Chapter 7 Nederlandse samenvatting

Nederlandse samenvatting Chapter 7 Nederlandse samenvatting 157

Chapter 7 Samenvatting Alhoewel door cytomorfologie-gebaseerde screening voor baarmoederhalskanker de incidentie van baarmoederhalskanker in de westerse wereld heeft verminderd, wordt voorspeld dat in 2030 het aantal sterfgevallen wereldwijd als gevolg van baarmoederhalskanker toe zal nemen tot ongeveer 410.000 1,2,3. De vooruitgang in preventie, vroegtijdige opsporing en behandeling van baarmoederhalskanker wordt belemmerd door het feit dat de meerderheid van de gevallen voorkomen in de derde wereld, waar voor de vroegdetectie en behandeling van baarmoederhalskanker de infrastructuur, het personeel en de medische voorzieningen met voldoende kwaliteitsborging beperkt of zelfs afwezig zijn 4. China, als één van de ontwikkelingslanden, speelt een belangrijke rol in de wereldwijde strijd tegen baarmoederhalskanker. Toch zijn er verschillende uitdagingen die belangrijk zijn in deze strijd, zoals de enorme bevolking en oppervlakte, de snelle, onevenwichtige economische groei en de massale migratie van de laatste jaren. Door zijn lage gevoeligheid en hoge arbeidsintensiteit, is cytomorfologie-gebaseerd onderzoek van uitstrijkjes geen ideale screeningsmethode in China 5. Het testen van HPV is een andere bekende benadering voor de vroege detectie van baarmoederhalskanker. De introductie van de HPV test voor de vroegdetectie van baarmoederhalskanker in China is vanwege de talrijke beschikbare HPV detectie platformen met uiteenlopende specificaties een grote uitdaging. Hiervoor is het noodzakelijk om een optimaal en gevalideerd platform te kiezen voordat de HPV-test wordt ingevoerd als primaire screeningsmethode. Tegelijkertijd, moet een andere belangrijke vraag eerst worden beantwoord, namelijk hoe de HPV-positieve patiënten, met name die in dichtbevolkte, maar minder ontwikkelde regio s leven, te vervolgen. Om de verschillende screeningsmethoden voor de vroegdetectie van baarmoederhalskanker effectief op grote cohorten te onderzoeken, worden in dit proefschrift de nieuwe inzichten in het gebruik van biomarkers specifiek voor de screening voor baarmoederhalskanker, waaronder de HPV-testen en DNAmethylatie markers, onderzocht en bediscussieerd. HPV-DNA-screeningen worden al meer dan 15 jaar uitgevoerd en toont aan dat de prevalentie van HPV-infectie geografisch en per ras varieert 6,7. Hoewel verscheidene 158

