Opsporen van genmutaties door middel van Sanger sequencing bij leukemieën en lymfomen

Transcriptie

1 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar Opsporen van genmutaties door middel van Sanger sequencing bij leukemieën en lymfomen Tessa Dickele Promotor: Prof. dr. ir. Van Landschoot Anita Tutor: Dr. Sc. Nollet Friedel Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie 1

2 2

3 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar Opsporen van genmutaties door middel van Sanger sequencing bij leukemieën en lymfomen Tessa Dickele Promotor: Prof. dr. ir. Van Landschoot Anita Tutor: Dr. Sc. Nollet Friedel Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie 3

4 The author and supervisor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis. De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. Gent, juni 2014 iv

5 Woord vooraf Deze masterproef is het sluitstuk van een vierjarige opleiding in de industriële wetenschappen, afstudeerrichting biochemie. Dit eindresultaat zou echter niet mogelijk zijn geweest zonder de hulp van een aantal mensen. Ik wil dan ook van deze gelegenheid gebruik maken om hen hiervoor te bedanken. Mijn dank gaat in de eerste plaats uit naar het ziekenhuis A.Z. Sint-Jan Brugge-Oostende AV waar ik de kans kreeg om dit onderzoek uit te voeren. Dit maakte het voor mij mogelijk om heel wat technieken en theoretische inzichten die mij tijdens de opleiding zijn meegegeven nu in de praktijk aan te wenden voor het uitvoeren van een wetenschappelijke studie. In het bijzonder wens ik Dr. Sc. Friedel Nollet te bedanken voor zijn tijd, zijn nuttige inzichten, zijn kritische bemerkingen en zijn uitstekende begeleiding. Zijn deskundige kennis was zonder twijfel een meerwaarde voor deze paper. Daarnaast ook een woordje van dank voor ing Stefanie Vermeire. Haar additionele inzichten zijn zeer hulpvol geweest voor de totstandkoming van deze masterproef. Mijn onderzoek was voornamelijk verbonden aan de afdeling moleculaire biologie van het A.Z. Sint-Jan Brugge-Oostende AV. Daar wens ik in het bijzonder de laboranten Bernadette, Astrid, Nadine, Ellen en Rik te bedanken voor hun begeleiding. Ook de laboranten van de afdelingen HLA en microbiologie waren steeds bereid om bij te springen waar nodig. Ik wens ook van deze gelegenheid gebruik te maken om mijn ouders te bedanken van wie ik de kans kreeg om deze vierjarige studie te vervolmaken. Een succesvolle beëindiging zou niet mogelijk zijn geweest zonder hun onvoorwaardelijke steun. Ten slotte wens ik nog mijn zus en vrienden te bedanken voor hun steun en aanmoedigingen. v

6 Abstract - English In recent literature a lot of recurrent mutations which appear with leukemias and lymphomas are described. The purpose of this thesis consists of developping a method to search for pointmutations in a more efficient way. Mutationhotspot regions have been amplified by means of PCR and a DNA sequence was achieved via direct sanger sequencing. The gene-specific primers were prolonged with a universal M13-sequence to facilitate the execution of the sequence analysis. The method was validated by means of reanalyzing MPL, IDH1 and IDH2 genemutations. This confirmed the analyses executed in the AZ Sint-Jan. Bonemarrow and bloodsamples of patient diagnosed with MDS, and MDS/ were examined for SETBP1-, CSF3R- en ASXL1- mutations. A mutationfrequence of respectively 28,6% (6/21), 0% (0/38) and 19,1% (9/47) was achieved. In case of CLL-patients a respective mutationfrequence of 12,5% (4/32) and 2,9% (1/34) was achieved for the TP53- en NOTCH1-gene. NOTCH1-mutations were also tested with T-ALL (40%, 4/10) and MCL (0%, 0/13). In case of AML-patients c-kit (5%, 2/40), ASXL1 (14,3%, 3/21) en DNMT3A (13,2%, 7/53) mutations were being looked for. Patients diagnosed with LGL were examined for the STAT3-gene, in which case a mutationfrequence of 57,1% (4/7) was achieved. An efficient method was developed to detect pointmutations in mutationhotspots. However, the method has a limited sensitivity so that approximately 20 % of mutant DNA has to be present before it can be detected. Furthermore, the method does not allow one to look for genemutations outside mutationhotspots. This optimalized and validated mutationanalyses are from now onwards routinely performed in the lab, pending the introduction of a new method for extended mutationanalysis by means of Next Generation Sequencing. KEY WORDS: Mutation analysis, Sanger sequencing, leukemias and lymphomas, gene mutations vi

7 Abstract In de recente literatuur werden heel wat recurrente mutaties beschreven die voorkomen bij leukemieën en lymfomen. Het doel van deze thesis is om een methode te ontwikkelen om puntmutaties op een efficiënte manier op te sporen. Mutatiehotspot regio s worden met PCR geamplificeerd, en een DNA-sequentie wordt bekomen door directe Sanger sequencing. De gen-specifieke primers werden met een universele 5 M13-sequentie verlengd om de uitvoering van de sequentie analyse te vereenvoudigen. De methode werd gevalideerd door heranalyse van MPL, IDH1 en IDH2 genmutaties, als bevestiging van de analyses uitgevoerd in het AZ Sint-Jan. Beenmerg of bloedstalen van patiënten met een diagnose van MDS, en MDS/ werden onderzocht naar SETBP1-, CSF3R- en ASXL1-mutaties. Een respectievelijke mutatiefrequentie van 28,6% (6/21), 0% (0/38) en 19,1% (9/47) werd bekomen. Bij CLL-patiënten werd voor het TP53- en NOTCH1-gen een mutatiefrequentie van respectievelijk 12,5% (4/32) en 2,9% (1/34) bekomen. NOTCH1-mutaties werden eveneens getest bij T-ALL (40%, 4/10) en MCL (0%, 0/13). Bij AML-patiënten werden c-kit (5%, 2/40), ASXL1 (14,3%, 3/21) en DNMT3A (13,2%, 7/53) mutaties opgespoord. Het STAT3-gen werd onderzocht bij de diagnose van LGL, waarbij een mutatiefrequentie bekomen werd van 57,1% (4/7). Een efficiënte methode werd ontwikkeld voor het opsporen van puntmutaties in mutatiehotspots. De methode heeft echter een beperkte gevoeligheid, ongeveer 20% mutant DNA dient aanwezig te zijn. Bovendien laat de methode niet toe genmutaties op te sporen buiten mutatiehotspots. Deze geoptimaliseerde en gevalideerde mutatieanalyses worden vanaf heden routinematig uitgevoerd in het laboratorium, dit in afwachting van de introductie van een nieuwe methode voor uitgebreide mutatieanalyse door middel van Next Generation Sequencing. SLEUTELWOORDEN: Mutatie-analyse, Sanger sequencing, leukemieën en lymfomen, genmutaties vii

8 Inhoudsopgave Woord vooraf... v Abstract Engels... vi Abstract... vii Lijst met gebruikte afkortingen... 3 Lijst met figuren... 6 Lijst met tabellen... 8 Inleiding Hoofdstuk I: Literatuurstudie 1 Mutaties Soorten mutaties Gevolgen van mutaties Opsporen van mutaties Nomenclatuur Mutaties en kanker World Health Organization (WHO) classificatie van hematologische neoplasma s Genen die in verband kunnen gebracht worden met leukemieën en lymfomen Genmutaties bij, MDS en MDS/ Genmutaties bij chronische lymfatische leukemie Genmutaties bij T-cel acute lymfoblastaire leukemie Genmutaties bij mantelcellymfoom Genmutaties bij acute myeloïde leukemie Genmutaties bij large granulaire lymfocytaire leukemie Genmutaties bij lymfoplasmocytair lymfoom Implementatie van nieuwe mutaties als merkers

9 Hoofdstuk II: Materialen en methoden 1 Algemeen PCR-reactie Controle PCR-amplificatie agarosegelelektroforese Zuivering van het PCR-product - ExoSAP-it Sequentiereactie Zuivering van de sequentieproducten - Sephadex kolomzuivering Capillaire Elektroforese Interpretatie van de sequenties Hoofdstuk III: Resultaten en bespreking 1 Screening van het MPL-gen Screening van het IDH1- en IDH2-gen Screening van het TP53-gen Screening van het SETBP1-gen Screening van het STAT3-gen Screening van het DNMT3A-gen Screening van het CSF3R gen Screening van het NOTCH1-gen Screening van het ASXL1 gen Screening van het c-kit gen Screening van het MYD88 gen Vergelijkende studie met de literatuur Algemeen besluit Referentielijst Bijlage I: Overzicht positieve stalen Bijlage II: Overzicht vergelijkende studie MPL Bijlage III: Overzicht alle stalen

10 Lijst met gebruikte afkortingen A B α-kg α-ketoglutaraat ABL Abelson-gen acml Atypische chronische myeloïde leukemie ALL Acute lymfatische leukemie AML Acute myeloïde leukemie ANK-domein Ankyrin repeat domein ASX Additional sex combs ASXL1 Additional seks comb-like 1 C D E F G H BCR Bp CBF CD CLL CML CMML CNL CSF3R DNMT3A EGF ET FN GDH HG HD-domein Breekpunt cluster regio Basenparen Core binding factor Cluster of differentiation Chronische lymfatische leukemie Chronische myeloïde leukemie Chronische myelomonocytaire leukemie Chronische neutrofiele leukemie Colony Stimulerende Factor 3-Receptor DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3A Epidermale groeifactor Essentiële thrombocytemie Fibronectine Glutamaat dehydrogenase Hydroxyglutaraat Heterodimerisatie domein I IDH1 Isocitraat dehydrogenase 1 IDH2 Isocitraat dehydrogenase 2 Ig Immunoglobuline IL Interleukinen 3

11 J K L IRAK ISM JAK KDM LGL LNR LPL Interleukine receptor geassocieerd kinase Indolente systemische mastocytose Janus kinase Histon lysine demethylase Large granulaire lymfocytaire leukemie Lin-12-Notch repeats Lymfoplasmocytair lymfoom M MCL Mantelcellymfoom MDS Myelodysplastisch syndroom MDS/ Myelodysplastische/myeoloproliferatieve neoplasma s MPL Myeloproliferatief leukemie virus oncogene Myeloproliferatieve neoplasma MYD88 Myeloid differentiation primary response gene 88 MYH Myosine heavy chain N O NHL NK-cel NLS-domein OPA-domein Non-Hodgkin-lymfoom Natural killer cel Nuclear localization sequence domein opposite paired domein P PCR Polymerase kettingreactie PHD Plant homeodomein PMF Primaire myelofibrose PP2A Proteïne fosfatase 2 PV Polycythemia vera R RAM-domein RBP-Jkappa-associated module domein S SCF Stamcel groeifactor SETBP1 SET binding proteïne 1 SH2-domein Scr Homology 2-domein STAT3 Signal Transducer and Activator of Transcription SM Systemische mastocytose SNP Single nucleotide polymorphism 4

12 T W TET T-ALL TIR TLR WHO WM Ten-eleven-translocatie T-cel acute lymfoblastaire leukemie Toll-interleukine-1-receptor Toll-like receptoren World Health Organisation Waldenström macroglobulinemie 5

13 Lijst met figuren Hoofdstuk I: Literatuurstudie Figuur 1: Voorstelling van de hematopoëse (All Things Stem Cell 2013) 16 Figuur 2: Chronische Neutrofiele Leukemie Perifeer bloed (Scholten 2013) 18 Figuur 3: Chronische Neutrofiele Leukemie Beenmerg (Scholten 2013) 18 Figuur 4: Dysplasie perifeer bloed (Scholten 2013) 19 Figuur 5: Dysplasie perifeer bloed: reuzentrombocyten (Scholten 2013) 19 Figuur 6: Atypische Chronische Myeloïde Leukemie- Perifeer bloed (Scholten 2013) 20 Figuur 7: Voorstelling van het ASXL1-eiwit en het mutatiespectrum (Schnittger et al. 2013) 22 Figuur 8: Vergelijking tussen de prognose van MDS-patiënten met wild type ASXL1 en mutant ASXL1 (Chen et al. 2014) 23 Figuur 9: c-kit receptor dimeriseert in de aanwezigheid van het ligand SCF en initieert op deze manier de signaalcascade (Royster 2010) 24 Figuur 10: Voorstelling van de ligand-afhankelijke en ligand-onafhankelijke activatie van c-kit (Verstovsek 2013) 25 Figuur 11: Hematopoietische groeifactor signaaltransductie (Kaushansky 2006; Vainchenker and Constantinescu 2013) 26 Figuur 12: Opbouw van het CSF3R-gen met het mutatiespectrum (Maxson et al. 2013) 27 Figuur 13: Voorstelling twee grote groepen mutaties bij CSF3R (Maxson et al. 2013) 27 Figuur 14: MPL-signaalpathway en negatieve regulatoren (Modlich et al. 2013) 29 Figuur 15: Mutatiespectrum van het MPL-gen (gebaseerd Chaligne et al. 2008) 30 Figuur 16: Vergelijking van de overall survival van -patiënten met en zonder MPL- en JAK2-mutaties (Paradanani et al. 2011) 30 Figuur 17: Voorstelling mutaties bij het SETBP1-eiwit (Cristobal et al. 2010) 31 Figuur 18: Opbouw van het SETBP1-eiwit met het mutatiespectrum (Makishima et al. 2013) 32 Figuur 19: Vergelijking overlevingskansen tussen acml-patiënten SETBP1 wild type en gemuteerd en gemuteerd (Piazza et al. 2013) 33 Figuur 20: Vergelijking overlevingskansen tussen CMML-patiënten met wild type en mutant SETBP1 (Damm et al. 2013) 33 Figuur 21: Chronische lymfatische leukemie (Scholten 2013) 34 Figuur 22: Chronische lymfatische leukemie (Scholten 2013) 34 Figuur 23: Voorstelling van het TP53-gen met mutatiespectrum (Soussi 2012a) 35 Figuur 24: Vergelijking van progressie vrije fractie tussen CLL-patiënten met mutant en wild type TP53 (Zenz et al. 2010) 36 Figuur 25: Vergelijking tussen de overlevingskansen van CLL-patiënten met en zonder mutaties in het P53-gen (Zenz et al. 2010) 36 Figuur 26: Schematische voorstelling van de NOTCH1-signalering in T-cel voorlopers (Van Vlierberghe en Ferrando 2012) 37 Figuur 27: Schematische voorstelling van de domein architectuur van een humane NOTCH-receptor (Sala et al. 2012) 38 Figuur 28: Voorstelling NOTCH1-gen en -eiwit met mutatiespectrum bij CLL (Fabbri et al. 2011) 39 6

14 Figuur 29: Voorstelling NOTCH1-eiwit met mutatiespectrum bij T-ALL (Zhu et al. 2006) 40 Figuur 30: Voorstelling NOTCH1-eiwit met mutatiespectrum bij MCL (Parekh 2012) 41 Figuur 31: Prognostisch effect van NOTCH1-mutaties bij MCL (Parekh 2012) 41 Figuur 32: Mutatiespectrum van het DNMT3A-gen (Roller et al. 2013) 45 Figuur 33: Schematische voorstelling van de productie en het gebruik van α-ketoglutaraat in humane cellen (Yang et al. 2012) 46 Figuur 34: IDH1/2 mutaties inhiberen zowel histon- als DNA-demethylaties (Yang et al. 2012) 47 Figuur 35: Vergelijking overlevingskansen tussen AML-patiënten en gemuteerd ASXL1-gen (Schnittger et al. 2013) 48 Figuur 36: STAT3-signaalpathway (Yu et al. 2007) 50 Figuur 37: Opbouw van het STAT3-eiwit met het mutatiespectrum (Makishima et al. 2013) 51 Figuur 38: MYD88-signaalpathway (O'Neill en Bowie 2007) 53 Hoofdstuk II: Materialen en methoden Figuur 39: Opeenvolging van de verschillende stappen voor de mutatieanalyse 58 Figuur 40: Principe ExoSAP-IT (Affymetrix 2013) 63 Figuur 41: Voorstelling voor het aanmaken van Sephadex-kolommen (Sheer et al. 1997) 67 Figuur 42: Multiscreen HV plaat (Millipore 2014) 67 Figuur 43: Voorstelling Multiscreen Align Frame Blue (Sheer et al. 1997) 67 Figuur 44: 3500xL Genetic Analyzer (Life Technologies 2014) 67 Figuur 45: ABI 3130 Genetic Analyzer (Life Technologies 2014) 67 Hoofdstuk III: Resultaten en bespreking Figuur 46: Overzicht controle van de PCR-amplificatie d.m.v. agarosegelektroforese 69 Figuur 47: Voorstelling c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) - patiënt 9L Figuur 48: Voorstelling van het verdwijnen van de p.gly646trpfsx12-mutatie bij remissie (gebaseerd op Schnittger et al. 2013) 81 Figuur 49: Voorstelling p.gly646trpfsx12-mutatie bij diagnose (2009) Patiënt VM - Staal 9C Figuur 50: Voorstelling p.gly646trpfsx12-mutatie bij follow up (2014) Patiënt VM - Staal DD Figuur 51: Vergelijking van de gevonden mutatiefrequentie en de mutatiefrequenties beschreven in de literatuur per gen en per diagnose 85 7

15 Lijst met tabellen Hoofdstuk I: Literatuurstudie Tabel 1: Nomenclatuur sequentievariaties op DNA-niveau (op basis van den Dunnen en Antonarakis 2000; Ogino et al. 2007) 14 Tabel 2: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een ASXL1-mutatie voornamelijk bij, AML, MDS en MDS/ in verschillende publicaties 23 Tabel 3: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een c-kit-mutatie bij mastocytose in verschillende publicaties 25 Tabel 4: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een CSF3R-mutatie voornamelijk bij CNL, acml en CMML in verschillende publicaties 28 Tabel 5: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een MPL-mutatie voornamelijk bij myeloproliferatieve aandoeningen in verschillende publicaties 30 Tabel 6: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een SETBP1-mutatie bij specifieke ziektebeelden in verschillende publicaties 32 Tabel 7: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een TP53-mutatie bij Chronische Lymfatische Leukemie in verschillende publicaties 36 Tabel 8: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een NOTCH1-mutatie bij CLL in verschillende publicaties 39 Tabel 9: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een NOTCH1-mutatie bij T-ALL in verschillende publicaties 40 Tabel 10: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een NOTCH1-mutatie bij MCL in verschillende publicaties 41 Tabel 11: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een c-kit-mutatie voornamelijk bij AML in verschillende publicaties 42 Tabel 12: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een DNMT3A-mutatie bij en AML in verschillende publicaties 44 Tabel 13: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een IDH1/IDH2-mutatie voornamelijk bij AML in verschillende publicaties 47 Tabel 14: De meest voorkomende mutaties in het IDH1- en IDH2-gen met betrekking tot AML, met in het vet aangeduid de meest voorkomende mutaties (Paschka et al. 2010; Patel et al. 2011a; Patel et al. 2011b; Ashraf et al. 2013) 47 Tabel 15: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een ASXL1-mutatie bij AML in verschillende publicaties 48 Tabel 16: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een CSF3R-mutatie bij AML in verschillende publicaties 49 Tabel 17: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een STAT3- mutatie bij LGL en NK-LGL in verschillende publicaties 51 Tabel 18: Vergelijking voorkomen van een MYD88-mutatie bij Lymfoplasmocytair Lymfoom in verschillende publicaties 54 Tabel 19: Overzichtstabel van de reeds uitgevoerde testen en met implementatie van de voorgestelde nieuwe mutatieanalyses 55 Tabel 20: Overzichtstabel van de reeds uitgevoerde testen en met implementatie van de voorgestelde nieuwe mutatieanalyses - vervolg 56 8

16 Hoofdstuk II: Materialen en methoden Tabel 21: Overzicht gebruikte primers 60 Tabel 22: Gebruikte primers tijdens de sequentiereacties 65 Hoofdstuk III: Resultaten en bespreking Tabel 23: Overzicht gevonden mutaties in het MPL-gen 70 Tabel 24: Overzicht gevonden mutaties in het IDH1- en IDH2-gen 72 Tabel 25: Overzicht gevonden mutaties in het TP53-gen 73 Tabel 26: Overzicht gevonden mutaties in het SETBP1-gen 74 Tabel 27: Overzicht gevonden mutaties in het STAT3-gen 75 Tabel 28: Overzicht gevonden mutaties in het DNMT3A-gen 76 Tabel 29: Overzicht gevonden mutaties in het CSF3R-gen 78 Tabel 30: Overzicht gevonden mutaties in het NOTCH1-gen 78 Tabel 31: Overzicht gevonden mutaties in het ASXL2-gen 80 Tabel 32: Overzicht gevonden mutaties in het c-kit-gen 83 Tabel 33: Overzicht gevonden mutaties in het MYD88-gen 84 Tabel 34: Overzicht van de gevonden mutatiefrequentie en de in de literatuur beschreven mutatiefrequenties met eventueel een verklaring voor het verschil tussen beide mutatiefrequenties 86 Tabel 35: Overzicht van de gevonden mutatiefrequentie en de in de literatuur beschreven mutatiefrequenties met eventueel een verklaring voor het verschil tussen beide mutatiefrequenties - vervolg 87 Tabel 36: Overzicht van de gevonden co-mutaties 88 9

17 Inleiding Kanker heeft een enorme impact op het leven van patiënten en hun omgeving. Het is na hart- en vaatziekten de belangrijkste natuurlijke doodsoorzaak in België (Nationaal Instituut voor de Statistiek). Jaarlijks overlijden zo n acht miljoen personen aan de verscheidene vormen van kanker (WHO 2012). Daarnaast vergen de courante behandelingsmethoden van kanker (chemotherapie, bestraling en chirurgie) het uiterste van de patiënt op zowel fysiek als mentaal vlak. Desalniettemin is de overlevingskans bij vele kankers nog steeds gering. Een cruciale factor hierbij is het tijdstip waarop de ziekte wordt vastgesteld. Hoe sneller de correcte diagnose gesteld wordt, des te sneller kan de gepaste behandeling gestart worden. Dit resulteert in verhoogde overlevingskansen voor de patiënt (WHO 2012). Kanker valt niet onder één noemer te brengen, het is een verzamelnaam voor meer dan honderd verschillende ziekten, die één gemeenschappelijk kenmerk delen: een ongecontroleerde en ongeremde deling van lichaamscellen. Momenteel zijn de belangrijkste types van kwaadaardige kankers carcinomen, sarcomen, melanomen, lymfomen en leukemieën, waarbij het onderscheid wordt gemaakt op basis van welke cel zich differentieert tot een kankercel. Leukemieën en lymfomen vormen de focus van deze masterproef. Het zijn beiden bloedkankers waarbij geen echte tumorvorming plaatsvindt, maar een overdreven deling van de witte bloedcellen, die zich onmiddellijk in het hele lichaam kunnen verspreiden (Movva 2013). Centraal in het ontstaan van kanker staan mutaties in het DNA, meer bepaald in genen die betrokken zijn bij het reguleren en controleren van de celdeling. Het zijn combinaties van dit soort mutaties die uiteindelijk leiden tot de ontwikkeling van kanker. Verschillen in gemuteerde gencombinaties leiden tot verschillende ziektebeelden. Er is bovendien een duidelijk verband tussen deze mutaties en het voorkomen van een welbepaalde vorm van kanker, wat perspectieven biedt voor het (voortijdig) opsporen van de ziekte. Tot op vandaag worden de meeste kankers immers gediagnosticeerd op basis van morfologische, immunofenotypische of cytogenische principes. Dit maakt het vaak moeilijk om onderscheid te maken tussen de verschillende ziektebeelden. Bovendien is het stellen van dergelijke diagnoses vaak gebaseerd op exclusie, wat soms kostbare tijd in beslag neemt. Wanneer de ziekte echter gelinkt kan worden aan het voorkomen van een bepaalde mutatie, een moleculaire merker, kan het stellen van de diagnose mogelijk versneld worden. Dit leidt vervolgens tot een snellere start van een effectieve behandeling, wat de overlevingskans van de patiënt drastisch vergroot. Anderzijds kan de aanwezigheid van een specifieke mutatie ook als extra controle dienen. Het AZ Sint-Jan Brugge maakt voor een aantal gevallen reeds gebruik van moleculaire merkers. Toch worden een aantal diagnosen nog steeds gesteld op basis van exclusie. Om deze reden is het interessant voor het ziekenhuis om op zoek te gaan naar nieuwe moleculaire merkers. Het doel van deze masterproef is dan ook om een methode te ontwikkelen die in staat is om de in de literatuur beschreven puntmutaties op een efficiënte manier te kunnen opsporen. Voor deze mutatieanalyse wordt gebruik gemaakt van Sanger sequencing. Deze thesis is opgebouwd uit drie hoofdstukken. Het eerste hoofdstuk handelt over de theoretische achtergrond. Hierin wordt dieper ingegaan op mutaties in het algemeen en het verband tussen het 10

18 voorkomen van mutaties en kanker. Er wordt beschreven welke genen in verband gebracht worden met een specifieke vorm van bloedkanker. Er wordt telkens wat dieper ingegaan op de ziekte en op de genen. De nadruk hierbij ligt vooral op het belang van het opsporen van de mutatie. In een tweede hoofdstuk worden de materialen en methoden beschreven die tijdens het uitvoeren van dit onderzoek gebruikt werden. In een laatste hoofdstuk worden de bekomen resultaten van de mutatieanalyses besproken. 11

19 Hoofdstuk I: Literatuurstudie 1 Mutaties Een mutatie is een verandering in het erfelijk materiaal van een organisme, dit kan zowel in het DNA als in het RNA. De nucleotidevolgorde wordt een sequentie genoemd. Met een mutatie wordt een verandering in deze nucleotidevolgorde of sequentie bedoeld. Er bestaan verschillende soorten mutaties, deze worden hieronder verduidelijkt. 1.1 Soorten mutaties Een eerste soort zijn de genmutaties. Er wordt gesproken over genmutaties als de mutatie slechts één of slechts enkele nucleotiden betreft. Tot deze groep behoren als eerste de puntmutaties. Hierbij wordt het ene nucleotide uitgewisseld voor een ander nucleotide. Hiertoe behoren eveneens kleine deleties en inserties. Bij een deletie worden één of enkele nucleotiden uit de sequentie verwijderd, terwijl bij een insertie net het omgekeerde gebeurt, één of enkele nucleotiden worden aan de sequentie toegevoegd. Als laatste behoren tot de genmutaties eveneens de inversie mutaties. Inversie houdt in dat een stukje van de DNA-streng is losgeraakt en achterstevoren terug is geïntegreerd (Loewe 2008). Als tweede soort zijn er de chromosoommutaties. Een chromosoommutatie treedt op als een chromosoom van structuur verandert. Dit kan onder andere door een verkeerde deling van het chromosoom, door een deletie waarbij een deel van het chromosoom verloren gaat, door een translocatie of door een duplicatie (Loewe 2008). Als laatste zijn er de genoommutaties. Bij een genoommutatie zijn er meer of minder chromosomen dan het normale aantal van 46 aanwezig (Loewe 2008). 1.2 Gevolgen van mutaties Grote delen van het DNA, genaamd junk DNA, hebben (nog) geen duidelijke functie. Mutaties in deze delen hebben meestal weinig gevolgen: ze veranderen het genotype, maar niet het fenotype. Een dergelijke onschuldige mutatie wordt ook wel een polymorfisme genoemd. Wanneer een mutatie echter optreedt in een coderend gedeelte van een gen, kunnen er wel duidelijke gevolgen zijn. Mutaties kunnen een gevolg hebben voor de structuur van eiwitten. Puntmutaties kunnen een codon veranderen, met als mogelijk gevolg een silent mutatie, nonsense mutatie of missense mutatie. Bij een silent mutatie codeert het nieuwe codon voor hetzelfde aminozuur, zodat deze mutatie geen gevolgen heeft voor de structuur en functie van het eiwit. Dit soort puntmutatie wordt ook wel een single nucleotide polymorfisme (SNP) genoemd. Bij een nonsense mutatie codeert het nieuwe codon voor een stopcodon, waardoor het eiwit ingekort wordt en al dan niet zijn functie verliest. Als laatste zijn er de missense mutaties. Hierbij codeert het nieuwe codon voor een ander aminozuur. De gevolgen zijn niet altijd even duidelijk, afhankelijk van het soort aminozuur dat gemuteerd wordt, kan de functie van het eiwit al dan niet veranderen. Wanneer deze functie niet verandert, wordt gesproken van een SNP, terwijl een mutatie duidt op een functieverandering ten gevolge van een 12

20 mutatie. Bij een deletie of een insertie kan het gaan over een verwijdering of toevoeging van één of meerdere nucleotiden of aminozuren. Een insertie of deletie kan eveneens een verschuiving van het reading frame tot gevolg hebben, waardoor de eigenschappen van het al dan niet ontstane eiwit volledig veranderen (Loewe 2008). 1.3 Opsporen van mutaties Vaak wordt de aanwezigheid van een specifieke mutatie in verband gebracht met een welbepaald ziektebeeld. Het opsporen van deze mutaties kan dus helpen bij het stellen van een diagnose. Momenteel worden in het AZ Sint-Jan Brugge reeds verschillende mutaties opgespoord die in verband kunnen gebracht worden met een specifiek ziektebeeld. De gebruikte techniek is afhankelijk van het soort mutatie dat dient gelokaliseerd te worden. Hierbij wordt een onderscheid gemaakt tussen drie verschillende types. Ten eerste zijn er de puntmutaties. Deze worden meestal opgespoord met behulp van Sanger sequencing gecombineerd met capillaire elektroforese. Als tweede type mutaties zijn er de deleties en inserties. Deze kunnen opgespoord worden door middel van fragmentanalyse m.b.v. capillaire elektroforese. Fragmentanalyse is de overkoepelende naam voor de technologieën waarbij DNA-fragmenten volgens lengte gescheiden worden en waarbij hun grootte en hoeveelheid bepaald wordt. Als laatste type mutaties die reeds onderzocht worden zijn er de chromosoommutaties. Deze mutaties kunnen opgespoord worden via karyotypering en FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). Deze laatste is een techniek waarbij chromosoomdelen of chromosomen fluorescent gekleurd worden en vervolgens onder een fluorescentie microscoop bestudeerd worden. In tabel 19 en 20 op het einde van de literatuurstudie wordt een overzicht weergegeven van de testen die uitgevoerd worden in het AZ Sint-Jan Brugge bij het vermoeden van een specifieke diagnose. Uit de tabel kan besloten worden dat voor een aantal diagnosen nog geen moleculaire merkers gevonden zijn, bijvoorbeeld voor atypische chronische myeloïde leukemie, chronische myelomonocytaire leukemie en large granulaire lymfocytaire leukemie. Het valt tevens op dat de meeste merkers die onderzocht worden niet specifiek zijn voor een bepaalde diagnose. Het is dus belangrijk om op zoek te gaan naar nieuwe moleculaire merkers die in verband kunnen gebracht worden met een specifieke diagnose, zodat op een snellere en efficiënte manier de correcte diagnose kan gesteld worden. 1.4 Nomenclatuur Een uniforme beschrijving van mutaties is ten eerste nodig om een efficiënte en nauwkeurige rapportering te verzekeren en ten tweede om de vastgestelde stijging in sequentievariatie correct te controleren, te documenteren en op te slaan om toekomstige raadpleging te vereenvoudigen (Whitfield 2013). Sequentievariaties worden het best beschreven op DNA-niveau. Om verwarring te vermijden wordt het nucleotidenummer voorafgegaan door g. wanneer een genomische referentiesequentie gebruikt is, door een c. wanneer een coderende DNA-sequentie gebruikt is of door een m. wanneer een mitochondriale sequentie gebruikt is als referentie. De A van de ATG-initiator methionine wordt nucleotide +1 genoemd. De nucleotide in de 5 -richting ten opzichte van dit 13

