Summary in Dutch (Nederlandse samenvatting) Curriculum Vitae Publications Acknowledgements (Dankwoord) Color fi gures CHAPTER 10
178 Chapter 10 Samenvatting In Nederland staat kanker van de dikke- en endeldarm (colorectaal carcinoom) bij mannen op de derde plaats en bij vrouwen op de tweede plaats van de meest voorkomende tumoren. Deze ziekte is de tweede meest voorkomende doodsoorzaak door kanker. Colorectaal carcinoom (CRC) wordt veroorzaakt door een opeenstapeling van genetische en epigenetische afwijkingen, die genexpressie beïnvloeden en leiden tot een afwijkende eiwitexpressie of zelfs tot een nietfunctionerend eiwit waardoor cellen ongecontroleerd gedrag en groei gaan vertonen. In sporadische CRC is chromosomale instabiliteit, gekenmerkt door nummerieke en structurele chromosomale veranderingen, de meest voorkomende vorm (85%) van genomische instabiliteit. In dit proefschrift hebben we onderzocht of chromosomale afwijkingen in CRC en voorstadia hiervan, de adenomen, bijdragen aan de maligne ontaarding van adenomen, van invloed zijn op de prognose van patiënten met primaire CRC en het mogelijk maken respons op therapie in gemetastaseerd CRC te voorspellen. Hierbij is gebruik gemaakt van comparative genomic hybridization (CGH), deze techniek kan chromosomale afwijkingen detecteren in het hele genoom in één enkel experiment, zonder dat celkweek nodig is. Een ander voordeel van deze techniek is dat DNA van formaline gefi xeerd, paraffi ne ingebed weefsel gebruikt kan worden. In hoofdstuk 2-5 werd gebruik gemaakt van chromosome-based CGH, wat een resolutie heeft van ongeveer 10 Mb. In hoofdstuk 6-8 is ingezoomd op de belangrijkste chromosomale regio s met behulp van arraybased CGH. Deze techniek heeft een hogere resolutie (0.1 Mb-1 Mb) en sensitiviteit waardoor we in staat waren om DNA copy number afwijkingen van specifi eke genen te detecteren. Hoofdstuk 2 bevat een uitgebreide studie naar chromosomale veranderingen in colorectaal tumoren in verschillende stadia van ontwikkeling, gericht op afwijkingen die geassocieerd zijn met de progressie van adenoom naar carcinoom. Aangezien van alle colorectale adenomen slechts 5 procent ooit kwaadaardig wordt, was het eerste doel de genetische afwijkingen te vinden die kunnen discrimineren tussen adenomen met een hoog risico en adenomen die zich niet verder ontwikkelen tot carcinoom. Het tweede doel was bestaande modellen van de adenoom-carcinoom progressie bij colorectaal kanker te verbeteren. Het totale aantal chromosomale afwijkingen correleerde met dysplasie, maar niet met mutaties in APC of KRAS. Opeenstapeling van deleties van 8p21-pter, 15q11-q21, 17p12-p13 en 18q12-q21, en van gains van 8q23-qter, 13q14-q31 en 20q13 was sterk geassocieerd met progressie van adenoom naar carcinoom, onafhankelijk van de mate van dysplasie. Dit gegeven zou kunnen worden gebruikt als een marker voor hoog risico. Hierarchische cluster analyse onthulde 3 verschillende, frequent voorkomende combinaties van
Summary in Dutch (Nederlandse samenvatting) 179 genetische afwijkingen, namelijk 17p deletie met KRAS mutatie, gains van 8q en 13q, en deletie van 18q met gain van 20q. Dit toont aan dat de combinatie van een beperkt aantal afwijkingen wellicht belangrijker is voor tumorprogressie dan de opeenstapeling van afwijkingen als zodanig. Verder vormen de resultaten een aanwijzing dat er meerdere onafhankelijke routes van tumorprogressie bestaan, welke mogelijk op verschillende wijze dezelfde biologische processen, zoals proliferatie, differentiatie, apoptose en invasie verstoren. Initiatie en progressie van kanker gaat naast genetische veranderingen ook gepaard met epigenetische veranderingen zoals DNA methylering. Echter de exacte timing en relatie tussen deze veranderingen in de carcinogenese van CRC is nog niet volledig verklaard. Hoofdstuk 3 beschrijft op welk moment promotor methylering optreedt en zijn relatie tot mutaties en chromosomale afwijkingen in normale darmmucosa, colorectale adenomen en carcinomen. De promotor methylering status van 9 tumor suppressor genen en DNA reparatie genen, die zijn geassocieerd met de ontwikkeling van CRC, werd geanalyseerd met methylation-specifi c PCR (MSP) in dezelfde dataset als gebruikt in hoofdstuk 2. Het bleek dat promotor methylering in de meerderheid van deze genen al in grote mate aanwezig is in adenomen zonder enige histologische kenmerken van progressie en dat deze mate van methylering gelijk bleef gedurende tumorprogressie. Zelfs in morfologisch nomale darmmucosa van CRC patiënten, werd promotor methylering voor de meerderheid van de bestudeerde genen gezien, alleen in een lagere frequentie dan in carcinomen. We concludeerden dat