A Evaluatie van de Cellavision DM96: geautomatiseerde digitale WBC differentiatie Woord vooraf Graag zou ik, na afloop van de stageperiode, iedereen willen bedanken die mij op welke manier dan ook hielp bij het volbrengen van mijn stage en eindwerk. Eerst en vooral dank ik mijn ouders, om mij de kans te geven de studies van Biomedische laboratoriumtechnologie aan te vatten en om mij steeds te motiveren het beste van mezelf te geven. Ook mijn vriend hielp mij door alle moeilijke momenten heen. Verder bedank ik hartelijk de biologen van het klinisch labo in het Jan Yperman ziekenhuis. Dankzij hen was deze stage mogelijk. Ze stonden steeds klaar om mij te helpen en gaven me bruikbare tips. In het bijzonder dank ik hierbij mijn stagementor Apr. Biol. De Keersmaecker om mij te begeleiden met mijn eindwerk en om mijn kennis over bloedcellen uit te breiden. Ik wil hierbij ook alle laboranten van het Jan Yperman ziekenhuis bedanken voor hun vele inspanningen om mij alle afdelingen van het labo te leren kennen. Ik voelde mij een collega in de groep, steeds gesteund en bijgestaan. Ik vergeet zeker mijn stagebegeleider Dhr. Bart Quartier niet, die voor mijn eindwerk en stage steeds bereid was te helpen, en die mij in eerste plaats ook overtuigde voor deze studiekeuze. Ik bedank ook hierbij Dhr. Piet Dedeckere voor de hulp bij de statistische verwerking. Alle leerkrachten van Howest departement Simon Stevin opleiding Biomedische Laboratoriumtechnologie hou ik in gedachten, voor de kennis die ze me gedurende drie jaar bijbrachten en de steun die ze betekend hebben. In het bijzonder zeg ik dank u papa, omdat ik weet dat hij mij nog steeds bijstaat in alles wat ik doe. 1 Annelies Decq
A Evaluatie van de Cellavision DM96: geautomatiseerde digitale WBC differentiatie Samenvatting In dit eindwerk wordt de Cellavision DM96 geëvalueerd. Het is een toestel dat geautomatiseerd bloeduitstrijkjes analyseert en er een digitale witte bloedcel differentiatie van maakt. Ook het rode bloedbeeld wordt gekarakteriseerd op een monolayer dat de Cellavision zelf opspoort. Daarenboven kan het een schatting maken van het aantal bloedplaatjes. De Cellavision DM96 is gedurende een proefperiode van een aantal weken getest geweest in het labo van het Jan Yperman ziekenhuis. Hierbij wordt deze nieuwe methode vergeleken met de huidige microscopische methode die het labo momenteel hanteert. Ten eerste wordt bepaald dat een manueel uitstrijkje, met in de kleuring een buffer van de firma, het meest ideaal is om de neerslag van kleurstofkorrels zoveel mogelijk te beperken. Bij de bepaling van de accuraatheid van de WBC tonen de regressielijnen aan dat die behoorlijk is. De karakterisatie van de RBC is minder goed, aangezien veel voorstellen van de Cellavision aangepast moeten worden. De schatting van het aantal trombocyten ligt telkens dicht bij het aantal geteld door de Sysmex, maar houdt wel een groot telwerk in. De statistische verwerking dat er een significant verschil is tussen de huidige methode en de meetmethode met de Cellavision. Deze verschillen hebben echter geen klinisch belang. De reproduceerbaarheid van het toestel wordt bepaald, zowel door het herhaaldelijk meten van eenzelfde uitstrijkje als door het meermaals uitstrijken van eenzelfde staal. De berekende variatiecoëfficiënten blijken beter dan die van de microscopie. De analyse met de Cellavision neemt wel meer tijd in beslag, dan de huidige methode. Het toestel is ook een dure aankoop. Alle besluiten leiden tot de conclusie dat het interessant kan zijn voor het labo om dit toestel aan te kopen in de toekomst, maar dan in combinatie met een nieuwe hematologielijn om de problemen met kleurstofneerslag te vermijden. 2 Annelies Decq
A Evaluatie van de Cellavision DM96: geautomatiseerde digitale WBC differentiatie Lijst met afkortingen en symbolen - CLL: chronisch lymfoïde leukemie; - CO 2 : koolstofdioxide; - CRP: C-reactieve protëine; - DNA: desoxyribonucleotidenzuur; - fl: femtoliter; - HUS: Hemolytisch Uremisch Syndroom; - Kdn: kinderen; - LIS: Laboratorium Informatie Systeem; - MAHA: microangiopatische hemolytische anemie; - MCH: Mean Cell Haemoglobin; - MCHC: Mean Cell Haemoglobin Concentration; - MCV: Mean Cell Volume; - µm: micrometer; - NK-cellen: Natural Killer cellen; - NRBC: nucleated red blood cells; - O 2 : zuurstof; - RBC: rode bloedcellen; - RDW-CV: Red blood cell Distribution Width Coëfficient of Variation; - RDW-SD: Red blood cell Distribution Width Standard Deviation; - RNA: ribonucleotidenzuur; - SIS: Sysmex Information System; - SN: Serial Number; - TTP: Trombotische Trombocytopenische Purpura; - WBC: witte bloedcellen; 3 Annelies Decq
A Evaluatie van de Cellavision DM96: geautomatiseerde digitale WBC differentiatie Verklarende woordenlijst Alle woorden die cursief staan in de tekst, worden hier uitgelegd: - anemie: een tekort aan hemoglobine, vaak door tekort aan rode bloedcellen; - biconcaaf: aan beide zijden hol; - chromatine: DNA-kluwen in de celkern die het erfelijke materiaal bevat; - cirrose: verschrompeling, degeneratie van de normale levercellen; - cytostatica: chemische geneesmiddelen die de celdeling remmen en gebruikt worden bij kankertherapie; - erytropoëse: aanmaak van rode bloedcellen; - excentrisch: niet in het middelpunt gelegen; - extra-medullair: buiten het beenmerg; - fagocytose: een proces waarbij vreemde cellen worden omsloten door uitstulpingen van het celmembraan, opgenomen en gedood; - foliumzuurdeficiëntie: een tekort aan foliumzuur; - hairy cell leukemie: een chronische leukemie waarbij de B-lymfocyten een eigenaardige morfologie hebben; - hematopoëse: aanmaak van bloedcellen; - hemolyse: afbraak van rode bloedcellen; - hemolytisch uremisch syndroom: een ernstige aandoening gekenmerkt door acute nierinsufficiëntie, hemolytische anemie en trombopenie; - hemosiderose: teveel ijzer aanwezig in het bloed; - Hodgkin lymfoom: een aandoening met de aanwezigheid van Reed-Sternbergcellen en mononucleaire Hodgkin cellen, met een achtergrond van lymfocyten, monocyten en eosinofielen. De abnormale celgroei veroorzaakt vergrote lymfeklieren, waardoor de lymfocyten hun werking verliezen en het immuunsysteem verzwakt; - left shift: een toename van minder mature neutrofielen zoals bandneutrofielen in het perifere bloed of het beenmerg; - leukopenie: een tekort aan witte bloedcellen (minder dan 3,0.10 3 WBC/L); - lysosomen: primaire granules van de neutrofiel die bacteriedodende enzymen bevatten; 4 Annelies Decq