21 adenosine wordt als -1 benoemd. Er bestaat dus geen nucleotide 0. De nucleotiden die voorkomen na het stopcodon aan het 3 uiteinde worden genummerd als *1, *2, enzovoort. Voorbeelden van de mutatienomenclatuur op DNA-niveau zijn weergegeven in tabel 1. De mutatie kan ook beschreven worden op proteïneniveau. Hierbij gelden ook enkele belangrijke afspraken. Een eerste afspraak is dat de mutatie altijd vooraf wordt gegaan door een p.. Als tweede wordt het codon dat codeert voor initiator methionine altijd codon 1 genoemd. Een derde afspraak is dat stopcodons altijd worden aangegeven door X. P.Arg97X duidt bijvoorbeeld een verandering aan van arginine (Arg) op positie 97 naar een stopcodon (X). De drielettercode van het aminozuur (bijvoorbeeld Arg van arginine) wordt aanbevolen om de mutaties te beschrijven, de eenlettercode (bijvoorbeeld R van arginine) is evenwel ook aanvaardbaar. Een voorbeeld van een mutatie beschreven op proteïneniveau is p.tyr97ser. Hiermee wordt bedoeld dat tyrosine (Tyr) op positie 97 wordt vervangen door een serine (Ser) (den Dunnen and Antonarakis 2000; Ogino et al. 2007; Whitfield 2013). Tabel 1: Nomenclatuur sequentievariaties op DNA-niveau (op basis van den Dunnen en Antonarakis 2000 en Ogino et al. 2007) Type van variatie Beschrijving Voorbeeld Betekenis g. g.12t>a Verandering beschreven ten opzichte van een genomische referentie sequentie c. c.12t>a Verandering beschreven ten opzichte van een coderende DNA-referentie sequentie m. m.12t>a Verandering beschreven ten opzichte van een mitochondriale referentie sequentie Substitutie > c.1997g>t Nucleotide 1997 (G) van de referentiesequentie is veranderd in een T Deletie Del c.1997_1998delgac Deletie ter hoogte van nucleotide van het aminozuur asparaginezuur Insertie Ins c.1997_1998inst Insertie van T tussen nucleotiden 1997 en Mutaties en kanker Kanker is een verzamelnaam voor meer dan honderd verschillende ziekten. Al deze verschillende soorten kanker hebben één gemeenschappelijk kenmerk: een ongeremde deling van lichaamscellen. Kanker is een aandoening die gekenmerkt wordt door een aantal specifieke verschijnselen. Ten eerste is dit door de aanwezigheid van cellen die zich ongecontroleerd vermenigvuldigen. Het tweede kenmerk is dat de woekerende cellen zich uitbreiden in het omliggend weefsel en ook daar schade aanrichten. Het derde en laatste belangrijke verschijnsel is de uitzaaiing of metastasering. Dit begrip duidt op de verspreiding van de woekerende cellen naar verder weg gelegen plaatsen in het lichaam (Dirkse 2010). 14

22 Momenteel zijn de belangrijkste types van kwaadaardige kankers carcinomen, sarcomen, melanomen, lymfomen en leukemieën. Het onderscheid wordt gemaakt op basis van welke cel zich differentieert tot een kankercel. Sommige kankers vormen niet echt tumoren, maar er treedt wel overdreven veel deling van sommige cellen op, zoals bij de leukemieën en lymfomen. Dit zijn bloedkankers waarbij een overmatige deling van de witte bloedcellen voorkomt (Movva 2013). In dit werk wordt enkel dieper ingegaan op de leukemieën en lymfomen, dewelke kwaadaardige hematologische kankers zijn. Centraal in het ontstaan van kanker staan defecten, zijnde mutaties, in het DNA. Deze mutaties kunnen op twee verschillende manieren verkregen worden. Als eerste zijn er de erfelijke mutaties en als tweede zijn er de verworven mutaties door bijvoorbeeld infecties (bv. humaan popillomavirus), fysische factoren (bv. UV- en ioniserende straling) en/of chemische stoffen (bv. asbest, benzopyreen). Om daadwerkelijk kanker te krijgen moeten de mutaties optreden in genen die betrokken zijn bij het reguleren en controleren van de celdeling. Enkele belangrijke genen zijn proto-oncogenen, tumorsuppressorgenen, genen die apoptose reguleren en genen die DNA-herstel reguleren. Proto-oncogenen komen steeds normaal voor in het lichaam. Het zijn genen die coderen voor eiwitten die een actieve rol spelen in de celregulatie. Ze zijn gewoonlijk betrokken bij het stimuleren van normale celdelingen. Indien een mutatie optreedt in een proto-oncogen kan een oncogen gevormd worden die de cel aanzet tot overmatige deling of zelfs onbeperkte groei. Tumorsuppressorgenen bezitten als het ware de omgekeerde functie als proto-oncogenen en zorgen er bijgevolg voor dat de groei van de cel onder controle wordt gehouden. Ze voorkomen de onbeperkte deling van de cel en verhinderen zo het ontstaan van een tumor. Wanneer ter hoogte van dit type gen een mutatie optreedt kan de controle op de deling van de cel verdwijnen, waardoor het mogelijk wordt dat de cel ongecontroleerd kan verder gaan met delen. Wanneer een cel niet meer op de normale wijze functioneert, treedt er apoptose op, waardoor de cel vernietigd wordt. Dit verschijnsel wordt gereguleerd door apoptose regulerende genen. Bij kanker zijn deze genen vaak uitgeschakeld. Als laatste zijn er de genen die het DNA-herstel reguleren. Aan de hand van dit systeem kunnen afwijkingen in het DNA hersteld worden. Wanneer ter hoogte van deze genen een mutatie optreedt, worden fouten in het DNA niet meer voldoende hersteld waardoor er steeds meer defecten ontstaan in het DNA. Het is belangrijk te vermelden dat kanker pas optreedt wanneer in meerdere van bovengenoemde genen mutaties zijn opgetreden (multi-step proces). Verder is het zo dat bij iedere mutatie de kans op nieuwe mutaties steeds verder toeneemt. Mutaties in bijvoorbeeld proto-oncogenen en tumorsuppressorgenen maken het mogelijk dat cellen ongeremd kunnen delen. Bij iedere deling is er altijd een kans op nieuwe mutaties. Mutaties in DNA-herstel genen verhogen eveneens de kans op mutaties. Dankzij de onderdrukking van de apoptose wordt de cel niet vernietigd (Dirkse 2010). 15

23 3 World Health Organization (WHO) classificatie van hematologische neoplasma s Leukemieën en lymfomen zijn, zoals eerder vermeld, bloedkankers waarbij een overmatige deling van de witte bloedcellen voorkomt. Bij deze ziektes is de hematopoëse ernstig verstoord. Tijdens de hematopoëse differentieert de pluripotente hematopoietische stamcel naar de myeloïde of lymfoïde cellijn (zie figuur 1). Uit de myeloïde lijn (links) ontstaan de granulocyten, de monocyten, de erytrocyten en de bloedplaatjes, terwijl uit de lymfoïde lijn (rechts) de lymfocyten ontstaan. Deze groep bestaat uit B-lymfocyten (B-cellen), T-lymfocyten (T-cellen) en Natural Killer cellen (NK-cellen). Vanuit de pluripotente stamcel ontstaat dus een myeloïde of lymfoïde voorloper- of precursorcel. Telkens wordt van één van deze twee voorlopercellen vertrokken om een bepaald type bloedcel aan te maken. Op elk niveau in de hematopoëse kan er iets misgaan waardoor er een kanker of neoplasma ontstaat. Elk differentiatiestadium kan aanleiding geven tot een specifiek hematologisch neoplasma. Het aantal mogelijke types van hematologische neoplasma s is zeer groot en ze hebben vaak overlappende kenmerken. Niettemin is het van belang om alle subtypes correct te kunnen identificeren om een correcte behandeling te kunnen starten. Daarom heeft de WHO deze verschillende soorten neoplasma s geordend in de WHO-classificatie. Er kan binnen de hematologische maligniteiten een onderscheid gemaakt worden tussen myeloïde neoplasma s en lymfoïde neoplasma s. Dit onderscheid wordt gemaakt op basis van de origine van de maligne cellen (Swerdlow et al. 2008). Myeloïde neoplasma s zijn tumoren van de myeloïde cellijn. Terwijl de lymfoïde neoplasma s (meestal lymfomen) tumoren zijn van mature of immature B-, T- of NK-lymfocyten. Ze komen voort uit verschillende differentiatiestadia van deze lymfocyten. De T-cel neoplasma s en NK-cel neoplasma s worden gezien als één groep omdat de T- en NK-cellen veel gelijkenissen vertonen met elkaar wat betreft immunofenotype en functie. De lymfoïde neoplasma s kunnen ruim gezien in twee subgroepen worden onderverdeeld: de T-cel lymfomen en de B-cel lymfomen (Swerdlow et al. 2008). Figuur 1: Voorstelling van de hematopoëse. Een pluripotente hematopoëtische stamcel wordt gedifferentieerd naar de myeloïde cellijn (links) of de lymfoïde cellijn (rechts) (All Things Stem Cell 2013). 16

24 4 Genen die in verband kunnen gebracht worden met leukemieën en lymfomen Er is een duidelijk verband tussen bepaalde puntmutaties en het voorkomen van een welbepaalde vorm van bloedkanker. Vaak zijn de diagnoses van bepaalde ziekten op zowel morfologisch, immunofenotypisch als cytogenisch vlak moeilijk te onderscheiden van andere ziektebeelden. Het stellen van dergelijke diagnoses is dan ook vaak gebaseerd op exclusie. Wanneer de ziekte echter in verband kan gebracht worden met het voorkomen van een specifieke mutatie, kan het stellen van de diagnose versneld worden, wat leidt tot een snellere start van een effectieve behandeling. In andere gevallen kan de aanwezigheid van een specifieke mutatie als extra controle dienen voor de diagnose. Zoals eerder vermeld worden voor een aantal diagnosen reeds specifieke testen uitgevoerd in het AZ Sint-Jan Brugge (zie tabel 19 en 20). Aangezien niet voor alle diagnosen dergelijke moleculaire merkers getest worden en bepaalde diagnosen nog steeds gesteld worden op basis van exclusie, is het nuttig om op zoek te gaan naar nieuwe merkers. Hieronder wordt een overzicht gegeven van de mutaties die in verband kunnen gebracht worden met een specifieke vorm van bloedkanker. Hierbij wordt telkens wat dieper ingegaan op het gen zelf, de functie en het eiwit, maar de nadruk ligt vooral op het belang van het opsporen van de mutaties. De genen worden hier uit praktische overweging ingedeeld in verschillende groepen. Deze indeling gebeurt op basis van de soort leukemie waarmee de mutatie van het gen in verband kan gebracht worden. 4.1 Genmutaties bij myeloproliferatieve neoplasma s (), myelodysplastisch syndroom (MDS) en myelodyplastische/myeloproliferatieve neoplasma s (MDS/) Indeling neoplasma s en hun kenmerken Volgens de WHO-classificatie kunnen neoplasma s ingedeeld worden in verschillende grote groepen. Drie van deze groepen zijn, MDS en MDS/ Myeloproliferatieve neoplasma s Myeloproliferatieve aandoeningen zijn hematopoiëtische stamcelaandoeningen die gekenmerkt worden door proliferatie van een of meer myeloïde lijnen (zie figuur 1), bijvoorbeeld proliferatie van granulocyten, mestcellen of megakaryocyten. Tot deze groep van aandoeningen behoren onder andere chronische myeloïde leukemie (CML), chronische neutrofiele leukemie (CNL), polycythemia vera (PV), primaire myelofibrose (PMF), essentiële thrombocytemie (ET), chronische eosinofiele leukemie (CEL) en mastocytose. Het zijn chronische aandoeningen waarbij het beenmerg te veel rode bloedcellen, witte bloedcellen en/of bloedplaatjes aanmaakt. komt het meest voor bij volwassenen tussen de 50 en 70 jaar. Enkele subtypes, voornamelijk CML en ET worden eveneens teruggevonden bij kinderen. Elk jaar wordt bij 6 tot 10 personen op de diagnose van vastgesteld (Swerdlow et al. 2008). De belangrijke diagnoses in dit werk worden hieronder uitvoerig besproken. 17

25 Chronische neutrofiele leukemie CNL is een uiterst zeldzame waarbij een blijvend hoog aantal neutrofiele granulocyten in de bloedsomloop bestaat (Swerdlow et al. 2008). a) Epidemiologie Het voorkomen van CNL is onbekend, maar er zijn slechts ongeveer 150 gevallen gemeld volgens de WHO-classificatie. In een onderzoek van 660 gevallen van chronische leukemie van myeloïde oorsprong, werd geen enkel geval van CNL waargenomen. CNL treft in het algemeen meestal oudere volwassenen, maar werd ook reeds gemeld bij adolescenten. De ratio man:vrouw is ongeveer gelijk aan 1:1 (Swerdlow et al. 2008). b) Klinische kenmerken De meest voorkomende klinische kenmerken bij CNL-patiënten zijn splenomegalie (vergroting van de milt) en hepatomegalie (vergroting van de lever) (Swerdlow et al. 2008). In het perifere bloed treedt leukocytose op (verhoging van het aantal witte bloedcellen in het bloed, meestal >25x10 9 leukocyten/l), bestaande uit overwegend neutrofiele granulocyten. Deze granulocyten kunnen toxische en grove korreling bevatten (zie figuren 2 en 3) (Swerdlow et al. 2008). Het beenmerg toont een hyperplastisch wit systeem zonder morfologische afwijkingen. Hyperplasie duidt op bovenmatige vermeerdering van weefsel (Swerdlow et al. 2008). c) Diagnose CNL is een zeer zeldzaam dat vooral gekenmerkt wordt door leukocytose. Aangezien specifieke klinische en moleculaire merkers ontbreken, is de diagnose vaak gebaseerd op exclusie. Het is bijgevolg belangrijk dat er gezocht wordt naar nieuwe moleculaire merkers die in tegenstelling tot de reeds bestaande merkers niet overlappen met andere neoplasma s, maar specifiek zijn voor CNL. Op deze manier zullen de moleculaire merkers niet alleen een belangrijke rol spelen in het stellen van de juiste diagnose, maar zullen ze eveneens aanleiding geven tot een snellere start van een effectieve behandeling (Ziai et al. 2010). Figuur 2: Chronische Neutrofiele Leukemie - Perifeer bloed: zeer veel neutrofiele granulocyten met grove korreling (Scholten 2013) Figuur 3: Chronische Neutrofiele Leukemie - Beenmerg: hyperplastisch beenmerg met hyperplasie van de myelopoëse (Scholten 2013) 18

26 Figuur 4: Dysplasie perifeer bloed: granulocyt met slechte segmentatie, hypogranulatie en afwijkende chromatinecondensatie (Scholten 2013) Figuur 5: Dysplasie perifeer bloed: reuzentrombocyten (Scholten 2013) Myelodysplastisch syndroom MDS staat voor een aantal stoornissen van het beenmerg waardoor de productie van bloedcellen is verstoord. Het ontstaat door een beschadiging in het erfelijk materiaal van een myeloïde voorlopercel van één of meer verschillende types bloedcellen (rode, witte en bloedplaatjes). Het resultaat van deze gestoorde aanmaak is dat er misvormde en niet goed uitgegroeide bloedcellen ontstaan (zie figuren 4 en 5). Deze misvormingen worden dysplasie genoemd (vandaar de naam myelodysplasie). Door de slechte kwaliteit van de bij MDS geproduceerde bloedcellen, wordt een belangrijk deel van de bloedcellen vernietigd voor het verlaten van het beenmerg, waardoor een tekort aan bloedcellen kan ontstaan. Deze aandoeningen komen frequenter voor bij mannen en komt vooral voor bij ouderen tussen 60 en 80 jaar (Swerdlow et al. 2008) Myelodysplastische/myeoloproliferatieve neoplasma s De MDS/ groep bestaat uit myeloïde neoplasma s die klinische en morfologische kenmerken bevatten die zowel de diagnose van MDS als ondersteunen. Tot deze groep behoren onder andere atypische chronische myeloïde leukemie (acml) en chronische myelomonocytaire leukemie (CMML) Atypische chronische myeloïde leukemie ACML heeft zowel dysplastische als proliferatieve kenmerken. Het lijkt op CML, maar mist het Philadelphia-chromosoom en de voor CML typische toename van basofielen. Dysplasie staat meer op de voorgrond dan bij CML. a) Epidemiologie Het exacte voorkomen van acml is niet bekend, maar is naar verluidt slecht 1 à 2 gevallen per 100 gevallen van BCR-ABL positieve CML. Met BCR-ABL positieve CML wordt bedoeld dat er een translocatie heeft plaatsgevonden. Deze translocatie leidt tot de overdracht van het Abelson(ABL)-gen op chromosoom 9 naar een gebied van chromosoom 22 dat de breekpunt cluster 19

27 regio (BCR) wordt genoemd. Dit resulteert op zijn beurt in een gefuseerd BCR-ABL gen en in de productie van een abnormaal ABL-tyrosine kinase eiwit. De gemiddelde leeftijd bij diagnose is 70 à 80 jaar, maar de ziekte werd ook gemeld bij tieners. De man:vrouw ratio varieert, maar is in de meeste gevallen ongeveer 1:1 (Swerdlow et al. 2008). b) Klinische kenmerken Er zijn slechts een paar verslagen van de klinische kenmerken van patiënten met acml. De meeste patiënten vertonen symptomen die verband houden met bloedarmoede of soms trombocytopenie, terwijl in andere landen de belangrijkste klacht is gerelateerd aan splenomegalie (vergroting van de milt). Met trombocytopenie bedoelt men het symptoom waarbij er te weinig bloedplaatjes (trombocyten) in het bloed aanwezig zijn (Swerdlow et al. 2008). c) Morfologie In het perifere bloedbeeld is een leukocytose altijd > 13 x 10 9 leukocyten/l, variërend van 30x10 9 tot 100x10 9 leukocyten/l, met hierin vele onrijpe vormen. Het aantal blasten is meestal kleiner dan 5%, maar altijd kleiner dan 20%. De cellen van de myelopoëse vertonen een bizarre segmentatie en afwijkende granulatie (zie figuur 6) (Swerdlow et al. 2008). Het beenmerg is hyperplastisch waarbij er een proliferatie van de myelopoëse zichtbaar is. Het aantal myeloblasten varieert van 3 tot 10%. Ook in het beenmerg is dysplasie in de myelopoëse aanwezig (Swerdlow et al. 2008). d) Diagnose ACML vertoont heel wat gemeenschappelijke kenmerken met andere MDS/. Zowel CMML en acml worden bijvoorbeeld beide gekenmerkt door een verhoogd leukocytgehalte, trombocytopenie en splenomegalie. Er kunnen heel wat abnormaliteiten gevonden worden bij patiënten met acml, maar geen enkel is specifiek. Er dient dus gezocht te worden naar een nieuwe merker die specifiek is voor acml, zodat een snelle diagnose kan gesteld worden. Figuur 6: atypische Chronische Myeloïde Leukemie Perifeer bloed: myeloïde voorlopers en twee segmenten met dysplasie: slechte segmentatie en afwijkende chromatinestructuur (pijlen) (Scholten 2013). 20

28 Chronische myelomonocytaire leukemie CMML wordt eveneens zowel gekenmerkt door dysplastische als proliferatieve kenmerken. Patiënten met CMML hebben een te veel aan monocyten in hun bloed (>1x10 9 /l). De meest voorkomende symptomen zijn vermoeidheid, gewichtsverlies en koorts. De gemiddelde leeftijd van diagnose ligt tussen de 65 en 75 jaar. Het precieze voorkomen is nog niet gekend. Dit blijkt eveneens duidelijk uit het feit dat verschillende studies CMML classificeren onder verschillende groepen, bijvoorbeeld bij CML en een andere bij MDS. Er wordt geschat dat ongeveer bij dertien patiënten per de diagnose CMML wordt gesteld per jaar. Voor het stellen van de diagnose CMML gebeuren momenteel nog geen specifieke testen in het AZ Sint-Jan Brugge. De diagnose is dus gebaseerd op exclusie, waardoor het belangrijk is om te zoeken naar moleculaire merkers die het stellen van de diagnose CMML kunnen versnellen Mastocytose Mastocytose wordt volgens het WHO-criterium beschouwd als een subcategorie van. De aandoening wordt gekenmerkt door een abnormale groei van de mestcellen. Mestcellen zijn witte bloedcellen die zich niet vrij doorheen de bloedbaan bewegen, maar aanwezig zijn in de meeste organen. Ze spelen een belangrijke rol in het immuunsysteem. Mestcellen zijn betrokken bij allergische reacties en het bestrijden van bepaalde infecties. Mastocytose wordt ingedeeld in twee grote groepen, namelijk cutane mastocytose en systemische mastocytose. Cutane mastocytose is de meest voorkomende mestcel ziekte. Hierbij zijn geen andere organen betrokken dan de huid. In deze studie wordt enkel dieper ingegaan op de tweede groep van mastocytose, namelijk systemische mastocytose (SM). Bij SM infiltreren de mestcellen eveneens in extracutane organen zoals het beenmerg, de milt en de lever. Het klinisch verloop van SM kan variëren van indolente SM (ISM) tot een meer agressieve, levensbedreigende SM. SM is een zeldzame aandoening van de mestcel, gekenmerkt door abnormale proliferatie en accumulatie van mestcellen. De meest voorkomende symptomen zijn gewichtsverlies, pijn, misselijkheid, hoofdpijn en vermoeidheid. De meeste patiënten met SM hebben ISM. Hun levensverwachting loopt gelijkaardig aan deze van de algemene bevolking. Het bestaat evenwel dat de indolente vorm van de ziekte zich ontwikkeld tot de agressieve vorm. In tegenstelling tot de goedaardige vorm van SM, is de levensverwachting bij agressieve SM aanzienlijk korter dan deze van de algemene bevolking, variërend van 2 tot 41 maanden afhankelijk van het subtype. De diagnose van mastocytose wordt gemakkelijk gemist en de ziekte wordt vaak slechts ontdekt jaren na de beginnende klachten wat soms leidt tot een rampzalige uitkomst. Mastocytose kan voorkomen op iedere leeftijd. De kliniek van een patiënt met SM wordt sterk bepaald door enerzijds de uitscheiding van de vele mediatoren, waaronder onder andere histamine en prostaglandines na mestceldegranulatie, en anderzijds door het soms tumorvormende gedrag van de mestcellen (Alto and Clarcq 1999; Verstovsek 2013). Voor het stellen van de diagnose SM worden geavanceerde technieken ingezet en is specifiek expertise nodig van de afdelingen hematologie, allergologie, dermatologie, pathologie, klinische chemie (flowcytometrie en moleculaire biologische technieken) en radiodiagnostiek. Bij een laboratoriumonderzoek wordt het tryptasegehalte in het bloed evenals afbraakproducten van histamine in de urine bepaald. Tryptase is een stof die uitgescheiden wordt door de mestcellen en die bij SM verhoogd is. Bij een lichamelijk onderzoek wordt gelet op huidafwijkingen, een vergrote 21

29 lever, milt of lymfeklieren. Bij flowcytometrie worden de mestcellen specifiek gekleurd en verder onderzocht. Bij de moleculair biologische analyse wordt het beenmergmonster onderzocht op mutaties die specifiek zijn voor de verschillende types mastocytose. In het AZ Sint-Jan Brugge worden mastocytose-patiënten reeds getest op de aanwezigheid van c-kit-mutaties, waardoor het hier dus niet gaat om een nieuwe merker. Deze testen worden momenteel nog buitenshuis uitgevoerd (kwantitatief en gevoeliger), maar het is de bedoeling om deze test ook binnenhuis te kunnen uitvoeren Belangrijke mutaties aanwezig in, MDS en MDS/ Additional Sex Combs Like (ASXL1)-mutatie Het ASXL1-gen codeert voor een proteïne die deel uitmaakt van de polycomb-groep eiwitten. Dit is een groep van eiwitten die in staat is chromatine te remodelleren zodanig dat epigenetische silencing van genen kan plaatsvinden. Het is de menselijke homoloog van het additional sex combs (ASX)-gen van Drosophila. Het gen is bij verschillende soorten zeer goed geconserveerd. Bij de mens is de exacte functie nog niet achterhaald, maar het kan wel functioneren als een ligandafhankelijke co-activator voor een retinoïnezuurreceptor door binding met een steroïde receptor coactivator-1. Bovendien is ASXL1 ook betrokken bij de regulatie van de histonen-methylatie. Dit gebeurt door de coöperatie met het heterochromatine proteïne-1 (Weizmann Institute of Science 2013) ASXL1-eiwit en genstructuur Het expressieproduct van het ASXL1-gen is een eiwit dat bestaat uit 1541 aminozuren dat voornamelijk voorkomt in de kern en heeft een moleculaire massa van ongeveer 165 kda (Weizmann Institute of Science 2013). Het humane eiwit bestaat uit een sterk geconserveerd N-terminaal ASX-homoloog domein (ASXN) en een C-terminaal plant homeodomein (PHD) zinc finger domein, een nucleair proteïne interactie domein. Het ASXL1-eiwit bevat eveneens een geconserveerd domein in het midden van het eiwit, namelijk het ASXM-domein en een nucleair receptor domein (NR box) (zie figuur 7) (Mozziconacci and Birnbaum 2010). Het humane ASXL1-gen is gelokaliseerd op chromosoom 20 (20q11.21). Het ASXL1-gen bestaat uit bp en 13 exonen (Weizmann Institute of Science 2013). Figuur 7: Voorstelling van het ASXL1-eiwit en het mutatiespectrum van het ASXL1-eiwit (Schnittger et al. 2013) 22

30 Belang van de ASXL1-mutatie In heel wat studies worden mutaties in het ASXL1-gen in verband gebracht met, MDS/, MDS en eveneens met acute myeloïde leukemie (AML) dat verder aan bod komt. In tabel 2 wordt een overzicht gegeven van verschillende publicaties waarin dit verband wordt bestudeerd. De verschillende studies zijn het erover eens dat de mutatiehotspot zich bevindt ter hoogte van exon 12 (zie figuur 7) net voor het PHD-domein. Alle mutaties die optreden in deze mutatiehotspot resulteren in een verstoring van dit domein. Het PHD-domein is een structureel motief dat aanwezig is in nucleaire eiwitten die betrokken zijn bij modificaties van het chromatine, zoals histondemethylasen. Mutaties in het ASXL1-gen leiden bijgevolg tot afwijkende DNA-methylaties en histon wijzigingen. Mutaties in het ASXL1-gen worden geassocieerd met een slechte prognose voor de patiënt. Dit wordt geïllustreerd voor de diagnose MDS in figuur 8, maar dit geldt eveneens voor de andere diagnosen waarmee ASXL1-mutaties in verband gebracht worden (Gelsi-Boyer et al. 2009). Figuur 8: Vergelijking tussen de prognose van MDS-patiënten met wild type ASXL1 en mutant ASXL1 (Chen et al. 2014) Tabel 2: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een ASXL1-mutatie voornamelijk bij, AML, MDS en MDS/ in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het opsporen van mutaties Tefferi et al. (2011) Niet vermeld (Review) PMF Ziekte 13% 18% Voorkomen Schnittger et al. (2013) Sanger sequencing AML 127/740 (17,2%) Gelsi-Boyer et al. (2012) (vergelijking van 19 studies) MDS CMML PMF AML (secundair) AML (de novo) Abdel-Wahab et al. (2013) Niet vermeld (Review) MDS 10-30% Meggendorfer et al. (2013) Sanger sequencing CNL acml CMML 148/914 (16,2%) 124/274 (45%) 41/119 (34,5%) 30/99 (30,3%) 130/2000 (6,5%) 8/11 (73%) 38/59 (64%) 110/251(44%) 23

31 Figuur 9: c-kit receptor dimeriseert in de aanwezigheid van het ligand SCF en initieert op deze manier de signaalcascade (Royster 2010) Mest-/stamcel groeifactor receptor KIT-mutatie C-KIT is een proto-oncogen dat codeert voor een type 3 transmembraan receptor voor mestcel groeifactoren. Synoniemen voor het proto-oncogen c-kit zijn CD117, mest- of stamcel groeifactor (SCF) en tyrosine-proteïne kinase Kit. Cluster of differentation (CD)-molecules zijn merkers die aanwezig zijn op het celoppervlak. Deze merkers kunnen herkend worden door specifieke antilichamen. CD117 is een cytokine receptor die zowel voorkomt op het oppervlak van hematopoietische stamcellen als op het oppervlak van andere celtypes. Wijzigende vormen van deze receptor kunnen geassocieerd worden met sommige vormen van kanker. CD117 is een tyrosine kinase type III-receptor die bindt met een stamcel groeifactor. Wanneer deze receptor bindt met een SCF, wordt een dimeer gevormd dat de intrinsieke tyrosine kinase activiteit activeert. Hierdoor ontstaat een signaalcascade waardoor het signaal zich kan verderzetten in de cel (zie figuur 9). CD117 speelt een rol in proliferatie, differentiatie en overleving van de cel (Royster 2010) C-KIT-eiwit en genstructuur Het c-kit eiwit is opgebouwd uit 976 aminozuren en heeft een moleculair gewicht van ongeveer 110 kda (Weizmann Institute of Science 2013). Het eiwit bestaat uit zes verschillende domeinen, vijf Ig-like domeinen en één proteïne kinase domein (aminozuren ) (UniProt 2014). Het humane c-kit-gen is gelokaliseerd op chromosoom 4 (4q12) en bestaat uit bp en 21 exonen (Weizmann Institute of Science 2013) Belang van de mutatie Mutaties in de c-kit receptor zijn geassocieerd met SM. Vooral de puntmutatie p.asp816val (c.2447a>t) blijkt sterk in verband te kunnen worden gebracht met SM. Door deze mutatie wordt de mestcel voortdurend gestimuleerd, ook zonder dat binding met de mestcelgroeifactor heeft plaats gevonden (zie figuur 10). Het gaat hier om een activerende puntmutatie die wordt gevonden in het tyrosine kinase domein, wat leidt tot een conformationele verandering die resulteert in een ligand-onafhankelijke constitutieve activatie van c-kit. Dit leidt op haar beurt tot een verhoogde proliferatie en een vermindering van apoptose (Verstovsek 2013). 24