promotor methylering een vroege afwijking is tijdens het ontstaan van CRC, die eerder optreedt dan chromosomale veranderingen. Het is verleidelijk te speculeren dat promotor methylering van celcyclus controle genen geassocieerd zou zijn met initiatie van chromosomale instabiliteit. Echter voor bijvoorbeeld het celcyclus regulator gen p16 INK4A en mitose checkpoint controle gen CHFR werd geen associatie gevonden tussen promotor methylering status en chromosomale instabiliteit. De laatste 10 jaar is het duidelijk geworden dat naast de poliep-kanker sequentie er een alternatieve route naar colorectaal carcinoom bestaat met een ander fenotype, het vlakke adenoom. In vergelijking met adenomateuze poliepen van dezelfde grootte, is bij vlakke adenomen vaker submucosale invasie en hooggradige dysplasie gerapporteerd. Gebaseerd op het concept dat het fenotype van een tumor word gedreven door zijn genotype, onderzochten we of vlakke adenomen verschillen van adenomateuze poliepen in hun patronen van chromosomale afwijkingen. In hoofdstuk 4 werden vlakke adenomen en carcinomen geanalyseerd en hun copy number profi elen werden vergeleken met die van poliepeuze adenomen geanalyseerd in hoofdstuk 2. Vlakke tumoren werden gekenmerkt door een hogere prevalentie van 18q loss en 20q gain. De combinatie 18q loss en 20q gain werd ook al gezien in een subgroep van poliepeuze colorectale tumoren in hoofdstuk 2, en de aanwezigheid van deze chromosomale afwijkingen correleerde met een hogere graad van dysplasie en een groter risico op progressie naar carcinoom. Multiplex
180 Chapter 10 ligation-dependent probe amplifi cation (MLPA) werd gebruikt om afwijkingen in aantal DNA kopieën van specifi eke genen op chromosoom 20 te identifi ceren in vlakke en poliepeuze tumoren. Het bleek dat vlakke en poliepeuze colorectale tumoren met een gain van chromosoom 20q dezelfde patronen van DNA kopieën hadden voor de individuele genen. Adjuvante chemotherapie voor dikke darm kanker patiënten met ongunstige kenmerken, zoals aanwezigheid van lymfkliermetastasen (TNM stadium III), is succesvol gebleken. Echter adjuvante chemotherapie voor stadium II dikke darm kanker blijft controversieel. Deze groep patiënten bestaat uit een heterogene populatie, waarvan een subgroep op den duur metastasen ontwikkelt. Deze patiënten zouden baat hebben bij adjuvante chemotherapie. In hoofdstuk 5 onderzochten we in een kleine groep colorectale carcinomen, welke chromosomale afwijkingen gerelateerd zijn aan patiënt overleving. In deze serie tumoren bleken carcinomen met een 20q gain een signifi cant slechtere overleving te hebben in vergelijking met tumoren zonder 20q gain. We concludeerden dat 20q gain een kandidaat marker is om een slechte klinische uitkomst te voorspellen bij CRC patiënten en dat deze observatie klinisch relevant kan zijn, met name bij patiënten met stadium II dikke darm kanker. Gain van chromosoom 20q is, zoals hierboven beschreven één van de meest voorkomende chromosomale afwijkingen tijdens progressie van adenoom naar carcinoom, in adenomen geassocieerd met agressiever klinisch gedrag, en in carcinomen gerelateerd aan een slechtere patiënt overleving. Om de belangrijkste oncogenen gelocaliseerd op dit chromosoom te identifi ceren hebben we in hoofdstuk 6 een serie van 149 colorectale tumoren met behulp van array CGH en expressie microarrays geanalyseerd om gen-dosis effecten te bestuderen. Chromosoom 20q bleek frequent afwijkend in de progressed adenomen en carcinomen (in 60% van de gevallen) terwijl in de nonprogressed adenomen 20q gain maar in 20% van de gevallen werd gedetecteerd. Deze data bevestigen de rol van 20q gain in de progressie van adenoom naar carcinoom, zoals al eerder werd beschreven in hoofdstuk 2. Verdere analyse van 20q gain met behulp van array CGH leverde 3 belangrijke regio s op: één op 20q11.22-q11.23, en de andere twee op 20q13.32 q13.33 en 20q13.33. Analyse van veranderde mrna expressie van genen in deze gebieden resulteerde in 7 genen (C20orf24, AURKA, RNPC1, TH1L, ADRM1, C20orf20 en TCFL5) op chromosoom 20q die signifi cante overexpressie vertoonde in carcinomen in vergelijking met adenomen, als gevolg van 20q gain. Toegenomen mrna expressie van deze genen werd bevestigd met qrt-pcr en toegenomen eiwit expressie van AURKA (aurora kinase A) met behulp van immunohistochemie. Deze genen zouden daarom wel eens zeer belangrijk kunnen zijn in chromosomale instabiliteit gerelateerde progressie van adenoom naar carcinoom en kunnen dienen als prognose markers voor CRC. Met name AURKA is interressant, aangezien dit gen betrokken is in celcyclus regulatie en overexpressie is geassocieerd met centrosoom amplifi catie en aneuploïdie.
