SAMENVATTING Ammoniak is een van de voornaamste luchtverontreinigende stoffen in Nederland. Het is voor bijna 90% afkomstig uit de landbouw. De ammoniak komt vooral vrij bij de produktie van mest in de rundveehouderij en intensieve veehouderij en bij het uitrijden van mest op het land. In gebieden zoals de Veluwe, Zuidoost-Brabant en Noord-Limburg, waar zulke landbouwbedrijven zijn geconcentreerd, is de ammoniak concentratie in de lucht 10 tot 15 maal hoger dan in relatief schone gebieden. Uit de vele onderzoekingen, die zijn uitgevoerd in het kader van het Additioneel Programma Verzuringsonderzoek (APV), is gebleken dat luchtverontreiniging met ammoniak het functioneren van planten, dieren en ecosystemen (levensgemeenschappen van planten en dieren) sterk beïnvloedt. Het wordt beschouwd als een van de belangrijkste oorzaken van de bossterfte in Nederland. Bovengrondse en ondergrondse effecten van ammoniak Ammoniak is een gas dat na vrijkomen uit dierlijke mest in verschillende vormen in het milieu kan belanden. Allereerst kan het als gasvormig ammoniak op planten en in de bodem terechtkomen. Daarnaast kan het reageren met zwaveldioxide, een ander luchtverontreinigend gas, of oplossen in waterdruppels van wolken, mist of dauw. In deze gevallen wordt het gasvormig ammoniak omgezet in ammonium, dat op deze manier op planten en de bodem terecht kan komen. Ammoniak, dat op de bodem is neergekomen kan, na omzetting tot ammonium, door de wortels van de plant worden opgenomen. Afhankelijk van de zuurgraad (ph) en samenstelling van de bodem kan het ammonium ook eerst worden omgezet in nitraat (zogeheten nitrificatie) en in deze vorm worden opgenomen. In beide gevallen leidt dit tot een verlaging van de zuurgraad van de bodem, wat tot gevolg heeft dat het chemisch evenwicht in de grond verandert. De voedingsstoffenbalans van de bodem kan ernstig worden verstoord als gevolg van de verzuring en de grote hoeveelheid stikstof die in de vorm van ammonium in de bodem terecht komt. Dit kan de opname van essentiële voedingsstoffen door de plant bemoeilijken. Ook kunnen allerlei zware metalen, die normaal sterk gebonden zijn aan bodemdeeltjes, zoals bijvoorbeeld aluminium, door de verzuring in het bodemwater oplossen. Op deze manier kunnen ze in hoge concentraties voor gaan komen, wat schadelijk is voor de plant. 135
Planten kunnen ammoniak ook rechtstreeks uit de lucht opnemen via de bovengrondse delen, zoals de bladeren en de stengels. De opname van gasvormig ammoniak vindt plaats via de huidmondjes. In het blad wordt het ammoniak snel omgezet in ammonium. Dit ammonium kan worden ingebouwd in stikstofrijke verbindingen, zoals aminozuren, die de bouwstenen zijn voor eiwitten. Ondanks het feit dat dit essentiële verbindingen zijn voor planten, kan er door een overmatige vorming van deze stoffen een verstoring van de normale stofwisseling plaatsvinden. In het geval dat ammoniak in de vorm van ammonium het blad bereikt kan dit ook door het blad worden opgenomen. Deze opname wordt echter gecompenseerd door de afgifte van andere voedingsstoffen door het blad. Dit leidt ertoe dat in de plant een overschot aan stikstof en een tekort aan voedingsstoffen zoals kalium, magnesium en calcium kan ontstaan, waardoor allerlei fysiologische processen worden verstoord. Uit het voorgaande blijkt dat luchtverontreiniging met ammoniak, zowel via reacties in de wortel als in de bovengrondse delen, het normale functioneren van een plant ernstig kan beïnvloeden. Het is gebleken dat de opname van gasvormig ammoniak door de bovengrondse delen van de plant veel belangrijker is dan de opname van ammonium via de wortels. In dit proefschrift zijn daarom voornamelijk de effecten van gasvormig ammoniak op planten bestudeerd. Positief en negatief Blootstelling van planten aan gasvormig ammoniak kan zowel positieve als negatieve gevolgen hebben. Hoge concentraties van ammoniak in de lucht zijn giftig en leiden vaak tot een sterk verminderde groei en directe toxische effecten, zoals verkleuring en het afsterven van bladeren. Zulke hoge concentraties zijn echter zeldzaam. Ze treden