32 Volgens de studie van Bunimovich et al. (2009) wordt de mutatie p.asp816val bij meer dan 80% van de patiënten met ISM gevonden terwijl andere mutaties, zoals p.asp816gly, p.lys509ile, p.asp816his en p.val530ile, worden gevonden bij de meer agressieve varianten van mastocytose. In tabel 3 wordt een overzicht gegeven van de verschillende studies die het verband tussen specifieke mutaties en SM onderzocht hebben. Over de prognostische invloed van deze mutaties is nog weinig gekend. Figuur 10: Voorstelling van de ligand-afhankelijke en ligand-onafhankelijke activatie van c-kit (Verstovsek 2013). Tabel 3: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een c-kit-mutatie bij mastocytose in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het Voorkomen opsporen van mutaties Kristensen et al. (2011) Sanger sequencing 19/20 (95%) Bunimovich et al. (2009) Niet vermeld (Review) > 80 % Lim et al. (2009) Allel-specifieke PCR 112/165 (68%) 25

33 Colony Stimulerende Factor 3-Receptor (CSF3R)-mutatie Het eiwit dat gecodeerd wordt door het CSF3R-gen is de transmembraanreceptor voor de colony stimulerende factor 3. Dit is een cytokine dat de productie, differentiatie en functie van granulocyten controleert. Het gecodeerde proteïne is lid van de familie van de cytokinereceptors en heeft ook functies in bijvoorbeeld herkenningsprocessen. Cytokinereceptoren zijn gekoppeld aan de STAT, Ras-MAPK en fosfatidylinositol-3 -kinase(pi3k)-akt routes die convergeren in de kern en daar de genenexpressie reguleren (zie figuur 11) (Kaushansky 2006; Vainchenker and Constantinescu 2013). Het CSF3R-gen is een proto-oncogen, dat kan omgezet worden naar een oncogen dat op zijn beurt de vorming van kanker bevordert. Figuur 11: Hematopoietische groeifactor signaaltransductie. Iedere hematopoietische groeifactor-receptor is samengesteld uit twee subunits die twee moleculen Janus kinase 2 (JAK2) kunnen binden. De binding van een ligand induceert een conformationele verandering in het dimeer, wat leidt tot tyrosinefosforylering en een cross-activatie van JAK2, die de intracellulaire receptor tyrosine residuen fosforyleren. Deze trekken op hun beurt adaptereiwitten aan die de specifieke tyrosine gefosforyleerde sequenties herkennen. Verschillende adaptereiwitten worden substraat van JAK s triggering signaleringscascade. Cytokinereceptoren zijn gekoppeld aan de STAT, Ras-MAPK en fosfatidylinositol-3 - kinase(pi3k)-akt routes die convergeren in de kern en daar de genenexpressie reguleren (Kaushansky 2006; Vainchenker and Constantinescu 2013) CSF3R-eiwit en genstructuur Het humaan CSF3R-eiwit is opgebouwd uit 836 aminozuren en heeft een moleculair gewicht van ongeveer 92 kda. Het eiwit bevindt zich ter hoogte van het celmembraan en bestaat uit twee belangrijke domeinen: het immunoglobuline(ig)-like domein en het fibronectine type-iii domein (UniProt 2014) (figuur 12). Er zijn twee belangrijke motieven in het CSF3R-eiwit aanwezig. Een eerste is het WSXWS motief, dat noodzakelijk lijkt voor een goede eiwitvorming, wat op zijn beurt leidt tot een efficiënt intracellulair transport en een efficiënte celoppervlak receptorbinding. Een tweede motief is het box-1 motief, dat nodig is voor de JAK-interactie en/of -activatie (UniProt 2014). Het humane CSF3R-gen is gelokaliseerd op chromosoom 1 (1p34.3) en bestaat uit bp en 14 exonen (Weizmann Institute of Science 2013). 26

34 Figuur 12: Opbouw van het CSF3R-gen met het mutatiespectrum (Maxson et al. 2013) Belang van de mutatie De CSF3R-mutaties kunnen ingedeeld worden in twee grote groepen (zie figuren 12 en 13). Als eerste zijn er de CSF3R-mutaties die een ingekort eiwit leveren. Dit belemmert het vermogen om signalen door te geven die nodig zijn voor de neutrofiele differentiatie (Kosmider et al. 2013). Als tweede zijn er de CSF3R membraan proximale mutaties. Deze eerste soort mutaties resulteren in verhoogde niveaus van CSF3R. De tweede soort daarentegen activeren sterk de JAK/STAT-route. Beide soorten mutaties zetten het oorspronkelijke proto-oncogen om in een oncogen die de vorming van kanker stimuleert door overactivatie (Gotlib 2013). Figuur 13: Voorstelling twee grote groepen mutaties bij CSF3R (Maxson et al. 2013) Verschillende studies hebben het verband aangetoond tussen het voorkomen van CSF3R-mutaties en bepaalde specifieke vormen van bloedkanker, voornamelijk MDS/, CNL en AML (zie later) (zie tabel 4). 27

35 Tabel 4: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een CSF3R-mutatie voornamelijk bij CNL, acml en CMML in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het opsporen van mutaties Ziekte Maxson et al. (2013) Next generation sequencing CNL/aCML AML T-ALL Pardanani et al. (2013) Sanger sequencing CNL acml Voorkomen 16/27 (59%) 3/292 (1%) 1/3 (33%) 12/12 (100%) 0/9 (0%) Meggendorfer et al. (2013) Sanger sequencing CMML acml CNL 2/252 (0,8%) 2/60 (3,3%) 7/20 (35%) Kosmider et al. (2013) Sanger sequencing CMML 6/196 (3%) Figuur 12 geeft het mutatiespectrum weer van het CSF3R-gen. Uit deze figuur kan besloten worden dat er twee mutatiehotspots aanwezig zijn, namelijk ter hoogte van exon 14 (membraan proximale mutaties) en ter hoogte van exon 17 (truncation mutations). Volgens Maxson et al. (2013) bevinden 60 tot 80% van de mutaties zich ter hoogte van aminozuur 618, waarbij het oorspronkelijke threonine verandert in isoleucine. Volgens Pardanani et al. (2013) is er geen verband tussen de aanwezigheid van CSF3R-mutaties en de prognose voor de patiënt Myeloproliferatief leukemie virus oncogene (MPL)-mutatie De functies van hematopoiëtische stamcellen worden gecontroleerd door veel verschillende factoren, onder andere door cytokines en hun receptoren, zoals de thrombopoëtine receptor MPL (zie figuur 14). MPL werd geïdentificeerd als de cellulaire homoloog van het myeloproliferatieve leukemie virus oncogen (v-mpl). De MPL-signaalpathway is betrokken bij zowel de ontwikkeling als de instandhouding van de hematopoiëtische stamcellen. Bovendien is de signaalpathway via MPL cruciaal voor de megakaryocyt differentiatie en de vorming van de bloedplaatjes. Ontregeling van deze pathway kan leiden tot hematologische aandoeningen (Modlich et al. 2013). 28

36 Figuur 14: MPL-signaalpathway en negatieve regulatoren. Na het binden van het trombopoëtine aan de transmembraan receptor MPL, wordt JAK gerekruteerd en geactiveerd, wat leidt tot de inductie van drie belangrijke downstream signaalwegen (Modlich et al. 2013) MPL-eiwit en genstructuur Het proteïne dat gecodeerd wordt door het MPL-gen is opgebouwd uit 635 aminozuren en heeft een moleculair gewicht van ongeveer 71 kda. Het bestaat uit twee extracellulaire cytokinereceptor domeinen en twee intracellulaire cytokine receptor box motieven (Weizmann Institute of Science 2013). Het humane MPL-gen is gelokaliseerd op chromosoom 1 (1p34.2) en bestaat uit bp en 12 exonen (Weizmann Institute of Science 2013) Belang van de mutatie In heel wat studies worden mutaties in het MPL-gen in verband gebracht met, voornamelijk met PMF en ET en in mindere mate met MDS en MDS/ (zie tabel 5). 29

37 Tabel 5: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een MPL-mutatie voornamelijk bij myeloproliferatieve aandoeningen in verschillende publicaties Publicatie Tefferi et al. (2011) Integrated Oncology (2013) Chaligne et al. (2008) Vannucchi and Guglielmelli (2008) Gebruikte techniek voor het opsporen van mutaties Niet vermeld (Review) Niet vermeld (Review) Niet vermeld (Review) Niet vermeld (Review) Ziekte ET PMF PMF ET 3% 10% 5% 5% 1% PMF 5-10 % ET 3-7 % Voorkomen Schmitt-Graeff et al. (2008) Allel-specifieke PCR MDS 1/23 (4,35%) Schnittger et al. (2008) Sequencing MDS 1/1 (100%) Opmerking: Het onderscheid tussen, MDS en MDS/ is vaak moeilijk (Olsen et al. 2008) Tot de mutatiehotspot van het MPL-gen behoren twee aminozuren in exon 10. Een eerste aminozuur, tryptofaan 515, wordt vaak gemuteerd met de vorming van leucine, lysine of alanine. Een tweede aminozuur dat behoort tot de mutatiehotspot is serine 505, dat meestal omgevormd wordt tot asparagine (figuur 15) (Chaligne et al. 2008). Beide aminozuren behoren tot het transmembranair domein. De mechanismen van de MPL-activering blijven onduidelijk. Aan de hand van specifieke software werden de mechanismen van de MPL-activatie bestudeerd voor verschillende mutaties. De simulatieresultaten suggereren dat serine 505 en tryptofaan 515 belangrijk zijn in het behouden van de correcte positie van het transmembranair domein van MPL. Mutaties in een van deze twee posities leidt tot een verandering van dit domein, waardoor de conformatie van nabijgelegen intracellulaire domeinen op een onverwachte manier wijzigt. Deze structuurveranderingen kunnen op hun beurt leiden tot een constitutieve activatie van JAK2, de MPL kinase partner, wat leidt tot overexpressie (Lee et al. 2011). Volgens Pardanani et al. (2011) heeft een MPL-mutatie slechts een geringe prognostische waarde (zie figuur 16). Figuur 15: Mutatiespectrum van het MPL-gen (gebaseerd Chaligne et al. 2008). Figuur 16: Vergelijking van de overall survival van -patiënten met en zonder MPL- en JAK2-mutaties (Pardanani et al. 2011). 30

38 SET binding proteïne 1-mutatie Het SET binding proteïne 1 (SETBP1)-gen codeert voor het eiwit genaamd SET bindend eiwit 1. Dit is een slecht gekarakteriseerd eiwit dat wordt verondersteld om PP2A fosfatase-activiteit te remmen door zich aan een ander eiwit (SET) te binden. SET is een multitasking proteïne dat betrokken is in verschillende cellulaire processen. SET speelt onder andere een rol in apoptose, in de regulering van de celcyclus, in de samenstelling van het nucleosoom en in de migratie. Het SET-eiwit is een nucleair oncogen in tegenstelling tot het PP2A eiwit, dat een tumorsupressorgen is (Perrotti and Neviani 2008). PP2A staat voor proteïne fosfatase 2 en is een sterk geconserveerd en alomtegenwoordig serine-threonine fosfatase met een brede substraatspecificiteit en diverse cellulaire functies. Over de functie van het SETBP1-eiwit en het effect van de binding ervan aan het SET-eiwit is nog weinig bekend. Mutaties in het SETBP1-gen zorgen voor een overexpressie van het SETBP1-eiwit, waarbij het tumorsuppressor eiwit fosfatase 2A wordt onderdrukt (zie figuur 17) (Piazza et al. 2013). Figuur 17: SETBP1-eiwit bindt met het SET-eiwit, wat leidt tot de vorming van een SETBP1-SET-PP2A complex dat resulteert in de inhibitie van PP2A, wat de proliferatie van leukemiecellen bevordert (Cristobal et al. 2010) SETBP1-eiwit en genstructuur Het SETBP1-eiwit is opgebouwd uit 1596 aminozuren en heeft een moleculair gewicht van 175 kda. De SETBP1 sequentie bevat drie AT-hook domeinen (zie figuur 18). Deze AT-hook domeinen zijn kleine DNA-bindende motieven met een voorkeur voor AT-rijke gebieden. De sequentie bevat eveneens een SKI homologe regio (aminozuren ). Het SKI-eiwit is een nucleaire proto-oncoproteïne die wordt geassocieerd met tumoren bij hoge cellulaire concentraties. SKI interfereert met de normale cellulaire werking door zowel de directe belemmering van de expressie van bepaalde genen binnen de kern van de cel, als door de verstoring van de signalerende eiwitten die genen activeren. Als laatste twee domeinen van het SETBP1-eiwit zijn er een SET-binding domein (aminozuren ) en een repeat domein (aminozuren ) (Makishima et al. 2013). Het humane SETBP1-gen is gelokaliseerd op de lange arm van chromosoom 18 (18q12.3) en bestaat uit bp en vijf exonen (Weizmann Institute of Science 2013). 31

39 Figuur 18: Opbouw van het SETBP1-eiwit met het mutatiespectrum (Makishima et al. 2013) Belang van de mutatie In 2012 werd SETBP1 geïdentificeerd als een nieuw oncogen. Specifieke somatische mutaties van dit gen werden voornamelijk ontdekt bij patiënten die lijden aan acml en CNL en in mindere mate bij CMML, MDS en. De mutatiehotspot bevindt zich ter hoogte van codon 858 tot codon 871 (zie figuur 18). Volgens Piazza et al. (2013) komen hier 92% van de mutaties voor. Volgens Makishima et al. (2013) komen deze somatische SETBP1-mutaties voornamelijk voor ter hoogte van p.asp868, p.ser869, p.gly870, p.ile871 en p.asp880. Zoals eerder vermeld leiden mutaties in het SETBP1-gen tot overexpressie van het SETBP1-eiwit, wat op zijn beurt leidt tot onderdrukking van het tumorsuppressor eiwit fosfatase 2A. In tabel 6 is een overzicht te zien van de reeds uitgevoerde studies over dit onderwerp. In figuren 19 en 20 wordt het prognostisch belang weergegeven voor acml- en CMML-patiënten van de SETBP1-mutatie, maar dit geldt eveneens voor de andere ziektebeelden waarmee SETBP1-mutaties gelinkt zijn. Er kan uit deze figuren besloten worden dat patiënten met het mutante gen een duidelijk slechtere prognose hebben (Piazza et al. 2013). Tabel 6: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een SETBP1-mutatie bij specifieke ziektebeelden in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het opsporen van mutaties Ziekte Piazza et al. (2013) Sanger sequencing acml CNL MDS/ CMML Meggendorfer et al. (2013) Sanger sequencing acml MDS/ Laborde et al. (2013) Sanger sequencing CMML PMF Damm et al. (2013) Sanger sequencing CMML MDS AML Voorkomen 17/70 (24,3%) 1/4 (25%) 3/30 (10%) 3/82 (3,7%) 19/60 (31,7%) 20/240 (9,3%) 8/179 (4,5%) 6/236 (2,5%) 12/195 (6,2%) 5/222 (2,2%) 4/241 (1,7%) 32

40 Figuur 19: Vergelijking overlevingskansen tussen acml-patiënten SETBP1 wild type en gemuteerd (Piazza et al. 2013) Figuur 20: Vergelijking overlevingskansen tussen CMML-patiënten wild type en mutant SETBP1 (Damm et al. 2013) 4.2 Genmutaties bij chronische lymfatische leukemie Chronische lymfatische leukemie Chronische lymfatische leukemie (CLL) wordt gekenmerkt door de accumulatie van min of meer rijpe B-lymfocyten. Het is een neoplasma bestaande uit monomorfe kleine, ronde tot licht onregelmatige B-lymfocyten in het perifere bloed, het beenmerg, de milt en de lymfeklieren. Hoewel de maligne lymfocyten bij CLL er normaal uitzien, zijn ze dat niet waardoor ze infecties niet effectief kunnen bestrijden (Swerdlow et al. 2008) Epidemiologie CLL is de meest voorkomende vorm van leukemie bij volwassenen in de Westerse landen en komt zelden voor in de Oosterse landen. Elk jaar wordt bij 2 tot 6 personen op de diagnose van CLL vastgesteld. De gemiddelde leeftijd bij diagnose schommelt tussen de 65 en 75 jaar. CLL wordt zelden gezien bij patiënten jonger dan 30 jaar. Slechts 20 à 30% van de patiënten zijn jonger dan 55 jaar. CLL heeft een man:vrouw ratio van 1,5-2:1. Er kan bijgevolg gesteld worden dat de ziekte ongeveer twee keer zoveel voorkomt bij mannen als bij vrouwen (Swerdlow et al. 2008) Klinische kenmerken In het begin van de ziekte zijn er meestal geen klachten. Bij 70-80% van de patiënten wordt CLL pas vastgesteld naar aanleiding van een toevallig bloedonderzoek. De klachten ontstaan pas na verloop van tijd en kunnen onder andere bleekheid, onverklaarbare vermoeidheid, herhaalde infecties, nachtelijke koorts en zweten, gewichtsverlies, botpijnen, spontane blauwe plekken en bloedingen omvatten (Swerdlow et al. 2008). 33

41 Figuur 21: Chronische lymfatische leukemie - Toename van rijpcellige lymfocyten met kenmerkende marmerstructuur in de kern en verspreid meerdere kapot gestreken cellen: gumprechtse schollen (Scholten 2013) Figuur 22: Chronische lymfatische leukemie - Woekering bij rijpcellige lymfocyten bij CLL (Scholten 2013) Morfologie Het perifere bloed vertoont een karakteristieke morfologie. Enkele typische kenmerken zijn kleine rijpe lymfocyten, geblokt kernchromatine, gumprechtse schaduwen en minder dan 10% prolymfocyten (figuur 21 en 22) (Swerdlow et al. 2008). Het beenmerg wordt gekenmerkt door het voorkomen van meer dan 30% lymfocyten (Swerdlow et al. 2008) Diagnose De diagnose van CLL wordt gebaseerd op de combinatie van het aantal lymfocyten (lymfocytose), cytomorfologisch onderzoek van het bloeduitstrijkje en immunofenotypering van het perifere bloed (Swerdlow et al. 2008). Er zijn echter ziektebeelden die heel erg op CLL kunnen lijken, bijvoorbeeld small lymfatisch lymfoom (Hallek et al. 2008). Het is dus belangrijk om te zoeken naar een nieuwe manier om een vlugge diagnose te stellen zodat een effectieve behandeling gestart kan worden Mutaties die kunnen voorkomen bij CLL TP53-mutatie Bij de regulering van de celgroei en differentiatie zijn zoals eerder vermeld meestal twee groepen genen betrokken, namelijk de proto-oncogenen en de tumorsuppressorgenen. Deze eerste hebben een stimulerende werking in tegenstelling tot de tumorsuppressorgenen, die een remmende werking hebben. Kanker wordt meestal veroorzaakt door mutaties in deze genen. P53, ook gekend als TP53, heeft de functie van een tumorsuppressor. Naast het repareren van fouten in het DNA bij de celdeling, brengt het TP53-gen ook de apoptose op gang als de schade niet meer hersteld kan worden. TP53 stimuleert P21, het BAX-gen en MDM2. Het gen P21 stimuleert de remming van de celcyclus. Wanneer TP53 gemuteerd is en daardoor niet meer aan P21 kan binden, wordt de celcyclus niet meer geremd waardoor er een ongeremde celdeling gaat plaatsvinden. BAX zorgt voor apoptose van cellen met mutaties. Zonder een ongemuteerd TP53-eiwit komt er dus een overvloed aan gemuteerde cellen die niet opgeruimd worden. MDM2 zorgt voor negatieve terugkoppeling. Het breekt TP53-eiwitten af. Wanneer MDM2 een mutatie heeft waardoor het beter of sneller werkt, 34

42 blijven er nauwelijks TP53-eiwitten over. Dit doet de kans op kankerontwikkeling stijgen (Lodish et al. 2013, Ryan et al. 2001, Soussi 2012b, Vogelstein et al. 2000) TP53-eiwit en genstructuur Het TP53-proteïne is een relatief klein fosfoproteïne dat opgebouwd is uit 393 aminozuren en kan in ingedeeld worden in vijf domeinen (zie figuur 23). Het N-terminale einde (aminozuren 1-42) bevat het domein dat het TP53-eiwit als transcriptiefactor activeert en bevat een bindingsplaats voor het MDM2-eiwit. Daarna bevindt zich een proline-rijke regio die een belangrijke functie heeft in de apoptose. De centrale regio (aminozuren ) bevat het domein dat een specifieke DNA-sequentie herkent en eraan bindt. De volgende regio (aminozuren ) bevat het domein dat verantwoordelijk is voor de tetramerisatie van het TP53-eiwit. Tenslotte is er het C-terminale einde van TP53 (aminozuren ) dat een niet-specifiek DNA-domein bevat dat kan binden aan beschadigd DNA. Het humane TP53-gen is gelokaliseerd op de korte arm van chromosoom 17 (17p13) en bestaat uit bp en 11 exonen die coderen voor een eiwit met een moleculair gewicht van 53 kda, die betrokken is bij de regulering van de celcyclus. Figuur 23: Voorstelling van het TP53-gen met aanduiding van de hotspotregio's (Soussi 2012a) Belang van de TP53-mutatie Het TP53-eiwit bevat vijf aminozuren die een hoge mutatiefrequentie (28%) vertonen (zie figuur 23). Deze hotspot regio s situeren zich van exon 5 tot exon 8 (van aminozuur 126 tot 306). De meest frequente mutaties komen voor op de plaatsen waar de lussen van het TP53-eiwit contact maken met het DNA (Lodish et al. 2013). TP53-mutaties worden teruggevonden in ongeveer 50% van de humane kankers (Soussi 2012a). Deze hoge frequentie is logisch aangezien TP53 een erg belangrijk tumorsuppressorgen is dat het herstel van fouten in het DNA reguleert en de apoptose op gang brengt als de schade niet hersteld kan worden. Als het TP53-gen gemuteerd wordt, kan deze functie wegvallen waardoor een overvloed aan beschadigde cellen niet opgeruimd wordt, wat leidt tot kanker. Tabel 7 geeft een overzicht van verschillende studies die het verband onderzocht hebben tussen CLL en TP53-mutaties. 35

43 Tabel 7: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een TP53-mutatie bij CLL in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het opsporen van mutaties Voorkomen van TP53-mutaties bij het optreden van CLL Zenz et al. (2010) Sanger sequencing 8,5 % (28/328) Marinelli et al. (2013) Sanger sequencing 4-37% (afhankelijk van stadium van de ziekte) Dufour et al. (2013) Sanger sequencing 11,4% (52/457) Barnabas et al. (2001) Sanger sequencing 46,7 % (14/30) Pekova et al. (2011) Sanger sequencing 18,4 % (237/1287) TP53-mutaties worden geassocieerd met een slechte prognose voor CLL-patiënten (figuren 24 en 25). Ongeveer 5% van de CLL-patiënten beschikt over een deletie ter hoogte van 17p13-locus, waar het TP53-gen zich bevindt. Deze deletie kan opgespoord worden d.m.v. FISH. Volgens Zainuddin et al. (2011) bezitten 70% van de CLL-patiënten met een 17p-deletie een TP53-mutatie op het resterende allel, wat echter niet kan opgespoord worden met FISH. Nog eens ongeveer 5% van de CLL-patiënten beschikt over een mutant TP53-gen, zonder het voorkomen van de 17p-deletie. Beide groepen worden geassocieerd met het voorkomen van de slechtste prognose onder de CLL-patiënten (Zenz et al. 2010). Figuur 24: Vergelijking van progressie vrije fractie tussen CLL-patiënten met mutant en wildtype TP53 (Zenz et al. 2010) Figuur 25: Vergelijking tussen de overlevingskansen van CLL-patiënten met en zonder mutaties in het TP53-gen (Zenz et al. 2010). 36

44 NOTCH1-mutatie NOTCH1 is een humaan gen dat codeert voor een transmembraan receptor. Deze NOTCH1-receptor functioneert als een ligand geactiveerde transcriptiefactor die extracellulaire signalen overbrengt van het celoppervlak, wat leidt tot verandering van genenexpressie in de kern (figuur 26) (Ferrando 2009). De NOTCH-signaleringspathway wordt geactiveerd door een ligand op een naburige cel en speelt een essentiële rol in het controleren van de proliferatie, differentiatie en overleving van cellen (Willander et al. 2013). De NOTCH1-receptor is een membraangebonden proteïne die bestaat uit een extracellulair, transmembraan en intracellulair domein. NOTCH1-eiwitten spelen een rol bij een waaier aan ontwikkelingsprocessen, bijvoorbeeld bij de regulering van de differentiatie van T-helper cellen. NOTCH1 is een oncogen waarvan constitutieve activering van NOTCH1-signalering de meest prominente oncogene pathway is in T-cel transformatie (Ferrando 2009; Van Vlierberghe en Ferrando 2012). Figuur 26: Schematische voorstelling van de NOTCH1-signalering in T-cel voorlopers. Interactie van de NOTCH1-receptor met het NOTCH ligand delta-like-4. De delta gen familie codeert voor NOTCH liganden die worden gekarakteriseerd door een DSL domein, EGF repeats en een transmembraan domein. Deze NOTCH ligand delta-like 4 zijn aanwezig op het oppervlak van stroma cellen van de thymus. Interactie tussen ligand en receptor leidt tot een dubbele proteolytische splitsing van de receptor in T-cel voorlopers. De eerste splitsing gebeurt door ADAM 10, een metalloprotease en een tweede splitsing gebeurt door de aanwezigheid van een gamma-secretase complex. Vrijstelling van de intracellulaire domeinen van NOTCH1 van het membraan, leidt tot de activatie van de expressie van NOTCH doelgenen in de kern (Van Vlierberghe en Ferrando 2012). 37

45 NOTCH1-eiwit en genstructuur Het NOTCH1-eiwit is opgebouwd uit 2555 aminozuren en heeft een moleculair gewicht van 272,5 kda (Weizmann institute of Science 2013). Gaande van de N- naar de C-terminus bevat de humane NOTCH-receptor vijf regio s (zie figuur 27). Een eerste regio is een variabel aantal (25 tot 36) van epidermale groeifactor(egf)-achtige domeinen. Vele van deze domeinen bevatten calcium bindingsplaatsen. Een tweede regio is de LNR-regio (Lin-12-Notch repeats). De volgende regio is het HD-domein (niet aangegeven op figuur 27), het receptor heterodimerisatie domein. Na dit domein aan het C-terminale uiteinde bevindt zich een specifieke knipplaats. Deze knipplaats wordt zoals eerder vermeld herkend door ADAM 10, een metallo-protease. Daarna volgt het transmembraan (TM) domein. Dit domein bevat eveneens een knipplaats. Deze plaats wordt specifiek herkend door het secretasecomplex, waardoor het intracellulaire domein van de receptor vrijgesteld kan worden. De laatste regio bevat een RAM-, ANK-, NLS-, OPA- en PEST-domein. Het PEST-domein (rijk aan proline (P), glutaminezuur (E), serine (S) en threonine (T)) speelt een belangrijke rol in de eiwitafbraak. Mutaties van dit domein leiden tot een grotere stabiliteit van de receptor, wat samenhangt met kanker (Ranganathan et al. 2011; Sala et al. 2012). Het humane NOTCH1-gen is gelokaliseerd op de lange arm van chromosoom 9 (9q34.3) en bestaat uit bp en 34 exonen (Weizmann institute of Science 2013). Figuur 27: Schematische voorstelling van de domein architectuur van een humane NOTCH1-receptor (Sala et al. 2012) Belang van de mutatie In heel wat studies worden mutaties in het NOTCH1-gen in verband gebracht met CLL (zie tabel 8). Volgens de studies van Willander et al. (2013) en Fabbri et al. (2011) komen de mutaties die gelinkt worden met CLL enkel voor in het PEST-domein (exon 34) (zie figuur 28). Deze heeft een belangrijke rol in de eiwitafbraak. Mutaties in dit domein leiden tot een grotere stabiliteit van de receptor, wat in verband kan gebracht worden met kanker, in dit geval bloedkanker. NOTCH1-mutaties kunnen een belangrijke merker zijn van een ongunstige prognose bij CLL-patiënten (Fabbri et al. 2011). 38

46 Tabel 8: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een NOTCH1-mutatie bij CLL in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het Voorkomen opsporen van mutaties Willander et al. (2013) Sanger sequencing 14/209 (6,7%) Fabbri et al. (2011) Next generation sequencing 8/53 (15,1 %) Del Giudice et al. (2012) Sanger sequencing 25/104 (24%) Figuur 28: Voorstelling NOTCH1-gen en -eiwit met mutatiespectrum bij CLL (Fabbri et al. 2011) 4.3 Genmutaties bij T-cel acute lymfoblastaire leukemie T-cel acute lymfatische leukemie T-cel acute lymfatische leukemie is een kanker van het bloed en beenmerg die wordt gekenmerkt door een overproductie van onrijpe T-lymfocyten. Deze cellen hopen zich op in het beenmerg en verstoren de aanmaak van normale bloedcellen. Een tekort aan rode bloedcellen en bloedplaatjes leidt tot bloedarmoede. Een tekort aan normale leukocyten kan leiden tot een verhoogde vatbaarheid voor infecties. In vergelijking met B-cel leukemie heeft deze leukemie een duidelijk slechtere prognose (Swerdlow et al. 2008) NOTCH1-mutatie belangrijk bij T-ALL In verschillende studies worden mutaties in het NOTCH1-gen naast CLL ook in verband gebracht met het voorkomen van T-ALL (zie tabel 9). Het NOTCH1-gen heeft bij het voorkomen van T-ALL twee mutatiehotspots. Dit in tegenstelling tot bij CLL, waar enkel het PEST-domein als mutatiehotspot wordt aangeduid. Een eerste mutatiehotspot bevindt zich ter hoogte van het sterk geconserveerde HD-domein (exon 26 en exon 27) (zie figuur 29). Mutaties in dit domein leiden tot een verhoogde NOTCH1-splitsing. Deze mutaties kunnen leiden tot een ligand onafhankelijke activatie. De tweede mutatiehotspot bevindt zich ter hoogte van het C-terminaal PEST-domein (exon 34). Mutaties in dit domein leiden tot een grotere stabiliteit van de receptor (Mansour et al. 2006). Uit de analyses van 39

