het gemuteerde CFTR-eiwit. Je test dit op de knock-in en knock-out-muizen die je hebt gefokt. De knock-out-muizen vertonen geen enkel effect. De knock-in-muizen vertonen een duidelijke verbetering. C. Heeft deze stof effect op het CFTR-eiwit van de muis?
D. Heeft deze stof effect op het humane CFTR-eiwit? E. Heeft deze stof bijwerkingen? DNA fingerprinting 13. DNA fingerprinting Er wordt iemand mishandeld, maar het slachtoffer krijgt de dader niet te zien. Gelukkig vindt men wel DNA-sporen van de dader. Er zijn vijf personen die mogelijk de dader zijn. Op grond van hun DNA-profiel wil men de werkelijke dader vaststellen. Men voert een RFLP-analyse uit, met een probe die een VNTR herkent. Resultaten van de analyse zie je hiernaast. A. Van welk type analyse is dit het resultaat? B. Welke techniek vormt de basis van deze test? C. Wat kun je nu zeggen over verdachte 5? D. Wat kun je nu zeggen over verdachte 1? E. Hoeveel verschillende allelen bestaan er minimaal van dit locus in de populatie? 14. PCR in DNA fingerprinting Dit is een schematische tekening van een VNTR in een chromosoom. Aangegeven zijn de restrictiesites die gebruikt worden in de RFLP-test. Tegenwoordig wordt in plaats van een RFLP-test bijna altijd een PCR gedaan.
A. Geef in de figuur aan waar de primers voor de PCR moeten binden. B. Hoeveel verschillende primers heb je nodig om het DNA van 5 verdachten hiermee te kunnen vergelijken? C. Noem twee voordelen van PCR boven de RFLP-test. 15. Repeats De VNTR in het chromosoom worden vaak gebruikt voor forensisch onderzoek. Tegenwoordig gebruikt men vaak repeats met een sequentie van een paar nucleotiden. A. Hoe worden dit soort repeats genoemd? B. Er is echter altijd een kans dat twee mensen hetzelfde profiel hebben. Hoe meer van deze repeats je analyseert, hoe kleiner die kans wordt. Hoeveel van die korte repeats moet je analyseren om de kans kleiner dan 1 : 1 miljard te maken? 16. Verwantschapsanalyse Iemand wordt al geruime tijd vermist. Op een gegeven moment wordt er een stoffelijk overschot gevonden dat mogelijk van deze persoon kan zijn. Men maakt een genetische stamboom van zijn familie. De vermiste persoon is in grijs aangegeven. De ouders en broer en zus van de vermiste persoon zijn helaas al overleden (zwart). Men analyseert het DNA, maar dit is helaas ook in slechte staat. A. Welk DNA is geschikt voor het analyseren van verwantschappen over meerdere generaties? B. Uiteindelijk blijken er maar drie verwanten bereid hun DNA af te staan voor een verwantschapstest (1, 2 en 3). Welke analyse ga je nu uitvoeren, en op wie?
Medische biotechnologie 17. Monoklonale antilichamen Antilichamen worden in de geneeskunde veel gebruikt. Vaak zijn dit monoklonale antilichamen, die in een muis worden gemaakt. A. In welke volgorde zijn de stappen nodig om deze in muizen te maken? 3. 4. 5. 6. B. Als je dit doet, eindig je met een aantal cellijnen die monoklonale antilichamen produceren. Hoe noemt men deze cellijnen? C. Waarom worden er voor de fusie tumorcellen gebruikt? D. Wat is het grootste probleem van deze productiemethode voor therapeutische monoklonale antilichamen? E. Hoe kun je dit oplossen? 18. Gelijke genen mens en modelorganisme Modelorganismen zijn heel belangrijk voor het bestuderen van humane ziekten. Belangrijk daarbij is dat de genen voor deze ziekten in de modelorganismen zoveel mogelijk in DNAsequentie overeenkomen met die van de mens. A. Hoe noemt men van verschillende organismen de genen die op elkaar lijken? B. Een veel gebruikt modelorganisme is de muis. Welk percentage van onze genen hebben een homoloog in muizen?
19. Detectie restrictiesites Als gen X met restrictie-enzym EcoRI wordt geknipt, ontstaan er drie fragmenten met een stukje van het gen erin, twee van 200 baseparen lang, en één van 100 baseparen lang. Je gebruikt een probe speciaal voor dit gen, en analyseert na bewerking met restrictieenzym het DNA met een Southern blot. A. Hoe zal je blot voor dit gen eruit zien? Men heeft in gen X een mutatie gevonden die verantwoordelijk is voor een autosomale recessieve ziekte. Het is een substitutie van een A in een T, waardoor een restrictiesite voor het enzym EcoRI verdwijnt. B. Je analyseert dit gen op dezelfde manier, met een ander bandjespatroon als resultaat. Welk resultaat verwacht je nu? C. Hoe noemt men een dergelijke analyse?