meestal alleen op als gevolg van ongelukken bij de produktie of het transport van ammoniak. Bij lagere en meer realistische concentraties is ammoniak in eerste instantie niet giftig en fungeert het als meststof. Bij zulke concentraties resulteert blootstelling aan ammoniak vaak in een stimulering van de fotosynthese en de groei, wat het gevolg is van de extra stikstof die de plant via de ammoniak opneemt. In eerste instantie zijn er geen negatieve effecten waar te nemen. Toch gaan deze positieve effecten meestal gepaard met ernstige fysiologische veranderingen, die ertoe kunnen leiden dat de vitaliteit van de plant vermindert. Enkele voorbeelden van zulke veranderingen zijn: verstoringen in de voedingsstoffenbalans, een vervroegde blad- of naaldval, een minder goed uitlopen van knoppen, een verhoogde spruit-wortel verhouding en minder mycorrhiza s (dit zijn samenlevingsvormen tussen schimmels en de wortels van een plant die een efficiënte opname van voedingsstoffen en water mogelijk maken). Als gevolg van deze verminderde vitaliteit kunnen planten gevoelig worden voor natuurlijke stress-factoren, zoals droogte, vorst, insektenplagen en ziektes. Er wordt algemeen aangenomen dat deze indirecte 136
effecten de hoofdoorzaak zijn voor het sterven van bomen en planten bij blootstelling aan ammoniak. In dit proefschrift zijn de gevolgen van ammoniak op één van deze stressfactoren, namelijk vorstgevoeligheid, nader bestudeerd. Ammoniak en vorstgevoeligheid Voordat in 1990 met het in dit proefschrift beschreven onderzoek werd gestart, was al duidelijk dat blootstelling aan ammoniak kan leiden tot een verhoogde gevoeligheid van planten voor vorst. Dit verschijnsel was in Nederland goed waar te nemen na de strenge winters van 1985 en 1986. Bomen in de nabijheid van intensieve veehouderijen bleken vaak het slachtoffer van vorstschade. De conditie van de bossen in sterk vervuilde gebieden was na de winter sterk verslechterd ten opzichte van de situatie ervoor. De reden voor deze toegenomen vorstgevoeligheid is echter nog niet goed bekend. Normalerwijze zijn de meeste planten, die van oorsprong in Nederland voorkomen, in staat om lage temperaturen tijdens de winter te overleven. De plant moet hiervoor een aantal veranderingen ondergaan die haar in zekere zin ongevoelig maken voor koude. Er vinden ophopingen plaats van bepaalde suikers, aminozuren en eiwitten en wijzigingen in de samenstelling van de celmembranen. Dit proces van veranderingen, dat afharding wordt genoemd, komt normaal in het begin van de herfst op gang, aan het einde van de groeiperiode van de plant. Luchtverontreiniging met ammoniak zou dit afhardingsproces op verschillende manieren kunnen verstoren en zodoende de gevoeligheid voor vorst doen toenemen. Allereerst zou door het verhoogde stikstofgehalte van de planten het afhardingsproces kunnen worden vertraagd, wat zou leiden tot een grotere gevoeligheid voor vorst. Een andere mogelijke reden is dat er door veranderingen in fysiologische en stofwisselingsprocessen door ammoniak een tekort kan ontstaan aan stoffen die noodzakelijk zijn voor het overleven van planten tijdens de winter, zoals bepaalde suikers en eiwitten. Daarnaast zou een ophoping van stoffen, zoals ammonium, de vorstgevoeligheid kunnen vergroten. Het hier beschreven onderzoek is opgezet om achter de mechanismen van de verhoogde vorstgevoeligheid te komen. Wintertarwe In het begin van het onderzoek is gebruik gemaakt van wintertarwe als proefplant. Deze plant is gekozen omdat er al veel bekend is over het afhardingsproces van deze plantesoort. Bovendien is deze plant vrij gemakkelijk in grote aantallen op te kweken, te hanteren en af te harden tegen koude, wat het onderzoek vereenvoudigt. De planten 137