47 de prognostische betekenis van NOTCH1-mutaties in T-ALL is gebleken dat deze mutaties niet geassocieerd worden met een ongunstige prognose. In bepaalde gevallen leiden NOTCH1-mutaties zelfs tot betere prognoses voor de patiënt (Ferrando 2009). Tabel 9: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een NOTCH1-mutatie bij T-ALL in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het Voorkomen opsporen van mutaties Van Vlierberghe and Ferrando (2012) Niet vermeld (Review) 60 % Ferrando (2009) Niet vermeld (Review) 50% Figuur 29: Voorstelling NOTCH1-eiwit met mutatiespectrum bij T-ALL (Zhu et al. 2006) 4.4 Genmutaties bij mantelcellymfoom Mantelcellymfoom Een non-hodgkin-lymfoom (NHL) is een vorm van lymfeklierkanker. Het is een kanker die begint in het lymfestelsel. Het lymfestelsel speelt een belangrijke rol in de afweer tegen ziekteverwekkers. Bij NHL zijn de lymfeklieren groter geworden door een overdreven celwoekering. De toename van het aantal cellen zorgt er voor dat de lymfocyten niet meer optimaal werken, waardoor het lichaam dus een deel van zijn afweersysteem verliest. Er bestaan meer dan 30 verschillende NHL s die zeer verschillend zijn qua gedrag, presentatie in het lichaam en gevoeligheid voor therapie. Een van de vele soorten NHL s is het mantelcellymfoom (MCL). Dit is een zeldzaam voorkomende groep van NHL s (ongeveer 5%). MCL is een B-cel NHL, wat duidt op het feit dat het de B-lymfocyten zijn die ongecontroleerd gaan vermenigvuldigen met de vorming van een lymfoom als gevolg. Het komt meest voor bij mannen ouder dan 60 jaar. De ziekte heet mantelcellymfoom omdat de tumorcellen afkomstig zijn uit de mantelzone van de lymfeklier (Swerdlow et al. 2008). 40

48 4.4.2 NOTCH1-mutatie belangrijk bij MCL Verschillende studies hebben het verband bestudeert tussen het voorkomen van NOTCH1-mutaties en MCL (zie tabel 10). De studies zijn het er allemaal over eens dat de mutatiehotspot zich net zoals bij CLL bevindt ter hoogte van het PEST-domein (exon 34) (zie figuur 30). De meest voorkomende mutaties zijn nonsense mutaties. Hierbij verandert het oorspronkelijke aminozuur in een stopcodon, wat resulteert in een ingekort eiwit met een verhoogde oncogene activiteit. Het PEST-domein speelt een belangrijke rol in de eiwitafbraak. Mutaties in dit domein leiden tot een grotere stabiliteit van de receptor, wat in verband kan gebracht worden met kanker. De aanwezigheid van een NOTCH1-mutatie bij patiënten met MCL wordt geassocieerd met een slechte prognose (zie figuur 31) (Parekh 2012). Tabel 10: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een NOTCH1-mutatie bij MCL in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het Voorkomen opsporen van mutaties Parekh (2012) Sanger sequencing 14/121 (12%) Bea et al. (2013) Sanger sequencing 8/172 (5%) Figuur 30: Voorstelling NOTCH1-eiwit met mutatiespectrum bij MCL (Parekh 2012) Figuur 31: Prognostisch effect van NOTCH1-mutaties bij MCL (Parekh 2012) 41

49 4.5 Genmutaties bij acute myeloïde leukemie Acute myeloïde leukemie Acute myeloïde leukemie (AML) is een vorm van kanker die specifiek de myeloïde cellijn van de witte bloedcellen aantast. AML leidt tot een enorme proliferatie van onrijpe voorstadia van deze cellen in het beenmerg en meestal ook in het bloed. AML is dus het resultaat van genomische veranderingen van een hematopoiëtische progenitor. Deze veranderingen liggen aan de basis van de verstoorde overleving, proliferatie en rijping van voorlopercellen. Het snel doordringen van abnormale cellen in het beenmerg interfereert met hematopoëse. De symptomen van AML worden veroorzaakt door het vervangen van de normale beenmergcellen door leukemische cellen, wat ertoe leidt dat de normale productie van erytrocyten, bloedplaatjes en normale leukocyten in het gedrang komt. AML is een relatief zeldzame aandoening met ongeveer vier nieuwe gevallen per personen per jaar. De incidentie van AML neemt toe met de leeftijd. De aandoening komt voornamelijk voor bij ouderen, de gemiddelde leeftijd van diagnose is 63 jaar. In het AZ Sint-Jan Brugge worden reeds een aantal moleculaire merkers getest bij het vermoeden van de diagnose AML (zie tabel 19). Het is de bedoeling om meer merkers te implementeren voor eenzelfde diagnose, omdat sommige patiënten voor al de andere moleculaire merkers negatief zijn. Het testen van meerdere merkers vergroot dus de kans om tot de juiste diagnose te komen Belangrijke mutaties aanwezig bij AML C-KIT mutatie Verschillende studies hebben het verband onderzocht tussen het voorkomen van AML en c-kit mutaties (zie tabel 11). De meeste studies zijn het er over eens dat de mutatiehotspot zich bevindt ter hoogte van exon 8 en exon 17. Slechts één studie (Hussain et al. 2011) onderzocht exon 11 en concludeerde dat dit de mutatiehotspot is. Deze mutatie werd eerder al besproken (zie ). Tabel 11: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een c-kit-mutatie voornamelijk bij AML in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het Voorkomen opsporen van mutaties My Cancer Genome (2014) Niet vermeld (Review) Exon 8: 1,8% Exon 17: 6,2% Li et al. (2013) sequencing of capillary electrophoresis (CE) 6/78 (7,7%) Ding et al. (2012) Direct sequencing Exon 8: 6/656 (0,9%) Exon 17: 33/656 (5,0%) Pollard et al. (2010) Denaturing high-performance liquid chromatography 38/203 (18,7%) Hussain et al. (2011) Sequencing Exon 11: 8/51 (15,7%) Hussain et al. (2009) Sequencing Exon 8: 23/90 (25,6 %) Exon 17: 31/90 (34,4%) Schnittger et al. (2006) Sequencing 33/1940 (1,7%) 42

50 Er zijn twee chromosomale afwijkingen die voorkomen bij AML die een aparte groep AML definiëren. Een eerste afwijking is de translocatie t(8;21)(q22;q22). Het resultaat hiervan is het fusiegen AML1-ETO. Er werd aangetoond dat dit gen de differentiatie, proliferatie en apoptose beïnvloedt (Schnittger et al. 2006). Een tweede belangrijke chromosomale afwijkingen is een inversie, namelijk inv(16)(p13q22). De inversie bevindt zich ter hoogte van chromosoom 16, waar het DNA-segment vanaf p13 tot q22 volledig omgekeerd ingebouwd is. Deze herschikking leidt tot de verstoring van het MYH11-gen op 16p13 en het CBFβ-gen op 16q22. In beide subgroepen van AML treden veranderingen op ter hoogte van de CBF-transcriptiefactor: AML1 (CBFα2) in t(8;21) en CBFβ in inv(16). Dit leidt tot de gemeenschappelijke nomenclatuur van Core-binding-factor (CBF)-leukemieën voor inv(16)- en t(8;21)-positieve AML (Schnittger et al. 2006). Deze twee subgroepen worden beiden in verband gebracht met een relatief goede prognose voor de patiënt (Cho et al. 2003; Van der Reijden et al. 2010). Volgens de studie van Schnittger et al. (2006) worden c-kit-mutaties in exon 8 vooral teruggevonden bij CBFβ-MYH11 positieve AML-patiënten. Terwijl c-kit-mutaties in exon 17, voornamelijk ter hoogte van asparaginezuur 816, hoofdzakelijk worden teruggevonden bij AML1-ETO positieve AML-patiënten. In deze studie werd eveneens aangetoond dat AML1-ETO-positieve AML-patiënten met een c-kit-asp816 mutatie behoren tot een subgroep met een ongunstige prognose. Er kan dus gesteld worden dat een c-kit-asp816 mutatie een betrouwbare moleculaire merker is voor het identificeren van patiënten met een slechte prognose binnen een prognostisch gunstige AML-groep. Dit wordt eveneens aangetoond in de studie van Boissel et al. (2006). In de studie van Schwind et al.(2013) wordt de prognostische waarde onderzocht van c-kit-mutaties bij CBFβ-MYH11 positieve AML-patiënten. Hier wordt net zoals bij AML1-ETO-positieve AML-patiënten, besloten dat deze subgroep van AML geassocieerd wordt met een slechte prognose. Terwijl in de studie van Boissel et al. (2006) wordt aangetoond dat er geen prognostisch verschil bestaat tussen CBFβ-MYH11 positieve AML-patiënten met en zonder c-kit-mutatie DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3A (DNMT3A)-mutatie DNA-methylatie is een epigenetische modificatie die een cruciale rol speelt in diverse biologische processen, zoals transcriptionele repressie van genen en transposon silencing. Bovendien zijn afwijkende DNA-methylatie patronen gerapporteerd in vele tumoren en ziekten bij mensen. In het humaan genoom worden cytosine residuen van CpG dinucleotide sequenties gemodificeerd tijdens de post-replicatie door DNA-methylatie. Ongeveer 70%-80% van de CpG dinucleotiden zijn gemethyleerd. CpG dinucleotide sequenties zijn regio s van het DNA waar een cytosine nucleotide voorkomt naast een guanine nucleotide. Het DNMT3A-gen codeert voor een DNA-methyltransferase waarvan gedacht wordt vooral te functioneren in de novo methylatie (Umehara et al. 2013). 43

51 DNMT3A-eiwit en genstructuur Het DNMT3A-eiwit is opgebouwd uit 912 aminozuren en heeft een moleculair gewicht van ongeveer 102 kda. Het eiwit is een heterotetrameer dat samengesteld is uit één DNMT3A-homodimeer en twee DNMT3L-subunits. Het eiwit is terug te vinden in de nucleus en in het cytoplasma (Weizmann Institute of Science 2013). Het humane DNMT3A-gen is gelokaliseerd op de korte arm van chromosoom 2 (2p23.3) en bestaat uit bp en 23 exonen (Weizmann Institute of Science 2013) Belang van de mutatie DNMT3A-mutaties worden vooral in verband gebracht met AML en in mindere mate met. In tabel 12 wordt een overzicht gegeven van verschillende publicaties waarin dit verband wordt bestudeerd. De verschillende studies zijn het erover eens dat de mutatiehotspot zich bevindt ter hoogte van aminozuur 882 (zie figuur 32). Hier bevinden zich 50 tot 60% van de mutaties. De meest voorkomende mutatie is p.arg882his. Dit aminozuur maakt deel uit van het katalytisch centrum. Er kan dus gesteld worden dat DNMT3A-mutaties de katalytische activiteit aantasten, maar wat hun effect juist is op de DNA-methylatie in de cel is nog niet duidelijk (Kim et al. 2013). Patiënten met een DNMT3A-mutatie hebben een duidelijk slechtere prognose dan patiënten zonder mutatie (Ley et al. 2010). Tabel 12: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een DNMT3A-mutatie bij en AML in verschillende publicaties Publicatie Tefferi et al. (2011) Gebruikte techniek voor het opsporen van mutaties Niet vermeld (Review) PV PMF Ziekte 7% 6% 14% Voorkomen Hou et al. (2012) Direct sequencing AML 70/500 (14%) Shivarov et al. (2013) Niet vermeld AML 22,5 % (variërend van 14% (vergelijking van negen studies) tot 34,2%) 44

52 Figuur 32: Mutatiespectrum van het DNMT3A-gen (Roller et al. 2013) Isocitraat dehydrogenase mutatie Er bestaan meerdere isovormen van het enzym isocitraat dehydrogenase (IDH). Isocitraat dehydrogenasen katalyseren de oxidatieve decarboxylering van isocitraat naar 2-oxoglutaraat, wat op zijn beurt verder omgezet wordt tot α-ketoglutaraat (α-kg) en CO 2 (zie figuur 33). Deze enzymen kunnen ingedeeld worden in twee verschillende subklassen. De eerste subklasse maakt gebruik van NAD + als elektronacceptor, terwijl de tweede subklasse gebruik maakt van NADP + als elektronacceptor. Het humane isocitraat dehydrogenase bestaat in drie isovormen namelijk IDH1, IDH2 en IDH3. IDH1 en IDH2 zijn twee NADP + -afhankelijke isocitraat dehydrogenasen, waarvan één terug te vinden is in de mitochondriën (IDH2) en de andere hoofdzakelijk terug te vinden is in het cytoplasma (IDH1). De isovorm IDH3 is een NAD + -afhankelijke isocitraat dehydrogenasen dat voorkomt in de mitochondriën (Yang et al. 2012). 45

53 Figuur 33: Schematische voorstelling van de productie en het gebruik van α-ketoglutaraat (α-kg) in humane cellen. Vier enzymen (IDH1, IDH2, IDH3 en glutamaat dehydrogenase (GDH)) kunnen α-kg produceren. Dit α-kg wordt gebruikt in vier afzonderlijke pathways (Yang et al. 2012) Isocitraat dehydrogenase-eiwit en genstructuur Het IDH1-eiwit is opgebouwd uit 414 aminozuren en heeft een moleculair gewicht van ongeveer 46,6 kda. Het is een homodimeer waarvan elke subunit bindt met één magnesium- of mangaan-ion. Het eiwit komt voor in het cytoplasma en in de peroxisomen (Weizmann Institute of Science 2013). Het humane IDH1-gen is gelokaliseerd op de lange arm van chromosoom 2 (2q34) en bestaat uit bp en 10 exonen (Weizmann Institute of Science 2013). Het IDH2-eiwit is opgebouwd uit 452 aminozuren en heeft een moleculair gewicht van ongeveer 51 kda. Het is een homodimeer waarvan elke subunit eveneens bindt met één magnesium- of mangaan-ion. Het eiwit komt in tegenstelling tot het IDH1-eiwit voor in de mitochondriën (Weizmann Institute of Science 2013). Het humane IDH2-gen is gelokaliseerd op de lange arm van chromosoom 15 (15q26.1) en bestaat uit bp en 11 exonen (Weizmann Institute of Science 2013) Belang van de mutatie Mutante IDH1- en IDH2-enzymen beschikken over de capaciteit om α-kg om te zetten in 2-hydroxyglutaraat (2-HG), een klein onco-metaboliet. De aanwezigheid van mutante IDH1- of IDH2-eiwitten resulteert in verhoogde hoeveelheden 2-HG. Deze verhoging leidt op zijn beurt tot een verandering van een aantal downstream cellulaire activiteiten. 2-HG is bijvoorbeeld een competitieve inhibitor voor α-kg voor de binding aan verschillende histon demethylasen, bijvoorbeeld KDM (histon lysine demethylase). Door deze inhibitie ontstaat een sterk afwijkend histon methylatie profiel. Het metaboliet 2-HG remt eveneens de activiteit van de TET1 en TET2 hydroxymethylasen, wat opnieuw resulteert in een verandering van de epigenetische regulatie. Deze epigenetische veranderingen kunnen leiden tot een verandering in differentiatie en bijgevolg tot tumorvorming (zie figuur 34) (Prensner and Chinnaiyan 2011; Yang et al. 2012). 46

54 Figuur 34: IDH1/2-mutaties inhiberen zowel histon- als DNA-demethylaties en leiden tot epigenetische veranderingen, wat op hun beurt kan leiden tot verandering in differentiatie en tumorvorming (Yang et al. 2012). Verschillende studies hebben het verband onderzocht tussen het voorkomen van deze mutaties en het voorkomen van bepaalde specifieke bloedkankers (zie tabel 13). Tabel 13: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een IDH1/IDH2-mutatie voornamelijk bij AML in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het Mutatie Voorkomen opsporen van mutaties Ashraf et al. (2013) allele-specifieke oligonucleotide-pcr IDH2 22/120 (18%) Shih et al. (2012) Niet vermeld (Review) IDH1/IDH % Patel et al. (2011) Sanger sequencing IDH1 IDH2 Paschka et al. (2010) Denaturerende HPLC IDH1 IDH2 12/199 (6%) 4/199 (4%) 61/806 (7,6%) 70/806 (8,7%) De meest voorkomende mutaties in het IDH1-gen bevinden zich ter hoogte van het arginineresidu 132. Dit oorspronkelijke arginine wordt vaak omgezet in histidine, cytosine, serine, glycine of leucine. De meest voorkomende IDH2-mutatie is het arginineresidu 172 dat verandert in een lysine. Andere vaak voorkomende mutaties worden weergegeven in tabel 14. Het voorkomen van een IDH1- en/of IDH2-mutatie wordt geassocieerd met een slechte prognose (Paschka et al. 2010). Tabel 14: De meest voorkomende mutaties in het IDH1- en IDH2-gen met betrekking tot AML, met in het vet aangeduid de meest voorkomende mutaties (Paschka et al. 2010; Patel et al. 2011a; Patel et al. 2011b; Ashraf et al. 2013) IDH1 c.368g>a (p.gly123glu) c.392_296delinstcctg (p.gly131_arg132delinsvalleu) c.395g>a (p.arg132his) c.394c>t (p.arg132cys) c.394c>a (p.arg132ser) c.394c>g (p.arg132gly) c.395g>t (p.arg132leu) c.394_395delinsga (p.arg132glu) IDH2 c.419g>a (p.arg140gln) c.515g>a (p.arg172lys) 47

55 ASXL1-mutatie Het ASXL1-gen werd eerder al nader toegelicht bij het voorkomen van mutaties bij en MDS/ (zie ). Naast het voorkomen van ASXL1-mutaties bij deze aandoeningen is het belangrijk te vermelden dat mutaties in dit gen eveneens aanwezig zijn bij AML (zie tabel 15). De mutatiehotspot van het ASXL1-gen bij AML bevindt zich eveneens ter hoogte van exon 12 en mutaties in deze hotspot resulteren net zoals bij de andere diagnosen in een verstoring van het PHD-domein, wat leidt tot afwijkende DNA-methylaties en histonwijzigingen (Schnittger et al. 2013). Het voorkomen van ASXL1-mutaties bij AML-patiënten wordt geassocieerd met een slechte prognose (zie figuur 35). Tabel 15: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een ASXL1-mutatie bij AML in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het opsporen van mutaties Schnittger et al. (2013) Sanger sequencing 127/740 (17,2%) Gelsi-Boyer et al. (2012) (vergelijking van 19 studies) Niet vermeld Secundair AML De novo AML Voorkomen 30/99 (30,3%) 130/2000 (6,5%) Figuur 35: Vergelijking overlevingskansen tussen AML-patiënten en gemuteerd ASXL1-gen (Schnittger et al. 2013) CSF3R-mutatie Deze mutatie werd eveneens eerder al nader toegelicht, namelijk bij het voorkomen van, MDS en MDS/ (zie ). Naast het voorkomen van CSF3R-mutaties bij deze diagnosen is het belangrijk te vermelden dat mutaties in het CSF3R-gen eveneens in verband gebracht worden met AML (zie tabel 16). De mutatiehotspot voor het voorkomen van CSF3R-mutaties bij AML-patiënten bevindt zich volgens Beekman et al. (2013) ter hoogte van exon 14. Mutaties ter hoogte van dit exon resulteren in verhoogde niveaus van CSF3R. Het proto-oncogen wordt omgezet in een oncogen dat de vorming van kanker stimuleert door overactivatie (Beekman et al. 2013; Gotlib 2013). Over de prognostische waarde van deze mutaties bij AML-patiënten is nog weinig gekend. 48

56 Tabel 16: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een CSF3R-mutatie bij AML in verschillende publicaties Publicatie Sano et al. (2013) Aref et al. (2014) Beekman et al. (2013) Gebruikte techniek voor het opsporen van mutaties Voorkomen Next generation sequencing De novo AML 5/376 (1,3%) Sequencing De novo AML Secundair AML Niet vermeld (Review) De novo AML Secundair AML 2/159 (1,2%) 19/23 (78,2%) 0% 80% 4.6 Genmutaties bij large granulaire lymfocytaire leukemie Large granulaire lymfocytaire leukemie Large granulaire lymfocytaire (LGL) leukemie is een type chronische leukemie van de lymfocyten. LGL wordt gekarakteriseerd door grotere lymfocyten, die duidelijke korrels bevatten. Er zijn twee types van LGL-leukemie: T-LGL waarbij T-lymfocyten uitgroeien tot kankercellen en NK-LGL waarbij NK-lymfocyten uitgroeien tot kankercellen. Ongeveer 2 tot 5 procent van de chronische lymfoproliferatieve aandoeningen betreft LGL. De ziekte treft zowel mannen als vrouwen met een gemiddelde leeftijd van 60 jaar. Bij het optreden van LGL neemt het aantal abnormale cellen in het bloed toe, terwijl het aantal normale witte bloedcellen daalt. Hierdoor kan het lichaam minder goed infecties bestrijden (Loughran 2012). Voor het stellen van de diagnose LGL worden momenteel nog geen testen uitgevoerd in het AZ Sint-Jan Brugge. Er dient dus gezocht te worden naar moleculaire merkers die in aanmerking komen om op een snelle en efficiënte manier de diagnose van LGL vast te stellen Signaaltransducer en activator van transcriptie 3 gen (STAT3)-mutatie belangrijk bij LGL Het proteïne gecodeerd door het STAT3-gen behoort tot de STAT-eiwitfamilie. STAT staat voor Signal Transducer and Activator of Transcription. Deze naam geeft de dubbele functie van deze moleculen weer, namelijk het doorgeven van signalen in een cel en het initiëren van transcriptie van genen. Als reactie op de werking van cytokinen en groeifactoren, worden de STAT-moleculen gefosforyleerd door de receptor geassocieerde kinasen. Het STAT3-eiwit wordt geactiveerd door fosforylatie van tyrosine 705 als reactie op verschillende groei- en transcriptiefactoren. Het reguleert de expressie van diverse genen en speelt dus een belangrijke rol in vele cellulaire processen zoals celgroei en apoptose. STAT3 is een oncogen en kan oncogenesis bevorderen wanneer het constitutief actief is (zie figuur 36) (Weizmann Institute of Science 2013). 49

57 Figuur 36: Autocriene of paracriene signalen activeren tyrosine kinase groeifactorreceptoren, cytokinereceptor geassocieerde Janus-familie kinasen (JAKs) en SRC tyrosine kinasen. Deze activeren op hun beurt STAT3 door fosforylatie van tyrosine 705. In getransformeerde cellen kan STAT3 ook geactiveerd worden door constitutief actieve nietreceptortyrosinekinasen zoals SRC en ABL. Na de tyrosinefosforylering gaan de STAT3-moleculen dimeriseren, waarna ze zich verplaatsen naar de kern, waar ze de transcriptie kunnen activeren. De STAT3-signalering wordt normaal sterk gereguleerd door een aantal remmende moleculen (vb. SOCS-eiwitten). In kankercellen gaat deze sterke controle echter verloren, waardoor een overactieve receptor of niet-receptor tyrosinekinasen continu STAT3 fosforyleren en activeren. Wat resulteert in continue stimulatie van de genenexpressie (Yu et al. 2007) STAT3-eiwit en genstructuur Het STAT3-eiwit bestaat uit 770 aminozuren en heeft een moleculair gewicht van 88 kda. Het gen is opgebouwd uit vijf verschillende domeinen (zie figuur 37). De twee belangrijkste domeinen zijn het DNA-bindingsdomein en het Scr Homology 2 (SH2)-domein. Dit eerste is een onafhankelijk gevouwen eiwitdomein met ten minste één motief dat dubbel- of enkelstrengig-dna herkent. Het DNA-bindingsdomein herkent een specifieke DNA-sequentie of heeft een algemene aantrekkingskracht tot DNA. Het tweede belangrijke domein (aminozuren ) is een fosfotyrosine bindende module die in veel signaalmoleculen aanwezig is. Het behoort tot de groep eiwitten die een rol spelen in de signaalcascade. Het SH2-domein maakt het mogelijk om de proteïnen die deze domeinen bevatten te laten migreren naar een gefosforyleerd tyrosineresidu van andere proteïnen. Het domein interageert met eiwitten via de gefosforyleerde tyrosine van het eiwit. Er is bijgevolg een associatie tussen die eiwitten van het SH2-domein wat resulteert in een verdere signaalcascade (Makishima et al. 2013). Het humane STAT3-gen is gelokaliseerd op de lange arm van chromosoom 17 (17q21.2) en bestaat uit bp en 24 exonen (Weizmann Institute of Science 2013). 50

58 Figuur 37: Opbouw van het STAT3-eiwit met het mutatiespectrum (Makishima et al. 2013) Belang van de mutatie Recent werd aangetoond dat mutaties in het STAT3-gen in verband kunnen gebracht worden met het voorkomen van T-LGL en NK-LGL (zie tabel 17). STAT3 is een oncogen waarvan de activatie een centrale rol speelt in de celsignalering van verschillende kankers. Bij LGL komen mutaties in het STAT3-gen voor in een zeer nauwe regio, namelijk het SH2-domein (aminozuur ) (zie figuur 37). Dit domein speelt een sleutelrol in de functie van het gen. Mutaties in deze regio kunnen leiden naar constitutieve activiteit van STAT3 en wat leidt tot overactivatie, wat op zijn beurt oncogenese bevordert. Uit de studie van Jerez et al. (2012) kan besloten worden dan een STAT3-mutatie bij LGL-patiënten niet als een belangrijke prognostische merker kan beschouwd worden. Tabel 17: Vergelijking voorkomen van aanwezigheid van een STAT3- mutatie bij LGL en NK-LGL in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het Ziekte Voorkomen opsporen van mutaties Koskela et al. (2012) Next generation sequencing LGL 31/77 (40%) Jerez et al. (2012) Sanger sequencing T-LGL NK-LGL 32/120 (27%) 15/50 (30%) Fasan et al. (2013) Niet vermeld (Review) T-LGL NK-LGL 40% 30% Qiu et al. (2013) Sequencing T-LGL 6/28 (21,4 %) 4.7 Genmutaties bij lymfoplasmocytair lymfoom Lymfoplasmocytair lymfoom Het lymfoplasmocytair lymfoom (LPL) is een subtype van de mature B-cel neoplasieën. Mature B-cel neoplasieën zijn tumoren van de rijpe of mature B-cellen. Ze ontstaan doordat er een fout optreedt in de celdeling van de B-lymfocyten. De cellen zullen niet meer uitrijpen maar blijven ongecontroleerd delen of sterven niet meer af. Er is een ongecontroleerde proliferatie van lymfocyten in het beenmerg en ook in de lymfeklieren. De maligne cellen verplaatsen zich soms via lymfe naar andere plaatsen in het lichaam. Vaak gaat de ziekte gepaard met een paraproteïnemie van het IgM-type, waarbij er een zeer grote hoeveelheid antistoffen van het type IgM in het bloed 51

59 circuleren. Deze antistoffen, ook wel M-proteïnen genoemd, worden geproduceerd door de tumorcellen. Wanneer er dergelijke monoklonale IgM gammopathie aanwezig is, spreekt men van Waldenström macroglobulinemie (WM), ook wel de ziekte van Waldenström genoemd (Swerdlow et al. 2008) Epidemiologie LPL komt voornamelijk voor bij volwassenen met een gemiddelde leeftijd van 60 jaar. De ziekte komt vaker voor bij mannen dan bij vrouwen (Swerdlow et al. 2008) Klinische kenmerken Door de ontwikkeling van maligne cellen en door de productie van het IgM ontwikkelen veel patiënten allerhande symptomen. De meest voorkomende symptomen zijn algemene zwakte en vermoeidheid, die beide het gevolg zijn van een onderliggende anemie. Hyperviscositeit van het bloed komt voor in 30% van de gevallen. Door de grote hoeveelheden paraproteïnen kan het bloed stroperig worden waardoor het minder goed circuleren in de kleine bloedvaatjes. Dit kan leiden tot onder andere hartfalen, moeheid, daling van de eetlust en kortademigheid (Swerdlow et al. 2008) Morfologie Het bloedbeeld wordt meestal gekenmerkt door agglutinatie van de erytrocyten in samenhang met een M-proteïne, terwijl ook afwijkende circulerende lymfatische cellen aangetroffen kunnen worden. Vaak is er dan sprake van een mengbeeld van kleine lymfocyten met een grof chromatine en middelgrote lymfocyten met veel meer cytoplasmaontwikkeling Diagnose De diagnose van LPL/WM is zowel op morfologisch, immunofenotypisch en cytogenische eigenschappen moeilijk te onderscheiden van andere B-cel lymfomen en andere celplasma myelomen zoals milt marginale zone lymfomen. Een specifieke merker om LPL immunofenotypisch te definiëren ontbreekt dus. Een andere manier om de diagnose van LPL te stellen zou de aanwezigheid van het IgM-paraproteïne kunnen zijn, maar ook dit kenmerk is niet specifiek voor LPL, aangezien het in veel lymfoïde neoplasma s voorkomt. Hieruit kan besloten worden dat het stellen van diagnose LPL vaak gebaseerd is op exclusie (Ondrejka et al. 2013, Xu et al. 2011). Daardoor is het belangrijk om te zoeken naar een nieuwe manier om een vlugge diagnose te stellen zodat een effectieve behandeling gestart kan worden. 52