A Evaluatie van de Cellavision DM96: geautomatiseerde digitale WBC differentiatie - Mononucleosis infectiosa: klierkoorts, acute infectieziekte die veroorzaakt wordt door het Epstein-Barr-virus; - myelodysplastisch syndroom: afwijking in de pluripotente stamcel, vaak bij oudere mensen. Kan ontaarden in leukemie; - myelofibrose: zeldzame bloedziekte waarbij door woekering van bindweefsel in het beenmerg steeds minder bloedcellen worden aangemaakt; - nucleoli: kernlichaampjes binnen in de celkern die RNA bevatten; - scattering: lichtverstrooiing; - splenectomie: operatief verwijderen van de milt; - splenomegalie: vergrote milt; - thalassemie: erfelijke aandoening in de aanmaak van hemoglobine; - trombotische trombocytopenische purpura: een bloedaandoening waarbij een bepaald eiwit niet aangemaakt wordt, dat de trombocyten doet klonteren, waardoor een trombopenie ontstaat; 5 Annelies Decq
A Evaluatie van de Cellavision DM96: geautomatiseerde digitale WBC differentiatie Lijst van figuren en tabellen Fig. 2-1: links: bandneutrofiel [4] en rechts gesegmenteerde neutrofiel [5]... 14 Fig. 2-2: links: hypersegmentatie en rechts: Pelger Huët neutrofiel[4]... 15 Fig. 2-3: links: Toxische korreling in een neutrofiel [4] en rechts: Döhle lichaampje in neutrofiel [5]... 15 Fig. 2-4: links: eosinofiel en rechts: basofiel [5]... 16 Fig. 2-5: links: rustende lymfocyt en rechts: geactiveerde lymfocyt[4]... 17 Fig. 2-6: plasmacel [4]... 18 Fig. 2-7: monocyt [5]... 19 Fig. 2-8: uitrijping van pluripotente stamcel tot iedere bloedceltype [3]... 20 Fig. 2-9: uitrijping van precursor tot neutrofiel [5]... 20 Fig. 2-10: links: myeloblast en rechts: promyelocyt [4]... 21 Fig. 2-11: links: myelocyt en rechts: metamyelocyt [4]... 22 Fig. 2-12: links: rode bloedcellen [4] en rechts: biconcave rode bloedcel (elektronenmicroscoop) [5]... 22 Fig. 2-13: links: reuzentrombocyt en rechts: trombocytenaggregatie [4]... 26 Fig. 2-14: megakaryocyt [5]... 26 Fig. 2-15: links: schema scattergram en rechts: voorbeeld van scattergram met zijdelingse fluorescentie [10]... 27 Fig. 2-16: Cellavision DM96 [8]... 28 Fig. 3-1: Hemaprep: uitstrijktoestel... 35 Fig. 3-2: Test voor ideale hoeveelheid bloed op Hemaprep: 3 tot 8 µl... 35 Fig. 3-3: Cassette met draagglaasje voor Cellavision [10]... 36 Fig. 3-4: System Control scherm: analyse van uitstrijkje [4]... 37 Fig. 3-5: Verification scherm: alle celklassen [4]... 38 Fig. 3-6: Verification scherm: RBC-karakterisatie [4]... 38 Fig. 3-7: Verification scherm: bloedplaatjes analyse [4]... 39 Fig. 4-1: Scherm Cellavision: artefacten tussen cellen [4]... 40 Fig. 4-2: links slechte uitstrijkjes: te kort, te dik uitgestreken, te donker gekleurd en rechts goede uitstrijkjes: lang genoeg, dun uitgestreken, licht gekleurd... 41 Fig. 4-3: Resultaten beenmergstaal voor herclassificeren, na herclassificeren en door microscoop per celklasse... 43 6 Annelies Decq
A Evaluatie van de Cellavision DM96: geautomatiseerde digitale WBC differentiatie Fig. 4-4: Regressierechte gesegmenteerde neutrofielen in routine op 40 stalen na herclassificatie... 48 Fig. 4-5: Regressierechte lymfocyten in routine op 40 stalen na herclassificatie... 51 Fig. 4-6: Regressierechte monocyten in routine op 40 stalen na herclassificatie... 52 Fig. 4-7: Regressierechte gesegmenteerde neutrofielen gouden standaard 120 cellen geteld op 20 stalen na herclassificatie... 55 Fig. 4-8: Regressierechte lymfocyten gouden standaard 120 cellen geteld op 20 stalen na herclassificatie... 57 Fig. 4-9: Regressierechte monocyten gouden standaard 120 cellen geteld op 20 stalen na herclassificatie... 58 Fig. 4-10: Regressierechte gesegmenteerde neutrofielen gouden standaard 240 cellen geteld op 20 stalen na herclassificatie... 60 Fig. 4-11: Regressierechte lymfocyten gouden standaard 240 cellen geteld op 20 stalen na herclassificatie... 62 Fig. 4-12: Regressierechte monocyten gouden standaard 240 cellen geteld op 20 stalen na herclassificatie... 63 Fig. 4-13: Slechte monolayer om RBC-karakterisatie op uit te voeren [4]... 67 Fig. 4-14: Reproduceerbaarheid 10x zelfde plaatje onder microscoop... 69 Fig. 4-15: Reproduceerbaarheid 10x zelfde plaatje onder Cellavision na herclassificeren70 Fig. 4-16: Reproduceerbaarheid 10x zelfde staal uitgestreken onder microscoop... 72 Fig. 4-17: Reproduceerbaarheid 10x zelfde staal uitgestreken onder Cellavision na herclassificeren... 73 7 Annelies Decq
A Evaluatie van de Cellavision DM96: geautomatiseerde digitale WBC differentiatie Tabel 2-1: Variaties in vorm van rode bloedcellen... 24 Tabel 2-2: Insluitsels in rode bloedcellen... 25 Tabel 3-1: Run 4 van Mirastainer [11]... 32 Tabel 4-1: Vergelijking aantal smudge cellen en artefacten bij manueel uitstrijkje en uitstrijktoestel op 5 stalen... 41 Tabel 4-2: Vergelijking aantal smudge cellen en artefacten bij oude en nieuwe buffer op 10 stalen... 42 Tabel 4-3: Per flagging aantal gevonden, in mindere mate gevonden en verworpen op 19 stalen... 45 Tabel 4-4: Berekeningen per celklasse over aantal verkeerd geplaatste cellen en meest voorkomende verschuivingen op 40 stalen van routine (voorbeeld segmentneutrofiel)... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd. Tabel 4-5: Berekeningen per celklasse over aantal verkeerd geplaatste cellen en meest voorkomende verschuivingen op 20 stalen van gouden standaard 120 cellen geteld (voorbeeld gesegmenteerde neutrofielen)... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd. Tabel 4-6: Berekeningen per celklasse over aantal verkeerd geplaatste cellen en meest voorkomende verschuivingen op 20 stalen van gouden standaard 240 cellen geteld (voorbeeld gesegmenteerde neutrofielen)... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd. Tabel 4-7: Regressielijnen en R 2 routine, gouden standaard 120 en gouden standaard 240... 64 Tabel 4-8: Klinisch belangrijke verschillen tussen microscoop en Cellavision per celklasse... 65 Tabel 4-9: Gemiddelde, standaard deviatie en variatiecoëfficiënt 10x zelfde plaatje door microscoop... 69 Tabel 4-10: Vergelijking verschillende variatiecoëfficiënten 10x zelfde plaatje... 71 Tabel 4-11: Vergelijking verschillende variatiecoëfficiënten 10x zelfde staal uitgestreken 73 8 Annelies Decq