werden onder gecontroleerde groeiomstandigheden uit zaad opgekweekt in een klimaatruimte. Na een bepaalde tijd werden de planten overgebracht naar speciale begassingstonnen, waarin de planten aan ammoniak konden worden blootgesteld. De planten konden worden afgehard tegen vorst door de temperatuur in deze begassingstonnen te verlagen tot 4 C en de belichtingsduur te verkorten tot 8 of 10 uur per dag. In een eerste serie experimenten werd het effect van gasvormig ammoniak op de groei en de stikstofhuishouding van wintertarwe bestudeerd. De planten werden gedurende 1 tot 2 weken aan ammoniak blootgesteld bij gematigde groeitemperaturen (dagtemperatuur 18.5 C; nachttemperatuur 15 C). Onder deze omstandigheden bleken de planten al het ammoniak dat via de bladeren opgenomen werd om te kunnen zetten in eiwitten, zonder dat er een ophoping van de tussenprodukten ammonium en aminozuren plaatsvond. Uit het onderzoek bleek dat wintertarwe de extra opname van stikstof (als ammoniak) via de bladeren compenseerde met een verminderde stikstofopname (als nitraat) via de wortels. In een aantal gevallen bleken beide processen elkaar volledig te kunnen compenseren, zodat het totaal stikstofgehalte van de plant niet toenam. Bij blootstelling aan hogere concentraties of gedurende langere tijd was de verminderde nitraatopname via de wortels ontoereikend voor een volledige compensatie van de stikstofopname via het blad, waardoor het totaal stikstofgehalte steeg. De groei van de planten nam niet of slechts licht toe bij blootstelling aan ammoniak. De inbouw van ammoniak had geen verlaging van het suikergehalte tot gevolg, zoals werd verwacht uit resultaten van andere studies. Een verklaring hiervoor werd gevonden in een verhoging van de fotosynthese in de aan ammoniak blootgestelde planten. Door deze hogere fotosynthese kunnen de planten meer koolstof vastleggen en zodoende meer suikers maken. Na de blootstelling van tarweplanten aan ammoniak bij gematigde groeitemperaturen werd de temperatuur verlaagd tot 4 C overdag en 3 C s nachts. Onder deze condities wordt in wintertarwe het afhardingsproces gestart. De planten werden ook onder deze omstandigheden met ammoniak begast om het effect ervan tijdens de afhardingsfase te kunnen bestuderen. Bij deze lage temperaturen bleek dat de inbouw van ammoniak gedeeltelijk was geremd. Dit resulteerde in een ophoping van ammonium en aminozuren in de planten die aan ammoniak waren blootgesteld. Tegelijkertijd was het suikergehalte van deze planten verlaagd, als gevolg van het gebruik van suikers voor de inbouw van ammoniak in aminozuren. Anders dan bij gematigde temperaturen kon een verhoging van de fotosynthesesnelheid dit extra gebruik van suikers niet tegengaan. Bij zulke lage temperaturen is de fotosynthese blijkbaar zo sterk geremd, dat er geen extra suikers geproduceerd kunnen worden. De vorstgevoeligheid van de planten werd vastgesteld na verschillende perioden van afharding. Hiervoor werden kleine stukjes blad blootgesteld aan temperaturen van +4 C tot -20 C (of lager), waarna bekeken werd in hoeverre de bladstukjes deze temperaturen overleefden. Voor het vaststellen ervan werd gebruik gemaakt van een speciaal hiervoor 138
uitgeteste meetmethode van de veel gebruikte chlorofyl fluorescentie meting. Deze meetmethode gaf betrouwbare resultaten en was goed te gebruiken voor het snel doormeten van grote aantallen monsters. De vorstgevoeligheid van de wintertarwe planten bleek echter niet beïnvloed te zijn, ondanks de grote veranderingen in fysiologische en stofwisselingsprocessen bij lage temperatuur. Uit het onderzoek kon worden geconcludeerd dat wintertarwe geen nadelige effecten ondervindt van blootstelling aan ammoniak gedurende relatief korte tijd. Grove den Het tweede deel van het onderzoek is uitgevoerd aan een boomsoort, namelijk de grove den. Van deze plant was uit eerdere studies bekend dat de vorstgevoeligheid wel toeneemt onder invloed van ammoniak in de lucht. Deze planten zijn echter minder goed op te kweken en groeien langzaam, waardoor ze moeilijker te gebruiken zijn als proefplant in kortdurende begassingsproeven. In een eerste serie experimenten is gebruik gemaakt van 6 weken oude, uit zaad opgekweekte planten (zaailingen). Deze planten werden op dezelfde manier aan ammoniak blootgesteld als de wintertarwe planten. Ammoniak in de lucht had ook bij grove den zaailingen tot gevolg dat het ammonium- en totaal stikstofgehalte sterk werden verhoogd, terwijl het suikergehalte