Summary in Dutch (Nederlandse samenvatting) 181 Ongeveer 50 procent van alle CRC patiënten ontwikkelt metastasen op afstand en zal uiteindelijk overlijden aan deze ziekte. Hoewel nieuwe therapieën hebben geleid tot betere overleving, zijn behandelingsschema s nog voor het merendeel gebaseerd op de one size fi ts all benadering, en onvoldoende geindividualiseerd. Voorspellende markers zijn dus ook nodig om de patiënten die een goede respons zullen hebben op deze therapieën van de rest te onderscheiden. CRC is biologisch een heterogene ziekte en juist deze heterogeniteit zou de respons op therapie kunnen beïnvloeden. In hoofdstuk 7 werden 32 primaire tumoren van patiënten met gemetastaseerde dikke darm kanker geanalyseerd met behulp van array CGH. Het doel was profi elen van DNA afwijkingen van deze tumoren te correleren met respons op eerste-lijn chemotherapie, bestaande uit een combinatietherapie van capecitabine en irinotecan. Ongesuperviseerde hierarchische cluster analyse leverde 2 clusters van tumoren op en cluster membership liet een signifi cante correlatie met respons status zien. Patiënten die geen respons hadden op chemotherapie hadden minder chromosomale afwijkingen, met name minder losses, in vergelijking met patienten die wel respons toonden. De meest opvallende verschillen tussen de 2 groepen waren deleties van de regio s 18p11.32-q11.2 en 18q12.1-q23, deze werden vaker in de responders aangetroffen. Deze resultaten duiden op heterogeniteit in aantal DNA kopieën over het gehele genoom binnen de groep patiënten met gemetastaseerd CRC, en suggereren dat deze verschillen relevant zijn voor de respons op chemotherapie. Het is recent gebleken dat CRC patiënten met een KRAS mutatie in het tumorweefsel een slechte respons hebben op therapie met EGFR remmers, zoals cetuximab en panitumumab. Het aantal CRC patiënten met wild-type KRAS dat wel respondeert is echter laag. Hieruit blijkt dat er nog andere factoren naast het hebben van een KRAS mutatie van invloed zijn op de respons op EGFR remmers. In hoofdstuk 8 onderzochten we of er verschillen zijn in DNA copy number profi elen in CRC met en zonder KRAS mutatie en of we konden bepalen of in de groep carcinomen met een wild-type KRAS heterogeniteit bestaat op het niveau van veranderingen in DNA kopieën. Daarvoor werden 64 primaire colorectale carcinomen geanalyseerd met behulp van array CGH en 34 van deze tumoren met behulp van mrna expressie arrays. Er werd gekeken of er een associatie was van DNA kopie veranderingen met KRAS mutatie status, en gen-dosis effecten werden onderzocht voor relevante genen. Kandidaat markers werden gevalideerd in een onafhankelijke serie van 35 colorectale carcinomen. De meest signifi cant verschillende regio tussen CRC patiënten met en zonder KRAS mutatie was op chromosoom 8q23.3-q24.3, waar MYC en FAK gelokaliseed zijn. DNA copy number gains van MYC en FAK waren signifi cant vaker aanwezig in wild-type KRAS tumoren. Van deze 2 genen bleek alleen FAK een positieve correlatie te tonen tussen copy number gain en mrna overexpressie. FAK is een regulator van de RAS signalerings route. Dit zou kunnen betekenen dat continue geaktiveerde RAS signaling in CRC niet alleen door KRAS mutatie kan