A Evaluatie van de Cellavision DM96: geautomatiseerde digitale WBC differentiatie Inhoudsopgave Woord vooraf... 1 Samenvatting... 2 Lijst met afkortingen en symbolen... 3 Verklarende woordenlijst... 4 Lijst van figuren en tabellen... 6 Inhoudsopgave... 9 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling... 11 1.1 Inleiding... 11 1.2 Situatieschets... 11 1.3 Probleemstelling... 12 2 Literatuurstudie... 13 2.1 Hematologie... 13 2.2 Classificatie in de witte bloedcellen... 13 2.2.1 De granulocyten... 14 2.2.2 De agranulocyten... 17 2.3 Classificatie in de voorlopers... 19 2.3.1 De pluripotente stamcel... 19 2.3.2 Uitrijping van de myeloïde reeks... 20 2.4 Morfologie en insluitsels in de rode bloedcellen... 22 2.4.1 Variaties in morfologie... 23 2.4.2 Insluitsels in rode bloedcellen... 25 2.5 Bloedplaatjes... 25 2.6 WBC differentiatie in labo... 26 2.6.1 Huidige methode... 26 2.6.2 Digitale methode... 28 3 Materiaal en methode... 30 3.1 Huidige methode... 30 3.1.1 Materiaal... 30 9 Annelies Decq
A Evaluatie van de Cellavision DM96: geautomatiseerde digitale WBC differentiatie 3.1.2 Methode... 31 3.2 Cellavision DM96... 33 3.2.1 Materiaal... 33 3.2.2 Methode... 35 4 Resultaten en discussie... 40 4.1 Testen... 40 4.1.1 Manier van uitstrijken... 40 4.1.2 Manueel uitstrijkje versus uitstrijktoestel... 41 4.1.3 Standen op uitstrijktoestel... 42 4.1.4 Verschil in buffer... 42 4.1.5 Kinderen jonger dan twee jaar... 43 4.1.6 Beenmerg... 43 4.1.7 Normale stalen... 44 4.1.8 Stalen met WBC-flaggings van Sysmex... 44 4.2 Accuraatheid van de witte bloedcellen... 45 4.2.1 Routine... 45 4.2.2 Gouden standaard geteld op 120 cellen... 53 4.2.3 Gouden standaard geteld op 240 cellen... 59 4.2.4 Samenvatting accuraatheid WBC... 64 4.3 Accuraatheid rode bloedcellen... 67 4.4 Accuraatheid trombocyten... 68 4.5 Reproduceerbaarheid... 69 4.5.1 Tien keer zelfde uitstrijkje... 69 4.5.2 Tien uitstrijkjes van zelfde staal... 71 4.6 Tijdsgebruik... 74 4.7 Kostenberekening... 74 5 Conclusie... 75 Literatuurlijst... 77 Bijlagen... 78 Voor akkoord verklaring... 99 10 Annelies Decq
Theorie en literatuurstudie 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling 1.1 Inleiding Mijn stage en het uitwerken van mijn eindwerk verliepen in het Jan Yperman ziekenhuis in St.Jan Ieper. Het Jan Yperman ziekenhuis is ontstaan uit Het Onze Lieve Vrouw ziekenhuis van St. Jan, de Kliniek van de Zwarte Zusters van Ieper centrum en het Mariaziekenhuis van Poperinge, na een fusie in 1998. Tot oktober 2007 was er een centraal labo in St. Jan en een urgentielabo in Poperinge. Nu is er één groot labo in de nieuwbouw voor de verschillende campussen van zowel Ieper als Poperinge. Het labo is opgedeeld in hematologie, klinische chemie, immunologie en bacteriologie. Vooraan is ook een apart bloedafnamelokaal. Het labo is verbonden met een buizenpostsysteem zodat stalen van over het hele ziekenhuis op een vlotte manier toekomen in het labo. Er staan vier klinisch biologen aan het hoofd aan het labo, waarvan Apr. Biol. De Keersmaecker mij begeleidde met mijn eindwerk. [1] 1.2 Situatieschets Het differentiëren van witte bloedcellen gebeurt in het ziekenhuis door de Sysmex XT2000i en op aangeven van het toestel worden van bepaalde stalen uitstrijkjes gemaakt. Dit gebeurt bijvoorbeeld bij vermoeden van immature witte bloedcellen. Na het kleuren van de uitstrijkjes in een geautomatiseerd kleurbad, worden ze bekeken door een van de biologen onder de microscoop. Ze behandelen ongeveer vierentwintig uitstrijkjes per uur en hebben er rond de twintig tot veertig per dag. Vaak wordt opgemerkt dat een microscopische telling eigenlijk niet nodig was. Er is gedacht aan de aankoop van de Cellavision DM96 om het bekijken van bloeduitstrijkjes te vergemakkelijken en tijd te winnen. Het toestel kwam voor een aantal weken op proef in het ziekenhuis. Het toestel differentieert automatisch bloeduitstrijkjes aan de hand van digitale foto s die genomen worden. Het onderscheidt de verschillende celklassen van witte bloedcellen, het maakt een karakterisatie van de rode bloedcellen en het schat het aantal bloedplaatjes. Eerst is een demo gegeven door de firma, daarna zijn we zelf aan de slag gegaan. Er zijn verschillende testen bedacht en uitgevoerd, zodat het toestel op verschillende criteria beoordeeld is. 11 Annelies Decq
Theorie en literatuurstudie 1.3 Probleemstelling De vragen die gesteld worden bij het overwegen om over te gaan tot aankoop van de Cellavision DM96 zijn: - Heeft de Cellavision een goede accuraatheid voor witte bloedcellen, rode bloedcellen en bloedplaatjes? - Heeft het toestel een betrouwbare reproduceerbaarheid? - Kan het toestel voor een tijdswinst zorgen? - Wat is de aankoopprijs? - Heeft het toestel alles in rekening houdend een meerwaarde voor het labo? 12 Annelies Decq
Materiaal en methode 2 Literatuurstudie 2.1 Hematologie De term hematologie komt uit het Grieks: haimatos betekent bloed en logos is leer. Hematologie is dus de leer van de bloedcellen en van het weefsel waar bloedcellen aangemaakt worden. Bloed heeft een vloeibare en een vaste fractie. Het vloeibare gedeelte is het plasma en beslaat 55 procent. Het plasma is niet meer dan water met opgeloste bestanddelen. Tot de opgeloste bestanddelen behoren proteïnen, suikers, lipiden, zouten, vitaminen en hormonen. De bloedproteïnen zijn globulines (antilichamen), albumine en stollingseiwitten. De vaste fractie is goed voor 45 procent en zijn de bloedcellen. De bloedcellen worden in drie grote klassen onderverdeeld: de rode bloedcellen (of erytrocyten), de witte bloedcellen (of leukocyten) en de bloedplaatjes (of trombocyten). Aanmaak van bloedcellen gebeurt voornamelijk in het beenmerg, er is dus een medullaire hematopoëse. Er is ook extra-medullaire hematopoëse mogelijk. Wanneer bij jonge kinderen de vraag naar rode bloedcellen verhoogd is (bijvoorbeeld bij een bloeding), gebeurt de aanmaak ook buiten het beenmerg. Bij oudere kinderen en volwassen gebeurt extra-medullaire hematopoëse enkel nog bij ernstige ziektes zoals leukemie of sikkelcelanemie. Wanneer een hoog aantal voorlopercellen gevonden wordt in het perifere bloed, is dat dus alarmerend. [2] 2.2 Classificatie