60 4.7.2 Myeloid differentiation primary response gene 88 (MYD88) mutatie Het MYD88-gen codeert voor een cytolisch adaptereiwit dat een centrale rol speelt bij het aangeboren en adaptief immuunsysteem. Dit eiwit functioneert als een essentiële signaalomvormer in de interleukine-1 en Toll-like receptor signaleringstrajecten (zie figuur 38). Deze trajecten regelen de activatie van de talrijke pro-inflammatoire genen (Medicine 2013). Interleukinen (IL) zijn een groep cytokinen die geproduceerd worden door geactiveerde macrofagen en lymfocyten gedurende een immuunrespons. Cytokinen zijn een groep van signaalmoleculen die op grote schaal worden gebruikt voor de mobiele communicatie doorheen het lichaam. Het doel van de interleukineproductie is dan ook om met andere leukocyten te communiceren. Interleukinen stimuleren leukocyten om tot proliferatie en differentiatie over te gaan. Toll-like receptoren (TLRs) zijn een klasse van eiwitten die een rol spelen in het aangeboren afweersysteem. De TLRs bevinden zich op het celoppervlak en functioneren als patroonherkenningsmoleculen voor micro-organismen. TLRs die een ziekteverwekker tegenkomen, kunnen na herkenning een reactie in de cel opwekken wat leidt tot de productie van een heel scala aan eiwitten die een functie hebben in de afweer. Figuur 38: MYD88 is het belangrijkste signalerende adaptoreiwit voor Toll-like receptoren (TLRs) (met uitzondering van TLR3 en bepaalde TLR4 signalen), IL-1R en IL-18R. De belangrijkste taak van MYD88 is de activatie van NFκB (nuclear factor-kappab). NFκB is een complex eiwit dat de transcriptie van DNA regelt en speelt eveneens een belangrijke rol in het reguleren van de immuunrespons op infecties (O'Neill and Bowie 2007) 53

61 MYD88-eiwit en genstructuur Het MYD88-eiwit is opgebouwd is uit 296 aminozuren. Het humane MYD88-proteïne kan in drie domeinen worden ingedeeld. Als eerste domein (aminozuren 1-110) is er het N-terminaal einde dat het dood domein wordt genoemd. Dit domein is betrokken bij de regulatie van apoptose. Als tweede is er het intermediair domein (aminozuren ). Dit domein is cruciaal in de TLR-signalering. Als laatste is er het C-terminaal domein (aminozuren ) dat het Toll-interleukine-1-receptor(TIR) domein wordt genoemd. Dit TIR-domein bevat drie sterk geconserveerde gebieden en heeft een functie in de eiwitinteracties tussen TLRs en andere factoren die een rol spelen in de signalering (Watters et al. 2007, Wiersinga and van der Poll 2005). Het humane MYD88-gen is gelokaliseerd op de chromosoom 3 (3p22) en is opgebouwd uit basenparen. Het gen bestaat uit vier exonen Belang van de mutatie De groep van Steven Treon (2012) uit Boston heeft ontdekt dat in de tumorcellen van LPL-patiënten in 91% van de gevallen een puntmutatie is opgetreden in het MYD88-gen, resulterend in een gemuteerd MYD88-eiwit (p.leu265pro). Cellen met dergelijke mutatie krijgen een groeivoordeel ten opzichte van gezonde cellen door de activatie van allerlei andere eiwitten in de cel. Na verloop van tijd vormen deze kwaadaardige cellen de meerderheid in het beenmerg en lymfeklieren. Dit resulteert in klachten zoals bloedarmoede en lymfklierzwellingen. Deze mutatie is een interessant aangrijpingspunt voor gerichte therapie en om de behandeling effectiever te maken (Treon et al. 2012). Tabel 18 geeft een overzicht weer van verschillende studies die hetzelfde verband onderzocht hebben. Uit de tabel kan besloten worden dat de MYD88-mutatie (p.leu265pro) een goede indicator is voor LPL. Er kan eveneens besloten worden dat de Sanger sequencing een minder gevoelige techniek is dan allel specifieke PCR. Tabel 18: Vergelijking voorkomen van een MYD88-mutatie bij Lymfoplasmocytair Lymfoom in verschillende publicaties Publicatie Gebruikte techniek voor het opsporen van mutaties Voorkomen van een MYD88-mutatie bij Lymfoplasmocytair Lymfoom Ondrejka et al. (2013) Allel specifieke PCR 100 % (13/13) Treon et al. (2012) Sanger sequencing 91% (49/54) Xu et al. (2011) Sanger sequencing 90,1% (46/51) Varettoni et al. (2013) Allel specifieke PCR 100 % (58/58) Willenbacher et al. (2013) Sanger sequencing 85,7 % (6/7) 54

62 5 Implementatie van nieuwe mutaties als merkers Uit bovenstaande literatuurstudie kan besloten worden dat een aantal nieuwe moleculaire merkers gevonden zijn die specifiek in verband kunnen gebracht worden met een bepaalde diagnose. Het is belangrijk dat deze merkers opgenomen worden in het routine onderzoek aangezien deze aanleiding kunnen geven tot een versnelde diagnose. Tabellen 19 en 20 geven een finaal overzicht, dus met implementatie van de voorgestelde nieuwe mutaties, van de verschillende testen die bij een specifieke diagnose dienen uitgevoerd te worden. Tabel 19: Overzichtstabel van de reeds uitgevoerde testen en met implementatie van de voorgestelde nieuwe mutatieanalyses die in het AZ Sint-Jan Brugge opgespoord worden bij het vermoeden van specifieke diagnose. De leukemieën en overeenkomstige diagnoses besproken in de tekst zijn in vet aangeduid. Diagnose Reeds uitgevoerde testen Voorstel nieuwe testen ALL Acute lymfatische leukemie B-ALL B-cel acute lymfatische leukemie IGH/IGK klonaliteitsanalyse TCR klonaliteitsanalyse Hemavision kit T-ALL T-cel acute lymfatische leukemie IGH/IGK klonaliteitsanalyse TCR Hemavision kit HOX11 overexpressieanalyse BCR-ABL translocatie NOTCH1-mutatieanalyse AML Acute myeloïde leukemie Alle AML M3 Hemavision kit EVI 1 overexpressieanalyse HEVI/EVI1 BCR (PMC-RARa) IDH1- en IDH2- mutatieanalyse CLL Chronische lymfatische leukemie MDS Myelodysplastisch syndroom MDS/ Myelodysplastische/myeoloproliferatieve neoplasma s Myeloproliferatieve neoplasma Alle CLL RA, RARS, RAEBI, SQ- RAEB II Alle MDS/ acml Atypische chronische myeloïde leukemie CMML Chronische myelomonocytaire leukemie JMML Juveniele myelomonocytaire leukemie CML Chronische myeloïde leukemie CNL Chronische neutrofiele leukemie CEL/HES Chronische eosinofiele leukemie /hypereosinofiel syndroom ET Essentiële trombocytemie IGH/IGK klonaliteitsanalyse IgHV hupermutatieanalys JAK2 V617F mutatieanalyse MPL mutatieanalyse AML EVI 1 overexpressieanalyse JAK2 V617F mutatieanalyse BCR ABL translocatie JAK2 V617F mutatieanalyse Calreticuline mutatieanalyse BCR ABL translocatie BCR ABL translocatie JAK2 V617F mutatieanalyse BCR ABL translocatie TCR FIP1L1/PDGFRα translocatie BCR ABL translocatie JAK2 V617F mutatieanalyse Calreticuline mutatieanalyse TP53-mutatieanalyse SETBP1-mutatieanalyse ASXL1-mutatieanalyse ASXL1-mutatieanalyse SETBP1-mutatieanalyse CSF3R-mutatieanalyse ASXL1-mutatieanalyse MPL-mutatieanalyse 55

63 Tabel 20: Overzichtstabel van de reeds uitgevoerde testen en met implementatie van de voorgestelde nieuwe mutatieanalyses die in het AZ Sint-Jan Brugge opgespoord worden bij het vermoeden van specifieke diagnose - vervolg Diagnose Reeds uitgevoerde testen Voorstel nieuwe testen Myeloproliferatieve neoplasma NHL (B) B-cel Non-Hodgkin-lymfoom NHL (T) T-cel Non-Hodgkin-lymfoom PMF Primaire myelofibrose PV Polytemia vera Alle B-NHL ALCL Anaplastic Large Cell Lymphoma Burkitt DLBCL Diffuse large B-cell lymphoom FL Folliculair lymfoom HCL Haarcelleukemie LPL Lymfoplasmocytair lymfoom MALT Mucosa associated lymphoid tissue lymfoom MCL Mantelcellymfoom SLVL Splenic lymphoma with villous lymphocytes Alle T-LGL T-cel large granulaire lymfocytaire leukemie BCR ABL translocatie JAK2 V617F mutatieanalyse Calreticuline mutatieanalyse JAK2 V617F mutatieanalyse JAK2 exon 12 mutatieanalyse IGH/IGK klonaliteitsanalyse TCR NPM-ALK translocatie IgH-BCL2 translocatie IgH-BCL2 translocatie BRAF V600E mutatieanalyse SOX11 overexpressieanalyse TCR MPL-mutatieanalyse STAT3-mutatieanalyse Opmerking: niet alle besproken moleculaire merkers zijn opgenomen in de tabel, de verklaringen hiervoor zijn te vinden in hoofdstuk III. 56

64 Hoofdstuk II: Materialen en methoden 1 Algemeen DNA-sequencing is het bepalen van de volgorde aan nucleotiden, aangeduid als de basen (adenine, guanine, cytosine en thymine) in een DNA-molecule (zie figuur 39). Hiertoe vertrekt men van het te analyseren DNA-staal waarvan, met behulp van een polymerase ketting reactie (PCR), miljoenen kopieën worden gemaakt van de regio waarin men geïnteresseerd is. Tijdens de voorbereidende PCR wordt een watercontrole meegenomen om contaminatie uit te sluiten. Daarna wordt de amplificatie gecontroleerd met behulp van agarosegelelektroforese, waarna de PCR-producten opgezuiverd worden met ExoSAP-IT. Na het opzuiveren van het bekomen reactieproduct voegt men een mengsel toe van sequentieprimers, een polymerase en zowel fluorescerende dideoxynucleotiden (ddntp) als niet fluorescerende deoxynucleotiden (dntp). Deze ddntp s zijn nucleotiden zonder OH groep op het derde koolstofatoom van deoxyribose. Hierdoor kan het DNA polymerase geen volgende fosfodiësterbinding vormen en kan er dus ook geen nieuw nucleotide worden ingebouwd, waardoor verdere DNA synthese onmogelijk is. Bij het principe van cycle sequencing vindt de sequentiereactie verschillende keren plaats door een opeenvolging van denaturatie, annealing en verlenging in een PCR-toestel. Na een aantal cycli ontstaan er DNA-strengen die telkens 1 bp van elkaar verschillen in lengte. Om vlotte detectie mogelijk te maken worden de dideoxynucleotiden fluorescent gemerkt. In een volgende stap worden de sequentieproducten gezuiverd met behulp van Sephadex kolomzuivering. Hierbij wordt gebruik gemaakt van 96-well gelfiltratie chromatografie met een Sephadex gel. Sephadex wordt gevormd door het crosslinken van dextrine en epichlorohydrine en wordt geleverd als een fijn poeder dat moet worden opgelost in water om een gel te vormen. Deze chromatografie wordt ook wel size exclusion chromatografie genoemd. Tussen de DNA-moleculen en de primers, dntp s of ddntp s is er een sterk verschil in grootte. Hierdoor kunnen de DNA moleculen niet migreren in de poriën van de Sephadexkorrels en migreren ze snel doorheen de gevormde kolom. De kleinere moleculen, zoals primers, dntp s en ddntp s, blijven achter in de poriën. In de laatste stap worden de sequentieproducten via capillaire elektroforese van elkaar gescheiden, waarna de detector telkens het fluorochroom detecteert. Op die manier wordt het bijhorende nucleotide herkend en kan de volledige sequentie van de DNA-streng achterhaald worden. De bekomen resultaten worden geanalyseerd aan de hand van software van DNA-star. 57

65 Figuur 39: Opeenvolging van de verschillende stappen voor het opsporen van mutaties door DNA sequencing. 2 PCR-reactie PCR is een snelle amplificatietechniek die door nabootsing van een natuurlijk proces, namelijk de DNA-replicatie, enorme hoeveelheden DNA kan aanmaken. Met behulp van twee geselecteerde primers, voldoende dntp s en een thermostabiele DNA-polymerase kan een cyclische synthese van DNA worden opgezet, uitgaande van in theorie slechts één enkelstreng. Opeenvolgend wordt de temperatuur ingesteld voor de denaturatie van de DNA-modelsequentie, het hybridiseren van de primers op de enkelstrengen en de werking van de DNA-polymerase. Het gebruik van een thermostabiel polymerase laat toe het proces in een dertigtal cycli te automatiseren. 2.1 Principe De PCR-reactie bestaat uit drie fases. In een eerste fase wordt het dubbelstrengig DNA gedenatureerd, met twee enkelstrengen als resultaat. Dit gebeurt door een temperatuursverhoging tot 95 C. Bij deze temperatuur worden de waterstofbruggen tussen beide ketens verbroken, terwijl de covalente bindingen onaangetast blijven. Deze twee enkelstrengige DNA-ketens dienen als matrijs voor de aanmaak van twee complementaire DNA-ketens. Het enzym dat verantwoordelijk is voor deze aanmaak is het DNA-polymerase. Als polymerase wordt hier gebruik gemaakt van AmpliTaq Gold. Dit is een recombinant, thermostabiel 94 kda DNA-polymerase dat gecodeerd wordt door een gemodificeerde vorm van het Thermus aquaticus DNA polymerase gen dat in een 58

66 E.coli gastheer werd ingebracht (Lawyer et al. 1989). AmpliTaq Gold is een chemisch gemodificeerd AmpliTaq DNA polymerase. De reversibele modificaties houden het enzym inactief op kamertemperatuur. Hoge temperaturen en een lage ph bevorderen de activatie van de enzymactiviteit. De activatie van AmpliTaq Gold DNA Polymerase is afhankelijk van drie parameters, namelijk incubatietemperatuur, incubatietijd en ph. De activatie van het enzym gebeurt door het opwarmen van de enzymreactiemix voor tien minuten bij 95 C. Om het enzym te activeren wordt dus een hotstart toegevoegd aan de PCR-reactie, 95 C gedurende tien minuten (Chen and Janes 2002). Het DNA-polymerase is slechts werkzaam indien het een startpunt vindt in de vorm van een stukje dubbelstrengs DNA. In de PCR wordt hiervoor gebruik gemaakt van primers. Dit zijn kleine stukjes enkelstrengig DNA, meestal ongeveer 20 tot 40 basen lang, die precies complementair zijn aan de uiteinden van het stuk DNA waarin we geïnteresseerd zijn. Deze primers binden tijdens de annealing stap aan het gedenatureerde DNA. Na deze annealing kan het DNA-polymerase beginnen met de aanmaak van een complementaire DNA-streng, met als startpunt het kleine stukje dubbelstrengig DNA ter hoogte van de primer. Zo ontstaan, vanaf de primer, twee nieuwe dubbelstrengige DNA-ketens, volledig identiek aan het oorspronkelijke moedermolecule. Dit hele proces van denaturatie, annealing en verlenging wordt een aantal keren herhaald. De nieuwgevormde DNA-strengen fungeren hierbij in de volgende cyclus als matrijs voor de productie van nieuwe strengen. Bij elke cyclus verdubbelt de hoeveelheid DNA. Er is dus een exponentiële vermenigvuldiging van het op te sporen stukje DNA. Na de laatste PCR-cyclus wordt een extra lange elongatiestap uitgevoerd, die er voor zorgt dat alle geamplificeerde PCR-producten volledig geëlongeerd worden. 2.2 Benodigdheden - Geëxtraheerd template DNA; - Forward en reverse primers (IDT); - Deoxynucleotiden trifosfaten (5 mm per dntp) ; - 10 x PCR-buffer II (zonder MgCl 2 ) (Applied Biosystems); - MgCl 2 (Applied Biosystems, 25 mm); - AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems, 5U/µl); - RNase-vrij water; - Vortex; - Centrifuge (Biofuge); - 96-well plaat; - Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) Gebruikte primers Opmerking: Aan elke specifieke primer van iedere mutatie wordt een universele M13-adapter gekoppeld (tgtaaaacgacggccagt (forward) en caggaaacagctatgac (reverse)). Deze M13-staart is zo ontwikkeld dat hij niet kan binden aan humaan DNA. Hierdoor wordt het mogelijk om bij de sequentiereactie gebruik te maken van een primer homoloog aan de adapteruiteinden, waardoor voor iedere mutatie gebruik gemaakt kan worden van eenzelfde primer. De primers voor het uitvoeren van de mutatieanalyses werden gehaald uit de literatuur met daaraan de adaptersequentie M13 gekoppeld. De primers zoals aangegeven in de literatuur worden weergegeven in tabel

67 Tabel 21: Overzicht gebruikte primers Gen Primers Sequentie (5 -> 3 ) ASXL1-gen (Gelsi-Boyer et al. 2012) CSF3R-gen (Maxson et al. 2013) Forward primer Reverse primer Forward primer (exon 14) Reverse primer (exon 14) Forward primer (exon 17) Reverse primer (exon 17) aggtcagatcacccagtcagtt tagcccatctgtgagtccaactgt ccacggaggcagctttac aaatcagcatcctttgggtg ctgtcacttccggcaacat tggcccaaagacacagtcgt MPL-gen Forward primer agtctgaccctttttgtctcctag SETBP1-gen (Piazza et al. 2013) TP53-gen (Soussi 2012) NOTCH1-gen (Fabbri et al. 2011; Willander et al. 2013) c-kit-gen (Pollard et al. 2010; Kong et al. 2011) DNMT3A-gen (Neumann et al. 2012) IDH1- en IDH2-gen (Paschka et al. 2010) STAT3-gen (Koskela et al. 2012) MYD88-gen (Treon et al. 2012) Reverse primer Forward primer Reverse primer Forward primer exon 5 Reverse primer exon 5 Forward primer exon 6 Reverse primer exon 6 Forward primer exon 7 Reverse primer exon 7 Forward primer exon 8 Reverse primer exon 8 Forward primer exon 26a Reverse primer exon 26a Forward primer exon 26b Reverse primer exon 26b Forward primer exon 27 Reverse primer exon 27 Forward primer exon 34 Reverse primer exon 34 Forward primer (exon 8) Reverse primer (exon 8) Forward primer (exon 17) Reverse primer (exon 17) Forward primer Reverse primer Forward primer - IDH1 Reverse primer - IDH1 Forward primer IDH2 Reverse primer - IDH2 Forward primer Reverse primer Forward primer Reverse primer cacagagcgaaccaagaatg ccactttcaacacagttaggtg tctcgtggtagaaggtgtaactc cacttgtgccctgactttcaac cgcaaccagccctgtcgtctc ggttgcccagggtccccag cggccactgacaaccacccttaacc gccacaggtctccccaaggc ctggggcacagcaggccagtg ggaacctgatttccttactgcc cgaatctgaggcataactgcacc agccccctgtacgaccagta cttgcgcagctcctcctc acacggccagcagatgat gagagttgcggggattgac gtggcgtcatgggcctca tagcaactggcacaaacagc acagctactcctcgcctgtg aaggcttgggaaaggaagc ttcagattctgccctttgaacttg tgaaattcaagtgaattgcagtcc agttagttttcactctttacaa taaaatgtgtgatatccctaga gtgtggttagacggcttccg cccatgtcccttacacacacg ccatttgtctgaaaaactttgct tcacattattgccaacatgactt gctgcagtgggaccactatt tgtggccttgtactgcagag tcccatcggtcaccccaaca gccaggccactgaacagggtg gggatatgctgaactaagttgccac gacgtgtctgtgaagttggcatctc 60

68 2.3 Methode Als eerste stap wordt een mastermix gemaakt. Het volume van de mastermix is afhankelijk van het aantal reacties dat dient uitgevoerd te worden. Er wordt ook altijd rekening gehouden met eventuele pipetteerfouten door ongeveer 10% meer mastermix te maken. De PCR-reactie wordt uitgevoerd in een reactievolume van 25 µl. De mastermix bestaat uit: 16,9 µl RNase-vrij water (of 17.4µl); 2,5 µl 10x PCR-buffer II (zonder MgCl 2 ) ; 2,5 µl MgCl 2 (of 2 µl) ; 1 µl dxtp s; 0,1 µl AmpliTaq Gold. (hoeveelheden vermenigvuldigen met aantal reacties x 1.1) Alle stockoplossingen worden vooraleer ze toegevoegd worden aan de mastermix gevortext en afgecentrifugeerd, uitgezonderd de enzymmix, dewelke enkel wordt afgedraaid. De mastermix wordt bereid in een eppendorf van 1,5 ml. Wanneer de mastermix bereid is, wordt deze opnieuw kort gevortext en afgecentrifugeerd. Vervolgens wordt telkens 23 µl van de mastermix overgebracht in een 96-well plaat waarbij telkens nog 1 µl primer en 1 µl template DNA wordt gevoegd. Tenslotte wordt de plaat met de stalen in het PCR-toestel geplaatst en wordt het gewenste programma gestart. PCR-programma: Afhankelijk van de mutatie wordt gebruik gemaakt tijdens de annealing van 55 C of 60 C. 95 C gedurende 10 minuten 95 C gedurende 30 seconden 60 C gedurende 30 seconden 35 cycli Of 55 C gedurende 30 seconden 72 C gedurende 60 seconden 72 C gedurende 7 minuten 4 C tot gebruik 3 Controle PCR-amplificatie agarosegelelektroforese 3.1 Principe Agarosegelelektroforese wordt in dit werk gebruikt als controle van de PCR-amplificatie. Gelelektroforese is een techniek die macromoleculen van elkaar scheidt op basis van grootte en elektrische lading. Aangezien alle DNA-moleculen eenzelfde massa/lading verhouding hebben gebeurt de scheiding hier enkel op basis van de grootte. Onder invloed van een elektrisch veld gaan de moleculen bewegen in een gel. Negatief geladen moleculen, zoals DNA, bewegen van de 61

69 negatieve pool naar de positieve pool. Grote fragmenten migreren trager door de gel dan kleine fragmenten. Het DNA op gel wordt finaal gevisualiseerd met SybrSafe. Wanneer een 100 bp ladder eveneens aan de elektroforese wordt onderworpen, kan de lengte van de nucleïnezuurfragmenten worden afgeleid. 3.2 Benodigdheden Hulpmiddelen en toestellen - Balans; - Microgolfoven; - Warmwaterbad; - Pipetten en filtertips (Post-PCR); - Gelhouder; - Kam; - Erlenmeyer (250ml); - Maatcilinder (100ml); - Kleefband ; - Stroombron; - Elektroforesekamer; - UV illuminator (Genosmart 2); - Microtiterplaat; - Schaar Reagentia en producten - Agarose (Sigma); - Sybr Safe (Invitrogen); - TBE-buffer 0.5x (Sigma); - PCR-product; bp ladder (Bio-Rad); - Molecular grade water (Sigma); - 5x ladings buffer (Sigma). 3.3 Methode Als eerste stap wordt een agarosegel van 1% gemaakt. Hiervoor wordt 0,8 gram agarose afgewogen in een erlenmeyer, waarna 80 ml TBE 0,5 x buffer wordt toegevoegd. Als laatste wordt 8 µl Sybr Safe toegevoegd. Daarna wordt dit mengsel verwarmd in de microgolfoven tot het kookt en een heldere, homogene oplossing wordt bekomen. Deze oplossing wordt enkele minuten afgekoeld in een warmwaterbad. De erlenmeyer wordt voorzichtig opgemengd, waarna een 3-4 mm dikke gel wordt gegoten in de gelhouder. Als laatste stap worden 1 of 2 brede kammen geplaatst in de gegoten gel. Tenslotte wordt de gel gedurende minimum 20 minuten gestold. Wanneer de gel volledig gestold is, kunnen de kammen en de tape verwijderd worden. Om de elektroforese te starten wordt de gelhouder met gel in de elektroforesekamer, die gevuld is met 0,5x TBE-buffer, gebracht. De te laden reactieproducten worden verdund (1 µl loading buffer + 5 µl reactieproduct) in een microtiterplaat. Na deze verdunning wordt de gel geladen. Dit gebeurt door 6 µl van de verdunde reactieproducten en 5 µl van de 100 bp ladder in de slotjes van de gel te pipetteren. Tenslotte wordt het deksel op de elektroforesekamer geplaatst en de tijdsduur (20 minuten) en het voltage (150 V) ingesteld. Na de elektroforese wordt een foto genomen van het gel met behulp van UV-licht en een digitale camera. 62

70 4 Zuivering van het PCR-product - ExoSAP-it 4.1 Principe Na amplificatie van het DNA is er in het PCR product naast geamplificeerd DNA ook een overschot aan primers en dntp s aanwezig. Deze overschotten hebben een nadelig effect op de sequentiereactie en moeten verwijderd worden. Dit kan met behulp van ExoSAP-IT. Bij deze opzuivering wordt gebruik gemaakt van twee enzymes: Exonuclease I en Shrimp Alkalisch Fosfatase. Het exonuclease I hydrolyseert enkelstrengig DNA, zoals primers, in een 3-5 richting. Hierdoor worden de primers afgebroken tot dntp s. Het Shrimp Alkalisch Fosfatase inactiveert de dntp s door de 5 uiteinden te defosforyleren (zie figuur 40). Figuur 40: Principe ExoSAP-IT (Affymetrix 2013) 4.2 Benodigdheden - PCR-product; - PCR cooler (96 x 0.2 ml); - ExoSAP-IT (100 reactions)(glycerol solutions) (Affymetrix); - centrifuge; - 96-well plaat; - pipetten en filtertips; - Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700). 63

71 4.3 Methode Voor deze procedure wordt een 96-well plaat gebruikt die gedurende de ganse procedure in een koelblok wordt geplaatst. In de 96-well plaat wordt telkens 7 µl PCR-product gevoegd. Daarna wordt 3,5 µl ExoSAP-IT toegevoegd. Tijdens de ganse procedure dient ExoSAP-it in een koelblok gebruikt te worden, aangezien dit product zeer thermogevoelig is. Na het toevoegen van het ExoSAP-IT, wordt de plaat meteen in de thermocycler geplaatst, waar het programma EXOSAP wordt gestart. Programma EXOSAP: 37 C gedurende 30 minuten 80 C gedurende 20 minuten 4 C tot gebruik 5 Sequentiereactie 5.1 Principe Het bepalen van een DNA-sequentie is in dit werk gebaseerd op de enzymatische sequenering volgens Sanger (Sanger en Coulson 1975). De methode is ontwikkeld op de werking van DNA-polymerasen en maakt gebruik van het feit dat het reactiemechanisme van DNA-replicatie de vrije 3 -OH-groep van de DNA-keten nodig heeft voor het inbouwen van een nieuw nucleotide. In de reactiemix zijn zowel niet fluorescerende dntp s als fluorescerende ddntp s aanwezig en dit in een concentratie ten opzichte van elkaar die toelaat dat een keuze tussen de twee types van nucleotides mogelijk is. De sequentiereactie is een PCR-reactie die uitgevoerd wordt met slechts één primer. Er ontstaan PCR-producten van verschillende lengtes, doordat er competitie is tussen deoxynucleotiden en dideoxynucleotiden. Inbouw van een dideoxynucleotide laat geen verdere polymerisatie toe. Bij de annealingtemperatuur van 50 C gaat de primer zich vasthechten aan de template-dna streng. Het AmpliTaq DNA-polymerase zorgt voor de verlenging van de primer door het inbouwen van dntp s of ddntp s. Wanneer een ddntp wordt ingebouwd valt de ketenverlenging stil omdat er geen fosfaatbrug meer kan gevormd worden met het volgende (di)deoxynulcleotide. 5.2 Benodigdheden - Big Dye terminator v1.1 Ready Reaction premix (2.5 x) (Applied Biosystems); - Big Dye terminator v1.1 5x sequencing buffer (Applied Biosystems); - RNase-vrij water; - forward en reverse primers; - 96-well plaat; - opgezuiverd PCR-product; - thermocycler (GeneAmp PCR system 9700); - pipetten en filtertips. 64

72 Tabel 22: Gebruikte primers tijdens de sequentiereactie Primers Sequentie ( 5 -> 3 ) Forward primer Tgtaaaacgacggccagt Reverse primer Caggaaacagctatgacc Door de keuze om gebruik te maken van universele M13 primeruiteinden, kunnen voor iedere mutatie-analyse dezelfde primers gebruikt worden tijdens de sequentiereactie. Alle amplicons worden zowel forward als reverse gesequeneerd. 5.3 Methode Als eerste stap in de sequentiereactie wordt een mastermix gemaakt. Het volume van de mastermix is afhankelijk van het aantal reacties die dienen uitgevoerd te worden. Er wordt ook altijd rekening gehouden met eventuele pipetteerfouten door ongeveer 10% meer mastermix te maken. De sequentiereactie wordt uitgevoerd in een reactievolume van 10 µl. De mastermix bestaat uit : 1 µl BDT Ready Reaction premix (2,5x); 1,5 µl BDT buffer (5x); 1 µl primer (forward of reverse); 5,5 µl RNase vrij water. (hoeveelheden vermenigvuldigen met aantal reacties x 1.1 ) Vervolgens wordt telkens 9 µl van deze mastermix overgebracht in een 96-well plaat. Bij deze mastermix wordt telkens nog 1 µl opgezuiverd PCR-product gevoegd. Waarna de 96-well plaat in de thermocycler wordt geplaatst en het programma wordt gestart. Programma : 96 C gedurende 10 seconden 96 C gedurende 10 seconden 50 C gedurende 10 seconden 60 C gedurende 2 minuten 4 C tot gebruik 25 cycli 65

