3. EXTRACTIES Vloeistof-vloeistof extracties zijn vaak één van de eerste stappen bij (bio)analytische bepalingen, naelijk bij de staalnae/voorbereiding, aar worden ook vaak tijdens de analyse aangewend (bv. bij derivatisaties; zie Hoofdstuk 5.8 en 6.3). Het onderliggende principe kot ook terug bij de theoretische benadering van chroatografie (zie Hoofdstuk 4). Bij de staalvoorbereiding is een andere extractie techniek, vaste fase extractie (solid phase extraction, SPE), ook erg populair, aar deze zal echter later besproken worden (Hoofdstuk 8). 3.1. VLOEISTOF-VLOEISTOF EXTRACTIE Bij extracties worden twee vloeistoffen, die et elkaar niet engbaar zijn, saengebracht. Het analyt is voor de extractie opgelost in de eerste vloeistof. Bij biocheische analyses is dit noraliter de biologische atrix, welke eestal of voornaelijk uit water bestaat (bv. urine, plasa, weefsel hoogenaat, cel lysaat). Hieraan wordt een tweede vloeistof (of solvent), niet engbaar et de eerste, toegevoegd en het geheel wordt zeer goed geschud. Nadien laat en het engsel rusten o twee fasen te bekoen (wat door centrifugatie versneld kan worden). Het analyt zal zich hierbij verdelen tussen de twee solventen, en dit afhankelijk van zijn relatieve oplosbaarheid in beide fasen. De verhouding van de concentraties 4 van het analyt in de twee solventen wordt weergegeven door de partitiecoëfficiënt of distributiecoëfficiënt, K d. C s K d et C s = concentratie van het analyt in het solvent C C = concentratie van het analyt in de atrix Anorganische stoffen en polaire organische oleculen zullen vooral in de waterfase achterblijven; niet-polaire analyten zullen bij voorkeur partitioneren naar de organische fase. Bij lage K d waarden, kan en de extractie efficiëntie verhogen door de fase waarin het analyt zich bevindt te verwijderen en de extractie te herhalen. Indien eer dan drie successieve extracties nodig zijn, loont het de oeite, zeker uit praktisch/econoisch standpunt, o een ander solvent te zoeken. Voorbeeld: Extractie van lipiden volgens Bligh en Dyer 5 Dit is één van de basis procedures voor de analyse van lipiden. Een waterig staal (0.8 vol.) wordt geschud/geengd et 1 vol. chlorofor en vol. ethanol (dit geeft een éénfasisch engsel). Vervolgens wordt 1 vol. chlorofor en 1 vol. water toegevoegd (twee fasen) en het geheel geschud. 4 In verdunde oplossingen is de partitie coëfficiënt bij eerste benadering onafhankelijk van de concentraties. Het gebruik van activiteiten ipv. concentraties zou correcter zijn. 5 Bligh E.G. & Dyer W.J. (1959) A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purifikation. Can. J. Bioche. Physiol. 37, 911-917. 3
Na centrifugatie worden de lipiden teruggewonnen in de onderste fase (voornaelijk chlorofor); suikers, ainozuren, zouten blijven in de water/ethanol fase. Welke principes werden hier aangewend? Voor- en nadelen? denaturatie + hydrofobe interacties opheffen; halogeen Distributiecoëfficiënten hebben betrekking tot een enkel species van het analyt, zonder rekening te houden et eventuele zijreacties. Ionisatie is één van de zijreacties die extracties negatief kunnen beïnvloeden. Voorkennis van het analyt zorgt ervoor dat deze eigenschap ook in positieve zin kan aangewend worden. Beschouwen we de extractie van een organisch zuur (), vanuit water naar ether. Wanneer de waterfase aangezuurd is (bv. et HCl) zodat ph < pk van, geldt de forule K d ether water Wanneer de waterfase echter niet is aangezuurd, zal dissociëren - H + + B - H B K a zodat er twee onafhankelijke evenwichten tijdens de extractie optreden, waarbij