in de witte bloedcellen De WBC (witte bloedcellen) of leukocyten zijn op zich kleurloos en hebben een kern. Ze worden in twee grote groepen ingedeeld op basis van aan- of afwezigheid van korrels of granules. Ze worden ingedeeld als granulocyten of agranulocyten. Een indeling is ook mogelijk op basis van de morfologie van de kern. Zo beschrijft men de mononucleairen (de monocyten en lymfocyten) en polymorfonucleairen (de neutro-, eosino- en basofielen). Een laatste mogelijke onderverdeling gebeurt aan de hand van de functie van de cellen. Dan spreekt men van fagocyten (de neutro-, eosino-, basofielen en monocyten) en immunocyten (de lymfocyten). In dit eindwerk wordt de indeling gebruikt als granulocyten en agranulocyten. In het perifere bloed vindt men 3,8 tot 10,6.10 9 WBC per liter. Bij minder dan 3,0.10 9 WBC per liter spreekt men van leukopenie. Een aantal hoger dan 10,6.10 9 WBC per liter noemt men leukocytose. [2] 13 Annelies Decq
Materiaal en methode 2.2.1 De granulocyten 2.2.1.1 De neutrofiel De neutrofiele granulocyt kunnen in het perifere bloed voorkomen als jonge vorm en als meer rijpere vorm. De jonge vorm wordt bandneutrofiel genoemd en de rijpere neutrofiel heeft een gesegmenteerde kern. De neutrofiel heeft een diameter van 10 tot 15 µm. Het cytoplasma kleurt lichtroze en heeft purperen primaire granules. Er zijn ook secundaire granules, te klein om met de gewone lichtmicroscoop te zien, die het cytoplasma een korrelig uitzicht geven. De functie van de neutrofielen is fagocytose: vreemde indringende cellen worden gelokaliseerd, opgenomen door uitstulpingen van het celmembraan en gedood. Neutrofielen spelen zo een belangrijke rol in acute ontstekingsreacties en zijn efficiënt tegen bacteriën. Hierbij stellen de primaire granules of de lysosomen hun enzymen vrij, met name lysozymen die in staat zijn bacteriën te doden. [2] In het perifere bloed komen 2,0 tot 7,0.10 9 neutrofielen per liter voor, wat relatief 40 tot 80% betekent. Men heeft neutropenie bij een aantal tussen 0,5 en 1.10 9 per liter en neutrofilie bij meer dan 7.10 9 neutrofielen per liter. Neutropenie treedt op als de aanmaak daalt (bvb: remming geneesmiddelen of tumor in het beenmerg) of als de afbraak stijgt. Neutrofilie is te zien bij ernstige infecties, vergiftiging, verbranding of sommige vaste tumoren. Men spreekt van agranulocytose bij een aantal minder dan 0,5.10 9 neutrofielen per liter. [3] 2.2.1.1.1 De bandneutrofiel De jonge cellen hebben een worstvormige kern. Door die gebogen vorm noemt men de vroege vormen staafkernige neutrofielen of kortweg bandneutrofielen (zie fig.2-1). Er is een beginnende segmentatie zichtbaar, maar de verbinding is nog breed. De kern bestaat uit dense chromatine. In normale omstandigheden is in het perifeer bloed 0 tot 3% van de neutrofielen staafkernig. [2] Fig. 2-1: links: bandneutrofiel [4] en rechts gesegmenteerde neutrofiel [5] 14 Annelies Decq
Materiaal en methode 2.2.1.1.2 De gesegmenteerde neutrofiel De oudere cellen, die veel talrijker zijn in het perifere bloed, hebben een kern die bestaat uit twee tot vijf lobben of segmenten. Dit zijn de gesegmenteerde neutrofielen (zie fig.2-1). Men spreekt over segmentatie vanaf de insnoering ongeveer een derde is van de breedte. Heeft de neutrofiel meer dan vijf lobben, dan spreekt men over hypersegmentatie (zie fig.2-2). Dit kan aangeboren zijn zonder klinische betekenis, maar kan vooral te zien zijn bij een anemie ten gevolge van een vitamine B12-of foliumzuurdeficiëntie. Het treedt ook mogelijk op bij alcoholisme of sepsis. Men noemt een neutrofiel hypogesegmenteerd als er maar twee lobben zijn, verbonden met elkaar door een dunne streng van chromatine. Men benoemt dit ook als de Pelger Huët neutrofiel (zie fig.2-2). Deze vorm is meestal het gevolg van een klinisch onbelangrijke genetische aandoening, maar is ook te zien bij ernstige infecties of myeloïde leukemie. Vaak wordt de Pelger Huët neutrofiel als een bandneutrofiel aanzien, waarbij men dan foutief een infectie diagnostiseert. Fig. 2-2: links: hypersegmentatie en rechts: Pelger Huët neutrofiel[4] In bepaalde gevallen kan men in neutrofielen toxische korreling zien: een groot aantal diep purperen granules (zie fig.2-3). In het cytoplasma merkt men soms ronde tot ovale hemelsblauwe vlekjes op: de Döhle lichaampjes (zie fig.2-3). Zowel toxische korreling als Döhle lichaampjes wijzen meestal op een infectie. Het is ook mogelijks een aanwijzing voor ontsteking, zwangerschap of verbranding. Lichaampjes van Döhle duiken ook op na een therapie met cytostatica. Bij het myelodysplastisch syndroom treedt hypo- of degranulatie op. Er is dan weinig of geen korreling te zien. [2] Fig. 2-3: links: Toxische korreling in een neutrofiel [4] en rechts: Döhle lichaampje in neutrofiel [5] 15 Annelies Decq
Materiaal en methode 2.2.1.2 De eosinofiel De eosinofiele granulocyt heeft een diameter van 12 tot 16 µm (zie fig.2-4). In het cytoplasma vindt men de typische grote granules met oranje tot roze kleur. De granules overdekken de kern niet en zijn gelijkmatig verdeeld over het cytoplasma. De kern is donkerpurper en is vaak tweelobbig. Eosinofielen hebben ook een fagocyterende functie, maar minder effectief als bij de neutrofielen. De belangrijkste functie van de eosinofiel is een regulerende invloed in allergische reacties. Ook bij parasitaire infecties is er een verhoogd aantal eosinofielen in het perifere bloed. Men spreekt dan van eosinofilie. De eosinofiel is in staat om zich vast te hechten aan de parasiet en zijn granules vrij te geven. De inhoud van de granules komt vrij en breekt de parasiet af. In absolute aantallen vindt men doorgaans 0,02 tot 0,5.10 9 eosinofielen per liter bloed, wat overeenkomt met 1 tot 6%. [2] Fig. 2-4: links: eosinofiel en rechts: basofiel [5] 2.2.1.3 De basofiel De basofiele granulocyt hebben een diameter van 10 tot 14 µm (zie fig.2-4). Het cytoplasma bevat felgekleurde donkerpurperen granules. De granules zijn wateroplosbaar en soms ziet men enkel nog holtes. De kern is lichtpurper gekleurd en kan rond, bandvormig of ingesneden zijn. Vaak is de kern minder zichtbaar door de overlappende granules. De granules bevatten histamine waardoor de basofiel een belangrijke functie uitoefent bij allergische reacties, ook overgevoeligheidsreacties van het onmiddellijke type genoemd. De histamine in de granules van de basofiel, is wellicht de enige voorraad histamine in het bloed. In aanwezigheid van een gepast antigeen degranuleert de basofiel en komt de histamine vrij. Er zijn weinig basofielen in het perifere bloed: 0,02 tot 0,1.10 9 per liter of minder dan 1 tot 2%. [2] Grotere aantallen van mature basofielen (basofilie) kunnen wijzen op chronische myeloïde leukemie, terwijl een woekering van minder mature vormen gevonden wordt bij acute leukemiëen. [6] 16 Annelies Decq
