11:29 Pagina 79 MICROL LABBLAD I N F O R M AT I E B U L L E T I N V A N H E T L A B O R AT O R I U M M I C R O B I O L O G I E T W E N T E A C H T E R H O E K Het zal u ongetwijfeld niet ontgaan zijn dat wij overgegaan zijn of een nieuwe afname- en detectiemethode voor parasieten en wormeieren. De meest wilde namen komt u nu tegen op de uitslagformulieren: Blastocystes homines, Dientameuba fragilis, Endolimax nana. In het december nummer van 2002 heeft Bert Mulder al geschreven over (bijna) niet pathogene darmprotozoa. Nu starten we een reeks artikelen over minder bekende protozoën. De spits wordt afgebeten door Truus Derks, die ons uitleg geeft over Cyclospora cayetanensis. Met dezelfde detectiemethoden als voor de cyclospora kunnen ook schimmels aangekleurd worden. Saskia Kuipers schrijft hierover. In de rij van exoten past ook het verhaal van Bert Mulder over pneumocystis carinii, een micro-organisme dat genetisch meer lijkt op een schimmel dan op een protozoa. 25 september a.s. promoveert Saskia Kuipers. In het volgende MicroLabBlad besteden wij daar uitgebreid aandacht aan. I N H O U D S O P G AV E Reeks: minder bekende darmparasieten Optische witmiddelen, suikers en schimmels PCP Vraag-en-antwoord rubriek 80 82 83 86 COLOFON Micro Lab Blad is een uitgave van: Redactie: S.D. Meijer E. Roelofsen Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek Burgemeester Edo Bergsmalaan 1 7512 AD Enschede Telefoon: (053) 4313263, Telefax: (053) 4341631 E-mail: info@labmicta.nl Openingstijden: ma.t/m vr. 08:00-18:00 uur, za. en zo. 10:00-11:00 uur Derde jaargang Nummer 3 September 2003
11:29 Pagina 80 M I N D E R B E K E N D E D A R M PA R A S I E T E N Cyclospora cayetanensis TRUUS DERKS Na terugkeer uit de (sub-) tropen melden zich regelmatig reizigers met klachten over diarree bij de huisarts. Naast bacteriële verwekkers moet, zeker bij langer aanhoudende diarree, gedacht worden aan parasieten als veroorzakers van de problemen. Aan het rijtje bekende pathogene protozoa, zoals Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Cryptosporidium en de wat minder bekende Isospora belli, kan de laatste jaren een derde tot de groep van de coccidia behorend ééncellige micro-organisme worden toegevoegd: Cyclospora cayetanensis. Casus Op 9 juni meldt zich een 24-jarige vrouw bij haar huisarts met klachten over aanhoudende waterdunne diarree. Van 28 april tot 21 mei maakte zij een rondreis door Guatemala. De klachten ontstonden in de eerste week van mei en ze heeft géén koorts. Er wordt een TFT-set voor parasitologisch onderzoek naar het lab gestuurd. Bij parasitologisch onderzoek worden in alle drie fecesmonsters oöcysten van C. cayetanensis aangetroffen. In het monster van de eerste afnamedag aanzienlijk méér dan in de twee daaropvolgende dagen, wat zou kunnen wijzen op een onregelmatige uitscheiding van deze parasieten in de feces. Er worden géén andere darmparasieten gevonden. De patiënte wordt behandeld met co-trimoxazol 2dd 960mg gedurende 7 dagen. Enkele dagen na aanvang van de kuur zijn de diarreeklachten verdwenen. Cyclospora cayetanensis is een ééncellige parasiet en behoort, evenals Cryptosporidium en Isospora belli tot de Coccidiae. Rijpe gesporuleerde oöcysten bevatten 2 sporocysten met elk 2 sporozoieten. Cyclosporidiasis wordt sinds het midden van de jaren 80 gemeld uit de gehele wereld maar blijkt aanzienlijk meer voor te komen in tropische en subtropische gebieden. Hoewel feco-orale transmissie het meest waarschijnlijk is, is in tegenstelling tot bij Cryptosporidium de directe overdracht van persoon naar persoon niet voor de hand liggend. De in de feces uitgescheiden onrijpe oöcysten van Cyclospora hebben namelijk dagen tot weken buiten de gastheer nodig om infectieus te worden. Als bron van infectie wordt vooral besmet drinkwater genoemd, maar ook groente, fruit en kruiden zijn mogelijke besmettingsbronnen. Tot nu toe zijn geen besmettingen bij wilde of huisdieren gevonden. De incubatieperiode varieert van 1 tot 10-12 dagen. De besmetting kan zowel symptomatisch als asymptomatisch verlopen. Cyclospora cayetanensis infecteert de dunne darm en kan waterige diarree (zonder bloed- of slijmbijmenging), bovenbuikklachten, anorexie met gewichtsverlies en extreme vermoeidheid veroorzaken. Soms ook misselijkheid en braken. De diarree ontstaat acuut en kan lang aanhouden (> 2 weken); soms wisselen perioden met waterige diarree zich af met constipatie. De ziekte is op den duur self-limiting. 80