het dissociatie evenwicht enkel geldt voor de oleculen in de waterfase; het partitie evenwicht enkel voor de nietgedissocieerde oleculen. Bij extracties onder zulke condities is het eestal belangrijker o de hoeveelheid geextraheerd analyt te kennen, en niet zozeer de vor ervan. Dit wordt uitgedrukt in de distributieverhouding, D. Bij het voorbeeld van het organisch zuur wordt dit D ether B water D water K ether a H water D ether water 1 Ka H D 1 K d K H a Hieruit blijkt het belang van de ph : hoe lager deze, hoe dichter D de waarde van K d zal benaderen. Bij een analyte et een K a van 10-4 wordt 99 % van het analyt geextraheerd bij ph ; bij ph 4 (waar D aar de helft bedraagt van K d ) echter aar 50 % (tov. een niet geladen analyt et dezelfde K d ). Metaal coplexatie en ionparing zijn voorbeelden van andere zijreacties die extracties beïnvloeden. Voorbeeld : Extractie van vetzuren Bij soige defecten in itochondriale -oxidatie zullen iddellange vetzuren (CH 3 -(CH ) n -COOH, n= 6-1) opstapelen en de concentratie ervan zal in plasa en urine verhoogd zijn. Bij fysiologische ph zijn ze gedissocieerd (de pk van de carboxygroep schoelt rond 4). O deze vetzuren te isoleren 4
uit urine, zal en het staal aanzuren en de waterfase verzadigen et een zout (bv. NaCl). Hierna wordt een solvent (bv. ethylacetaat of diethylether) toegevoegd. Na schudden, verdelen de organische zuren zich in de organische fase; andere bestanddelen zoals suikers en ainozuren blijven in de waterfase. Door het toevoegen van het zout, wordt de extractie efficiëntie verhoogd. Tot welke ph oet en aanzuren? Is deze ethode ook geschikt voor plasa? In Tabel 3.4 zijn een aantal solventen opgesod die bij extracties gebruikt worden (en ook bij chroatografische scheidingen). De keuze ervan is niet arbitrair. Vooreerst oeten ze een bifasisch engsel geven (zie Tabel 3.5). Ook aanbevolen is het kookpunt na te gaan. Iers, vooraleer het analyt geeten of verder gescheiden kan worden, oet dit solvent eestal verwijderd worden (rotovap; drogen onder stikstof). Sos kan het extract direct verder verwerkt/geanalyseerd worden. In dit geval oet en de copatibiliteit van het extractie solvent et het solvent van de volgende toepassing nagaan (zie verder). Tenslotte zijn vele solventen toxisch (werk in afzuigkast; beperk blootstelling; keuze van inst toxische)! 5
Tabel 3.4. Solvent eigenschappen* FYSISCHE PARAMETERS solvent kookpunt vriespunt dichtheid dielectrische constante (Debye eenheden) diethylether 35-116 0,708 4,3 carbon disulfide 46-111 1,56,6 aceton 56-95 0,785 0,7 chlorofor 61-64 1,480 4,8 ethanol 65-98 0,787 3,6 tetrahydrofuran 66-65 0,884 7,6 diisopropylether 68-60 0,74 3,9 carbon tetrachoride 76-3 1,584, ethylacetaat 77-84 0,895 6,0 ethanol 78-117 0,785 4,3 benzeen 80 5.5 0,874,3 acetonitril 81-46 0,790 37,5 cyclohexaan 81 6.5 0,774,0 isopropanol 8-89 0,781 18,3 water 100 0 1,000 78,5 dioxaan 10 1 1,07, tolueen 111-95 0,86,4 azijnzuur 118 17 1,050 6, n-butanol 118-89 0,806 17,5 N,N-diethylforaide 154-61 0,945 34,8 diethyleenglykol 45-10 1,100 37,7 * zie ook Tabel 3.5 en 4.3 6
xyleen water trichloroethyleen tolueen tetrahydrofuraan di-iso-propylether iso-propanol n-propanol pentaan ethylethylketone ethyl-1-butylether ethanol hexaan heptaan di-ethylether ethanol ethylacetaat dioxaan diethylsulfoxide diethylforaide dichloroethaan 1,-dichloroethaan cyclohexaan chlorofor butylacetaat n-butanol acetonitril aceton azijnzuur SOLVENT azijnzuur aceton acetonitril butylacetaat n-butanol chlorofor cyclohexaan 1,-dichloroethaan dichloroethaan diethylforaide diethylsulfoxide dioxaan ethylacetaat ethanol di-ethylether heptaan hexaan ethanol ethyl-1-butylether ethylethylketone pentaan n-propanol isopropanol di-iso-propylether tetrahydrofuraan tolueen trichloroethyleen water xyleen Niet engbaar Mengbaar Tabel 3.5. Mengbaarheid van solventen 7