Materiaal en methode 2.2.2 De agranulocyten 2.2.2.1 De lymfocyt De meeste lymfocyten in het perifere bloed zijn normale niet-geactiveerde lymfocyten. Soms vindt men grote geactiveerde lymfocyten met een variante morfologie. 2.2.2.1.1 De rustende lymfocyt De normale lymfocyten zijn klein met een diameter van 6 tot 8 µm (zie fig.2-5). Ze hebben een kleine, soms slecht zichtbare cytoplasmarand die lichtblauw kleurt. Ze kunnen ook groter voorkomen waarbij de diameter varieert tussen 8 en 15 µm. Het lichtblauwe cytoplasma is dan meer overvloedig en kan enkele rode granules bevatten. De kern is rond tot ovaal, heeft een donkerpaarse kleur en is dens. In het perifeer bloed vindt men 1,0 tot 3,0.10 9 rustende lymfocyten per liter, wat goed is voor 20 tot 40%, terwijl andere bronnen spreken van 30 tot 40%. [6] Een aantal lymfocyten groter dan 10.10 9 per liter noemt men lymfocytose en daarbij heeft men een vermoeden van chronische lymfoïde leukemie (CLL). Al kan lymfocytose ook het gevolg zijn van acute infecties (bvb: mazelen of hepatitis), chronische infecties (bvb: TBC of toxoplasmose) of inentingen. Een aantal onder de 0,4.10 9 lymfocyten per liter of lymfopenie kan te vinden zijn bij een aangeworven immuundeficiëntie syndroom (AIDS), of kan optreden na bestraling of chemotherapie. [3] Fig. 2-5: links: rustende lymfocyt en rechts: geactiveerde lymfocyt[4] 2.2.2.1.2 De geactiveerde lymfocyt of lymfocyt met variante vorm De geactiveerde lymfocyt is zeer variabel van vorm met een diameter tussen 10 en 22 µm (zie fig.2-5). Het cytoplasma is overvloedig en de kleur kan variëren tussen donker- en lichtblauw. De kern heeft een variabele structuur tussen een donkere dense massa en een bleke kern met een onrijp uitzicht. Het chromatine kan ook geklonterd zijn met blekere zones en nucleoli kunnen zichtbaar zijn. Er komen veel minder geactiveerde lymfocyten 17 Annelies Decq
Materiaal en methode voor: 0 tot 0,7.10 9 per liter of slechts 0 tot 7,5 %, al spreken andere bronnen van 10 tot 15 % [6]. Variante lymfocyten zijn te zien bij virale infecties (zoals Mononucleosis infectiosa of HIV) of bij chronische ontstekingen. De lymfocyten hebben hun belangrijkste functie in het immunologisch systeem. Ze worden volgens functie opgedeeld in B- en T-lymfocyten en NK-cellen (Natural Killer-cellen). Deze drie soorten kunnen morfologisch niet onderscheiden worden. T-lymfocyten en NK-cellen staan in voor de cellulaire immuniteit. Deze cellen vallen vreemd materiaal rechtstreeks aan. Humorale immuniteit is wanneer antilichamen geproduceerd worden als reactie op een antigeen. De B-lymfocyten worden dan geprikkeld om zich te delen en te differentiëren tot plasmacellen. [2] 2.2.2.1.3 De plasmacel De plasmacel is een geactiveerde B-lymfocyt en is in staat om grote hoeveelheden antilichamen te produceren (zie fig.2-6). Plasmacellen zijn groot met een diameter van 12 tot 16 µm. Het cytoplasma is blauw en overvloedig aanwezig. Er is een perinucleaire bleke zone. De kern is rond tot ovaal en ligt excentrisch in de cel. Het chromatine ligt in klompen. Normaal zijn plasmacellen niet te vinden in perifeer bloed. [3] Fig. 2-6: plasmacel [4] 2.2.2.2 De monocyt De monocyt is de grootste cel met een diameter van 12 tot 22 µm (zie fig.2-7). Er is overvloedig cytoplasma met een bleke blauwgrijze kleur. Het cytoplasma heeft een uitzicht van gemalen glas door fijne granules. Het cytoplasma kan onregelmatig zijn van vorm en kan vacuoles bevatten. De kern varieert van vorm, van rond tot hoefijzervormig of gelobd. Het chromatine is licht purper en heeft een fijn kantwerk -structuur. Monocyten ontstaan in het beenmerg en komen binnen de 24 uur in de bloedbaan. Daar circuleren ze voor een korte tijd, ongeveer 70 uur. Daarna verlaten ze de bloedbaan en in de weefsels differentiëren ze tot macrofagen. Macrofagen kunnen zeer lang, tot maanden, overleven 18 Annelies Decq
Materiaal en methode en kunnen delen. Macrofagen kunnen differentiëren tot twee celsoorten met verschillende functies. Een eerste celsoort heeft een uitgesproken fagocyterende functie. Ten tweede kunnen ze een belangrijke rol spelen in een specifieke immunologische reactie. In dit geval is hun fagocyterende rol beperkt. In het perifere bloed is 0,2 tot 1,0.10 9 per liter of 2 tot 10% een monocyt. [2] Bij een aantal hoger dan 1,5.10 9 per liter spreekt men van monocytose. Dit kan optreden bij bacteriële infecties of bij herstel van agranulocytose, maar ook bij het Hodgkin lymfoom of bij acute of chronische leukemie met uitrijping tot monocyten. Monocytopenie (minder dan 0,1.10 9 per liter) kan te zien zijn bij hairy cell leukemie. [3] Fig. 2-7: monocyt [5] 2.3 Classificatie in de voorlopers 2.3.1 De pluripotente stamcel Alle lichaamscellen ontstaan uit een pluripotente stamcel. Deze cel kan elke lichaamscel van de mens vormen. Na een aantal celdelingen en differentiaties bekomt men de multipotente stamcel, bijvoorbeeld de hematopoëtische stamcel in het beenmerg. Deze kan nog iedere bloedcel vormen. Na verdere celdeling krijgt men een progenitorcel per cellijn van het beenmerg: de granulocytaire en monocytaire, de lymfocytaire, de erytroïde en de megakaryocytaire stamcel. Uit deze cellen worden steeds meer mature en gespecialiseerde cellen gevormd (zie fig.2-8). [2] 19 Annelies Decq
Materiaal en methode Fig. 2-8: uitrijping van pluripotente stamcel tot iedere bloedceltype [3] 2.3.2 Uitrijping van de myeloïde reeks Bij uitrijping van de myeloïde reeks kan men spreken van de granulopoëse. De term beslaat de uitrijping tot neutrofielen, basofielen en eosinofielen (zie fig.2-9). De precursoren van deze drie cellijnen komen normaalgezien niet voor in het bloed maar enkel in het beenmerg. De vroegste precursor is de myeloblast. Het beenmerg bevat ongeveer 0 tot 1,4% myeloblasten. [2] Fig. 2-9: uitrijping van precursor tot neutrofiel [5] 20 Annelies Decq