73 6 Zuivering van de sequentieproducten - Sephadex kolomzuivering 6.1 Principe Na de sequentiereactie moeten resterende dntp s, ddntp s, zouten en andere overschotten van het sequentiereagens verwijderd worden uit het DNA-sequentiereagens. Deze zuivering wordt uitgevoerd door middel van gelfiltratie met Sephadex 50 (Separation Pharmacia Dextran) kolommen. Bij deze vorm van gelfiltratie - ook wel size-exclusion chromatography genoemd- bestaat de kolom uit gecrosslinkte dextraandeeltjes of met andere woorden een gel bestaande uit met poriën bedekte korreltjes. De poriën van dergelijke gelkolommen hebben een zekere diameter. Kleinere moleculen zullen in de poriën vastgehouden worden, terwijl grotere moleculen zoals DNA niet in de poriën passen en de kortste weg langs de met poriën bedekte korreltjes nemen om de kolom te verlaten waarna ze opgevangen worden. Sephadex G-50 Superfine is een gelfiltratiemedium voor onder andere het ontzouten en het verwijderen van eiwitten. Het heeft een cutoff-waarde van molecuulgewicht (Healthcare 2014). Dus moleculen met een moleculair gewicht groter dan Da zullen niet in de poriën passen en zullen dus het snelst elueren. 6.2 Benodigdheden - multiscreen 45µl Column Loader (Millipore); - Sephadex G-50 Superfine; - multiscreen Column Loader Scraper Centrifuge Clear (Millipore); - sequencingproducten; - pipetten en filtertips; - multiscreen HV plaat (Millipore); - lichrosolv water voor chromatografie (Merck); - 96-well microtiterplaat; - 96-well PCR-plaat; - Multiscreen centrifuge Align Frame Blue (Millipore). 6.3 Methode Als eerste stap worden de Sephadex-kolommen aangemaakt. Dit gebeurt door de wellen van de Multiscreen 45 µl Column Loader te vullen met Sephadex G-50. Het teveel aan Sephadex wordt met behulp van de Multiscreen Column Loader Scraper Clear verwijderd (zie figuur 41). Daarna wordt een Multiscreen HV plaat (zie figuur 42) ondersteboven op de gevulde Column Loader geplaatst, waarna het geheel wordt omgedraaid zodat alle Sephadex in de Multiscreen HV plaat is gevallen. Als laatste stap in de vorming van de Sephadex kolommen wordt 300 µl lichrosolv water toegevoegd aan de verschillende wellen. Na 3 uur wellen zijn de kolommen klaar voor gebruik. Om de zuivering te starten wordt de Multiscreen HV plaat op een 96-well microtiterplaat geplaatst met een Multiscreen Align Frame Blue er tussenin (zie figuur 43). Dit geheel wordt gecentrifugeerd bij 2500 rpm gedurende 5 minuten. Daarna wordt de Multiscreen HV plaat op een gelabelde 96-well PCR-plaat geplaatst. Vooraleer de sequencing-producten op de kolommen worden gebracht, wordt aan elk van deze producten 10 µl AD water toegevoegd. Het volledige staal (20 µl) wordt daarna op de overeenkomstige Sephadex kolom gebracht, waarna alles nog eens gecentrifugeerd wordt bij 2500 rpm gedurende 5 minuten. 66

74 Figuur 41: Voorstelling voor het aanmaken van de Sephadex-kolommen (Sheer et al. 1997) Figuur 42: Multiscreen HV plaat (Millipore 2014) Figuur 43: Om de zuivering te starten wordt de Multiscreen HV plaat op een 96- well microtiterplaat geplaatst met een Multiscreen Align Frame Blue er tussenin (Sheer et al. 1997) 7 Capillaire Elektroforese 7.1 Principe Het gezuiverd product van de sequentiereactie wordt geanalyseerd met capillaire elektroforese. De verschillende basen zijn gemerkt met een verschillende dideoxyterminator en zullen bij sequentiebepaling met de ABI 3500xL Genetic Analyzer of ABI3130 Genetic Analyzer licht van een verschillende golflengte fluoresceren (zie figuren 44 en 45). Figuur 44: 3500xL Genetic Analyzer (Life Technologies 2014) Figuur 45: ABI 3130 Genetic Analyzer (Life Technologies 2014) 67

75 7.2 Benodigdheden - gezuiverd sequentieproduct; - plate septa 96-well; - plaathouder; xL Genetic Analyzer of ABI 3130 Genetic Analyzer. 7.3 Methode Op de 96-well plaat met het gezuiverde sequentieproduct wordt een septa geplaatst. De plaat met septa wordt vervolgens in een plaathouder gebracht, waarna de volledige plaat op het toestel wordt geladen. 8 Interpretatie van de sequenties 8.1 Aligneren forward en reverse sequentie Het aligneren van de sequenties gebeurt met het programma SeqMan van DNA-star. De software vergelijkt de bekomen sequenties van de forward en reverse primer met elkaar, zodat één consensus sequentie bekomen wordt. Het programma neemt van de reverse sequentie het complement zodat een sequentie bekomen wordt die identiek zou moeten zijn aan de forward sequentie. Het sequeneren met zowel de forward als de reverse primer leidt meteen tot een extra controle van de reactie. De forward en reverse streng dienen identiek te zijn. Wanneer dit niet het geval is, kan besloten worden dat de reactie niet correct is verlopen. 8.2 Opsporen van mutaties Het opsporen van mutaties gebeurt met dezelfde software als het aligneren van de forward en reverse sequentie, namelijk met SeqMan van DNA-star. Deze software is in staat om de mutaties te detecteren vanaf het moment dat 20% van het gesequeneerde materiaal gemuteerd is. Wanneer dit niet het geval is, wordt de mutatie niet weergegeven. Er kan dus besloten worden dat de gebruikte Sanger sequencing-methode voor de mutatie-analyse een gevoeligheid heeft van 20%. 68

76 Hoofdstuk III: Resultaten en bespreking De resultaten worden besproken per gen waarin mutaties optreden die gelinkt worden met een specifieke vorm van leukemie. De patiëntenstalen werden telkens geselecteerd op basis van hun diagnose zodat de gestelde diagnose overeenstemt met de diagnose waarmee het gen in verband wordt gebracht in de literatuur. Als template DNA werd steeds geïsoleerd DNA uit witte bloedcellen of beenmergcellen gebruikt. De PCR-condities zijn degene zoals beschreven bij Materialen en methoden met een annealingtemperatuur van 60 C, tenzij anders vermeld. In figuur 46 wordt het resultaat gegeven van de agarosegelelektroforese, waarop alle primermixen getest worden op een normaal staal (CG ) en waarbij voor iedere mix de geoptimaliseerde PCR-condities gebruikt werden. Bij ieder gen worden de gevonden mutaties besproken. Een overzicht van alle onderzochte stalen en alle figuren van de gevonden mutaties zijn terug te vinden in de bijlages I en III. 2µl MgCl 2 55 C 2µl MgCl 2 Figuur 46: Overzicht controle van de PCR-amplificatie d.m.v. agarosegelektroforese met optimale PCR-condities voor alle genen. Voor alle genen werd gebruik gemaakt van een annealingtemperatuur van 60 C en een 2,5µl MgCl 2 per reactie, tenzij anders vermeld. 69

77 1 Screening van het MPL-gen 1.1 Methode Het opsporen van MPL-mutaties wordt al uitgevoerd in het labo van AZ Sint-Jan Brugge. Er is dus reeds een methode beschikbaar. Deze methode is volledig gebaseerd op hetzelfde principe, maar aan de gebruikte primers zijn geen M13-sequenties gekoppeld. Dit heeft als nadeel dat bij de sequentiereactie voor ieder gen verschillende forward en reverse primers dienen gebruikt te worden. Aangezien het de bedoeling is om een zo uniform mogelijke methode te ontwikkelen voor het onderzoeken van meerdere mutaties, is het de bedoeling om de methode voor het opsporen van MPL-mutaties ook aan te passen zodat gebruik kan gemaakt worden van de universele forward en reverse primer. Dit wordt mogelijk door aan de reeds gebruikte primers de M13-sequentie te koppelen. Aangezien hier dus met nieuwe primers wordt gewerkt, is het nodig dat deze getest worden en dat de bekomen resultaten vergeleken worden met de resultaten verkregen met de oude primers. De stalen werden uitgezocht op basis van de diagnosen, MDS en AML. Aangezien het hier gaat om een reeds bestaande test, werden voornamelijk de reeds geteste positieve stalen getest met de nieuwe primers. Exon 10 wordt gesequeneerd vanaf p.trp491 tot p.tyr Resultaten Er werden achttien stalen onderzocht op de aanwezigheid van mutaties in het MPL-gen. Hiervan zijn 15 stalen afkomstig van -patiënten, 2 van MDS-patiënten en 1 staal afkomstig van een MDS/-patiënt. In deze stalen werden dertien mutaties gevonden (zie tabel 23). Aangezien hier bewust getest werd op positieve stalen, heeft de mutatiefrequentie weinig betekenis. Tabel 23: Overzicht gevonden mutaties bij het MPL-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur c.1544g>t (p.trp515leu) Missense mutatie 8 1 MDS/ Tryptofaan 515 is belangrijk in het behouden van de correcte positie van het transmembranaire domein van MPL (Lee et al. 2011). Vooral in verband gebracht met ET en PMF: Resulteert in een cytokine onafhankelijke groei, wat resulteert in een constitutieve activatie van de JAK-STAT signaleringspathway (ExPASy 2014). Ja, zowel bij -, MDS- als AMLpatiënten (He et al. 2013) c.1514g>a (p.ser505asn) c.1502t>c (p.val501ala) Missense mutatie Missense mutatie 3 1 MDS Serine 505 heeft eveneens een belangrijke functie in het behouden van de correcte positie van het transmembranaire domein van MPL (Lee et al. 2011). Voornamelijk in verband gebracht met ET: activerende mutatie die MPL-autonome dimerisatie induceert en signaalactivering in afwezigheid van een ligand (ExPASy 2014). Ja, zowel bij, MDS- als AMLpatiënten (He et al. 2013) 1 Niet gekend Slechts in 1 studie, nl. Pietra et al. (2011) 70

78 1.3 Besluit Alle studies, onder andere Lee et al. (2011), zijn het er over eens dat de twee meest voorkomende mutaties zich bevinden ter hoogte van tryptofaan 515 en serine 505. Deze twee mutaties werden in deze studie eveneens gevonden. De derde mutatie, namelijk p.val501ala werd slechts één keer gevonden bij een -patiënt, en dit samen met de p.ser505asn-mutatie (patiënt CI ). De mutatie wordt beschreven in de studie van Pietra et al. (2011). Hier werd deze tweemaal gevonden en dit twee keer in combinatie met een andere mutatie, namelijk samen met p.tyr515leu en p.tyr515arg, maar niet in combinatie met de hier gevonden mutatie. Het verband tussen het samen voorkomen van zowel p.ser505asn en p.val501ala wordt niet beschreven in de literatuur. De bedoeling van deze proefopzet was het nagaan of de nieuwe primers tot dezelfde resultaten leidden als de oude, reeds gebruikte primers. Het resultaat van deze vergelijking is te zien in bijlage II. Er kan besloten worden dat de nieuwe primers dezelfde resultaten opleveren als de oude primers en dat de oude primers, zonder universele M13-sequentie, dus kunnen vervangen worden door de nieuwe primers waaraan wel een universele M13-sequentie gekoppeld is. Er dient wel opgemerkt te worden dat twee van de achttien geteste stalen niet konden vergeleken worden met de oude methode aangezien door een computercrash de oude resultaten niet meer beschikbaar waren. 2 Screening van het IDH1- en IDH2 gen 2.1 Methode Mutaties in het IDH1- en IDH2-gen worden voornamelijk gelinkt met AML. De stalen werden dan ook uitgezocht op deze diagnose. Het IDH1-gen werd gesequeneerd vanaf p.tyr42 tot p.gln138 en het IDH2-gen vanaf p.phe126 tot p.gln178. Het gaat hier net zoals bij het MPL-gen om een vergelijkende studie, namelijk een vergelijking met een eindwerk die eerder al uitgevoerd werd op IDH1 en IDH2 (Genête 2011). 2.2 Resultaten In totaal werden zes stalen afkomstig van AML-patiënten getest op de aanwezigheid van IDH1- en IDH2-mutaties. Twee van deze zes stalen vertonen een mutatie, waarvan één staal eveneens beschikt over een SNP (zie tabel 24). De mutatiefrequentie heeft hier opnieuw weinig betekenis, aangezien het hier opnieuw gaat om een vergelijkende studie. 71

79 Tabel 24: Overzicht gevonden mutaties en SNP s in het IDH1- en IDH2-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur IDH1: c.394c>t (p.arg132 Cys) Missense mutatie IDH1 : c.315c>t (p.gly106 Gly) IDH2: c.419g>a (p.arg140 Gln) SNP (Patel et al. 2011) Missense mutatie 1 AML De aanwezigheid van dergelijke mutatie resulteert in verhoogde hoeveelheden 2-hydroxyglutaraat, wat leidt tot een verandering van een aantal downstream cellulaire activiteiten (Prensner en Chinnaiyan 2011; Yang et al. 2012). 1 AML Opmerking: volledig homozygoot aanwezig 1 AML De aanwezigheid van dergelijke mutatie resulteert in verhoogde hoeveelheden 2-hydroxyglutaraat, wat leidt tot een verandering van een aantal downstream cellulaire activiteiten (Prensner en Chinnaiyan 2011; Yang et al. 2012). Ja, 34,5% van de mutaties in het IDH1-gen bij AML-patiënten (Trust Sanger Institute 2014) Geen effect Ja (Patel et al. 2011) Ja, 74,8% van de IDH2-gemuteerde AML-patiënten (Trust Sanger Institute 2014) Opmerking: - Voor dit gen werden slechts zes stalen onderzocht aangezien vroeger al een eindwerk hierover gemaakt werd in het AZ Sint-Jan Brugge (Genête 2011). Hier wordt enkel gebruik gemaakt van andere primers, namelijk de genspecifieke primers met daaraan M13 gekoppeld. - Er werd bij één patiënt zowel de mutatie c.394c>t(p.arg132cys) gevonden als de SNP c.315c>t(p.gly106gly). Deze combinatie werd in de literatuur eveneens beschreven bij een AML-patiënt (Wagner et al. 2010). Volgens deze studie heeft een Arg132-mutatie geen invloed op de prognose. Dit in tegenstelling tot de IDH1-SNP c.315c>t(p.gly106gly). Het voorkomen van deze SNP duidt volgens deze studie op een ongunstige prognose. Dit is een merkwaardige vaststelling aangezien de eiwitsequentie ongewijzigd blijft. 3 Screening van het TP53-gen 3.1 Methode De patiëntenstalen werden gescreend naar mutaties in exon 5 tot exon 8. Hiervoor werden vier reacties per staal opgezet. Exon 5 wordt gesequeneerd van aminozuur p.tyr126 tot p.asp186, exon 6 vanaf p.leu188 tot p.glu224, exon 7 vanaf p.val225 tot p.ser260 en exon 8 vanaf p.gly262 tot p.arg306. De stalen werden uitgezocht op basis van de diagnose CLL. 3.2 PCR-optimalisatie Initieel werd de PCR-reactie uitgevoerd bij een hybridisatietemperatuur van 60 C. Bij de controle van de amplificatiereactie werd besloten dat de amplificatie van exon 7 niet optimaal was, aangezien bij de meeste reacties geen bandjes te zien waren. Om dit probleem op te lossen werd de PCR-reactie geoptimaliseerd door de geschikte annealingtemperatuur te bepalen. Het PCR-programma werd 72

80 zowel uitgevoerd met 55 C als 60 C als annealingtemperatuur. Aangezien dit niet leidde tot betere resultaten, werd de reactie geoptimaliseerd door het aanpassen van de concentratie MgCl 2. De optimale reactiecondities bleken degene te zijn met een annealingstemperatuur van 60 C en 2 µl MgCl 2, in plaats van 2,5µl MgCl Resultaten Van de 32 geteste stalen werd in vier stalen (12,5%) een mutatie gevonden. Het gaat hier om vier verschillende mutaties (zie tabel 25). Tabel 25: Overzicht gevonden mutaties in het TP53-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur c.733g>a (p.gly245ser) Missense mutatie 1 CLL Leidt tot een structurele verandering waardoor de TP53-bindingsactiviteit veranderd (Pospisilova et al. 2006). Nog maar 1 keer beschreven bij CLL (Pospisilova et al. 2006) c.517g>c (p.val173leu) c.743g>a (p.arg248gln) c.734g>t (p.gly245val) Missense mutatie 1 CLL Onduidelijk (ExPASy 2014) Ja (ExPASy 2014) Missense mutatie 1 CLL Leidt tot een structurele verandering waardoor de TP53-bindingsactiviteit veranderd (Pospisilova et al. 2006). Ja (Pospisilova et al. 2006) Eén van de meest voorkomende TP53-mutaties bij CLL (Hagenkord et al. 2010) Missense mutatie 1 CLL Ongekend Ja maar niet specifiek bij CLL (ExPASy 2014) 3.4 Besluit Zoals in de literatuurstudie reeds besproken werd, hebben patiënten met een deletie ter hoogte van de 17p13-locus, waar het TP53-gen zich bevindt, de slechtste prognose onder de CLL-patiënten. Volgens Zainuddin et al. (2011) bezitten 70% van de CLL-patiënten met een 17p-deletie een TP53-mutatie op het resterende allel. In de hier uitgevoerde studie bedraagt dit 40% (2/5). Dit percentage is niet volledig representatief aangezien er te weinig stalen met een 17p-deletie onderzocht werden. Zainuddin et al. vermelden eveneens in hun studie dat recente studies aantonen dat 3-5% van de CLL-patiënten beschikken over een mutant TP53-gen zonder een 17p-deletie en dat deze TP53-mutaties eveneens leiden tot eenzelfde slechte prognose. In de hier uitgevoerde studie behoren 7,6% (2/26) van de CLL-patiënten tot deze groep, wat hoger is dan de beschreven 3-5%. 73

81 4 Screening van het SETBP1-gen 4.1 Methode De mutatiehotspot van het SETBP1-gen bevindt zich ter hoogte van exon 4. Er wordt gesequeneerd van p.leu790 tot p.gln965. De stalen werden uitgezocht op basis van de diagnosen, MDS en MDS/. 4.2 Resultaten Er werden 21 stalen onderzocht op aanwezigheid van mutaties in het SETBP1-gen. Waarvan 16 stalen afkomstig zijn van MDS/-patiënten, 1 staal van een MDS-patiënt en 4 stalen van een -patiënt. Van deze stalen bezitten zes stalen een mutatie in het SETBP1-gen (28,6%). Er werden twee verschillende mutaties gevonden, namelijk p.gly870ser en p.asp868asn (zie tabel 26). Tabel 26: Overzicht gevonden mutaties bij het SETBP1-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur c.2608g>a (p.gly870ser) Missense mutatie 3 acml 1 CMML c.2602g>a (p.asp868asn) Missense mutatie 1 1 MDS Leidt tot overexpressie van het SETBP1-eiwit, wat leidt tot onderdrukking van het tumorsuppressoreiwit fosfatase 2A (Piazza et al. 2013). Idem Ja, zowel bij acml als bij CMML (Makishima et al. 2013) Ja, zowel bij als bij MDS (Piazza et al. 2013) 4.3 Besluit Volgens Piazza et al. (2013) is één derde van de gevonden mutaties in het SETBP1-gen p.gly870ser en één derde p.asp868asn. De p.gly870ser- en p.asp868asn-mutaties werden hier in de verhouding 4/6 (66,6%) en 2/6 (33,3%) gevonden. Het hier gevonden percentage p.gly870ser is bijgevolg hoger dan in de literatuur beschreven wordt. Er dient opgemerkt te worden dat er slechts een beperkt aantal stalen getest werden, waardoor deze mutatiefrequenties niet volledig representatief zijn. 74

82 5 Screening van het STAT3 gen 5.1 Methode Mutaties in het STAT3-gen worden gelinkt aan LGL. De te onderzoeken stalen werden dan ook gezocht op deze diagnose. Van deze stalen werden mutaties gezocht door het sequeneren van exon 21, vanaf p.gly630 tot p.gly PCR-optimalisatie Initieel werd de PCR-reactie uitgevoerd bij een annealingtemperatuur van 60 C. Bij het uitvoeren van gelelektroforese werden op het gel per laan twee bandjes waargenomen. Dit duidt op het optreden van niet-specifieke bindingen van de primers aan de doelsequentie. Er kan dus besloten worden dat de PCR-reactie dient geoptimaliseerd te worden. Voor het optimaliseren komen een aantal parameters in aanmerking onder andere de magnesiumconcentratie en de cyclustemperaturen. Aangezien volgens de enzymfiche een annealingtemperatuur van 60 C maximaal is en aangezien deze temperatuur hier reeds gehanteerd werd, kan de temperatuur niet als aanpasbare parameter beschouwd worden (Applied Biosystems 2010). Een parameter die wel kan aangepast worden is de magnesiumconcentratie. De initiële reactie werd uitgevoerd met een magnesiumconcentratie van 2,5µl per reactie. Deze reacties werden opnieuw uitgevoerd, maar nu met 1 µl, 1,5 µl en 2 µl magnesiumchloride per reactie. Uit het resultaat van de agarosegelelektroforese kon besloten worden dat bij alle concentraties het niet-specifieke bandje verdwenen was en dat enkel bij de reacties met 2 µl magnesiumchloride alle reacties zijn opgegaan. Voor het uitvoeren van de amplificatiereactie wordt dus gebruik gemaakt van een annealingtemperatuur van 60 C en 2 µl magnesiumchloride per reactie. 5.3 Resultaten In totaal werden zeven stalen onderzocht, allemaal met diagnose LGL. Van deze stalen bleken vier stalen positief te zijn voor mutaties in het STAT3-gen (57,1%) (zie tabel 27). Tabel 27: Overzicht gevonden mutaties in het STAT3-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur c.1919a>t (p.tyr640phe) Missense mutatie 3 LGL De mutatie bevindt zich in het SH2-domein. Dit domein speelt een sleutelrol in de functie van het gen. Mutaties in deze regio kunnen leiden naar constitutieve activiteit van STAT3, wat leidt tot overactivatie, wat op zijn beurt oncogenese bevordert (Jerez et al. 2012). Ja, een van de meest frequent voorkomende STAT3-mutatie bij LGL (samen met p.asp661tyr: 80% van alle gevonden mutaties) (Jerez et al. 2012) c.1981g>t (p.asp661tyr) Missense mutatie 1 LGL Idem Ja (Jerez et al. 2012) 75

83 6 Screening van het DNMT3A gen 6.1 Methode Aangezien mutaties in het DNMT3A-gen voornamelijk in verband worden gebracht met AML en in mindere mate met, werden de stalen op basis van deze diagnosen uitgezocht. De verschillende studies zijn het erover eens dat de mutatiehotspot van het DNMT3A-gen zich bevindt ter hoogte van aminozuur 882. Er werd dan ook gesequeneerd vanaf p.val867 tot p.val912, deze sequentie maakt deel uit van exon 23 van het DNMT3A-gen. 6.2 Resultaten In totaal werden 83 stalen getest op de aanwezigheid van mutaties in het DNMT3A-gen. Drie stalen afkomstig van MDS-patiënten, 2 van MDS/-patiënten, 22 van -patiënten, 1 van een CLL-patiënt, 53 van AML-patiënten en 2 afkomstig van andere diagnosen. Zeven van deze 83 stalen testten positief op een mutatie in het DNMT3A-gen (8,4%) (zie tabel 28). Tabel 28: Overzicht gevonden mutaties in het DNMT3A-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur c.2645g>a Missense mutatie 6 AML Aminozuur 882 is de mutatiehotspot van Ja, 39,6% van de (p.arg882his) DNMT3A. Dit aminozuur maakt deel uit van het mutaties in het katalytisch centrum. Er kan dus gesteld worden DNMT3A-gen bij dan DNMT3A-mutaties de katalytische AML-patiënten activiteit aantasten, maar wat hun effect juist (Trust Sanger is op de DNA-methylatie in de cel is nog niet Institute 2014) duidelijk (Kim et al. 2013). c.2644c>t Missense mutatie 1 AML Mutaties ter hoogte van dit aminozuur tasten Ja, 18,5% van de (p.arg882cys) de katalytische activiteit aan, maar wat hun mutaties in het effect juist is op de DNA-methylatie in de cel is DNMT3A-gen bij nog niet duidelijk (Kim et al. 2013). AML-patiënten (Trust Sanger Institute 2014) 76

84 7 Screening van het CSF3R-gen 7.1 Methode Aangezien het CSF3R-gen voornamelijk gelinkt wordt aan, MDS, /MDS en AML, worden stalen uitgezocht van patiënten met een van deze diagnosen. Van de verschillende stalen werd zowel exon 14 (van p.ala576 tot p.pro621) en exon 17 (van p.asp681 tot p.glu808) onderzocht, aangezien deze twee exonen beschreven worden als mutatiehotspots. 7.2 PCR-optimalisatie Bij het testen van de stalen met de standaardinstellingen van het PCR-programma, namelijk met een annealingtemperatuur van 60 C, werd besloten dat met beide primermixen, zowel met die voor het amplificeren van exon 14 als voor het amplificeren van exon 17, geen goede amplificatie plaatsvond. Dit kon besloten worden na controle van de PCR-reactie met agarose gelelektroforese. Een belangrijk onderdeel van de optimalisatie van de PCR-reactie is het analyseren bij welke annealingtemperatuur de DNA-amplificatie optimaal is. Bij een hoge annealingtemperatuur zal de selectiviteit van de primers toenemen, maar bij een te hoge annealingtemperatuur zullen de primers uiteindelijk niet meer optimaal binden aan het DNA. Een te hoge temperatuur kan eveneens leiden tot inactivatie van het gebruikte polymerase. In de ideale situatie is de annealingtemperatuur laag genoeg om efficiënte primerhybridisatie met de doelsequentie te garanderen, maar ook hoog genoeg om niet-specifieke bindingen te reduceren, zodat de kans op onspecifieke producten zo klein mogelijk is. Aangezien bij de controle door middel van agarosegelelektroforese geen bandjes werden gedetecteerd bij een annealingtemperatuur van 60 C, kan besloten worden dat de primers niet optimaal binden aan het DNA, zodat geen verlenging kan optreden. De reactie werd opnieuw uitgevoerd maar nu bij een lagere annealingtemperatuur van 55 C. Na het amplificeren werd opnieuw een controle uitgevoerd waaruit kon besloten worden dat bij deze temperatuur wel een efficiënte primerhybridisatie met de doelsequentie is opgetreden. Deze annealingtemperatuur is onlogisch aangezien volgens PCR3 de ideale annealingtemperatuur 60 C is. 7.3 Resultaten Er werden 76 stalen getest op de aanwezigheid van mutaties in het CSF3R-gen. Hiervan zijn 2 stalen afkomstig van MDS-patiënten, 31 van MDS/-patiënten, 5 van -patiënten, 1 van een CLL-patiënt, 35 AML en nog twee afkomstig van andere diagnose. In één van deze stalen werd een mutatie gevonden (1,3%) en in twee stalen werd eenzelfde mogelijks eiwit-polymorfisme (2,6%) gevonden (zie tabel 29). 77

85 Tabel 29: Overzicht gevonden mutaties en eiwit-polymorfismen bij het CSF3R-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur c.2260c>t (p.gln754x) Nonsense 1 AML Levert ingekort eiwit, wat belemmert het Neen vermogen om signalen door te geven die nodig zijn voor de neutrofiele differentiatie (Kosmider et al. 2013). c.2422g>a (p.glu808lys) Mogelijks eiwitpolymorfisme 1 CMML Mogelijke pathogeniteit, maar Ja, enkel 1 AML werkingsmechanisme nog onbekend specifiek bij (ExPASy 2014) (Liongue and Ward 2014). niet AML (Perkins 2013) 8 Screening van het NOTCH1-gen 8.1 Methode Bij het screenen van de stalen met potentiële NOTCH1-mutaties wordt een onderscheid gemaakt tussen enerzijds patiënten met de diagnose CLL en MCL en anderzijds patiënten met de diagnose T-ALL, aangezien deze diagnosen verschillende mutatiehotspots hebben. De uitgezochte stalen met diagnose CLL en MCL worden gescreend naar mutaties in exon 34 aangezien dat exon beschreven wordt in de literatuur als mutatiehotspot. De reeks stalen uitgezocht op basis van de diagnose T-ALL, werden gescreend naar mutaties zowel in exon 26 en exon 27 als exon 34. Voor exon 26 wordt gesequeneerd vanaf aminozuur p.phe1540 tot aminozuur p.gly1673 en voor exon 27 wordt gesequeneerd vanaf aminozuur p.leu1674 tot aminozuur p.gln1722. Exon 34 wordt zoals bij CLL en MCL gesequeneerd van aminozuur p.ser2489 tot aminozuur p.lys Resultaten In totaal werden 57 stalen onderzocht op de aanwezigheid van mutaties in het NOTCH1-gen. Hiervan zijn 34 stalen afkomstig van CLL-patiënten, 13 van MCL-patiënten en 10 van T-ALL-patiënten. Vijf van deze onderzochte stalen bleken mutaties te bevatten (8,8%) en zeven bezitten een SNP (12,3%) (zie tabel 30). Tabel 30a: Overzicht gevonden mutaties en SNP s in het NOTCH1-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur c.7544_7545delct (p.pro2515argfsx4) c.5094c>t (p.asp1698asp) Frameshift mutatie SNP (Trust Sanger Institute 2014) 1 CLL Deze mutatie zorgt voor de verstoring van het C-terminale PEST-domein. Afwezigheid van dit domein leidt tot een constitutieve activatie van het NOTCH1-eiwit (Campregher et al. 2012). 7 T-ALL Geen functionele betekenis (Trust Sanger Institute 2014) Ja, 75% van alle NOTCH1-mutaties bij CLL (Campregher et al. 2012) Ja, komt voor in ongeveer 43% van de bevolking, wordt niet specifiek gelinkt aan een ziektebeeld (Trust Sanger Institute 2014) 78

86 Tabel 30b: Overzicht gevonden mutaties en SNP s in het NOTCH1-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur c.4754t>c Missense mutatie 1 T-ALL Stimuleert de NOTCH1-signalering Ja (Park et al. 2009) (p.leu1585pro) door de stimulatie van het gammasecretase complex, wat leidt tot een verhoogde NOTCH1-splitsing (Malecki et al. 2006). c.4821g>c (p.lys1607asn) Missense mutatie 1 T-ALL Niet gekend Nee c.4735_4737delgtg (p.val1578del ) c.4778t>a (p.leu1593pro) Deletie 1 T-ALL Deze mutatie leidt tot een verandering in de conformatie van het HD-domein, welke de NOTCH1- splitsing bevordert, resulterend in verhoogde intracellulaire NOTCH1- concentraties (Mansur et al. 2010). Missense mutatie 1 T-ALL Stimuleert de NOTCH1-signalering door de stimulatie van het gammasecretase complex, wat leidt tot een verhoogde NOTCH1-splitsing (Malecki et al. 2006). Ja (Mansour et al. 2006) Ja (Mansour et al. 2006) 8.3 Besluit In het NOTCH1-gen werd een zeer frequente SNP gevonden bij T-ALL-patiënten, namelijk c.5094c>t(p.asp1698asp). Er kan opgemerkt worden dat T-ALL-patiënten frequenter beschikken over een gemuteerd NOTCH1-gen dan CLL- en MCL-patiënten, respectievelijk 40% (4/10), 2,9% (1/34) en 0% (0/13). Deze dalende mutatiefrequenties worden eveneens zo beschreven in de literatuur, respectievelijk 55%, 15,3% en 8,5% (zie figuur 51). 9 Screening van het ASXL1-gen 9.1 Methode De verschillende stalen werden gescreend naar mutaties in exon 12 aangezien dit exon beschreven wordt in de literatuur als mutatiehotspot. De ASXL1-stalen werden uitgezocht op basis van de diagnosen, MDS, /MDS en AML. De stalen worden gesequeneerd van p.ile574 tot p.leu Resultaten Er werden 79 stalen getest op de aanwezigheid van mutaties in het ASXL1-gen. Hiervan zijn 7 stalen afkomstig van MDS-patiënten, 17 van MDS/-patiënten, 23 van -patiënten, 9 van CLL-patiënten, 21 van AML-patiënten, 1 van een B-NHL-patiënt en 1 van een ALL patiënt. In twaalf van deze stalen werd een mutatie gevonden (15,2%) en in één staal (1,3%) werd een eiwit-polymorfisme gevonden (zie tabel 31). 79