182 Chapter 10 worden geinduceerd, maar ook door FAK overexpressie als resultaat van een gen-dosis effect. Dit leidt tot de hypothese dat CRC patiënten met een wild-type KRAS en een copy number gain van FAK mogelijk niet zullen responderen op anti-egfr therapie, net als CRC patiënten met een KRAS mutatie. Toekomstperspectieven In dit proefschrift werden 7 kanker geassocieerde DNA copy number veranderingen beschreven, die sterke indicatoren zijn voor progressie van colorectale adenomen naar maligniteit en daardoor als hoog risico markers gebruikt kunnen worden. De meest interessante chromosomale afwijking is gain van chromosoom 20q, omdat dit niet alleen een van de meest frequente chromosomale afwijkingen in de progressie van adenoom naar carcinoom is, maar ook geassocieerd is met een groep van poliepeuze en vlakke adenomen met een agressiever fenotype. Bovendien hadden patiënten met een 20q gain een slechtere overleving. Dus genen gelokaliseerd op 20q, of hun eiwit, kunnen mogelijk fungeren als markers voor vroege detectie van CRC in ontlasting of bloed. Anderzijds kunnen ze ook fungeren als mogelijke nieuwe targets voor farmacologische interventie. In hoofdstuk 6 vonden we 7 genen (C20orf24, AURKA, RNPC1, TH1L, ADRM1, C20orf20 en TCFL5) gelokaliseerd op chromosoom 20q die overexpressie tonen op basis van een gen-dosis effect. AURKA overexpressie werd bevestigd op eiwit niveau met behulp van immunohistochemie. Ten tijde van deze studie waren er voor de eiwitten van de 6 andere genen helaas nog geen voor immunohistochemie geschikte antilichamen. Momenteel worden antilichamen tegen deze eiwitten ontwikkeld. Tevens zijn er functionele studies gaande om de biologische relevantie van deze 7 genen te onderzoeken. CRC is biologisch een heterogene ziekte op DNA, RNA en eiwit niveau en dat kan respons op chemotherapie beinvloeden. Onze data en die van anderen laten zien dat respons op therapie voorspelt kan worden aan de hand van DNA copy number profi elen. In hoofdstuk 7 beschreven we dat CRC patiënten met loss van chromosoom 18 een betere respons hadden op combinatietherapie van capecetabine en irinotecan. Chromosoom 18 bevat echter vele genen en welke van deze verantwoordelijk zijn voor het respons fenotype is niet bekend. Een uitgebreide validatie studie is momenteel gaande om te bevestigen of onze observaties ook echt van waarde kunnen zijn in de klinische praktijk bij selectie van patiënten voor chemotherapie. In deze validatie studie wordt gebruik gemaakt van een array CGH platform met een nog hogere resolutie, zodat we meer in detail kunnen kijken welke genen afzondelijk geassocieerd zijn met respons op therapie. In hoofdstuk 8 ontdekten we dat in CRC met wild-type KRAS copy number gain van FAK een potentiele marker
Summary in Dutch (Nederlandse samenvatting) 183 is voor respons op EGFR remmers. Ook deze observatie moet verder gevalideerd worden in een serie van CRC patiënten die behandeld zijn met cetuximab of panitumumab om te bewijzen of copy number gain van FAK ook echt respons op deze therapie kan voorspellen. Hoewel histopathologie altijd de hoeksteen van de diagnostiek zal blijven, zullen biologische kenmerken van tumoren onvermijdelijk belangrijk worden als diagnostische, prognostische en voorspellende markers. De nieuwe techniek massively parallel sequencing (MSP) zal array CGH waarschijnlijk gaan verdringen als de methode van keuze voor high throughput genomics. MSP biedt de mogelijkheid om in één enkel experiment het gehele genoom te screenen op puntmutaties, DNA copy number afwijkingen en rearrangements. In de nabije toekomst, zal het mogelijk worden om de complexiteit van de biologie van CRC nog dieper te doorgronden en van de verkregen informatie gebruik te maken om kosten effectieve testen te ontwikkelen voor betere diagnostiek en op maat gemaakte behandelingschema s.