Materiaal en methode 2.3.2.1 De myeloblast De cel is rond tot licht ovaal en is 14 tot 18 µm groot (zie fig.2-10). De kern neemt 4/5 de van de cel in beslag en heeft fijn chromatine, homogeen roodpurper gekleurd. Er kunnen in de kern twee tot vijf blauw doorschijnende nucleoli te zien zijn, evenals een perinucleaire halo. Het weinige cytoplasma is azuurblauw en bevat geen granules. In het beenmerg is 0,3 tot 3% van de cellen myeloblast. Fig. 2-10: links: myeloblast en rechts: promyelocyt [4] 2.3.2.2 De promyelocyt De cel is rond tot ellipsvormig en groter dan zijn voorganger met een diameter van 16 tot 25 µm (zie fig.2-10). De kern beslaat 7/10 de van de hele cel en heeft grover chromatine. De kern ligt meestal excentrisch en indien aanwezigheid van nucleoli zijn ze minder duidelijk. Het cytoplasma is meer overvloedig aanwezig, heeft een basofiele kleur en bevat roodblauwe granules die over de kern kunnen liggen. In het beenmerg vindt men 1,7 tot 8,4% promyelocyten. Worden ze in het perifere bloed gevonden dan wijst dat mogelijk op een leukemie. [2] 2.3.2.3 De myelocyt De cel is rond tot licht ovaal en 12 tot 18 µm groot (zie fig.2-11). De kern ligt excentrisch en neemt ongeveer de helft van de cel in. Het chromatine is nog denser en kan al geklompt zijn. Er zijn geen nucleoli meer en er kan al een lichte indeuking zijn. Het cytoplasma is lichtblauw tot bleek roze en bevat veel specifieke granules. Vanaf de myelocyt kan het onderscheid tussen neutro-, eosino en basofiel te zien zijn. In het beenmerg zijn 3,3 tot 12 % myelocyten aanwezig en aanwezigheid in het perifere bloed duidt op leukemie. [2] 21 Annelies Decq
Materiaal en methode Fig. 2-11: links: myelocyt en rechts: metamyelocyt [4] 2.3.2.4 De metamyelocyt De cel is rond met een diameter van 10 tot 15 µm (zie fig.2-11). De kern neemt een kleiner deel van de cel in en is ingedeukt tot boonvormig. Het chromatine is grof en te vergelijken met dat van de mature cel. Het cytoplasma is roze met kleine granules. Vanaf de metamyelocyt is het onderscheid tussen neutro-, eosino- en basofiel duidelijk te zien. De grens tussen metamyelocyt en bandneutrofiel is soms moeilijk te bepalen. Het beenmerg bevat 3,1 tot 10,7 % metamyelocyten. [2] Metamyelocyten zijn zeldzaam in het perifere bloed van gezonde personen. Ze kunnen wel te zien zijn tijdens infecties of zwangerschap. Aanwezigheid in het perifere bloed van vormen jonger dan de myelocyt wijzen uitsluitend op hematologische maligniteiten. [6] 2.4 Morfologie en insluitsels in de rode bloedcellen De RBC (rode bloedcellen) of erytrocyten kleuren rood door de hemoglobine (zie fig.2-12). Ze zijn biconcaaf van vorm en hebben geen kern meer. Een RBC heeft een diameter van ongeveer 8 µm, een dikte van 0,8 µm op het dunne gedeelte en een dikte van 2,6 µm op het dikke gedeelte van de biconcave schijf (zie fig.2-12). Fig. 2-12: links: rode bloedcellen [4] en rechts: biconcave rode bloedcel (elektronenmicroscoop) [5] 22 Annelies Decq
Materiaal en methode De RBC is ook vervormbaar waardoor het door de fijnste haarvaten kan en nadien weer ongeschonden de oorspronkelijke vorm aanneemt. Het membraan bestaat zoals de meeste celmembranen uit een dubbele fosfolipidenlaag. Aan de buitenkant van het membraan bevinden zich koolhydraten en eiwitten, die de diverse bloedgroepantigenen vormen. De functie van RBC is het transporteren van zuurstof (O 2 ) en koolstofdioxide (CO 2 ). Dit transport is mogelijk door de binding van O 2 of CO 2 aan hemoglobine, het belangrijkste eiwit in de RBC. De andere eiwitten in de RBC zijn nodig in de energiesystemen. Deze enzymen moeten actief blijven gedurende de hele levensloop van de RBC, dit is ongeveer 120 dagen. Na 120 dagen verlaten de RBC de circulatie en worden ze afgebroken hoofdzakelijk in de milt. In normaal perifeer bloed zijn bij vrouwen 3,9 tot 5,6.10 12 RBC per liter aanwezig en bij mannen 4,5 tot 6,5.10 12 per liter. [2] Soms zijn er in het bloed immature RBC voor uitstoting van de kern te vinden. De gekernde RBC worden vaak benoemd met de Engelse term nucleated red blood cells (NRBC). Men spreekt van reticulocyten wanneer bij jonge RBC nog DNA-restanten te zien zijn in de vorm van blauwe stippeling. [5] 2.4.1 Variaties in morfologie 2.4.1.1 Variaties volgens grootte Een RBC met een diameter kleiner dan 6,5 µm of een volume kleiner dan 80 fl noemt men een microcyt. Een macrocyt is een RBC met een diameter groter dan 8,5 µm of een volume groter dan 95 fl. Men kan ook spreken van megalocyten wanneer de diameter groter is dan 10 µm. Een normocyt is een RBC met een normale diameter en met een volume tussen 80 en 95 fl. Men spreekt van anosicytose bij een gemengd beeld, dus wanneer er zowel microcyten als macrocyten voorkomen. Vervolgens worden de variaties volgens vorm besproken in tabel 2-1. Iedere vormverandering van RBC noemt men poikilocytose. [7] 23 Annelies Decq
Materiaal en methode Tabel 2-1: Variaties in vorm van rode bloedcellen Vormveranding Beschrijving heeft zijn biconcave vorm verloren een heeft twee tot twintig puntige stekels De acanthocyt die onregelmatig verdeeld zijn over het oppervlak. Deze vormverandering kan te zien zijn bij alcoholische cirrose en splenectomie. ook doornappelcel genoemd, heeft een gekartelde vorm. Tien tot dertig afgeronde stekels zijn egaal verdeeld over het oppervlak van de RBC. In De echinocyt vitro is dit vaak een artefact bij het verouderen van het bloedstaal. Deze vormverandering is dan omkeerbaar. De RBC heeft een ellipsvorm. Elliptocytose kan overgeërfd zijn, maar kan De elliptocyt ook optreden bij sikkelcelanemie. Mogelijks is het een artefact door het uitstrijken. De RBC kunnen gegroepeerd liggen als een geldrol, een per een na mekaar. Dit wordt rouleauxvorming genoemd en is te zien bij de ziekte van Rouleauxvorming Kahler. Bij deze ziekte is een woekering van plasmacellen te vinden. Rouleauxvorming treedt ook op bij zwangerschap en inflammatie. of fragmentocyt is een RBC in stukken gebroken. Verwarring is mogelijk doordat de fragmenten een sikkelvorm kunnen hebben. Deze vormverandering vindt men bij mensen met een defecte hartklep, De schistocyt microangiopatische hemolytische anemie (MAHA) of diffuus