Nederlandse samenvatting projecten met betrekking tot de hrhpv-infectie frequentie en baarmoederhalskanker screening al zijn uitgevoerd 8 (Tabel 4 hoofdstuk 1), zijn de beschikbare gegevens in China nog zo variabel dat conclusies om tot een landelijke standaard te komen nog niet gemaakt kunnen worden. Deze informatie is nodig om de juiste referentiewaarden te kunnen bepalen voor een effectieve screening. In hoofdstuk 2 beschrijven we een landelijk cross-sectionele studie naar de HPV-DNA-prevalentie in verschillende regio s binnen China, Tevens werd de verdeling van de verschillende HPV genotypes tussen de verschillende regio's en verschillende leeftijdsgroepen geanalyseerd. Voor deze studie werden uitstrijkjes verkregen via dunne-laag cytologie van 120.772 vrouwen afkomstig uit bevolkingsonderzoek of werknemergebaseerde baarmoederhalskanker screening programma s in 2012 uit 37 Chinese steden en opgestuurd naar het laboratorium van moleculaire infectieziekten van Guangzhou KingMed. In totaal, werden 111.131 uitstrijkjes getest met behulp van de Hybrid Capture 2 (HC2) test en van 9641 monsters werd het HPV-genotype bepaald door middel van de TellgenplexTM HPV-DNA-test. De totale frequentie van hoogrisico HPV (hrhpv) positiviteit was 21,07%, variërend van 31,94% tot 18,42% over de verschillende regio's. Leeftijdsspecifieke prevalentie toonde een "twee pieken" patroon. De jongste leeftijdsgroep (15-19 jaar) had de hoogste hrhpv-infectie frequentie (30,55%) en de tweede piek werd gevonden in de leeftijdsgroep van 50-60 jaar. HPV16 (4.82% van alle monsters) en HPV52 (4,52% van alle monsters) waren de meest voorkomende type hrhpv, gevolgd door HPV58 (2,74% van alle monsters); terwijl HPV6 (4.01% van alle monsters) en HPV11 (2,29% van alle monsters) het meest voorkomend waren in de laag risico HPV (lrhpv) types. HPV16/HPV52 en HPV52/HPV58 dubbelinfecties waren de meest voorkomende co-existentie genotypen in het geval van meerdere infecties. Deze data tonen dat de HPV-infectie frequentie in China is toegenomen naar het niveau van landen met de hoogste HPV infectiegraad. Daarom biedt dit onderzoek een waardevolle referentie voor een effectief landelijk screeningsprogramma voor baarmoederhalskanker. Verder toont de analyse van de genotypische verdeling van hrhpv aan dat HPV52 en HPV58 de twee meest-voorkomende genotypen in China zijn. Dat betekent dat de momenteel beschikbare commerciële vaccins, Cervarix (tegen HPV16/18) en Gardasil (tegen HPV6/11/16/18 ) mogelijk niet volledig effectief zijn binnen de Chinese bevolking. 159

Chapter 7 Voor de keuze van de uitvoering van de screening en vaccinatie-programma s moet in China dus rekening gehouden worden met deze epidemiologische kenmerken. Momenteel worden veel nieuwe screeningstechnologieën (inclusief de HPV-testen) ontwikkeld en op de markt gebracht in China zonder validatie van hun effectiviteit voor het bevolkingsonderzoek 9. Onderzoekers proberen algoritmes te ontwikkelen die in China kunnen worden toegepast voor zowel de hoogste risicogebieden als de stedelijke gebieden. Momenteel zijn er vele commerciële HPV DNA testen beschikbaar, maar slechts enkele testen zijn formeel gevalideerd voor primaire HPV screening voor baarmoederhalskanker zoals de HC2 hrhpv DNA-test, de eerste hrhpv-test goedgekeurd door de FDA in de VS 11. De Cervista HR HPV test (Hologic Inc), de tweede door de FDA-goedgekeurde hrhpv-test, wordt op grote schaal gebruikt in de VS en in sommige Chinese studies. Cervista heeft enkele voordelen ten opzichte van de HC2: Het vereist minder monstervolume, bevat een interne controle en heeft een kortere verwerkingstijd. De Cervista is echter nog niet formeel gevalideerd voor primaire screening voor baarmoederhalskanker volgens de internationale richtlijn. In hoofdstuk 3 hebben we aangetoond dat Cervista voldeed aan de internationale prestatie- en reproduceerbaarheidseisen die worden gesteld aan HPV-testen voor screening voor baarmoederhalskanker. Door middel van noninferioriteitsanalyse volgens de internationale richtlijn, werd de klinische gevoeligheid en specificiteit van de Cervista test vergeleken met die van HC2 voor de detectie van hooggradige cervicale laesies (CIN2 +) in Chinese vrouwen die 30 jaar of ouder waren. De Cervista test had een klinische gevoeligheid voor CIN2+ van 89% (95% CI: 81,7-93,6) en een klinische specificiteit voor CIN2+ van 91% (95% CI: 90,5-91,8). Zowel de relatieve klinische gevoeligheid als de specificiteit waren niet-inferieur aan die van HC2 (non-inferioriteit scoren testen, p=0,043 en p<0,0001, respectievelijk). Daarnaast hebben we ook de intra- en inter-laboratorium reproduceerbaarheid van de Cervista test bepaald in 510 uitstrijkjes, opnieuw volgens de internationale richtlijnen. De intra- en inter-laboratorium overeenkomsten waren 92% (ondergrens 95% CI: 89,7%; kappa = 0,83; p<0,001) en 90,4% (ondergrens 95% CI: 88,4%; kappa = 0,81; p<0,001), respectievelijk. Samenvattend betekent dit dat de Cervista HR-HPV-test voldoet aan de internationale richtlijnen gesteld voor nieuwe HPV- 160