87 Tabel 31: Overzicht gevonden mutaties en eiwit-polymorfismen bij het ASXL1-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur c.2110g>a (p.gly704arg) c.2122c>t (p.gln708x) c.1900_1922del (p.glu635argfsx15) c.1772dupa (p.tyr591x) c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) Eiwit-polymorfisme (Gemovic et al. 2013) 1 AML Geen invloed (Gemovic et al. 2013) Nonsense mutatie 1 MDS/ Levert een ingekort eiwit, zodat de oorspronkelijke functie niet correct kan uitgevoerd worden. Deletie 1 AML Leidt tot afwijkende DNA-methylaties en histon wijzigingen (Gelsi- Boyer et al. 2009). Duplicatie 1 MDS/ Leidt tot een frameshift en vroegtijdige stop, waardoor een volledig ander, ingekort eiwit ontstaat (Beekman et al. 2012). Duplicatie 2 AML Leidt tot een frameshift 1 en vroegtijdige stop, 5 MDS/ waardoor een volledig 1 MDS ander, ingekort eiwit ontstaat (Schnittger et al. 2013). Ja (Schnittger et al. 2013) Ja, enkel bij niet bij MDS/ (Tefferi et al. 2011) Ja, volgens Pratcorona et al. (2012) 10/46 gevonden mutaties bij AML-patiënten. Ja, maar voornamelijk bij AML (Beekman et al. 2012). Ja, goed voor >50% van alle ASXL1-mutaties en komt voor bij een groot spectrum aan myeloïde aandoeningen, bijvoorbeeld zowel bij, als bij MDS, /MDS en AML (Abdel- Wahab et al. 2010). Opmerking: De mutatie c.1934dupg(p.gly646trpfsx12), die goed is voor meer dan 50% van alle ASXL1-mutaties, werd meerdere malen bediscussieerd in verschillende studies. Er wordt getwijfeld of het al dan niet om een somatische mutatie gaat, of eerder om een PCR-artefact, aangezien de mutatie zich net na een guanine-rijke regio bevindt (zie figuur 47). c.1934dupg p.gly646trpfsx12 Wild type: TCGGAGGGGGGGGTGGCCCGGGTGGAGGTGGCGGCGGGGCCACCGATGAGGGAGG Mutant: TCGGAGGGGGGGGGTGGCCCGGGTGGAGGTGGCGGCGGGGCCACCGATGAGGGAGG Figuur 47: Voorstelling c.1934dupg(p.gly646trpfsx12) patiënt 9L

88 Figuur 48: Voorstelling van het verdwijnen van de p.gly646trpfsx12-mutatie bij remissie (gebaseerd op Schnittger et al. 2013) In de studie van Schnittger et al. (2013) werd op basis van een aantal bevindingen besloten dat het niet gaat om een artefact. Er werden twintig monsters elk tien keer onderzocht, alle positieve monsters bleven positief terwijl alle negatieve monsters negatief bleven. Bovendien verdwijnt deze afwijking na remissie (zie figuur 48). Bij de studie van Pratcorona et al. (2012) werd een tweede onafhankelijk staal onderzocht van iedere patiënt, waarbij identieke resultaten bekomen werden. Er werd eveneens geconstateerd dat bij remissie de mutatie volledig verdwenen was. Bovendien werden er 91 stalen onderzocht van gezonde personen, waarbij geen enkele mutatie in exon 12 van het ASXL1-gen gevonden werd. Hier werd dus eveneens besloten dat het om een somatische mutatie gaat en niet om een artefact. Thol et al. (2011) sequeneerden eveneens 65 gezonde stalen, waarbij geen enkel een mutatie vertoonde. De groep van West et al. (2014) herhaalde de PCR-reacties minstens drie keer voor ieder positief staal, waarbij telkens hetzelfde resultaat bekomen werd. Deze PCR-reacties werden uitgevoerd door gebruik te maken van verschillende enzymen en verschillende primers. Ook in de studie van Gelsi-Boyer et al. (2012) werd besloten dat het om een somatische mutatie gaat door onder andere het onderzoeken van stalen van patiënten met andere vormen van kanker, waar de mutatie telkens afwezig was. Figuur 49: Voorstelling p.gly646trpfsx12-mutatie bij diagnose (2009) Patiënt VM - Staal 9C Figuur 50: Voorstelling p.gly646trpfsx12-mutatie bij follow up (2014) Patiënt VM - Staal DD

89 In de studie van Abdel-Wahab et al. (2010) wordt het tegenovergestelde aangetoond. Een eerste punt dat hier aangehaald wordt is het feit dat de mutatie net voorafgegaan wordt door een guanine-rijke regio, wat kan leiden tot problemen tijdens de amplificatie. De verklaring voor het feit dat er eveneens stalen zijn waarbij deze mutatie afwezig is, is volgens hen dat niet bij iedere amplificatie deze slipped-strand mispairing optreedt. Aangezien Sanger sequencing slechts een beperkte nauwkeurigheid heeft, werden de stalen eveneens geanalyseerd m.b.v. massaspectroscopie, om zo een onderscheid te kunnen maken tussen de aanwezigheid van acht of negen guanine-nucleotiden. Bij het uitvoeren van de PCR-reactie gevolgd door massaspectroscopie, werd in ieder staal de mutatie teruggevonden. Finaal werden 96 gezonde stalen onderzocht d.m.v. Sanger sequencing, waarvan 25% positief bleek te zijn voor p.gly646trpfsx12. In deze studie werd dus besloten dat het niet om een somatische mutatie gaat, maar wel om een PCR-artefact. In de hier uitgevoerde studie werd deze mutatie, net zoals in de literatuur, ook het meest gevonden. Om zeker te zijn dat het effectief om een mutatie gaat en niet om een PCR-artefact werden alle positieve stalen een tweede keer gescreend op mutaties. Telkens werd exact hetzelfde resultaat bekomen als bij de eerste analyse. Er werd hier net zoals in de studie van Schnittger et al. (2013) gevonden dat de mutatie verminderd naarmate de ziekte gunstig evolueert (zie figuren 49 en 50). Een derde argument is het feit dat hier ook stalen onderzocht werden waar deze mutatie duidelijk afwezig bleek te zijn. Op basis van deze bevindingen werd hier besloten dat het weldegelijk om een mutatie gaat en niet om een PCR-artefact zoals in de studie van Abdel-Wahab et al. (2010) beschreven wordt. 9.3 Besluit De meest voorkomende mutaties bij het ASXL1-gen zijn volgens de literatuur frameshift mutaties (Trust Sanger Institute 2014), wat hier eveneens het geval is (11/12). Volgens de meeste studies, onder andere volgens Schnittger et al. (2013) is de meest voorkomende mutatie p.gly646trpfsx12 (53,9%, 69/128). In de hier uitgevoerde studie werd dit ook gevonden, namelijk negen van de twaalf (75%) gevonden mutaties betreffen deze mutatie. De tweede meest frequente mutatie is p.gln635argfsx15, gevolgd door p.tyr591x, p.arg693x en p.gln733x. Er kan dus besloten worden dat hier drie van de meest voorkomende mutaties gevonden werden en één minder voorkomende, namelijk p.gln708x. Alle gevonden mutaties worden in de literatuur eveneens beschreven bij de specifieke diagnosen van de stalen, uitgezonderd p.tyr591x. Deze mutatie wordt in de literatuur enkel in verband gebracht met AML en niet met MDS/, zoals hier gevonden werd. In de studie van Gelsi-Boyer et al. (2012) wordt deze mutatie zeven keer gevonden, maar hier wordt geen onderscheid gemaakt tussen de verschillende diagnosen, MDS, MDS/ en AML. Het is dus onduidelijk of deze mutatie al dan niet in verband wordt gebracht met de specifieke diagnosen van de patiënt, namelijk MDS/. 82

90 10 Screening van het c-kit gen 10.1 Methode C-KIT-mutaties worden voornamelijk gelinkt aan AML en SM. De stalen werden uitgezocht op basis van deze diagnosen en werden gescreend naar zowel exon 8 (van p.lys412 tot p.gln448) als exon 17 (van p.cys788 tot p.asn828). Voor SM worden de stalen reeds opgestuurd naar CME Leuven voor een c-kit-screening. De daar uitgevoerde screening is een zeer gevoelige, kwantitatieve test. Er kan dus gesteld worden dat de screening van het c-kit-gen geen nieuwe moleculaire merker is bij SM, maar dat het hier eerder gaat om een vergelijkende methode, dit in tegenstelling tot de screening bij de diagnose AML, wat wel een nieuwe moleculaire merker is Resultaten Er werden 49 stalen onderzocht, waarvan 40 afkomstig van AML-patiënten, 6 van SM-patiënten, 1 MDS-patiënt, 1 MDS/-patiënt en 1 afkomstig van een patiënt met een andere diagnose. Aangezien het bij de diagnose SM gaat om een vergelijkende studie wordt hier geen mutatiefrequentie weergegeven aangezien bewust getest werd op positieve stalen. Van de onderzochte AML-stalen vertonen twee stalen een mutatie (5%) en twee stalen beschikken over een SNP (5%) (zie tabel 32). Tabel 32: Overzicht gevonden mutaties en SNP s in het c-kit-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur c.2394c>t(p.ile798ile) SNP (Colarossi et al. 2007) 2 SM 2 AML Geen effect Ja, zowel bij SM als AML (Colarossi et al. 2007; Riera et al. 2013) c.1255_1257delgac (p.asp419del) c.2466t>g (p.asn822lys) c.2447a>t (p.asp816val) Deletie 1 AML Exon 8 codeert voor het extracellulaire juxtamembraan domein, dit is een functioneel gebied dat instaat voor de c-kit-activiteit. Mutaties in dit gebied leiden tot een ligand-onafhankelijke constitutieve activatie (Casteran et al. 2003). Ja (Matthews and Gerritsen 2010) Missense mutatie 1 AML Onduidelijk (ExPASy 2014) Ja (Hussain et al. 2009) Missense mutatie 1 SM Het gaat hier om een activerende Ja, bij >80% van de puntmutatie die wordt gevonden in het ISM-patiënten tyrosine kinase domein, wat leidt tot (Verstovsek 2013) een conformationele verandering die resulteert in een ligand-onafhankelijke constitutieve activatie van c-kit, wat leidt tot een verhoogde proliferatie en een vermindering van apoptose (Verstovsek 2013). 83

91 10.3 Besluit De screening van het c-kit-gen bij SM gebeurde als vergelijkende studie. Het gaat hier in dit geval dus niet om een nieuwe merker. Deze test wordt reeds buitenhuis (CME Leuven) uitgevoerd door middel van een kwantitatieve, zeer gevoelige test. Het is de bedoeling dat deze test kan uitgevoerd worden in het labo van het AZ Sint-Jan Brugge. Dit is momenteel nog niet mogelijk aangezien de gewenste gevoeligheid niet behaald kan worden met Sanger sequencing. Er zijn namelijk drie patiënten CL , CJ en CI (zie bijlage 3) waar een c-kit-mutatie aanwezig is en die d.m.v. Sanger sequencing niet kan gedetecteerd worden aangezien respectievelijk slechts 15,59%, 0,06% en 0,09% gemuteerde cellen aanwezig zijn, terwijl de gevoeligheid van Sanger sequencing hier 20% bedraagt. De screening van het c-kit-gen bij AML is echter wel een nieuwe merker. Hierbij wordt een mutatiefrequentie van 5% (2/40) bekomen. Beide mutaties werden gevonden bij AML1-ETO-positieve AML-patiënten. 11 Screening van het MYD88 gen 11.1 Methode Mutaties in het MYD88-gen worden in verband gebracht met LPL of ook wel de ziekte van Waldenström genoemd. De stalen worden dan ook uitgezocht op basis van deze diagnose. De mutatiehotspot van het MYD88-gen bevindt zich ter hoogte van aminozuur 265 (leucine) Resultaten Er werden 31 LPL-stalen gescreend naar mutaties in het MYD88-gen. Van deze stalen vertoonden slechts twee stalen een mutatie (6,5%) (zie tabel 33). Tabel 33: Overzicht gevonden mutaties in het MYD88-gen Mutatie Type mutatie Aantal Effect op eiwit Beschreven in literatuur c.794t>c (p.leu265p ro) Missense mutatie 2 LPL Cellen met dergelijke mutatie krijgen een groeivoordeel ten opzichte van gezonde cellen door de activatie van allerlei andere eiwitten in de cel (Treon et al. 2012) Meest frequent voorkomende mutatie in het MYD88-gen die in verband kan gebracht worden met LPL (Treon et al. 2012) 11.3 Besluit In de literatuur wordt beschreven dat ongeveer 95% van de LPL-patiënten beschikken over een mutatie ter hoogte van aminozuur 265 in het MYD88-gen (Treon et al. 2012). Er kan dus besloten worden dat de gevonden mutatiefrequentie veel lager is, namelijk 6,5% (2/31). Dit kan verklaard worden omdat bij de diagnose LPL, maximaal 30% van de cellen maligne cellen zijn en aangezien hier slechts een gevoeligheid is van 20%, worden heel wat mutaties niet gedetecteerd. Dit probleem kan opgelost worden bijvoorbeeld door het ontwerpen van een specifiekere PCR-reactie waardoor de gevoeligheid aanzienlijk zal stijgen. Dit is mogelijk aangezien de mutatiehotspot slechts één aminozuur betreft. Een andere mogelijkheid om dit probleem op te lossen is om voorafgaandelijk 84

92 aan de amplificatie het staal te onderwerpen aan een celscheiding. Waldenström B-cellen vertonen in ongeveer 90% van de B-cellen expressie van CD19 (Owen et al. 2001). Wanneer deze cellen voorafgaandelijk geïsoleerd worden, is er een veel grotere kans om mutaties te vinden. 12 Vergelijkende studie met de literatuur In onderstaande figuur wordt een vergelijking gemaakt tussen het aantal mutaties per gen en per diagnose gevonden in deze studie en beschreven in de literatuur (zie literatuurstudie). Een belangrijke opmerking die dient gemaakt te worden bij deze vergelijking is het feit dat in de literatuur geen onderscheid gemaakt wordt tussen mutaties en eiwit-polymorfismen, waar in tegenstelling tot een SNP het aminozuur wel verandert. Zowel mutaties als eiwit-polymorfismen worden gerekend onder de noemer mutaties, terwijl in deze studie wel degelijk een verschil gemaakt wordt tussen dergelijke polymorfismen en mutaties. In tabellen 34 en 35 wordt een overzicht gegeven van de gevonden mutatiefrequenties en de in de literatuur beschreven mutatiefrequenties met eventueel een verklaring voor het verschil tussen beide mutatiefrequenties. Figuur 51: Vergelijking van de gevonden mutatiefrequenties en de mutatiefrequenties beschreven in de literatuur (zie literatuurstudie) per gen en per diagnose Er kan opgemerkt worden dat de vergelijkende studies, namelijk IDH1- en IDH2-, MPL en c-kit bij SM, evenals de totaal niet representatieve waarden in deze figuur niet weergegeven worden, aangezien hierbij geen representatieve mutatiefrequenties bekomen worden. 85

93 Tabel 34: Overzicht van de gevonden mutatiefrequentie en de in de literatuur beschreven mutatiefrequenties met eventueel een verklaring voor het verschil tussen beide mutatiefrequenties (voor de in de literatuur beschreven mutatiefrequenties wordt verwezen naar de voorafgaande literatuurstudie). Diagnose Genen Gevonden Literatuur Besluit (gemiddelde) MDS SETBP1 100% (1/1) 2,2% De mutatiefrequentie is niet representatief aangezien slechts 1 staal getest werd. ASXL1 14,3% (1/7) 16% Beide mutatiefrequenties komen ongeveer overeen. Er dient wel opgemerkt te worden dat slechts 7 stalen getest werden. MPL 50% (1/2) 4,4% Gevonden mutatiefrequentie heeft weinig betekenis aangezien hier bewust getest werd op positieve stalen. MDS/ SETBP1 25% (4/16) 7,5% Voor SETBP1 wordt een hogere mutatiefrequentie bekomen dan in de literatuur beschreven wordt. Dit kan verklaard worden door het feit dat bij acml een hogere mutatiefrequentie bekomen wordt in de literatuur dan CMML, respectievelijk 28% en 4,8%. Hier werden voornamelijk acml-patiënten onderzocht (14 stalen) en slechts 2 CMML-stalen. Voor acml wordt dus een mutatiefrequentie bekomen van 21,4%, wat de beschreven mutatiefrequentie benadert, namelijk 28%. Voor CMML werden slechts twee stalen getest waardoor de verkregen mutatiefrequentie weinig betekenis heeft. CSF3R 0% (0/31) 3,6% Er werd bij 1 van de 31 (3,23%) onderzochte stalen een eiwit-polymorfisme gevonden. Aangezien in de literatuur vaak geen onderscheid gemaakt wordt tussen deze eiwit-polymorfismen en mutaties kan het verschil in beide mutatiefrequenties hierdoor verklaard worden. ASXL1 41,2% (7/17) 51% Alle mutaties werden gevonden bij acml-patiënten. In de literatuur hebben deze een hogere mutatiefrequentie dan CMML-patiënten (respectievelijk 64% vs. 44%). Er werden slechts 5 CMML-patiëntenstalen onderzocht. Door het beperkt aantal CMML-stalen ter beschikking worden geen genmutaties gevonden. Er kan dus geen uitgebreid onderzoek gebeuren. Voor acml wordt hier een vergelijkbare mutatiefrequenties bekomen t.o.v. de literatuur, respectievelijk 58,3% en 64%. MPL 100% (1/1) Wordt niet Gevonden mutatiefrequentie heeft weinig betekenis specifiek beschreven in de literatuur aangezien hier bewust getest werd op positieve stalen. Het onderscheid tussen, MDS en MDS/ is vaak moeilijk te onderscheiden. SETBP1 25% (1/4) 13,8% Te weinig stalen werden getest om een representatieve mutatiefrequentie te bekomen. CSF3R 0% (0/5) 64,7% Mutaties in het CSF3R-gen bij worden voornamelijk beschreven bij CNL. Aangezien dit een uiterst zeldzame aandoening is, werd deze specifieke diagnose hier niet getest, maar werden andere diagnosen van de groep getest. Er werden eveneens slechts vijf stalen getest, wat geen representatieve mutatiefrequentie oplevert. DNMT3A 0% (0/22) 14% Geen verklaring ASXL1 4,3% (1/23) 41,8% Mutaties in het ASXL1-gen bij worden voornamelijk beschreven bij CNL. Aangezien dit een uiterst zeldzame aandoening is, werd deze specifieke diagnose hier niet getest, maar werden andere diagnosen van de groep getest. MPL 73,3% (11/15) 5% Gevonden mutatiefrequentie heeft weinig betekenis aangezien hier bewust getest werd op positieve stalen. 86

94 Tabel 35: Overzicht van de gevonden mutatiefrequentie en de in de literatuur beschreven mutatiefrequenties met eventueel een verklaring voor het verschil tussen beide mutatiefrequenties - vervolg Diagnose Genen Gevonden Literatuur Besluit (gemiddelde) CLL TP53 12,5% (4/32) 21,3% Geen verklaring NOTCH1 2,9% (1/34) 15,3% Geen verklaring AML CSF3R 2,9% (1/35) De novo AML 0,8% In de literatuur wordt meestal onderscheid gemaakt tussen secundaire AML en de novo AML, wat hier niet gedaan werd. Uit de literatuur blijkt duidelijk dat secundaire Secundaire AML-patiënten een veel hogere mutatiefrequentie AML 79% vertonen, namelijk (respectievelijk 79% vs. 0,83%). IDH1 en 33,3% (2/6) 11,4% Gevonden mutatiefrequentie heeft weinig betekenis IDH2 aangezien hier bewust getest werd op positieve stalen. DNMT3A 13,2% (7/53) 18,3% Ongeveer gelijke mutatiefrequenties werden bekomen. ASXL1 14,3% (3/21) De novo AML 6,5% Secundaire AML 30,3% In de literatuur wordt meestal onderscheid gemaakt tussen secundaire AML en de novo AML, wat hier niet gedaan werd. Uit de literatuur blijkt duidelijk dat secundaire AML-patiënten een veel hogere mutatiefrequentie vertonen, namelijk (30,3% vs. 6,5%). Er werd eveneens bij 1 van de 21 stalen een eiwit-polymorfisme gevonden. c-kit 5% (2/40) 11,8% Geen verklaring T-ALL NOTCH1 40% (4/10) 55% Geen verklaring SM c-kit 16,7% (1/6) 80% Gevonden mutatiefrequentie heeft weinig betekenis aangezien hier bewust getest werd op positieve stalen. LPL MYD88 6,5% (2/31) 93,4% Maximaal 30% van de cellen bij LPL zijn maligne cellen, aangezien de hier gebruikte methode slechts een gevoeligheid heeft van 20%, worden veel mutaties niet gedetecteerd. Oplossing 1: ontwerpen van een specifieke PCR-reactie, aangezien de mutatiehotspot slechts één aminozuur betreft. Oplossing 2: CD19-cellen die in een laag percentage aanwezig zijn voorafgaandelijke isoleren. Deze tweede oplossing wordt ook uitgevoerd in de literatuur, vandaar de hogere mutatiefrequentie. LGL STAT3 57,1% (4/7) 33,4% Er werden te weinig stalen getest om een representatieve mutatiefrequentie te bekomen. MCL NOTCH1 0% (0/13) 8,5% Geen verklaring Er werden eveneens patiënten gevonden die meerdere malen gemuteerd zijn. Er werd in de literatuur op zoek gegaan of deze co-mutaties reeds beschreven werden (zie tabel 36). 87

95 Tabel 36: Overzicht van de gevonden co-mutaties Patiënt Diagnose Mutaties Literatuur BD MDS/ acml 9L J MDS/ acml MDS/ acml ASXL1: c.1934dupg(p.gly646trpfsx12) CEBPA ASXL1: c.1934dupg(p.gly646trpfsx12) SETBP1: c.2608g>a(p.gly870ser) ASXL1: c.1934dupg(p.gly646trpfsx12) SETBP1: c.2608g>a(p.gly870ser) BI MDS ASXL1: c.1934dupg(p.gly646trpfsx12) SETBP1: c.2602g>a(p.asp868asn) 9C PMF ASXL1: c.1934dupg(p.gly646trpfsx12) JAK2: c.1849g>t (p.val617phe) 9E AML CSF3R: c.2422g>a(p.glu808lys) FLT3-ITD-mutatie DNMT3A: c.2645g>a(p.arg882his) CI MPL: c.1514g>a(p.ser505asn) en c.1502t>c(p.val501ala) JAK2: V617F CL AML DNMT3A: c.2645g>a(p.arg882his) FLT3-ITD mutatie NPM1-mutatie CF AML DNMT3A: c.2645g>a(p.arg882his) NPM1-mutatie CG AML DNMT3A: c.2645g>a(p.arg882his) NPM1-mutatie FLT3-ITD-mutatie 26% van de mutante ASXL1-patiënten bezitten eveneens een CEBPA-mutatie, terwijl slechts 9% van de -ASXL1-patiënten over een CEBPA-mutatie beschikt. Patiënten die zowel beschikken over een ASXL1-mutatie en een CEBPA-mutatie behoren tot de groep met een gunstige prognose (Metzeler et al. 2011). SETBP1-mutaties worden sterk geassocieerd met ASXL1-mutaties. SETBP1-mutaties komen frequenter voor bij mutante ASXL1-patiënten dan bij wild type ASXL1-patiënten. Bijna één derde van de ASXL1-gemuteerde gevallen bezit eveneens een mutatie in SETBP1 (63/208, 30,3%). In deze studie van Meggendorfer et al. (2013) wordt hieruit besloten dat een SETBP1-mutatie eerder een mutatie is die later optreedt tijdens de ziekte i.p.v. een initiële mutatie. In de studie van Hou et al. (2014) wordt eveneens besloten dat de SETBP1-muatie geen initiële mutatie is, maar dat de mutatie verkregen wordt gedurende het klinisch verloop en dat deze dus een rol speelt bij de progressie van de ziekte. Hier werd ook besloten dat het voorkomen van een SETBP1-mutatie en een ASXL1-mutatie zowel bij MDS-patiënten als MDS/-patiënten geassocieerd wordt met een slechte prognose. In de literatuur wordt het gelijktijdig voorkomen van deze twee mutaties niet beschreven. FLT3-ITD-mutaties komen vaak (40%) voor bij DNMT3A-gemuteerde AML-patiënten. Uit de studie van Shlush et al. (2014) wordt besloten dat de mutatie in DNMT3A eerder aanwezig is dan de FLT3-ITDmutaties. FLT3-mutante AML-patiënten met een DNMT3A-mutatie worden geassocieerd met een zeer slechte prognose (Testa and Pelosi 2013). Er wordt geen verband beschreven tussen deze mutaties en het voorkomen van het CSF3R-polymorfisme. Mutaties in het MPL-gen leiden tot constitutieve activatie van JAK2. Beide mutaties leiden dus tot een constitutieve activering van de JAK2-signaalpathway. Er worden geen specifieke verbanden beschreven tussen de hier voorkomende co-mutaties. DNMT3A-mutaties worden significant geassocieerd met NPM1-mutaties en FLT3-ITD-mutaties (Ribeiro et al. 2012). In de studie van Hou et al. (2012) werd gevonden dat van de 70 patiënten met mutant DNMT3A-gen er 68 (97,1%) beschikken over additionele moleculaire abnormaliteiten, waaronder voornamelijk NMP1-mutaties (55,9% (38/68)) en FLT3-ITD-mutaties (44,1% (30/68)). Mutante DNMT3A-AML-patiënten met een NPM1-mutatie en wild type FLT3-ITD beschikken over een gunstige prognose binnen de groep van mutante DNMT3A-AML-patiënten die geassocieerd worden met een slechte prognose. Aanwezigheid van zowel een NPM1-mutatie en een FLT3-ITD-mutatie bij mutante DNMT3A-AML-patiënten leiden tot een slechte prognose. 88

96 Algemeen besluit Er is een duidelijk verband tussen mutaties en het voorkomen van een welbepaalde vorm van kanker, wat perspectieven biedt voor het (voortijdig) opsporen van de ziekte en het stellen van de juiste diagnose. Tot op vandaag worden de meeste kankers gediagnosticeerd op basis van morfologische, immunofenotypische of cytogenische kenmerken. In bepaalde gevallen is het stellen van de juiste diagnose echter moeilijk en is het stellen ervan vaak gebaseerd op exclusie, wat kostbare tijd in beslag neemt. Wanneer de ziekte echter gelinkt kan worden aan het voorkomen van een bepaalde mutatie, een moleculaire merker, kan het stellen van de diagnose mogelijk versneld worden. Dit leidt vervolgens tot een snellere start van een effectieve behandeling, wat de overlevingskans van de patiënt vergroot. In de literatuur werden recent heel wat recurrente mutaties beschreven dankzij het fundamenteel kankeronderzoek m.b.v. Next Generation Sequencing. Het doel van deze thesis was om een methode te ontwikkelen die in staat is om de in de literatuur beschreven puntmutaties op een efficiënte manier te kunnen opsporen. De gebruikte methode is Sanger sequencing, dit omdat deze techniek in het AZ Sint-Jan Brugge reeds wordt toegepast o.a. voor HLA-typering. In deze studie wordt gebruik gemaakt van de in de literatuur beschreven gen-specifieke primers die tijdens de synthese verlengd werden met de universele M13-sequentie, zodat het mogelijk wordt om voor iedere analyse gebruik te maken van de universele M13-primers als sequentieprimer. Dit gebeurde om een efficiënte screening mogelijk te maken, wat het doel was van deze thesis. De gevoeligheid van Sanger sequencing is echter ongeveer 20%, waarmee dient rekening gehouden te worden tijdens de interpretatie. Het MPL-, IDH1- en IDH2-gen worden momenteel in het laboratorium van het AZ Sint-Jan Brugge gescreend naar mutaties, maar om deze analyses te integreren in de efficiëntere werkwijze, werd een vergelijkende studie uitgevoerd met de gen-specifieke primers gekoppeld aan de M13-sequentie. In totaal werden zestien stalen met gekende MPL-mutatiestatus onderzocht naar mutaties in het MPL-gen. Het IDH1- en IDH2-gen werden gescreend bij zes verschillende stalen. Bij de drie onderzochte genen werden telkens dezelfde resultaten bekomen als bij de huidige methode. Er kan dus besloten worden dat deze huidige methode in de routineanalyses kan vervangen worden door de efficiëntere nieuwe methode. Aangezien er een grote noodzaak is om nieuwe diagnostische merkers te vinden bij diagnose van MDS, en MDS/, werd een set van drie genen geselecteerd, namelijk SETBP1, CSF3R en ASXL1. Er werden in totaal 21 stalen gescreend voor het SETBP1-gen, waarbij bij zes stalen een mutatie werd gevonden (28,6%). Bij het CSF3R-gen werd geen enkele mutatie gevonden bij het screenen van 38 stalen. Voor het ASXL1-gen werden 47 stalen gescreend waarbij bij negen stalen een mutatie werd gevonden (19,1%). Het CSF3R- en ASXL1-gen werden naast het screenen bij voorgaande diagnosen ook nog onderzocht bij AML. Hierbij werden mutatiefrequenties bekomen van respectievelijk 2,9% (1/35) en 14,3% (3/21). Bij het CSF3R-gen werd slechts één mutatie gevonden bij de 35 onderzochte AML-stalen. Het gaat hier om een niet eerder beschreven nonsense mutatie, namelijk c.2260c>t(p.gln754x). 89