Curriculum Vitae 185 Curriculum Vitae Cindy Postma werd geboren op 10 maart 1974 te Arnhem. In 1993 behaalde zij haar Atheneum diploma aan het Christelijk Lyceum Arnhem (CLA) te Arnhem. In datzelfde jaar startte zij met de opleiding Hogere Laboratorium Onderwijs aan de Hogeschool van Arnhem en Nijmegen (HAN) en behaalde zij in 1997 haar diploma Bachelor of Science in de cyto-/histopathologie. Tijdens deze opleiding werd stage gelopen bij de afdeling Pathologie van het VU Medisch Centrum te Amsterdam, waar zij onder begeleiding van drs. J. Lagendijk, dr. H. Mullink en ing. T. Tadema onderzoek deed naar het antigeenprofi el en de HPV status in de differentiaal diagnose tussen adenocarcinomen van endocervix-endometrium-ovarium-colon. Na haar wetenschappelijke stage in 1997 is zij gaan werken als researchanalist bij de afdeling Pathologie van het VU Medisch Centrum onder begeleiding van prof.dr.c.j.l.m. Meijer in samenwerking met het Burns Research Institute (BRI), en deed onderzoek naar de verhouding van de verschillende TGFβ isoformen en zijn receptoren in de genezing van brandwonden. Na anderhalf jaar werk heeft zij in 1998 een overstap gemaakt naar een ander project onder leiding van prof.dr. G.A. Meijer, waar zij 3 jaar lang als researchanalist heeft gewerkt aan het identifi ceren van chromosomale afwijkingen in adenomen en carcinomen van de dikke darm. Dit onderzoek heeft geleid tot een vervolgproject in 2002, waarbij onderzoek werd gedaan naar oncogenen in de chromosomale regios 8q22-23, 13q21-31 en 20q13 die een rol spelen bij de progressie van colorectaal adenoom naar carcinoom. In 2001 heeft zij tijdelijk om de periode te overbruggen tussen deze 2 researchprojecten voor 6 weken gewerkt als researchanalist in het laboratorium van prof.dr. D. Albertson aan de Universiteit van Californië te San Francisco. In deze 6 weken heeft zij aan een project van een collega (M.M. Weiss) gewerkt, waarbij genetische afwijkingen in maagtumoren met behulp van micro-arrays werden geidentifi ceerd. In september 2002 is zij, naast haar werk als researchanalist, gestart met de studie Geneeskunde aan de Vrije Universiteit te Amsterdam. In 2006 behaalde zij haar doctoraal examen en eind 2008 het artsexamen. Na haar artsexamen heeft zij in 2009 nog een half jaar fulltime als AIO bij de afdeling Pathologie van het VU Medisch Centrum gewerkt en tevens het andere half jaar als researchanalist bij de afdeling Klinische Genetica van het VU Medisch Centrum, waar zij geholpen heeft met het implementeren en valideren van diverse micro-arrays in de diagnostiek. Het onderzoek dat zij in de afgelopen jaren als researchanalist/aio heeft uitgevoerd onder supervisie van prof.dr. G.A. Meijer heeft geresulteerd tot dit proefschrift getiteld Chromosomal instability in pathogenesis and prognosis of colorectal cancer.
186 Chapter 10 In januari 2010 is zij aangenomen als arts in opleiding tot maag-, darm en leverarts aan het Erasmus Medisch Centrum te Rotterdam (prof.dr. E.J. Kuipers, dr. R.A. de Man). Op dit moment is zij bezig met haar vooropleiding Interne Geneeskunde in het IJsselland Ziekenhuis te Capelle a/d IJssel (dr. H.E. van der Wiel).
Publications 187 Publications Sillars-Hardebol AH, Carvalho B, de Wit M, Postma C, Delis-van Diemen PM, Mongera S, Ylstra B, van de Wiel MA, Meijer GA, Fijneman RJ. Identifi cation of key genes for carcinogenic pathways associated with colorectal adenoma-to-carcinoma progression. Tumour Biol. 2010 Apr; 31(2): 89-96. Diosdado B, van de Wiel MA, Terhaar Sive Droste JS, Mongera S, Postma C, Meijerink WJ, Carvalho B, Meijer GA. MiR-17-92 cluster is associated with 13q gain and c-myc expression during colorectal adenoma to adenocarcinoma progression. Br J Cancer. 2009 Aug 18; 101(4): 707-714. Postma C, Koopman M, Buffart TE, Eijk PP, Carvalho B, Peters GJ, Ylstra B, van Krieken JHJM, Punt CJA, Meijer GA. DNA copy number profi les of primary colorectal cancers as predictors of response to therapy. Ann Oncol. 2009 Jun; 20(6):1048-1056. Carvalho B, Postma C, Mongera S, Hopmans E, Diskin S, van de Wiel MA, van Criekinge W, Thas O, Matthäi A, Cuesta MA, Terhaar Sive Droste JS, Craanen M, Schröck E, Ylstra B, Meijer GA. Multiple putative oncogenes at the chromosome 20q amplicon contribute to colorectal adenoma to carcinoma progression. Gut. 2009 Jan; 58(1): 79-89. Derks S, Postma C, Carvalho B, van den Bosch SM, Moerkerk PT, Herman JG, Weijenberg MP, de Bruïne AP, Meijer GA, van Engeland M. Integrated analysis of chromosomal, microsatellite and epigenetic instability in colorectal cancer identifi es specifi c associations between promoter methylation of pivotal tumour suppressor and DNA repair genes and specifi c chromosomal alterations. Carcinogenesis. 2008 Feb; 29(2): 434-439. Fijneman RJ, Carvalho B, Postma C, Mongera S, van Hinsbergh VW, Meijer GA. Loss of 1p36, gain of 8q24, and loss of 9q34 are associated with stroma percentage of colorectal cancer. Cancer Lett. 2007 Dec 18; 258(2): 223-229. Postma C, Terwischa S, Hermsen MA, van der Sijp JR, Meijer GA. Gain of chromosome 20q is an indicator of poor prognosis in colorectal cancer. Cell Oncol. 2007; 29(1): 73-75.