Nederlandse samenvatting testen en kan worden beschouwd als een klinisch gevalideerde test voor primaire screening voor baarmoederhalskanker. Door de screening van uitstrijkjes worden niet alleen vroege stadium carcinomen geïdentificeerd, maar ook de voorstadia die cervicale laesies zoals CIN (cervicale intra-epitheliale neoplasie) worden genoemd, representeren zich. Deze kunnen gemakkelijk verwijderd worden en ontwikkelen niet tot een invasief carcinoom 10. Echter, de relatief lagere specificiteit van hrhpv testen, vooral bij een jonge screeningspopulatie, kan leiden tot onnodige verwijzingen naar de gynaecoloog, onnodige ongerustheid bij vals-positief geteste vrouwen, en hogere kosten voor de gezondheidszorg, en zijn dus belangrijke redenen om de huidige screeningsprogramma s voor de vroegdetectie van baarmoederhalskanker te verbeteren. Daarnaast zal in de nabije toekomst de prevalentie van CIN en baarmoederhalskanker naar alle waarschijnlijkheid afnemen in de landen, die primaire preventie door middel van hrhpv-vaccinatie hebben ingevoerd. Met deze afname in de prevalentie zal de positieve voorspellende waarde van de huidige testen afnemen. Daarom zijn andere objectieve biomarkers nodig met zowel een hoge gevoeligheid als een hoge specificiteit als nieuwe screeningsmethode voor triage test. Differentiële DNA methylatie patronen van geselecteerde genen tussen normaal weefsel uit de baarmoederhals en weefsel van (voorstadia van) baarmoederhalskanker kunnen uitstekend gebruikt worden als diagnostische test op basis van methylatie specifieke PCR (MSP). Eerder onderzoek van onze groep, had al geresulteerd in de identificatie van 4 genen (C13ORF18, JAM3, EPB41L3 en TERT) 11,12,13. De diagnostische prestaties van de DNA-methylatie analyse van deze genen liet gevoeligheden voor het opsporen van CIN2+ in een hrhpv-positieve populatie zien variërend van 43% tot 71% en een specificiteit tussen de 89-100% 11. Onze strategieën voor het ontdekken van nieuwe methylatiemarkers waren dusver gebaseerd op het verschil tussen kanker en normaal weefsel, resulterend in markers met een hele hoge specifiteit en een hoge gevoeligheid voor kanker, maar met een te lage gevoeligheid voor het detecteren van CIN2/3 laesies in uitstrijkjes. Om nieuwe methylatiemarkers specifiek voor CIN2/3 te identificeren hebben we in 161