4. CHROMATOGRAFIE 4.1. CHROMATOGRAFISCHE PRINCIPES Aan de hand van partitiechroatografie (zie.) zullen we nu een aantal eigenschappen en paraeters van een chroatografische scheiding uitleggen. Beschouwen we een sectie van een kolo obiele fase stationaire fase waarbij een stof X zich verdeelt tussen de gebonden en de obiele fase. Net zoals bij extracties, kan en een partitiecoëfficiënt definiëren als C s K waarbij C s = concentratie X in de stabiele fase (kologebonden fase) en C C = concentratie X in de obiele fase (loopvloeistof). O de scheiding tijdens een chroatografisch proces beter te visualiseren, vervangen we de kolosectie door een beker [zie in Figuur 4.1] waarin twee solventen (en waarbij en de onderfase als stationaire fase zou kunnen beschouwen; de bovenfase als de obiele fase). Bij evenwicht en bij K = 0,5 voor stof X, zal de concentratie van X in de bovenste fase twee aal hoger zijn dan in de onderste fase. Laten we nu de bovenste fase overbrengen naar een volgend recipiënt (waarin een nieuwe hoeveelheid onderfase aar zonder analyt) en bij het eerst recipiënt opnieuw een hoeveelheid bovenfase (ook zonder analyt) toevoegen. Na uitwisseling tussen beide fasen, zal X zich verdelen in beide bekertje volgens zijn K waarde. Met toeneend aantal overzettingen ontstaat een verdeling van het analyt over de verschillende recipiënten, die zal evolueren naar een Gauss-kurve. Vraag : Wat gebeurt er et een analyt et K = 0? Of indien K =? Hoe eer affiniteit het analyt heeft voor de onderfase, hoe trager het analyt zal voortschrijden over de verschillende bekers. Hoe eer affiniteit het analyt heeft voor de bovenfase, hoe sneller het zal verdwijnen uit de onderfase, en hoe dichter het zich bij de laatste beker zal bevinden. Beschouwen we nu de verdeling van twee analyten et verschillende partitiecoëfficiënt (K-waarden), zoals geïllustreerd in Figuur 4., voor analyten et K-waarde 0,5 en. Vraag : Welk analyt loopt voorop? 8
Figuur 4.1. Tegenstrooverdeling na 4 transfers en K=0,5. Figuur 4.. Grafische voorstelling van de verdeling na 4,8, en 19 transfers bij K = 0,5 en. 9
Naargelang het aantal recipiënten toeneet, worden de verschillen in snelheid van beweging sterker en scheiden de pieken zich eer en eer. Het vertragend effect van de grotere oplosbaarheid in de onderfase wordt dus duidelijker en geeft een scheiding van beide analyten. We onthouden hieruit reeds enkele principes: - een groot verschil in partitiecoëfficiënt tussen analyten zorgt voor een snellere scheiding - een toeneend aantal recipiënten verhoogt het scheidingsverogen van twee analyten et een verschillende K-waarde. - een hogere affiniteit voor de onderfase (hoge K-waarde) geeft een tragere transfer van het analyt Indien we het bekertje terug ruilen voor een kolosectie en de onderfase en bovenfase de stationaire, respectievelijke obiele fase worden van deze kolosectie, dan geldt : - hoe eer affiniteit het analyt heeft voor de stationaire fase (hoge K-waarde), hoe trager het zal verdwijnen uit deze sectie bij continue stroing van de obiele fase (en dus een laattijdigere elutie en een grotere retentietijd). In tegenstelling tot het voorbeeld et de bekers, is er bij kolochroatografie echter een continue transfer (en dit over een groter aantal bekers et een kleiner