188 Chapter 10 Derks S, Postma C, Moerkerk PT, van den Bosch SM, Carvalho B, Hermsen MA, Giaretti W, Herman JG, Weijenberg MP, de Bruïne AP, Meijer GA, van Engeland M. Promoter methylation precedes chromosomal alterations in colorectal cancer development. Cell Oncol. 2006; 28(5-6): 247-257. Postma C, Hermsen MA, Coffa J, Baak JP, Mueller JD, Mueller E, Bethke B, Schouten JP, Stolte M, Meijer GA. Chromosomal instability in fl at adenomas and carcinomas of the colon. J Pathol. 2005 Mar; 205(4): 514-521. Weiss MM, Kuipers EJ, Postma C, Snijders AM, Pinkel D, Meuwissen SG, Albertson D, Meijer GA. Genomic alterations in primary gastric adenocarcinomas correlate with clinicopathological characteristics and survival. Cell Oncol. 2004; 26(5-6): 307-317. Weiss MM, Kuipers EJ, Postma C, Snijders AM, Stolte M, Vieth M, Pinkel D, Meuwissen SG, Albertson D, Meijer GA. Genome wide array comparative genomic hybridisation analysis of premalignant lesions of the stomach. Mol Pathol. 2003 Oct; 56(5): 293-298. Ruivenkamp C, Hermsen M, Postma C, Klous A, Baak J, Meijer G, Demant P. LOH of PTPRJ occurs early in colorectal cancer and is associated with chromosomal loss of 18q12-21. Oncogene. 2003 May 29; 22(22): 3472-3474. Weiss MM, Kuipers EJ, Postma C, Snijders AM, Siccama I, Pinkel D, Westerga J, Meuwissen SG, Albertson DG, Meijer GA. Genomic profi ling of gastric cancer predicts lymph node status and survival. Oncogene. 2003 Mar 27; 22(12):1872-1879. Hermsen M, Postma C, Baak J, Weiss M, Rapallo A, Sciutto A, Roemen G, Arends JW, Williams R, Giaretti W, De Goeij A, Meijer G. Colorectal adenoma to carcinoma progression follows multiple pathways of chromosomal instability. Gastroenterology. 2002 Oct; 123(4):1109-1119. Giaretti W, Rapallo A, Sciutto A, Macciocu B, Geido E, Hermsen MA, Postma C, Baak JP, Williams RA, Meijer GA. Intratumor heterogeneity of k-ras and p53 mutations among human colorectal adenomas containing early cancer. Anal Cell Pathol. 2000; 21(2):49-57.
Acknowledgements (Dankwoord) 189 Acknowledgements (Dankwoord) Het tot stand komen van dit proefschrift was niet de meest gangbare, laten we ook maar niet spreken over het aantal jaren. Echter in al die jaren heb ik veel geweldige mensen leren kennen, met wie ik met veel plezier heb samengewerkt en die op verschillende wijze hebben bijgedragen aan dit proefschrift. Te beginnen met mijn promotor prof.dr G.A. Meijer. Na een aantal jaren als researchanalist binnen jouw onderzoeksgroep te hebben gewerkt, stelde jij mij voor een artikel te gaan schrijven over onze data van de vlakke colorectale tumoren. Net op het moment dat ik hard toe was aan een nieuwe uitdaging. Na dat ene artikel heb je mij niet alleen gemotiveerd tot het schrijven van dit proefschrift, maar je respecteerde ook mijn keuze om op mijn 28 ste levensjaar te starten met de studie Geneeskunde (ach ja, ik ben ook niet de enige oude bok die een dergelijk besluit neemt!). Ik ben je dankbaar dat jij mij de mogelijkheid hebt geboden om binnen jouw onderzoeksgroep tegelijk te promoveren, te studeren en te werken als researchanalist. En ook al zag ik af en toe door de bomen het bos niet meer, na een gesprek met jou had ik altijd het gevoel dat het weer allemaal goed ging komen. Gerrit, ik bewonder jouw vermogen om alles positief te benaderen. Als tweede wil ik natuurlijk mijn beide copromotoren bedanken. Beatriz, vanaf het begin was er meteen een prettige klik tussen ons. Je hebt een heerlijk enthousiaste persoonlijkheid en bent altijd bereid om iedereen te helpen. Ik kon altijd bij je aankloppen voor adviezen en hulp, ondanks het groeiend aantal aio s die je begeleide. Ik ben blij dat je naast mijn copromotor ook een hele goede vriendin bent geworden. Ik hoop dat onze vriendschap ondanks mijn vertrek naar het zuiden zal blijven bestaan. Bauke, ik heb de groei van jouw microarray facillity met veel plezier van dichtbij mogen meemaken, beginnende met een aantal BAC clones en 2 man sterk personeel. Wat kan jij een mens verrassen door out of de blue te verkondigen dat je haar copromotor bent. Dank voor al jouw hulp met de array-experimenten en het kritisch lezen van de laatste artikelen van dit proefschrift. En dan natuurlijk mijn twee paranimfen, Sandra en Hedwig. Ik heb jullie functie even op wikipedia opgezocht: De oorspronkelijke betekenis van paranimf is bruidsjonker of bruidsmeisje. In het verleden werd afstuderen of promoveren ook wel gezien als het sluiten van een huwelijk met de universiteit... Echter, honderden jaren geleden, toen academische disputen bij een promotie nog wel eens hoog wilden oplaaien en de gemoederen danig verhit konden raken, dienden paranimfen als lijfelijke beschermers.