Chapter 7 hoofdstuk 4 een nieuwe techniek (MethylCap-seq) gebruikt om differentiële methylatie regio's (DMR's) te identificeren. Door DNA van 20 normale weefsels uit de baarmoederhals te vergelijken met DNA van 18 weefsels van CIN2/3 laesies, werden 176 DMR's van 163 genen geïdentificeerd. De top 15 van de meest differentieel gemethyleerde genen werden geselecteerd en gevalideerd middels MSP in twee stappen: Op hetzelfde DNA dat was gebruikt voor MethylCap-seq en op DNA van een onafhankelijke patiënten cohort met (voorstadia van) baarmoederhalskanker. Voor verdere diagnostische evaluatie, werden de best differentiële methylatiemarkers getest met kwantitatieve MSP (QMSP) op baarmoederhalsuitstrijkjes van 2 cohorten: 1) baarmoederhalskanker versus gezonde controles en 2) patiënten verwezen vanuit het bevolkingsonderzoek met een afwijkend uitstrijkje. Na verificatie en validatie van de top 15 genen met MSP, waren 9 genen significant differentieel gemethyleerd in normale baarmoederhalsweefsel versus CIN2/ 3 laesies (p<0,05). Vervolgens waren de methyleringswaardes van 8/9 genen significant hoger in uitstrijkjes van kankerpatiënten in vergelijking met uitstrijkjes van normale vrouwen. Voor alle 8 genen namen de methylatieswaardes toe met de ernst van de onderliggende histologische laesie in uitstrijkjes van patiënten verwezen met een abnormaal uitstrijkje. Naast de 8 nieuwe genen, werd ook de methylering van ons vorige vier-gen panel (C13ORF18, JAM3, EPB41L3 en TERT) geanalyseerd op dezelfde monsters. De combinatie C13ORF18 /JAM3/AL590705.4 liet een vergelijkbare hoge gevoeligheid voor CIN2+ (74-76%) zien als de hrhpv-test (79%), terwijl de specificiteit significant hoger was (71-76%) als de hrhpv-test (42%) (p 0,05). Met deze genoom-brede DNA methylatie analyse werden nieuwe CIN2/3 methylatiemarkers geïdentificeerd. De diagnostische prestaties van ons nieuwe methylatiepanel gaf vergelijkbare gevoeligheid voor de hrhpv-test voor het aantonen van CIN2+, maar met een hogere specificiteit, waardoor mogelijk meer onnodige verwijzingen voor colposcopie kunnen worden voorkomen. De volgende stap voor implementatie in primaire screeningsprogramma s is de validatie van ons nieuwe methylatiepanel in een groot screeningspopulatie. Baarmoederhalskanker omvat verschillende histologische types, waarvan adenocarcinomen (ADC) en plaveiselcelcarcinoma (SCC) de twee belangrijkste 162

Nederlandse samenvatting subtypen zijn, goed voor respectievelijk 10-25% en 75-90% 14,15,16. Momenteel neemt de incidentie van SCC af in de westerse landen, terwijl er een toename in de absolute en relatieve incidentie van ADC is 15,17. Hoewel ADC voornamelijk snel toeneemt in Europa, en relatief langzamer in Azië (2.8-22.6%) 16, kunnen de absolute gevallen met ADC niet worden genegeerd, vanwege zijn grote aantallen. Bovendien, in vergelijking met SCC, wordt ADC hoofdzakelijk gediagnosticeerd in een verder gevorderd stadium 16,17. Screeningsprogramma s zijn effectiever in het detecteren van de voorlopers van SCC dan die van ADC. Belangrijke reden voor de ineffectiviteit van de huidige screeningsmethodologie voor de detectie van ADC is de hoger gelegen locatie in het baarmoederhalskanaal, dat het verkrijgen van de nodige monsters voor cytologie bemoeilijkt, maar ook de directe observatie door colposcopische examinatie 17. Naast de hrhpv testen, zou analyse van DNA methylatiemarkers de detectie van ADC in eerdere fasen kunnen verbeteren. Er zijn echter geen specifieke methylatiemarkers beschreven voor de detectie van ADC of SCC. Het doel van de in hoofdstuk 5 beschreven studie was om nieuwe methylatiemarkers voor baarmoederhalskanker te identificeren voor zowel ADC als SCC. Nieuwe methylatiemarkers werden geïdentificeerd met behulp van MethylCap-seq door DNA van 20 normale weefsels uit de baarmoederhals te vergelijken met DNA uit 12 carcinomen (6 ADC en 6 SCC). De top 15 markers werden geselecteerd voor verificatie middels bisulfiet-pyrosequencing of MSP op hetzelfde DNA als gebruikt voor MethylCap-seq. Vervolgens werden de methylatiemarkers gevalideerd op een reeks DNA monsters geïsoleerd van in paraffine ingebedde monsters van patiënten met normaal weefsel of carcinoom uit de baarmoederhals met behulp van MSP. Tenslotte werd met QMSP op uitstrijkjes van een onafhankelijk cohort van vrouwen met normaal weefsel of carcinoom uit de baarmoederhals. Validatie van de top 15 differentieel gemethyleerde kandidaatgenen resulteerde in 5 markers die een hogere methylatie frequentie hadden in kankerweefsels in vergelijking met normaal weefsel (p<0,05). QMSP op DNA van uitstrijkjes toonde dat de gevoeligheid van deze 5 markers voor de detectie van baarmoederhalskanker varieerde van 80.5% tot 91.9% voor zowel ADC als SCC, terwijl bijna alle normale uitstrijkjes negatief waren(specificiteit: 94% -98,9%). Concluderend, identificeerden we met de 163