volue). Verschillen in K-waarden gaan dus leiden tot verschillen in tijdstip van elutie van de kolo. Het profiel van de elutie van de coponenten van de kolo (ogezet via een detector tot een signaal) noet en het chroatogra. Het chroatogra is de grafische voorstelling van de concentratie van het analyt in de loopvloeistof zoals zij van de kolo afkot [Figuur 4.3]. Figuur 4.3. Chroatographische scheiding en chroatogra. a. Scheiding van coponenten A en B tijdens kolochroatografie. b. Het detector signaal tijdens de verschillende elutietijdstippen in a. 30
4.. CHROMATOGRAFISCHE PARAMETERS Een eerste paraeter van partitiechroatografie, de partitiecoëfficiënt (ook distributiecoefficiënt genoed), werd reeds gedefinieerd C K C s hierbij is C s = de concentratie van het analyt in de stationaire fase en C = de concentratie van het analyt in de obiele fase. Het relatieve volue van de stationaire fase over de obiele fase wordt U genoed. V U V s hierbij is V s = het volue van de stationaire fase en V = het volue van de obiele fase. De totale hoeveelheid van het analyt in de stationaire fase is gelijk aan de concentratie in de stationaire fase C s aal het volue van de stationaire fase V s. De verhouding van het analyt over beide fasen wordt als k' benoed : k' C C s.v s.. V V K. V s K. U 4..1. Piekparaeters Bij een chroatogra, et één of eerdere pieken, kunnen we volgende paraeters aanduiden: t R t 0 Figuur 4.4. Chroatogra en retentietijd. Retentietijd en capaciteitsfactor Bij de start van de injectie van het analyt begint de tijd op het chroatogra te lopen. Een stof die zich volstrekt niet partitioneert naar de stationaire fase en et de loopfase ee igreert geeft de nultijd aan. De nultijd t 0 is dus de tijd die de loopvloeistof nodig heeft o van het punt van injectie tot het einde van de kolo op de detector te passeren [Figuur 4.4]. Op dezelfde anier is V 0 gedefinieerd, het volue dat gedurende t 0 door de detector passeerde. In gaschroatografie noet en dit sos de gas-holdup tijd, bij vloeistofchroatografie het dood volue (void volue), of de solvent piek. 31
Het tijdstip waarop het axiu van de piek van het analyt doorkot, noet en de retentietijd, t R. De retentietijd van coponent A is t R (A). De aangepaste retentietijd t' (adjusted retention tie) is: t' R (A) = t R (A) - t 0 Deze paraeter duidt dus aan hoezeer het analyt tegengehouden wordt en vertraagd wordt op de kolo door de verdeling naar de stationaire fase. Indien we dit corrigeren voor het volue van de kolo aan de hand van de t 0 definiëren we de capaciteitsfactor k' (capacity factor; voor A). tr (A) - t0 k' t 0 Deze factor (zonder diensie!) weerspiegelt de capaciteit van de kolo o analyt A te weerhouden en is gerelateerd aan de verdelingscoëfficiënt C s. Vs k' K. U C. V Piekbreedte Onder ideale ostandigheden zal de elutie van een analyt een Gauss-verdeling volgen. De breedte van de elutiepiek, piekbreedte of W, wordt geeten ter hoogte van de basislijn vanuit de tangentiaallijn aan de zijkant van de piek [Figuur 4.5]. De totale hoeveelheid van analyt is evenredig aan de oppervlakte onder de piek. W zal beïnvloedt worden door de sterkte van de retentie. Een piek wordt dus gekenerkt door drie paraeters : de retentietijd t R, de piekhoogte h, en de piekbreedte W. Sos eet en de piekbreedte, d (of W/), op de halve piekhoogte [Figuur 4.5]. h d h/ Figuur 4.5. Chroatogra en piekbreedte. 4... Scheidingsparaeters Bij eerdere pieken in een chroatogra, kan en de scheiding tussen twee pieken aan de hand van volgende paraeters beschrijven: Relatieve retentietijd Beschouw een chroatografische scheiding van twee analyten A en B, analyt A heeft een retentietijd t R (A), analyt B heeft een retentietijd t R (B). Het belangrijkste verschil tussen coponent A en 3