190 Chapter 10 Het was zeer verstandig om je als promovendus te laten begeleiden door een tweetal potige kerels. Dus dames, ik reken op jullie! Sandra ( prettig gestoorde Italiaan ), in het begin mijn wederhelft op het lab. Ik ben blij dat je ooit gesolliciteerd hebt op de parttime baan om mijn gat op te vullen omdat ik het in mijn bol kreeg om te gaan studeren. Naast alle hulp op het lab, zorgde je ook voor veel gezellige en ontspannende momenten tijdens en naast het werk. Je was/bent niet alleen een hele fi jne collega maar je bent ook een goede vriendin. Hedwig ( nichie ), ik ben vereerd dat je op deze belangrijke dag naast mijn zijde wilt staan. Je bent de laatste jaren een hele goede steun voor me geweest, want de laatste jaren waren nogal rumoerig. Dank voor jouw luisterend oor en de vele bemoedigende woorden. De leden van de lees- en promotiecommissie, prof.dr. E.J. Kuipers, prof.dr. C.J. Mulder, prof.dr. H.M.W. Verheul, dr. M. van Engeland, dr. A. Cats, dr. H. te Riele en dr. I.D. Nagtegaal, wil ik bedanken voor de tijd en aandacht die ze aan mijn proefschrift hebben besteed. De afgelopen 12 jaar heb ik veel collega s zien komen en gaan binnen de Tumor Profi ling unit (voormalig Kwantitatieve Pathologie). Mario en Janneke, jullie waren degene die mij in het begin de fi jne kneepjes van de CGH hebben geleerd, knus op een labje zonder ramen waar we net met zo n 2 tot 3 man inpasten. Maar gezellig was het er altijd wel! Mario, jij liet zien dat je niet per se de gebruikelijke weg tot promoveren hoeft te doorlopen. Janneke, het ontstaan van dit proefschrift heb ik voor een deel aan jou te danken, want na een avondje klaagzang bij jou thuis over het feit dat ik genoeg had van het alleen maar genereren van data, kwam Gerrit al snel met het voorstel of ik geïnteresseerd was om zelf een artikel te schrijven. Na dat ene artikel kwam alles aan het rollen. Ondanks jullie vertrek jaren geleden ben ik blij dat onze vriendschap is blijven bestaan. Een aantal jaar geleden stond ik jullie als paranimf ter zijde, en nu is de beurt aan mij. Dan natuurlijk dank aan alle oudgediende KP-ers en huidige TP-ers: Nicole ( Knokio ), Marta, Ellen, Angelique, Mark, Jane, Paul v. D, Mireille, Jeroen B, Petra, Astrid, Marije, Pien, David, Ingrid, Arno, Reinhard, Lennert, Tineke (dank voor al je adviezen en tips betreffende het promoveren en voor alle momenten van ontspanning, tijdens onze wekelijkse spinningsessies, op de skates of gewoon met één (of meerdere) biertje(s) in de kroeg), Erik, Linda, Anke, Meike, Marianne, Begoña, Remond, Rinus, Anne, Jeroen G, Lisette, Pauline, Henny en natuurlijk ook de pseudo TP-ers: Jordy, Frank, Sietze, Rebecca, Jochim, Eric, Liselot en natuurlijk Saskia W. Dank voor al jullie hulp en gezelligheid, dan wel op het werk of daarbuiten. Het was altijd weer een genoegen als we er weer op uit gingen voor een borreltje, een hapje, een fi lmpje, swingen op de dansvloer of een weekendje/weekje weg
Acknowledgements (Dankwoord) 191 om te onthaasten. Meike, Linda, Anke, Rinus, Josien, Jeroen G, Lisette, Frank, Sietze, Rebecca, Jochim, Eric en Liselot, ik wens jullie succes met de (laatste) loodjes van jullie promotietraject. Dan wil ik de medewerkers van de Micro-array Facility bedanken voor jullie gastvrijheid en hulp met alle array experimenten; Paul Eijk, Serge, Daniëlle, Josien, François en Dirk, en niet te vergeten ook de ex-medewerkers; Paul vd IJssel, Alan en Thijs. En voor het creëren van alle mooie programma s om die immense hoeveelheid verkregen array data te kunnen analyseren, Mark vd Wiel, Wessel, Sjoerd en Jolanda. Thanks! Natuurlijk alle andere collega s van de Pathologie, de huidige ganggenootjes van de Moleculaire Pathologie en natuurlijk ook de oud ganggenootjes van de Neuropathologie, dank voor al jullie hulp op het lab, de