20. RFLP-analyse Een mutatie in gen X zorgt voor een autosomale recessieve ziekte. Door de mutatie is ook het aantal restrictiesites voor EcoRI in het gen veranderd, waardoor je een RFLP-analyse kunt uitvoeren. In een verder gezond gezin blijken twee van de drie kinderen deze ziekte te ontwikkelen. Je voert een RFLP-analyse uit op alle leden van het gezin. Dit is het resultaat: A. Geef aan bij welke persoon welke laan hoort. 1 = 2 = 3 = 4 = 5 = B. Je wilt de procedure voor RFLP-analyse echter verbeteren door eerst de allelen van het gen X met PCR te amplificeren en dan te knippen met EcoRI. Je gebruikt nu geen probe meer, maar analyseert de PCR-producten met gelelektroforese. Hoeveel banden krijg je in dat geval bij de ouders te zien? 2 ASO Je hebt met behulp van een RFLP-analyse bepaald welke personen uit een gezin een defect allel bezitten: hierin is een restrictiesite verdwenen door een A-T-substitutie. Daarna wil je deze hele test omzetten in een ASO-analyse. Hiermee wil je achterhalen of dit een mutatie is van maar één nucleotide, en ben je niet afhankelijk van het al of niet veranderen van restrictiesites. A. Wat betekent de afkorting ASO? B. Hoeveel nucleotiden is een ASO ongeveer lang? C. Hoeveel ASO's heb je in dit geval nodig? D. Om te kijken of de tekst werkt analyseert men het bloed van een aantal gezonde en zieke personen uit verschillende families. Welke personen zijn zeer waarschijnlijk ziek? E. Ook persoon 2 heeft de ziekte. Hoe kun je dat verklaren?
2 Genomics in geneeskunde Niet alle geneeskundige behandelingen hebben bij patiënten met dezelfde ziekte ook hetzelfde resultaat. Dit komt door genetische verschillen tussen de patiënten onderling. Er is daarom een nieuwe discipline in de geneeskunde ontstaan, die behandelingen ontwikkelt die hiermee rekening houden. A. Hoe heet deze discipline? B. Een voorbeeld hiervan is het bestuderen van de genexpressie in een tumorcel om de juiste chemotherapie te bepalen. Met welke techniek kun je expressie van genen in tumorweefsel bepalen? C. Hierbij plak je oligonucleotiden die corresponderen met de genen van het humane genoom op een glasplaatje of siliconenchip, en hybridiseert dat met materiaal uit het zieke weefsel. Met welk materiaal uit deze cellen wordt de chip gehybridiseerd? 23. Gentherapie Je hoopt een ernstige hersenziekte (X-gekoppelde adrenoleukodystrofie) te verhelpen met behulp van gentherapie. Bij twee jongens met deze ziekte heb je stamcellen uit het beenmerg geïsoleerd, en daarin het intacte gen geïntroduceerd. Daarna heb je de cellen weer teruggeplaatst. A. Wat voor type gentherapie heb je toegepast? B. Je kunt verschillende vectoren gebruiken voor deze transfectie. Geef de voor- en nadelen van elke vector aan. vector voordeel nadeel retrovirus adenovirus liposomen C. Deze therapie waarbij je een intact gen inbrengt, werkt alleen bij bepaalde afwijkingen. Hoe moet de afwijking dan overerven?
D. Hoe kun je een niet op die manier overervende mutatie toch met gentherapie behandelen? E. Er zijn ziektes die hoewel ze veroorzaakt worden door een afwijking in het erfelijk materiaal, te complex zijn om met gentherapie te kunnen worden behandeld. Waarom kun je die niet behandelen met gentherapie? 24. Antisense RNA en RNAi Er zijn twee manieren om een dominant allel te onderdrukken: antisense RNA en RNAi. In beide gevallen breng je een gen in dat codeert voor een RNA dat complementair is aan het mrna van het defecte allel. Toch is de werking compleet anders, en verschillen de RNA-moleculen op een essentieel punt van elkaar. A. Wat is dit belangrijke verschil? RNAi kan niet zomaar binden aan het te remmen mrna. Dit gebeurt in 3 stappen. B. Wat is de eerste stap? C. Is dit eindproduct van stap 1 dubbelstrengs of enkelstrengs? D. Vervolgens worden deze door een ander eiwitcomplex herkend en opgenomen. Hoe heet dit eiwitcomplex? E. Hoe herkent dit complex vervolgens het mrna? 25. Stamcellen Stamcellen zijn cellen die zichzelf kunnen blijven delen. Bovendien hebben ze het vermogen om zich in verschillende celtypen te ontwikkelen. A. Hoe noem je cellen die dat laatste kunnen?
B. Er bestaan drie type stamcellen, die elk een andere oorsprong hebben. Zet de juiste namen bij de omschrijvingen. hergeprogrammeerde gedifferentieerde cellen: pluripotente cellen uit weefsel: blastocysten: C. Het meest worden embryonale stamcellen gebruikt. Er zijn drie manieren om aan embryo's te komen waar je de embryonale stamcellen uit kunt oogsten. Noem de drie technieken waarbij embryo's voor stamcelonderzoek beschikbaar komen. 3.