Chapter 7 MethylCap-seq analyse 5 nieuwe methylatiemarkers voor de vroegdetectie van ADC en SCC. Verdere validatie in een grote reeks uitstrijkjes afkomstig vanuit het bevolkingsonderzoek is nodig, in het bijzonder in uitstrijkjes van ADC en haar voorstadia, om onze bevindingen te bevestigen. Referenties 1 Kamangar F, Dores GM, Anderson WF. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol 2006; 24: 2137 50. 2 Mathers C, Boerma T MFD. The global burden of disease: 2004 update (Geneva, Switzerland: World Health Organization). http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/gbd_report_2004update_full.pdf. 3 Thomas G. Are we making progress in curing advanced cervical cancer? J Clin Oncol 2011; 29: 1654 6. 4 Nogueira-Rodrigues A, Ferreira CG, Bergmann A, de Aguiar SS, Thuler LCS. Comparison of adenocarcinoma (ACA) and squamous cell carcinoma (SCC) of the uterine cervix in a suboptimally screened cohort: A population-based epidemiologic study of 51,842 women in Brazil. Gynecol Oncol 2014; published online Aug 14. DOI:10.1016/j.ygyno.2014.08.014. 5 Wright TC, Kuhn L. Alternative approaches to cervical cancer screening for developing countries. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2012; 26: 197 208. 6 De Sanjosé S, Diaz M, Castellsagué X, et al. Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology: a meta-analysis. Lancet Infect Dis 2007; 7: 453 9. 7 Bruni L, Diaz M, Castellsagué X, Ferrer E, Bosch FX, de Sanjosé S. Cervical human papillomavirus prevalence in 5 continents: meta-analysis of 1 million women with normal cytological findings. J Infect Dis 2010; 202: 1789 99. 8 Li J, Huang R, Schmidt JE, Qiao YL. Epidemiological Features of Human Papillomavirus (HPV) Infection among Women Living in Mainland China. Asian Pac J Cancer Prev 2013; 14: 4015 23. 9 Castle PE, de Sanjose S, Qiao Y-LL, et al. Introduction of human papillomavirus DNA screening in the world: 15 years of experience. Vaccine 2012; 30 Suppl 5: F117 22. 10 Umar A, Dunn BK, Greenwald P. Future directions in cancer prevention. Nat Rev Cancer 2012; 12: 835 48. 11 Eijsink JJH, Lendvai Á, Deregowski V, et al. A four-gene methylation marker panel as triage test in high- risk human papillomavirus positive patients. Int J cancer 2012; 1869: 1861 9. 12 Yang N, Eijsink JJH, Lendvai A, et al. Methylation markers for CCNA1 and C13ORF18 are strongly associated with high-grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer in cervical scrapings. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009; 18: 3000 7. 164

Nederlandse samenvatting 13 Lendvai Á, Johannes F, Grimm C, et al. Genome-wide methylation profiling identifies hypermethylated biomarkers in high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Epigenetics 2012; 7: 1268 78. 14 Vizcaino AP, Moreno V, Bosch FX, et al. International trends in incidence of cervical cancer: II. Squamous-cell carcinoma. Int J cancer 2000; 86: 429 35. 15 Vizcaino AP, Moreno V, Bosch FX, Muñoz N, Barros-Dios XM, Parkin DM. International trends in the incidence of cervical cancer: I. Adenocarcinoma and adenosquamous cell carcinomas. Int J cancer 1998; 75: 536 45. 16 Seoud M, Tjalma W, Ronsse V. Cervical adenocarcinoma: moving towards better prevention. Vaccine 2011; 29: 9148 58. 17 Gien L, Beauchemin M, Thomas G. Adenocarcinoma: a unique cervical cancer. Gynecol Oncol 2010; 116: 140 6. 165

Chapter 7 166