11:29 Pagina 81 Laboratoriumdiagnostiek Cyclospora cayetanensis kan gemakkelijk gemist worden: de oöcysten worden vaak in kleine hoeveelheden uitgescheiden en zijn soms moeilijk te concentreren. De in de feces uitgescheiden oöcysten zijn bolvormig; 8 10 µm in doorsnede en hebben een duidelijke wand. In het directe ongekleurde preparaat zijn binnen de oöcyste kleine ongekleurde bolafbeelding 1: Onrijpe oöcyste van Cyclospora cayetanensis in direct preparaat vormige structuren te zien (afbeelding 1). Waarschijnlijk is de verbeterde diagnostiek voor Cryptosporidium - de invoering van de gemodificeerde Ziehl-Neelsen- en de invoering van de ijzerhaematoxyline-kinyounkleuring debet aan het frequenter melden van Cyclospora cayetanensis door parasitologische laboratoria (afbeelding 2). De sensitiviteit van deze zuurvaste kleuringen ligt in onze ervaring rond de 80% ten opzichte van de autofluorescentie (zie onder). Dit is te wijten aan het feit dat veel oöcysten de kleurstof slecht vasthouden. De ongekleurde parasieten blijven daardoor onopgemerkt. De bij de detectie van Cryptosporidium gebruikte Auraminekleuring is ongeschikt voor het opsporen van oöcysten van Cyclospora. De beste resultaten worden gezien bij het gebruik van autofluorescentie: een direct of geconcentreerd nat preparaat wordt onder de fluorescentiemicroscoop gescreend. Deze microscoop is daartoe uitgerust met een 330 380 nm filter. De oöcysten van Cyclospora cayetanensis lichten neon-blauw op tegen een donkere achtergrond (afbeelding 3). Ook infecties met weinig oöcysten kunnen hierdoor gemakkelijk worden opgespoord. Sinds enkele maanden beschikt het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek over een met dit filter uitgeruste fluorescentiemicroscoop. Afbeelding 2: Oöcyste van Cyclospora cayetanensis in ZN-preparaat Afbeelding 3: Autofluorescentie van Cyclospora cayetanensis MICROL LABBLAD 81
11:29 Pagina 82 OPTISCHE WITMIDDELEN, SUIKERS EN SCHIMMELS SASKIA KUIPERS Schimmels kweken is een tijdrovend werkje. Het duurt dagen tot weken voor een schimmel groeit. De sensitiviteit van kweken is daarbij slechts 70 tot 80 procent. Snellere detectiemethoden zijn dus welkom. Bijvoorbeeld in de vorm van fluorescerende kleurmethoden. Bepaalde fluorescerende kleurstoffen worden als optische witmakers gebruikt in de wasmiddelenindustrie en bij de fabricage van wit papier. Doordat deze witmakers een hoge affiniteit hebben voor specifieke suikers bijvoorbeeld glucaan en chitine zijn ze ook zeer geschikt om schimmels mee aan te kleuren. Er zijn verschillende witmiddelen in de handel, maar voor de detectie van schimmels in vers materiaal is Blankophor-P (Bayer, Leverkusen, Duitsland) de beste. Het Laboratorium Microbiologie verricht met dit middel de directe kleuring voor gisten en schimmels. Met behulp van de fluorescentiemicroscoop wordt de gebonden kleurstof in de preparaten zichtbaar gemaakt, waardoor morfologische herkenning van gisten en schimmeldraden mogelijk wordt. Schimmels in verse materialen hebben weinig tijd nodig om Blankophor te binden, maar om het middel in stukjes kalknagel te laten doordringen is meer tijd nodig, tot 24 uur. Candidiasis Foto: Jrn of Clin Microbiol, aug 1999, vol. 37, no. 8, p. 2694. Zygomycosis Foto: Jrn of Clin Microbiol, aug 1999, vol. 37, no. 8, p. 2694. Positieve Blankophor preparaten worden niet altijd gevolgd door een positieve kweek. Dit is wel vaker bij nagels het geval. Een van de redenen kan zijn dat het stuk nagel dat toegestuurd is voor schimmelonderzoek ook een gezond stukje nagel kan zijn; een andere reden is dat dermatofyten niet altijd even makkelijk in kweek kunnen worden gebracht. 82