intravasale stolling (DIS), trombotische trombocytopenische purpura (TTP) en hemolytisch uremisch syndroom (HUS). De RBC is niet meer biconcaaf, met een centrale blekere zone, maar heeft meer een bolvorm. De RBC kleuren egaal donkerder, door de rondere De sferocyt vorm. Doorgaans is sferocytose erfelijk. Men kan ook microsferocytose opmerken bij MAHA. kan bij milde gevallen de vorm hebben van een hulstblad, of bij de ernstiger De sikkelcel gevallen een echte sikkelvorm. In beide gevallen bevat de cel een aparte vorm van hemoglobine: het HbS. Dit is een erfelijke afwijking. of schietschijfcel heeft een hemoglobineconcentrering centraal in de cel. Dit De target cel komt voor, gecombineerd met microcyten, bij thalassemie en bij leverziekten. of traancel. Zoals de naam doet vermoeden heeft de tear drop cell de vorm De tear drop cell van een traan. Deze vormverandering treedt op bij splenomegalie. Het is een kenmerk bij myelofibrose. [7] 24 Annelies Decq
Materiaal en methode 2.4.2 Insluitsels in rode bloedcellen De bespreking van insluitsels in rode bloedcellen is te vinden in tabel 2-2. Tabel 2-2: Insluitsels in rode bloedcellen Insluitsel Beschrijving In de RBC zijn talrijke blauwe insluitsels te zien, egaal verspreid in de cel. Deze insluitsels kunnen RNA zijn bij reticulocyten, of vrije Basofiele stippeling globineketens bij thalassemie. Basofiele stippeling is ook te vinden bij loodintoxicatie. Een Howell-Jolly lichaampje is een klein, dens, roodpaars insluitsel, niet tegen de wand gelegen. Deze blijven achter als een fout optreedt bij het Howell-Jolly uitstoten van de kern en zijn DNA-restanten. Ze zijn te vinden na lichaampjes splenectomie, want normaal gezien worden Howell-Jolly lichaampjes eruit gehaald in de milt. Pappenheimer lichaampjes zijn een tot twee blauwe granules in de Pappenheimer RBC. Het zijn ijzerprecipitaten en kleuren daardoor positief met een lichaampjes Perl-kleuring, dat geïoniseerd ijzer kleurt. Deze insluitsels treden op bij hemosiderose. [7] 2.5 Bloedplaatjes Bloedplaatjes of trombocyten zijn kernloze, platte schijfvormige cellen. Ze zijn rond tot ovaal met een rode korreling in een lichtblauw cytoplasma. Ze zijn veel kleiner dan RBC met een diameter van 1,5 µm en een dikte van 1 µm in het perifeer bloed komen 150 tot 400.10 9 bloedpaatjes per liter voor. Bij een aantal minder dan 100.10 9 bloedpaatjes per liter spreekt men over trombopenie. De trombocyten hebben hun functie in de bloedstolling, die in een eerste fase de wonde afsluiten door te binden aan collageen. Ze geven in tweede instantie stoffen af die verder de bloedstolling bevorderen. In het perifere bloed kunnen ook reuzentrombocyten voorkomen, die merkelijk groter zijn dan normale bloedplaatjes (zie fig.2-13). Trombocytenaggregaties is een ander voorkomend fenomeen (zie fig.2-13). De bloedplaatjes worden in het beenmerg geproduceerd door de megakaryocyt. 25 Annelies Decq
Materiaal en methode Fig. 2-13: links: reuzentrombocyt en rechts: trombocytenaggregatie [4] De megakaryocyt is een zeer grote cel, met een diameter van 50 tot 90 µm (zie fig.2-14). De kern bestaat uit vele lobben met grof en diepgekleurd chromatine. De lobulatie is te verklaren door het feit dat de kern uit zeer veel DNA bestaat. Het cytoplasma is overdadig aanwezig, lichtblauw gekleurd met fijne rode granules. De aflijning is onregelmatig en de trombocyten worden gevormd door fragmentatie van de cel. Een megakaryocyt kan ongeveer 4000 trombocyten vormen. [2] Fig. 2-14: megakaryocyt [5] 2.6 WBC differentiatie in labo 2.6.1 Huidige methode Momenteel gebeurt WBC differentiatie in het Jan Yperman ziekenhuis met de Sysmex XT2000i. De bepalingen die op dit toestel uitgevoerd worden zijn: telling van rode bloedcellen, witte bloedcellen, trombocyten, reticulocyten, meten van Mean Cell Volume (MCV) en hemoglobine, berekening van hematocriet, Mean Cell Haemoglobin (MCH), Mean Cell Haemoglobin Concentration (MCHC). Uit de distributiecurven van de RBC en de bloedplaatjes worden RDW-SD (Red blood cell Distribution Width Standard Deviation) en RDW-CV (Red blood cell Distribution Width Coëfficient of Variation) afgeleid. Deze parameters geven een maat van afwijking van de grootte van de RBC, of anders gezegd een maat voor anisocytose. 26 Annelies Decq
Materiaal en methode Het toestel is uitgerust met vijf verschillende detectiekanalen. Een eerste kanaal is voor het tellen van de WBC en het differentiëren van de basofielen. In een tweede kanaal worden lymfocyten, monocyten, neutrofielen en eosinofielen onderscheiden. Een derde kanaal telt het aantal reticulocyten en bloedplaatjes, terwijl een vierde kanaal de MCH, MCHC en MCV bepaalt. Een vijfde en laatste kanaal telt de RBC en bepaalt de RDW-SD en RDW-CV. Vol bloed, aangegeven in de tube met stop, wordt met een naald opgezogen en verdeeld via een rotor over de verschillende detectiekanalen. De Sysmex XT2000i gebruikt zijdelingse lichtverstrooiing (of scattering) en zijdelingse fluorescentie in zijn differentiatiekanaal voor de differentiatie van neutrofielen, lymfocyten, eosinofielen en monocyten (zie fig.2-15). Fig. 2-15: links: schema scattergram en rechts: voorbeeld van scattergram met zijdelingse fluorescentie [10] De intensiteit van deze zijdelingse lichtverstrooiing is afhankelijk van de complexiteit van de kern, zijn vorm en granulatie in het cytoplasma. Hoe groter de lobulatie en de granulatie, hoe hoger de zijdelingse scattering. De intensiteit van de zijdelingse fluorescentie geeft een idee over aanwezigheid van nucleïnezuren in de cel. Voor de telling van WBC en differentiatie van basofielen wordt een ander kanaal gebruikt. In dit kanaal gebruikt de XT2000i de voorwaartse en de zijdelingse lichtverstrooiing. Een zuur reagens zorgt voor het barsten en de verschrompeling van de RBC, de plaatjes en de WBC met uitzondering van de basofielen. Het verschil tussen de basofielen en de andere cellen wordt gemeten door de voorwaartse en zijdelingse scattering. De intensiteit van de voorwaartse lichtverstrooiing is relevant voor het celvolume, terwijl de zijdelings lichtverstrooiing informatie geeft over de complexiteit van de kern. Na de uitgevoerde bepalingen kunnen verschillende flaggings gegeven worden, bijvoorbeeld blasten of eosinofilie. Het SIS (Sysmex Information System) geeft aan wanneer best een uitstrijkje gemaakt wordt en zet deze stalen in de smearlist. Aan de hand van een 27 Annelies Decq