coponent B is een verschil in de retentie op de kolo. Dit kan weergegeven worden door de relatieve retentietijd, t' t' R R (B) (A) Meestal neen we A als het analyt et de grootste retentietijd, zodat < 1. Delen we de teller en de noeer door t 0 dan bekoen we t' t' R R (B) (A) k' B k' A Dus is gelijk aan de verhouding van de capaciteitsfactoren. Gezien de capaciteitsfactor direct gerelateerd is aan de verdelingscoëfficiënt geeft de relatieve retentietijd het verschil weer in de partitie coëfficiënt K tussen stoffen A en B (als verhouding van K A en K B ). Resolutie In Figuur 4.6 zien we een scheiding van twee coponenten A en B. Bij een volledige scheiding tussen twee analyten zal het detectiesignaal terugkeren tot op de basislijn. Pieken die dichter bij elkaar elueren, zullen eer in elkaar overlopen. Bovendien, hoe breder de pieken, hoe sneller ze zullen overlappen. De scheiding tussen stof A en stof B wordt dus zowel bepaald door het verschil in retentietijden aar ook door de breedte van de elutiepieken. Het verschil in retentietijd, t R, is : t R = t R (B) - t R (B) = t B - t A a b c Figuur 4.6. Bepaling van R voor verschillende waarden van t R en W. Een goede scheiding is eveneens afhankelijk van de breedte van piek A en B, W A en W B. De resolutie, R s, wordt dan gedefinieerd als : 33
R s tr (B) - tr (A) tr WB WA WB WA Een goede scheiding tot op de basislijn vereist een resolutie groter of gelijk aan 1,5. Bij een resolutie gelijk aan 1 is er een kleine overlapping zoals te zien [Figuur 4.6 b] en bij een resolutie van inder dan 1 wordt deze overlapping onaanvaardbaar hoog [Figuur 4.6 a]. 4..3. Kolo-afhankelijke paraeters Het is duidelijk dat de hierboven beschreven paraeters, zowel de piekparaeters zelf als de resolutie, afhankelijk zullen zijn van de kolo. Of algeener oschreven, deze paraeters zijn bij elke vor van chroatografie afhankelijk van de fysische en cheische eigenschappen van stationaire fase. De twee belangrijkste begrippen hierbij zijn de theoretische plaat en plaathoogte. Theoretische plaat De efficientie van een kolo wordt traditioneel uitgedrukt aan de hand van het aantal theoretische platen (N). Eén theoretische plaat kan en beschouwen als het kleinste stukje van een kolo (volue van stationaire fase plus bijgaande obiele fase) waarin één volledige uitwisseling plaatsvond. In een kolo bevinden zich dus N successieve theoretische platen achter elkaar. De grootte van één theoretische plaat is niet gekend, aar et behulp van de piekparaeters t R en W kan en N berekenen als volgt: t R t R N of t R 4t R N 16 (gegeven 6 dat W=4) W W Vaak is het akkelijker de piekbreedte 7 bij halve hoogte te eten (bv. bij onvolledige scheiding), vandaar volgende vergelijking:.355 t N d R tr 5.545 d Hieruit volgt dat N ogekeerd evenredig is et de zoneverbreding (eer platen, betere scheiding, sallere pieken) [Figuur 4.7]. Hoe groter N, hoe efficiënter de kolo. 6 Wanneer een staal wordt ingespoten op een kolo zal dit initiëel een scherpe dunne zone et rechthoekige aflijning zijn, die tijdens het doorlopen van de kolo een Gauss kurve aanneet. De piekverbreding kan en dus uitdrukken als de variantie ( ) en de basis van de piek als 4. 7 De piekbreedte bij halve hoogte bij een Gauss verdeling is gelijk aan.355. 34