PNEUMOCYSTIS CARINII B ERT M ULDER Pneumocystis carinii kwam in de vorige eeuw aanvankelijk epidemisch voor als verwekker van een interstitiële longontsteking bij ondervoede kinderen in weeshuizen. P. carinii wordt nu wereldwijd gezien als verwekker van pneumonie bij een gestoorde afweer. Onduidelijk is of deze opportunistische infectie optreedt door reactivering van de latente infectie of doordat frequente blootstelling plaatsvindt. De gestoorde cellulaire afweer die predisponeert voor een P. carinii pneumonie (PCP) wordt met name gezien bij AIDS-patiënten met een CD4 getal lager dan 200/mm3 en patiënten onder immunosuppressieve en radiologische therapie tijdens de behandeling van tumoren of na orgaantransplantatie. De meest beschreven immunosuppressieve middelen zijn corticosteroïden in hoge dosering, maar ook tijdens chemotherapie zonder corticosteroïden kan de infectie voorkomen. De taxonomische plaats van P. carinii is controversieel, nadat uit moleculair genetische analyse bleek dat het organisme meer verwantschap vertoont met schimmels dan met protozoa. Klinische verschijnselen De belangrijkste klinische verschijnselen van PCP zijn kortademigheid, koorts en niet-productieve hoest als regel sinds 1 à 2 weken bestaand, bij HIV-patiënten vaak langer. Bij lichamelijk onderzoek staan tachypnoe en tachycardie en evt. cyanose op de voorgrond. Het klassieke beeld op de thoraxfoto is een diffuus bilateraal infiltraat. Het laboratoriumonderzoek (po2, pco2) toont de verslechterde oxygenatie. Diagnose Aan PCP dient bij immuun gecompromitteerde patiënten met respiratoire klachten, koorts en afwijkingen op de thoraxfoto te worden gedacht. Omdat in deze groep dit klinisch beeld een lange differentiaal diagnose heeft, van zowel infectieuze (bacteriën, tuberculose, schimmels, viraal, nocardia, toxoplasma, strongyloides), als niet-infectieuze aard, berust de diagnose PCP op het aantonen van P. carinii door middel van laboratorium diagnostiek. Immuunfluorescentie voor het aantonen van P. carinii blijkt gevoeliger dan histologische kleuringen. Preparaten zijn na voorbewerking door middel van een cytospincentrifugatie beter te beoordelen omdat te dikke preparaten niet betrouwbaar te beoordelen zijn (zie figuur 1). De ontwikkeling van een PCR heeft de sensitiviteit nog verder doen toenemen. Van groot belang voor de diagnose is het verkrijgen van representatief longmateriaal. In het algemeen neemt de diagnostische opbrengst toe met een meer invasieve procedure. P. carinii wordt slechts zelden aangetoond in sputum, tenzij dit sputum is geïnduceerd met zoutnevel inhalatie. De diagnostische opbrengst van geïnduceerd sputum ligt tussen 50 en 90%. Bij een broncho-alveolaire lavage (BAL) ligt deze opbrengst hoger, zeker als meerdere longkwabben worden gespoeld, met name de meest aangedane gedeelten. Cytomegalovirus wordt nogal eens als co-infectie aangetroffen maar dit beïnvloedt de prognose niet. Diagnostische dillema s Hoewel verbeterde diagnostiek (en behandeling) hebben geleid tot een reductie in mortaliteit, blijkt MICROLABBLAD 83
11:30 Pagina 84 het moeilijk de diagnostische kennis van Pneumocystis carinii op peil te houden. Dit wordt mede veroorzaakt door de dalende incidentie van PCP diagnoses gedurende het laatste decennium door de toepassing van zowel PCP profylaxe als HAART bij AIDS-patiënten. Daarnaast is de toepassing van immuunfluorescentie voor de detectie van P. carinii een gespecialiseerde technische vaardigheid, die in de praktijk alleen met een beperkt aantal analisten in stand te houden is. Derhalve is binnen het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek gekozen voor het middels continue scholing in stand houden van de vaardigheid met een beperkte analistengroep. Dit betekent dat de bepaling elke werkdag nog