Materiaal en methode tabel wordt beslist of er al dan niet een uitstrijkje gemaakt wordt (zie bijlage 1). Bijvoorbeeld bij de flagging WBC abnormal scattergram staat in de tabel een J, dus wordt een uitstrijkje gemaakt. Deze uitstrijkjes worden geteld door de biologen van het labo. In april 2008 is voor 22,3% van de bloedstalen een uitstrijkje en een microscopische review gemaakt. [10] 2.6.2 Digitale methode Er is een geautomatiseerde digitale methode op de markt dat perifere bloeduitstrijkjes bekijkt en analyseert. Tot voor kort was er enkel de Cellavision DM96, geleverd door de firma Goffin Meyvis. Binnenkort brengt de Duitse firma Fraunhofer de HemaCam uit, die werkt volgens hetzelfde principe. Hoogstwaarschijnlijk wordt dit toestel vanaf de zomer verdeeld door Siemens. In dit eindwerk wordt enkel de Cellavision DM96 verder besproken en geëvalueerd (zie fig.2-16). Fig. 2-16: Cellavision DM96 [8] De Cellavision DM96 bepaalt op bloeduitstrijkjes de WBC verdeling, de RBC morfologie en de bloedplaatjesconcentratie. De Cellavision bevat een glaasjestransporteenheid, een optische eenheid, bestaande uit een microscoop en een camera en een computersysteem met de classificatiesoftware. Eerst wordt met de 10x objectief een monolayer gezocht om de morfologie van de RBC te bekijken. Op die monolayer maakt het toestel met de 50x objectief 35 foto s voor RBC-karakterisatie. Immersie olie wordt via een darmpje automatisch toegevoegd. Het toestel geeft een prekarakterisatie over: polychromasie, hypochromasie, anisocytose, microcytose, macrocytose en poikilocytose. De laborant heeft de mogelijkheid om ook een beoordeling te geven over: target cells, schistocytose, 28 Annelies Decq
Materiaal en methode sikkelcellen, sferocytose, elliptocytose, ovalocytose, tear drop cells, acanthocytose, echinocytose, Howell-Jolly lichaampjes, Pappenheimer lichaampjes, basofiele stippeling en parasieten. Dit kan door aanklikken van de schaal in de afgebeelde lijst. [8] De 100x objectief lokaliseert WBC en neemt van elke cel een foto van hoge kwaliteit. Gedurende het classificatieproces analyseert de Cellavision ongeveer 250 karakteristieken per cel. De witte bloedcellen die het toestel herkent zijn: bandneutrofielen, gesegmenteerde neutrofielen, lymfocyten, monocyten, blasten, promyelocyten, myelocyten, metamyelocyten, variante lymfocyten, plasmacellen. Het toestel blijft cellen fotograferen tot het gevraagde aantal bereikt is. Deze celklassen kunnen doorlopen worden in een scherm waarin alle klassen onder mekaar worden gegeven, of in een scherm waar iedere celklasse apart kan bekeken worden. Per celsoort wordt het gevonden aantal in absolute getallen gegeven. Men kan opmerkingen noteren bij de WBC zoals toxische korreling, hypersegmentatie of Döhle lichaampjes. De niet-wbc die het toestel kan herkennen zijn: gekernde rode bloedcellen (NRBC), reuzentrombocyten, trombocyten-aggregaties, smudge cellen (uitgesmeerde cellen) en artefacten, zoals bijvoorbeeld kleurstofkorrels. Cellen die het toestel niet kan classificeren worden in de groep Unidentified geplaatst. Deze cellen worden door de laborant in de correcte celklasse gezet. Alle voorstellen van het toestel kunnen aangepast worden bij fouten. De fout geplaatste cel kan men slepen naar de juiste celklasse, of met een rechter muisklik verzetten. Voor de bloedplaatjes kunnen verschillende velden geteld worden en met een omrekenfactor wordt het aantal geschat. Alle resultaten worden in een database opgeslagen en kunnen worden doorgestuurd naar het LIS (Laboratorium Informatie Systeem). [9] Volgens een referentielijst van Goffin Meyvis opgesteld begin 2008 staat de Cellavision DM96 momenteel al zeker in dertien laboratoriums in Vlaanderen. Nog drie andere labo s zijn geïnteresseerd en houden een demo. 29 Annelies Decq
Materiaal en methode 3 Materiaal en methode 3.1 Huidige methode 3.1.1 Materiaal - Buffer: 10 tabletten oplossen in vat (tot aan merkstreep) Merck Microscopy buffer tablets ph 6,8 for preparing buffer solution acc. to Weise for the staining of blood smears, 100 tabs, Merck KGaA 64271 Darmstadt Germany Na 2 HPO 4.H 2 O 0,47 g/l KH 2 PO 4 0,47 g/l LOT: TP836474 - Draagglaasjes (50 van 76x26 mm) geslepen 45 met matrand; gewassen, ontvet en gebruiksklaar M.L.S. NV (Ringlaan 7, 8930 Menen, België); - Giemsa s azur eosin methylene blue solution 2,5 L Merck KGaA 64271 Darmstadt Germany LOT: HX697763 - Haematokrit-kapillaren 75 mm, 75 µm d.a. 1,5 1,6 mm Made in Germany Hirschmann Labogeräte - May-Grünwald s eosine methylene bleu solution modified for microscopy 2,5 L Merck KGaA 64271 Darmstadt Germany LOT: HX765173 - Methanol 10L prod. 20 903.415 Batch N : 074100512 VWR International NV/SA Leuven - Microscoop Leica DM2000 SN: 290036-032007 Made by Leica Microsystems CMS GmbH 30 Annelies Decq
Materiaal en methode - Mirastainer 64000/94 For in vitro diagnostic use Manufacturer: EMD Chemicals Inc An affiliate of Merck KGaA Darmstadt Germany 480 S.Democrat Road Gibstown, NJ 08027-1297 Made in U.S.A. SN: 1701MSS859 - Sysmex Automated Hematology Analyzer XT2000i Date of manufacture: 2003/08 Manufacturer: Sysmex Corporation C.P.O. Box 1002 Kobe 650-8591 Japan SN: 11611 Leverancier: Goffin Meyvis 3.1.2 Methode 3.1.2.1 WBC differentiatie De bespreking van de huidige methode voor WBC differentiatie kan gelezen worden in punt 2.6.1. 3.1.2.2 Uitstrijken Uitstrijken gebeurt pas op aangeven van de Sysmex. Het SIS geeft dan alarmen of zogenaamde WBC-flaggings zoals: blasten, immature granulocyten, die duidelijk maken dat er best een uitstrijkje gemaakt wordt om te controleren. Het SIS maakt ook een M-lijst aan en zet naast elk staal dat best uitgestreken wordt een M. Er bestaat in het Jan Yperman labo een procedure voor het uitstrijken: Aanmaak van een uitstrijkje van veneus bloed (omgekeerd voor linkshandigen). Leg een draagglaasje voor u met de matrand rechts. Met een hematocrietcapillair een klein bloeddruppeltje (+/- 5 µl) in het midden, rechts op het draagglaasje plaatsen ongeveer op 0,5 cm van de matrand. Het proper telkamerdekglas onder een hoek van 30 (scherpe hoek over de matrand) op het draagglaasje plaatsen enkele mm links van de 31 Annelies Decq