Figuur 4.7. Verband tussen aantal platen en piekvor. Tijdens de beweging doorheen de kolo zullen de initieel scherp afgelijnde concentratieverschillen van het aangebrachte staal (weergegeven in stippellijn) vervagen en een Gauss verdeling aanneen. De vor ervan is afhankelijk van N. Theoretische plaathoogte De theoretische plaathoogte (HETP; height equivalent to a theoretical plate), het volue van de kolo waarin een volledige uitwisseling en partitionering geschiedt, kan en berekenen uit de kololengte L en het aantal theoretische platen N (of de piekparaeters). HETP L N L 16 W t R HETP weerspiegelt de eigenschappen van de kolo die bijdragen tot het scheidend verogen (voor het bestaande systee van kolo, loopvloeistof en analyt!). Hoe kleiner de theoretische plaathoogte, hoe kleiner de piekbreedte, hoe groter het aantal theoretische platen voor een gegeven lengte van de kolo, en hoe beter het scheidend verogen van de kolo. Vraag : Hoeveel bedraagt de theoretische plaathoogte HETP bij goede koloen (N = 50000 tot 100000 per )? enkele µ. Terwijl N nuttig is de efficientie van verschillende koloen te vergelijken, kan HETP gebruikt worden o de efficientie van een kolo onder verschillende condities te vergelijken. HETP wordt kleiner als de efficientie verhoogt, wat eestal gebeurt bij kleinere partikels 8 en inder visceuze vloeistoffen. De ideale HETP (of H) waarde is nul, aar er zijn een drietal factoren die H beïnvloeden. 1. analyten (oleculen) volgen verschillende 'rando' wegen et verschillende lengte doorheen de kolo (ook bij een lege kolo!), wat leidt tot piekverbreding. Bij koloen et een niethoogene pakking (HPLC-koloen et korrels; gepakte GC-koloen) zal deze diffusie, bekend als Eddy diffusie, eer uitgesproken zijn [Figuur 4.8]. 8 O de kolo efficiëntie onafhankelijk van de partikelgrootte te bestuderen, gebruikt en sos de gereduceerde plaathoogte h = HETP/µ 35
. oleculen diffunderen van hoge naar lage concentraties, en deze diffusie zal zowel voor- als achterwaarts optreden tijdens het igreren door de kolo (longitudinale diffusie). Het diffusie effect wordt uiteraard inder indien de obiele fase sneller beweegt [Figuur 4.9]. 3. het concept 9 van de theoretische plaat is gebaseerd op een volledige uitwisseling tussen de obiele en de stationaire fase. Een evenwicht kan wel zeer vlug bereikt worden, aar echter nooit oniddellijk. De continue beweging van de obiele fase zorgt voor afwijkingen : C s /C zal kleiner zijn dan K bij de kop van de piek (leading zone), en groter dan K bij de staart van de piek (trailing zone). [Figuur 4.8]. Dit fenoeen, bekend als weerstand tegen assaoverdracht, zal ook tot bandverbreding in beide richtingen leiden. Hoe groter de vloeisnelheid, hoe inder tijd het analyt heeft o te equilibreren tussen obiele en stationaire fase en hoe breder de theoretische plaat wordt. Figuur 4.8. Scheatische voorstelling van piekverbreding veroorzaakt door Eddy-diffusie. obiele fase stationaire fase Figuur 4.9. Concentratieprofielen doorheen een zone van een chroatografische kolo. a. ideale situatie; b. bandverbreding door longitudinale diffusie; c. bandspreiding veroorzaakt door trage equilibratie tussen de fasen. Deze drie factoren opereren in of eer onafhankelijk, en het finale effect op de piekbreedte is dus afhankelijk van hun soatie : 9 Martin A.J.P. & Synge R.L.M. (1941) A New For of Chroatogra Eploying Two Liquid Phases. 1. A Theory of Chroatography.. Applikation to the Micro-deterination of the Higher Monoaino Acids in Proteins. Bioche. J. 35, 1358-1368; Nobelprijs scheikunde 195 voor de ontwikkeling en theoretische benadering van verdelingschroatografie. 36