gezellige koffi epauzes en de (gang)borrels. Manon en Sarah van de Universiteit van Maastricht, bedankt voor de prettige samenwerking. Mijn nieuwe collega s van het IJsseland ziekenhuis, jullie dank voor het geduld en de hulp met name in de eerste maanden van mijn opleiding. De chaos in mijn hoofd bereikte toen zijn hoogtepunt. Lieve familie en vrienden, zonder jullie was dit proefschrift ook niet tot stand gekomen. Velen van jullie waren altijd geïnteresseerd in wat ik nou deed met dat DNA en die chromosoompjes. Ik heb de afgelopen jaren veel steun van jullie gehad. En dat ik bij de meeste van jullie altijd vrijblijvend mocht aanschuiven aan de eettafel, omdat je niet rijk wordt van fulltime studeren en een parttime baan, daar ben ik jullie ook heel dankbaar voor! Lieve mama, ik ben je zeer dankbaar voor al het vertrouwen dat je in me hebt en de mogelijkheden die je mij (samen met papa) in al die jaren hebt geboden zodat ik mij kon ontwikkelen tot de persoon die ik nu ben. Het is altijd fi jn om te horen hoe trots een ouder op haar kind is. Pa, je kunt er helaas niet bij zijn. Je bent op veel te jonge leeftijd uit mijn leven verdwenen. Ook jou ben ik dankbaar voor alles wat je voor me gedaan hebt. Ik mis je nog dagelijks. Cindy
Color fi gures 193 Color figures Chapter 2: Figure 3. Heat map representations of the results of 2 separate hierarchic cluster analyses of (A) 112 colorectal adenomas and (B) 82 colorectal carcinomas, based on chromosomal gains and losses detected by CGH. Each row represents a specifi c chromosome arm, and every column represents a separate tumor. Green cells represent gains, red cells represent losses, and black cells indicate no abnormality. Rows are ordered according to correlations between chromosomal changes, following the tree displayed on the right side. Tumors are grouped on the basis of similarities in chromosomal aberrations following the tree displayed on top. Some chromosomal abnormalities are closely correlated, such as 8q and 13q gains, both in the (A) adenomas and in the (B) carcinomas. Only fi rst- and secondgeneration tumor clusters (the fi rst- and second-level branches of the tree) were used for classifi cation purposes. In the adenoma tree, 4 clusters emerged, whereas in the carcinoma tree, 2 major clusters appeared (next to 1 carcinoma that did not show any chromosomal abnormality).
196 Chapter 6: Figure 2. Delimitation of the smallest regions of overlap (SRO s) by STAC analysis for 115 samples (41 nonprogressed adenomas, 41 adenocarcinoma components of progressed adenomas, and 33 adenocarcinomas). Results for the long arm of chromosome 20 are displayed. Rows represent samples, and columns represent chromosomal locations. A black dot indicates a gain called in a sample at a location. Consecutive black dots are connected by a line to represent an interval of aberration. Grey bars track the maximum STAC confi dence (1 P value), darker bars are those with confi dence >0.95. The line graph indicates the actual frequencies in the sample set.
Color fi gures 197 Chapter 6: Figure 6. A. Examples of AURKA protein expression in TMA cores of an adenoma showing no expression (0), an adenocarcinoma showing weak expression (1), and an adenocarcinoma showing strong expression (2).
200 Chapter 7: Figure 1. Unsupervised hierarchical cluster analysis of 32 advanced CRC samples, based on chromosomal gains and losses detected by acgh. Rows represent chromosome 1 till 22 (different chromosomes are indicated by alternating blue and yellow colors), and every column represents a separate tumor. Green cells represent gains, red cells represent losses, white cells represent amplifi cations, and black cells indicate no abnormality. Two clusters emerged, cluster 1 containing mainly non-responders and cluster 2 responders.