niet werd beïnvloed. Het chlorofyl a (bladgroen) gehalte en de fotosynthese-capaciteit waren hoger in de met ammoniak begaste planten. Toch was bij deze planten geen verhoogde vorstgevoeligheid waar te nemen als gevolg van ammoniak, evenmin als bij 3 jaar oude denneboompjes uit een ander experiment. Integendeel, in sommige gevallen waren planten die met ammoniak waren begast zelfs beter in staat vriestemperaturen te overleven. Mogelijk speelden de kunstmatige afhardingscondities in het laboratorium hierbij een rol. Maar uit experimenten met 5 jaar oude bomen die van september tot en met april werden begast in grote begassingstonnen in het vrije veld (zogenaamde open top kamers ), en dus onder natuurlijke omstandigheden waren afgehard, werd ook geen negatief effect van ammoniak op de vorstgevoeligheid gevonden. Uit deze resultaten werd daarom geconcludeerd dat een verhoogd stikstof- of ammoniumgehalte of een verlaagd suikergehalte van de naalden niet direct leiden tot een verhoogde vorstgevoeligheid. Deze conclusie kon worden bevestigd aan de hand van de resultaten van veldexperimenten met 20 tot 30 jaar oude grove dennen. Deze bomen groeiden in een bosgebied met ernstige luchtverontreiniging met ammoniak (Rouwkuilen, Noord-Limburg) of in een bosgebied met schone lucht (Appèlbergen, Groningen). Uit metingen aan deze bomen bleek dat de naalden uit het met ammoniak vervuilde gebied gevoeliger waren voor vorst dan die uit het schone gebied. Dit was echter alleen het geval bij naalden die ouder dan 1 jaar waren. Jonge naalden, die in het afgelopen groeiseizoen waren gevormd, toonden 139
geen verschillen in vorstgevoeligheid. Toch hadden beide groepen naalden (zowel de jonge als de oude) een sterk verhoogd ammonium- en stikstofgehalte en een verlaagd suikergehalte, wat aangeeft dat deze factoren, net als bij wintertarwe, geen direct verband houden met de verhoogde vorstgevoeligheid. Uit deze experimenten bleek wel dat de oude naalden een ernstig verstoorde voedingsstoffenbalans hadden, terwijl dat veel minder het geval was bij de jonge naalden. Vooral het gehalte aan kalium in de oude naalden was erg laag. Uit literatuuronderzoek kwam naar voren dat een verstoring van de voedingsstoffenbalans tot een verhoogde gevoeligheid voor stressfactoren, zoals vorst kan leiden. Dit zou kunnen worden veroorzaakt door een verstoring van de eiwitproduktie of een verlaging van de algehele vitaliteit van de plant. Essentiële eiwitten of andere producten die betrokken zijn bij het afhardingsproces zouden daardoor in onvoldoende mate gemaakt kunnen worden, met als gevolg een verhoogde vorstgevoeligheid. Dit mechanisme achter de verhoogde gevoeligheid voor vorst door ammoniak verklaart ook waarom er in de experimenten met jonge planten geen negatief effect van ammoniak werd gevonden. Deze planten hadden geen gebrek aan voedingsstoffen en konden gedurende de relatief korte blootstelling aan ammoniak ook geen ernstige verstoringen van de voedingsstoffenbalans krijgen. Als gevolg hiervan was de vitaliteit waarschijnlijk hoog genoeg om de door ammoniak veroorzaakte veranderingen in fysiologische en stofwisselingsprocessen op te kunnen vangen. Conclusie Samenvattend kan worden gesteld dat ammoniak wel degelijk de vorstgevoeligheid van planten kan vergroten. Dit kan leiden tot een verlies van bladeren of naalden als gevolg van de vorstschade en uiteindelijk tot het sterven van de planten na een strenge winter. Deze negatieve effecten van ammoniak treden al op bij lagere concentraties dan waarbij directe schadelijke symptomen, zoals groeiremming en bladverkleuring, optreden. Bij de regelgeving omtrent de maximaal toelaatbare ammoniak-concentraties in de lucht dient men daarom rekening te houden met deze indirecte negatieve gevolgen voor planten. Bovendien moet men beseffen dat de verhoogde vorstgevoeligheid pas optreedt na langdurige blootstelling aan ammoniak en afhankelijk is van de voedingsstoffenhuishouding en vitaliteit van de planten. In vervolgonderzoek naar de effecten van luchtverontreiniging op planten zal hiermee rekening moeten worden gehouden. 140