H = aandeel van niet-gelijke aandeel diffusie over de weglengten + kololengte + aandeel van niet-evenwicht Eddy diffusie longitudinale diffusie assa transfer Dit kan zelfs in een atheatische forule gegoten worden, de Van Deeter vergelijking 10, in een vereenvoudigde vor als volgt : B H HETP A C.µ µ A,B, en C kan en beschouwen als constanten voor een welbepaalde kolo (aar elke constante ovat verschillende experientele paraeters specifiek voor het type van chroatografie en zijn coplexer dan hier getoond). De ter µ is de geiddelde lineaire (vloei)snelheid. Deze wordt uitgedrukt in afstand/tijd (c/seconde) 11, en is evenredig et het debiet van de obiele fase (volue/tijd; l/inuut) gerelateerd naar het oppervlakte van de kolo waarover deze obiele fase vloeit. De constante A, de Eddy-diffusie coëfficiënt, is afhankelijk van de grootte en uniforiteit van de partikels of van de packing van het koloateriaal. Kleine, unifore partikels geven een kleine A constante. Voor goede koloen ligt A eestal dicht bij nul. De B ter of de oleculaire diffusiefactor weerspiegelt de diffusie en dispersie van oleculen in de obiele fase (indien deze zou blijven stilstaan), en is gerelateerd et de diffusie over de kololengte. B is vooral van belang bij GC waar door de inherente Brownsiaanse bewegingen dispersie van het analyt in de gasfase 1 optreedt. Onthou dat B ogekeerd evenredig is et de vloeisnelheid van de obiele fase. De ter C of de weerstand tegen assaoverdracht, is een coplexe vergelijking in functie van de geoetrie van de stationaire fase, de distributiecoëffiënt, en de diffusiesnelheden in beide fasen. Beerk dat C recht evenredig is et µ. De relatieve contributie van de factoren A,B en C is afhankelijk van het type chroatografie (gaschroatografie of vloeistofchroatografie), van het type kolo (capillaire kolo versus partikel kolo) en van de aard van de packing. Deze constanten kan en experienteel bepalen, aar de factor die het akkelijkste controleerbaar is, is de vloeisnelheid. Let wel op, de vloeisnelheid kot in de Van Deeter vergelijking voor op twee plaatsen. Bij te hoge snelheid zal bandverbreding ontstaan door beperkte assaoverdracht tussen de obiele en stationaire fase geven. Bij te trage snelheid zal de longitudinale diffusie doineren bij de bepaling van H. Een optiale loopsnelheid ( opt ) waarbij de theoretische plaathoogte het kleinste is (H opt ) en bijgevolg de resolutie het best, kan en grafisch [Figuur 4.10] en experienteel afleiden. 10 De Van Deeter vergelijking werd afgeleid door een groep Nederlandse petroleucheisten. 11 Bij GC; bij kolochroatografie wordt µ eestal in c/hr uitgedrukt. 1 Diffusie in vloeistoffen is ongeveer 10 5 trager dan in gas. 37
H H GC B µ C.µ A H opt LC vloeisnelheid, µ µ opt vloeisnelheid, µ Figuur 4.10. Grafische voorstelling van de Van Deeter vergelijking. De resolutievergelijking De resolutie van twee coponenten is afhankelijk van de relatieve retentietijd, de capaciteitsfactor k en het aantal theoretische platen N. Men kan de volgende resolutievergelijking afleiden: R s N 16-1 k' k' 1 Deze resolutievergelijking geeft bijgevolg de sleutels waardoor we de scheiding van twee stoffen ten opzichte van elkaar kunnen verhogen. - het aantal theoretische platen verhogen door (ofwel een langere kolo, ofwel een kolo et een kleinere theoretische plaat) - de fysische en scheikundige eigenschappen van het chroatografisch systee aanpassen zodat de relatieve partitie tussen obiele fase en stationaire fase beïnvloed wordt. Dit heeft een invloed op enerzijds de k -waarden en anderzijds op de -waarde (stationaire en/of obiele fase aanpassen; teperatuur veranderen). 38