dezelfde dag (cito) kan worden uitgevoerd indien het klinisch (BAL-)materiaal voor 15:00 uur op het laboratorium aanwezig is. Uiteraard wordt dit beleid met de longartsen overlegd. Voor de toekomst wordt aan de ontwikkeling van PCP diagnostiek door toepassing van real-time PCR techniek gewerkt. De eerste ervaringen met deze techniek zien er hoopgevend uit (zie figuur 2) met een goede specificiteit en hogere sensitiviteit dan conventionele diagnostische methoden. Figuur 1a: Immunofluorescentie opname (Pneumo-cel) van P. carinii (foto: UMC St Radboud Nijmegen) Figuur 1b: Immunofluorescentie opname (Pneumo-cel) van P. carinii bij een te dik preparaat (foto: UMC St Radboud Nijmegen) 84
thoraxfoto bij patiënt met pneumocystis carinii FIGURE 260 1. Proposed Pneumocystis carinii life cycle involving asexual and sexual stages. The photographs show living trophic and cyst forms of the organism by Nomarski interference microscopy. (From Cushion M. Pneumocystis carinii. In: Collier L, Balows A, Sussman M, eds. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, v. 4. New York: Oxford University Press; 1998:645 683.) FIGURE 260 2. A, Cluster of Pneumocystis carinii trophozoites and cysts (Diff-Quik,?2500). B, Cluster of P. carinii cysts (methenamine silver stain,?1250). FIGURE 260 3. Pneumocystis carinii pneumonia illustrating frothy honeycombed material filling the alveolar space (H&E,?165). FIGURE 260 4. Chest radiograph showing bilateral infiltrates of Pneumocystis carinii pneumonia. MICROLABBLAD 85
DE VRAAG-EN-ANTWOORD RUBRIEK De laatste maanden wordt de arts-microbioloog vaker geconsulteerd over gevallen van (bulleus) impetigo. Uit heel Nederland wordt een toename van impetigo gemeld, vooral in de categorie van kinderen onder de 12 jaar. Voor ons was dit aanleiding om een aantal vragen hier te beantwoorden. Hoe ontstaan de blaren bij bulleus impetigo? De verwekker van impetigo met blaarvorming is de Staphylococcus aureus. Bepaalde toxinen exfoliatieve toxinen A en B zijn in staat om een belangrijk structureel eiwit van de menselijke huid, het zogeheten desmogleïne, af te breken. Hierdoor ontstaan blaren onder de stratum corneum van de huid. Welke antibiotica zijn geschikt om bulleus impetigo mee te behandelen? Uit Nederlands onderzoek blijkt dat het overgrote deel van de S. aureus stammen die impetigo veroorzaken gevoelig zijn voor fucidinezuur en mupirocine. Echter lokale behandeling met deze middelen is bij bulleus impetigo minder effectief dan systemische behandeling. Omdat de meeste stafylokokken stammen ongevoelig zijn voor penicilline en amoxicilline, zijn ook deze middelen minder geschikt. Flucloxacilline (50 mg/kg verdeeld over 3-4 doses) gedurende 7 dagen is de beste therapie. Van flucloxacilline is echter geen suspensie in de handel, alhoewel via de kinderarts op recept in bepaalde gevallen wel suspensie te verkrijgen is. Het enige alternatief blijft dan amoxicilline/clavulaanzuur (50/12.5 mg/kg te verdelen over 4 doses) of clindamycine (25 mg/kg verdeeld over 4 doses). De in Twente circulerende, impetigoveroorzakende S. aureus stam is ongevoelig voor erthromycine, azithromycine en clarithromycine, wat deze middelen onbruikbaar maakt als therapeuticum. Collega Bos konden wij onlangs verblijden met een positieve uitslag (>10 E/ml) voor kinkhoest serologie bij een man van middelbare leeftijd die gedurende langere tijd hoestbuien had. Waarop natuurlijk onmiddellijk de vraag rees hoe lang blijft zo'n titer aanwezig en hoe hoog is die dan. Een artikel van H.E. de Melker et al. in the Journal of Clinical Microbiology van februari 2000 leert ons dat de hoogte van de antistoftiter in 1 jaar afneemt tot onder de grens waarboven de uitslag positief wordt genoemd. Negatieve sera bij zowel kinderen als volwassenen komen zelden boven de 10 VE/ml. Een hoge titer (volwassenen > 18) in combinatie met klachten die verdacht zijn voor kinkhoest zijn dus een sterke aanwijzing voor een (recent doorgemaakte) infectie.