97 Volgende vijf genen met gekende mutatiehotspots werden eveneens onderzocht: Bij het TP53-gen werden 32 stalen afkomstig van CLL-patiënten getest waarbij bij vier patiënten (12,5%) een mutatie werd gevonden. NOTCH1-mutaties werden opgespoord bij CLL, MCL en T-ALL. Belangrijk op te merken bij het NOTCH1-gen is dat T-ALL-patiënten frequenter beschikken over een gemuteerd NOTCH1-gen dan CLL- en MCL-patiënten, respectievelijk 40% (4/10), 2,9% (1/34) en 0% (0/13), wat overeenstemt met wat in de literatuur beschreven wordt, namelijk 55%, 15,3% en 8,5%. Bij het STAT3-gen werden zeven stalen onderzocht, allemaal met de diagnose LGL. Vier van deze stalen bleken een mutatie te bevatten (57,1%), dit in vergelijking met 33,4% beschreven in de literatuur. Het DNMT3A-gen werd voornamelijk getest bij - en AML-patiënten, waarbij mutatiefrequenties bekomen werden van respectievelijk 0% (0/22) en 13,2% (7/53). Deze gevonden waarden zijn lager dan de in de literatuur beschreven frequenties, namelijk respectievelijk 14% en 18,3%. Het c-kit-gen werd onderzocht bij AML-patiënten. Veertig stalen werden onderzocht, waarbij bij twee stalen (5%) een mutatie werd gevonden. In de literatuur wordt beschreven dat bij deze diagnose 11,8% van de patiënten beschikken over een mutant c-kit-gen. Tijdens het uitvoeren van de vele mutatieanalyses werden een aantal technische beperkingen en moeilijkheden bij de interpretatie ondervonden. Een eerste technische beperking situeert zich bij de gevoeligheid van de Sanger sequencing methode die slechts ongeveer 20% bedraagt. Deze gevoeligheid veroorzaakt problemen bij het screenen van onder andere het MYD88-gen bij LPL. In de literatuur wordt beschreven dat ongeveer 95% van de LPL-patiënten beschikken over de mutatie p.leu265pro in het MYD88-gen, terwijl hier slechts een mutatiefrequentie bekomen wordt van 6,5% (2/32), wat verklaard kan worden door de beperkte gevoeligheid. Dit probleem kan opgelost worden door bijvoorbeeld een specifiekere PCR-reactie te ontwerpen zodat de gevoeligheid stijgt of door de stalen te onderwerpen aan een voorafgaandelijke celscheiding, namelijk een CD19-celscheiding. Bij de analyse van het c-kit-gen bij de diagnose SM werden eveneens problemen ondervonden door de beperkte gevoeligheid. Dit gen wordt reeds buitenhuis getest bij de diagnose SM d.m.v. een kwantitatieve, gevoelige test. Het is de bedoeling dat deze test kan uitgevoerd worden in het labo van het AZ Sint-Jan Brugge, maar na onderzoek blijkt dat dit momenteel nog niet mogelijk is aangezien de nodige gevoeligheid niet behaald kan worden met Sanger sequencing. Een tweede technisch aandachtspunt is het frequent voorkomen van een mutatie in het ASXL1-gen, namelijk c.1934dupg(p.gly646trpfsx12). De literatuur is het er niet over eens of het om een somatische mutatie gaat dan wel om een PCR-artefact. De reden ligt in het feit dat de mutatie net vooraf gegaan wordt door acht guanine-residuen. In één studie wordt beweerd dat het hier gaat om slipped strand mispairing, terwijl men er in de meeste studies van overtuigd is dat dit weldegelijk een mutatie is. Ook in deze studie wordt dit laatste besloten. 90

98 Als laatste werd een moeilijkheid ondervonden gedurende de interpretatie van de resultaten, namelijk bij het onderscheid tussen eiwit-polymorfismen en mutaties. Bij het uitvoeren van de verschillende mutatieanalyses werd een eiwit-polymorfisme gevonden bij het ASXL1-gen (c.2210g>a(p.gly704arg)) en een mogelijks eiwit-polymorfisme bij het CSF3R-gen, namelijk c.2422g>a(p.glu808lys). Deze mutaties hebben dus geen invloed op het eiwit, waardoor ze niet in verband kunnen gebracht worden met een specifieke diagnose met als gevolg dat ze niet bruikbaar zijn als moleculaire merker. Het doel van deze thesis was om een methode te ontwikkelen die in staat is om de in de literatuur beschreven puntmutaties op een efficiënte manier te kunnen opsporen. Er kan besloten worden dat de methode op punt gesteld werd en dat het mogelijk is om op een efficiënte manier verschillende mutaties te onderzoeken. Deze methode heeft echter een beperkte gevoeligheid, ongeveer 20% mutant DNA dient aanwezig te zijn. Bovendien laat de methode niet toe genmutaties op te sporen buiten mutatiehotspots. Het is bijna onmogelijk om bijvoorbeeld alle exonen van een gen te testen, wat bijvoorbeeld belangrijk kan zijn bij het DNMT3A-gen, waarbij nu enkel exon 23 gescreend werd, waar zich 50% van de mutaties bevinden, terwijl ook nog mutatiehotspots aanwezig zijn van exon 11 tot exon 24 (Roller et al. 2013). Ook het onderzoeken van zeer grote genen, zoals het TET2-gen, vormen een probleem om m.b.v. Sanger sequencing op een efficiënte manier te onderzoeken. Deze geoptimaliseerde en gevalideerde mutatieanalyses worden vanaf heden routinematig uitgevoerd in het laboratorium, dit in afwachting van de introductie van een nieuwe methode voor uitgebreide mutatieanalyse door middel van Next Generation Sequencing (NGS). Met NGS wordt het mogelijk om de gevoeligheid sterk te verhogen en om op een efficiënte manier meer exonen en grote genen zonder duidelijke mutatiehotspot te screenen. 91

99 Referentielijst Abdel-Wahab, O., J. Gao, M. Adli, A. Dey, T. Trimarchi, Y. R. Chung, C. Kuscu, T. Hricik, D. Ndiaye-Lobry, L. M. Lafave, R. Koche, A. H. Shih, O. A. Guryanova, E. Kim, S. Li, S. Pandey, J. Y. Shin, L. Telis, J. Liu, P. K. Bhatt, S. Monette, X. Zhao, C. E. Mason, C. Y. Park, B. E. Bernstein, I. Aifantis and R. L. Levine (2013) Deletion of Asxl1 results in myelodysplasia and severe developmental defects in vivo. The Journal of experimental medicine. 210, Abdel-Wahab, O., O. Kilpivaara, J. Patel, L. Busque and R. L. Levine (2010) The most commonly reported variant in ASXL1 (c.1934dupg;p.gly646trpfsx12) is not a somatic alteration. Leukemia. 24, Affymetrix (2013) ExoSAP-IT For PCR Product Cleanup Alto, W. A. and L. Clarcq (1999) Cutaneous and systemic manifestations of mastocytosis. American family physician. 59, , Alves (2013) The genetic code Arcaini, L., S. Zibellini, E. Boveri, R. Riboni, S. Rattotti, M. Varettoni, M. L. Guerrera, M. Lucioni, A. Tenore, M. Merli, S. Rizzi, L. Morello, C. Cavalloni, M. C. Da Via, M. Paulli and M. Cazzola (2012) The BRAF V600E mutation in hairy cell leukemia and other mature B-cell neoplasms. Blood. 119, Aref, S., M. El-Ghonemy, T. Abouzeid, A. El-Sabbagh and M. El-Baiomy (2014) Prevalence and impact of colony stimulating factor 3 receptor (CSF3R) mutations among Egyptian acute myeloid leukemia patients. Leukemia research. Ashraf, S., N. I. Noguera, J. Di Giandomenico, S. Zaza, S. K. Hasan and F. Lo-Coco (2013) Rapid detection of IDH2 (R140Q and R172K) mutations in acute myeloid leukemia. Annals of hematology. 92, Bai, L. and W.-G. Zhu (2006) p53: Structure, Function and Therapeutic Applications. Journal of Cancer Molecules. Balsat, M. and J. Cornillon (2013) Molecular and therapeutic advances in Hairy cell leukemia. Bulletin du cancer. 100, Barnabas, N., M. Shurafa, D. L. Van Dyke, S. R. Wolman, D. Clark and M. J. Worsham (2001) Significance of p53 mutations in patients with chronic lymphocytic leukemia: a sequential study of 30 patients. Cancer. 91, Bea, S., R. Valdes-Mas, A. Navarro, I. Salaverria, D. Martin-Garcia, P. Jares, E. Gine, M. Pinyol, C. Royo, F. Nadeu, L. Conde, M. Juan, G. Clot, P. Vizan, L. Di Croce, D. A. Puente, M. Lopez-Guerra, A. Moros, G. Roue, M. Aymerich, N. Villamor, L. Colomo, A. Martinez, A. Valera, J. I. Martin-Subero, V. Amador, L. Hernandez, M. Rozman, A. Enjuanes, P. Forcada, A. Muntanola, E. M. Hartmann, M. J. Calasanz, A. Rosenwald, G. Ott, J. M. Hernandez-Rivas, W. Klapper, R. Siebert, A. Wiestner, W. H. Wilson, D. Colomer, A. Lopez-Guillermo, C. Lopez-Otin, X. S. Puente and E. Campo (2013) Landscape of somatic mutations and clonal evolution in mantle cell lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, Beekman, R., M. Valkhof, P. van Strien, P. J. Valk and I. P. Touw (2013) Prevalence of a new auto-activating colony stimulating factor 3 receptor mutation (CSF3R-T595I) in acute myeloid leukemia and severe congenital neutropenia. Haematologica. 98, e62-3. Beekman, R., M. G. Valkhof, M. A. Sanders, P. M. van Strien, J. R. Haanstra, L. Broeders, W. M. Geertsma- Kleinekoort, A. J. Veerman, P. J. Valk, R. G. Verhaak, B. Lowenberg and I. P. Touw (2012) Sequential gain of mutations in severe congenital neutropenia progressing to acute myeloid leukemia. Blood. 119, Biosystems, A. (2010) AmpliTaq Gold DNA Polymerase - Protocol. Blombery, P. A., S. Q. Wong, C. A. Hewitt, A. Dobrovic, E. L. Maxwell, S. Juneja, G. Grigoriadis and D. A. Westerman (2012) Detection of BRAF mutations in patients with hairy cell leukemia and related lymphoproliferative disorders. Haematologica. 97, Boissel, N., H. Leroy, B. Brethon, N. Philippe, S. de Botton, A. Auvrignon, E. Raffoux, T. Leblanc, X. Thomas, O. Hermine, B. Quesnel, A. Baruchel, G. Leverger, H. Dombret, C. Preudhomme, A. Acute Leukemia French and G. Leucemies Aigues Myeloblastiques de l'enfant Cooperative (2006) 92

100 Incidence and prognostic impact of c-kit, FLT3, and Ras gene mutations in core binding factor acute myeloid leukemia (CBF-AML). Leukemia. 20, Boyd, E. M., A. J. Bench, M. B. van 't Veer, P. Wright, D. M. Bloxham, G. A. Follows and M. A. Scott (2011) High resolution melting analysis for detection of BRAF exon 15 mutations in hairy cell leukaemia and other lymphoid malignancies. Br J Haematol. 155, Bunimovich, O., M. Grassi and M. R. Baer (2009) Systemic Mastocytosis: Classification, Pathogenesis, Diagnosis, and Treatment. Cutis. 83, Campregher, P. V., R. C. Petroni, N. Muto, R. Santana, R. Sitnik, O. P. S. Ramos, N. Bacal, C. B. Bub, F. P. S. Santos, P. Guilherme, H. Ricardo, C. Souza, R. A. de Assis, G. B. Oliveira, I. L. Metze and N. Hamerschlak (2012) Novel Assay for the Identification of NOTCH1 PEST Domain Mutations Using Fragment Analysis and Allele Specific PCR. Blood Casteran, N., P. De Sepulveda, N. Beslu, M. Aoubala, S. Letard, E. Lecocq, R. Rottapel and P. Dubreuil (2003) Signal transduction by several KIT juxtamembrane domain mutations. Oncogene. 22, Cell, A. T. S. (2013) Hematopoiesis Chaligne, R., C. Tonetti, R. Besancenot, L. Roy, C. Marty, P. Mossuz, J. J. Kiladjian, G. Socie, D. Bordessoule, M. C. Le Bousse-Kerdiles, W. Vainchenker and S. Giraudier (2008) New mutations of MPL in primitive myelofibrosis: only the MPL W515 mutations promote a G1/S-phase transition. Leukemia. 22, Chen, B. and W. Janes (2002) PCR Cloning Protocols, pp 439 Chen, T. C., H. A. Hou, W. C. Chou, J. L. Tang, Y. Y. Kuo, C. Y. Chen, M. H. Tseng, C. F. Huang, Y. J. Lai, Y. C. Chiang, F. Y. Lee, M. C. Liu, C. W. Liu, C. Y. Liu, M. Yao, S. Y. Huang, B. S. Ko, S. C. Hsu, S. J. Wu, W. Tsay, Y. C. Chen and H. F. Tien (2014) Dynamics of ASXL1 mutation and other associated genetic alterations during disease progression in patients with primary myelodysplastic syndrome. Blood cancer journal. 4, e177. Chin, E. L., C. da Silva and M. Hegde (2013) Assessment of clinical analytical sensitivity and specificity of next-generation sequencing for detection of simple and complex mutations. BMC genetics. 14, 6. Cho, E. K., S. M. Bang, J. Y. Ahn, S. M. Yoo, P. W. Park, Y. H. Seo, D. B. Shin and J. H. Lee (2003) Prognostic value of AML 1/ETO fusion transcripts in patients with acute myelogenous leukemia. The Korean journal of internal medicine. 18, Colarossi, S., S. Soverini, A. Gnani, M. Rondoni, R. Zanotti, S. Merante, S. Gatto, M. Tiribelli, F. Musto, E. Gottardi, D. Cilloni, G. Martinelli and M. Baccarani (2007) A novel denaturing-high performance liquid chromatography (D-HPLC)based method for kit mutation screening of patients (PTS) with systemic mastocytosis (SM). Haematol-Hematol J. 92, Cristobal, I., F. J. Blanco, L. Garcia-Orti, N. Marcotegui, C. Vicente, J. Rifon, F. J. Novo, E. Bandres, M. J. Calasanz, C. Bernabeu and M. D. Odero (2010) SETBP1 overexpression is a novel leukemogenic mechanism that predicts adverse outcome in elderly patients with acute myeloid leukemia. Blood. 115, Damm, F., R. Itzykson, O. Kosmider, N. Droin, A. Renneville, V. Chesnais, V. Gelsi-Boyer, S. de Botton, N. Vey, C. Preudhomme, A. Clavert, E. Delabesse, S. Park, D. Birnbaum, M. Fontenay, O. A. Bernard and E. Solary (2013) SETBP1 mutations in 658 patients with myelodysplastic syndromes, chronic myelomonocytic leukemia and secondary acute myeloid leukemias. Leukemia. 27, Del Giudice, I., D. Rossi, S. Chiaretti, M. Marinelli, S. Tavolaro, S. Gabrielli, L. Laurenti, R. Marasca, S. Rasi, M. Fangazio, A. Guarini, G. Gaidano and R. Foa (2012) NOTCH1 mutations in +12 chronic lymphocytic leukemia (CLL) confer an unfavorable prognosis, induce a distinctive transcriptional profiling and refine the intermediate prognosis of +12 CLL. Haematologica. 97, den Dunnen, J. T. and S. E. Antonarakis (2000) Mutation nomenclature extensions and suggestions to describe complex mutations: a discussion. Human mutation. 15, Ding, Z. X., H. J. Shen, J. C. Miao, S. N. Chen, Q. C. Qiu, X. F. Qi, Z. M. Jin, D. P. Wu and J. He (2012) [C-kit, NPM1 and FLT3 gene mutation patterns and their prognostic significance in 656 Chinese patients with acute myeloid leukemia]. Zhonghua xue ye xue za zhi = Zhonghua xueyexue zazhi. 33, Dirkse, K. (2010) neoplasma malignum, kanker, carcinoom 93

101 Dufour, A., G. Palermo, E. Zellmeier, G. Mellert, G. Duchateau-Nguyen, S. Schneider, T. Benthaus, P. M. Kakadia, K. Spiekermann, W. Hiddemann, J. Braess, S. Truong, N. Patten, L. Wu, S. Lohmann, D. Dornan, D. GuhaThakurta, R. F. Yeh, G. Salogub, P. Solal-Celigny, A. Dmoszynska, T. Robak, M. Montillo, J. Catalano, C. H. Geisler, M. Weisser and S. K. Bohlander (2013) Inactivation of TP53 correlates with disease progression and low mir-34a expression in previously treated chronic lymphocytic leukemia patients. Blood. 121, ExPASy (2014) UniProtKB/Swiss-Prot variant pages Fabbri, G., S. Rasi, D. Rossi, V. Trifonov, H. Khiabanian, J. Ma, A. Grunn, M. Fangazio, D. Capello, S. Monti, S. Cresta, E. Gargiulo, F. Forconi, A. Guarini, L. Arcaini, M. Paulli, L. Laurenti, L. M. Larocca, R. Marasca, V. Gattei, D. Oscier, F. Bertoni, C. G. Mullighan, R. Foa, L. Pasqualucci, R. Rabadan, R. Dalla-Favera and G. Gaidano (2011) Analysis of the chronic lymphocytic leukemia coding genome: role of NOTCH1 mutational activation. The Journal of experimental medicine. 208, Fasan, A., W. Kern, V. Grossmann, C. Haferlach, T. Haferlach and S. Schnittger (2013) STAT3 mutations are highly specific for large granular lymphocytic leukemia. Leukemia. 27, Ferrando, A. A. (2009) The role of NOTCH1 signaling in T-ALL. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program, Gambacorti-Passerini, C., S. Valletta, N. Winkelmann, S. Redaelli, R. Spinelli, A. Pirola, L. Antolini, L. Mologni, C. Donadoni, E. Papaemmanuil, S. Schnittger, K. Dong-Wook, J. Boultwood, F. Rossi, G. Gaipa, G. De Martini, P. F. di Celle, H. G. Jang, V. Fantin, G. R. Bignell, V. Magistroni, T. Haferlach, E. M. Pogliani, P. Campbell, A. J. Chase, W. J. Tapper, N. C. P. Cross and R. Piazza (2012) Recurrent SETBP1 Mutations in Atypical Chronic Myeloid Leukemia Abrogate an Ubiquitination Site and Dysregulate SETBP1 Protein Levels. Blood Gelsi-Boyer, V., M. Brecqueville, R. Devillier, A. Murati, M. J. Mozziconacci and D. Birnbaum (2012) Mutations in ASXL1 are associated with poor prognosis across the spectrum of malignant myeloid diseases. Journal of hematology & oncology. 5, 12. Gelsi-Boyer, V., V. Trouplin, J. Adelaide, J. Bonansea, N. Cervera, N. Carbuccia, A. Lagarde, T. Prebet, M. Nezri, D. Sainty, S. Olschwang, L. Xerri, M. Chaffanet, M. J. Mozziconacci, N. Vey and D. Birnbaum (2009) Mutations of polycomb-associated gene ASXL1 in myelodysplastic syndromes and chronic myelomonocytic leukaemia. Br J Haematol. 145, Gemovic, B., V. Perovic, S. Glisic and N. Veljkovic (2013) Feature-based classification of amino acid substitutions outside conserved functional protein domains. TheScientificWorldJournal. 2013, Genête, T. (2011) Detection of IDH1 and IDH2 mutations in acute lmyeloid leukemia Genetica, C. v. M. (2013) Fragment analyse Genome, M. C. ( ) KIT in Acute Myeloid Leukemia Gotlib, J. (2013) Activating G-CSF Receptor Mutations in Neutrophilic Leukemias. American Society of Hematology. Gotlib, J., J. E. Maxson, T. I. George and J. W. Tyner (2013) The new genetics of chronic neutrophilic leukemia and atypical CML: implications for diagnosis and treatment. Blood. 122, Hagenkord, J. M., F. A. Monzon, S. F. Kash, S. Lilleberg, Q. M. Xie and J. A. Kant (2010) Array-Based Karyotyping for Prognostic Assessment in Chronic Lymphocytic Leukemia Performance Comparison of Affymetrix 10K2.0, 250K Nsp, and SNP6.0 Arrays. Journal of Molecular Diagnostics. 12, Hallek, M., B. D. Cheson, D. Catovsky, F. Caligaris-Cappio, G. Dighiero, H. Dohner, P. Hillmen, M. J. Keating, E. Montserrat, K. R. Rai, T. J. Kipps and L. International Workshop on Chronic Lymphocytic (2008) Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111, He, X., Z. G. Chen, Y. Y. Jiang, X. Qiu and X. Y. Zhao (2013) Different mutations of the human c-mpl gene indicate distinct haematopoietic diseases. Journal of hematology & oncology. 6. Healthcare (2014) Sephadex G-50 Superfine Hou, H. A., Y. Y. Kuo, C. Y. Liu, W. C. Chou, M. C. Lee, C. Y. Chen, L. I. Lin, M. H. Tseng, C. F. Huang, Y. C. Chiang, F. Y. Lee, M. C. Liu, C. W. Liu, J. L. Tang, M. Yao, S. Y. Huang, B. S. Ko, S. C. Hsu, S. J. Wu, W. 94

102 Tsay, Y. C. Chen and H. F. Tien (2012) DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia: stability during disease evolution and clinical implications. Blood. 119, Hou, H. A., Y. Y. Kuo, J. L. Tang, W. C. Chou, M. Yao, Y. J. Lai, C. C. Lin, C. Y. Chen, C. Y. Liu, M. H. Tseng, C. F. Huang, Y. C. Chiang, F. Y. Lee, M. C. Liu, C. W. Liu, S. Y. Huang, B. S. Ko, S. J. Wu, W. Tsay, Y. C. Chen and H. F. Tien (2014) Clinical implications of the SETBP1 mutation in patients with primary myelodysplastic syndrome and its stability during disease progression. American journal of hematology. 89, Hussain, S., F. Ahmed, H. Naqvi, P. Singh, F. Mahdi and S. Babu (2009) C-kit proto-oncogene deletion and pointmutation at exon 8, 17 in human acute myeloid leukemia Turkish Journal of Cancer. 39. Hussain, S., S. Raza, S. Babu, P. Singh, H. Naqvi and F. Mahdi (2011) Screening of C-kit gene Mutation in Acute Myeloid Leukaemia in Northern India. Iran J Cancer Prev. Institute, T. S. (2014) Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC) Jenkinson, S., K. Koo, M. R. Mansour, N. Goulden, A. Vora, C. Mitchell, R. Wade, S. Richards, J. Hancock, A. V. Moorman, D. C. Linch and R. E. Gale (2013) Impact of NOTCH1/FBXW7 mutations on outcome in pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia patients treated on the MRC UKALL 2003 trial. Leukemia. 27, Jerez, A., M. J. Clemente, H. Makishima, H. Koskela, F. Leblanc, K. Peng Ng, T. Olson, B. Przychodzen, M. Afable, I. Gomez-Segui, K. Guinta, L. Durkin, E. D. Hsi, K. McGraw, D. Zhang, M. W. Wlodarski, K. Porkka, M. A. Sekeres, A. List, S. Mustjoki, T. P. Loughran and J. P. Maciejewski (2012) STAT3 mutations unify the pathogenesis of chronic lymphoproliferative disorders of NK cells and T-cell large granular lymphocyte leukemia. Blood. 120, Kaushansky, K. (2006) Lineage-specific hematopoietic growth factors. The New England journal of medicine. 354, Kim, S. J., H. Zhao, S. Hardikar, A. K. Singh, M. A. Goodell and T. Chen (2013) A DNMT3A mutation common in AML exhibits dominant-negative effects in murine ES cells. Blood. 122, Kong, Y., L. Si, Y. Zhu, X. Xu, C. L. Corless, K. T. Flaherty, L. Li, H. Li, X. Sheng, C. Cui, Z. Chi, S. Li, M. Han, L. Mao, A. Lu and J. Guo (2011) Large-scale analysis of KIT aberrations in Chinese patients with melanoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 17, Koskela, H. L., S. Eldfors, P. Ellonen, A. J. van Adrichem, H. Kuusanmaki, E. I. Andersson, S. Lagstrom, M. J. Clemente, T. Olson, S. E. Jalkanen, M. M. Majumder, H. Almusa, H. Edgren, M. Lepisto, P. Mattila, K. Guinta, P. Koistinen, T. Kuittinen, K. Penttinen, A. Parsons, J. Knowles, J. Saarela, K. Wennerberg, O. Kallioniemi, K. Porkka, T. P. Loughran, Jr., C. A. Heckman, J. P. Maciejewski and S. Mustjoki (2012) Somatic STAT3 mutations in large granular lymphocytic leukemia. The New England journal of medicine. 366, Kosmider, O., R. Itzykson, V. Chesnais, T. Lasho, R. Laborde, R. Knudson, A. Gauthier, J. Merlevede, L. Ades, M. Morabito, M. Fontenay, A. Tefferi, N. Droin and E. Solary (2013) Mutation of the colonystimulating factor-3 receptor gene is a rare event with poor prognosis in chronic myelomonocytic leukemia. Leukemia. 27, Kristensen, T., H. Vestergaard and M. B. Moller (2011) Improved Detection of the KIT D816V Mutation in Patients with Systemic Mastocytosis Using a Quantitative and Highly Sensitive Real-Time qpcr Assay. Journal of Molecular Diagnostics. 13, Laborde, R. R., M. M. Patnaik, T. L. Lasho, C. M. Finke, C. A. Hanson, R. A. Knudson, R. P. Ketterling, A. Pardanani and A. Tefferi (2013) SETBP1 mutations in 415 patients with primary myelofibrosis or chronic myelomonocytic leukemia: independent prognostic impact in CMML. Leukemia. 27, Laurini, J. A., P. Aoun, J. Iqbal, W. Chan and T. C. Greiner (2012) Investigation of the BRAF V600E mutation by pyrosequencing in lymphoproliferative disorders. Am J Clin Pathol. 138, Lawyer, F. C., S. Stoffel, R. K. Saiki, K. Myambo, R. Drummond and D. H. Gelfand (1989) Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. The Journal of biological chemistry. 264, Lee, T. S., H. Kantarjian, W. L. Ma, C. H. Yeh, F. Giles and M. Albitar (2011) Effects of Clinically Relevant MPL Mutations in the Transmembrane Domain Revealed at the Atomic Level through Computational Modeling. Plos One

103 Ley, T. J., L. Ding, M. J. Walter, M. D. McLellan, T. Lamprecht, D. E. Larson, C. Kandoth, J. E. Payton, J. Baty, J. Welch, C. C. Harris, C. F. Lichti, R. R. Townsend, R. S. Fulton, D. J. Dooling, D. C. Koboldt, H. Schmidt, Q. Zhang, J. R. Osborne, L. Lin, M. O'Laughlin, J. F. McMichael, K. D. Delehaunty, S. D. McGrath, L. A. Fulton, V. J. Magrini, T. L. Vickery, J. Hundal, L. L. Cook, J. J. Conyers, G. W. Swift, J. P. Reed, P. A. Alldredge, T. Wylie, J. Walker, J. Kalicki, M. A. Watson, S. Heath, W. D. Shannon, N. Varghese, R. Nagarajan, P. Westervelt, M. H. Tomasson, D. C. Link, T. A. Graubert, J. F. DiPersio, E. R. Mardis and R. K. Wilson (2010) DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. The New England journal of medicine. 363, Li, L., X. D. Lyu, R. H. Mi, J. Ding, L. Chen, Q. Wang, Q. S. Yin, J. Y. Hu, R. H. Fan and X. D. Wei (2013) [Detection of NPM1, FLT3 and C-KIT mutations in acute myeloid leukemia and their prognostic analysis]. Zhongguo shi yan xue ye xue za zhi / Zhongguo bing li sheng li xue hui = Journal of experimental hematology / Chinese Association of Pathophysiology. 21, Lim, K. H., A. Tefferi, T. L. Lasho, C. Finke, M. Patnaik, J. H. Butterfield, R. F. McClure, C. Y. Li and A. Pardanani (2009) Systemic mastocytosis in 342 consecutive adults: survival studies and prognostic factors. Blood. 113, Liongue, C. and A. Ward (2014) Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptor mutations in myeloid malignancy. Frontiers in Oncology. Lodish, H. F. (2013) Molecular cell biology, 7th ed., W.H. Freeman and Co., New York Loewe, L. (2008) Genetic Mutation. Nature Education. Loughran, T. (2012) Large Granular Lymphocytic Leukemia Makishima, H., K. Yoshida, N. Nguyen, B. Przychodzen, M. Sanada, Y. Okuno, K. P. Ng, K. O. Gudmundsson, B. A. Vishwakarma, A. Jerez, I. Gomez-Segui, M. Takahashi, Y. Shiraishi, Y. Nagata, K. Guinta, H. Mori, M. A. Sekeres, K. Chiba, H. Tanaka, H. Muramatsu, H. Sakaguchi, R. L. Paquette, M. A. McDevitt, S. Kojima, Y. Saunthararajah, S. Miyano, L. Y. Shih, Y. Du, S. Ogawa and J. P. Maciejewski (2013) Somatic SETBP1 mutations in myeloid malignancies. Nat Genet. 45, 942-U298. Malecki, M. J., C. Sanchez-Irizarry, J. L. Mitchell, G. Histen, M. L. Xu, J. C. Aster and S. C. Blacklow (2006) Leukemia-associated mutations within the NOTCH1 heterodimerization domain fall into at least two distinct mechanistic classes. Mol Cell Biol. 26, Mansour, M. R., D. C. Linch, L. Foroni, A. H. Goldstone and R. E. Gale (2006) High incidence of Notch-1 mutations in adult patients with T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 20, Mansur, M. B., M. Emerenciano, A. Splendore, L. Brewer, R. Hassan, M. S. Pombo-De-Oliveira and B. C. S. Grp (2010) T-cell lymphoblastic leukemia in early childhood presents NOTCH1 mutations and MLL rearrangements. Leukemia research. 34, Marinelli, M., N. Peragine, V. Di Maio, S. Chiaretti, M. S. De Propris, S. Raponi, S. Tavolaro, F. R. Mauro, I. Del Giudice, A. Guarini and R. Foa (2013) Identification of molecular and functional patterns of p53 alterations in chronic lymphocytic leukemia patients in different phases of the disease. Haematologica. 98, Matthews, D. J. and M. E. Gerritsen (2010) Targeting protein kinases for cancer therapy, John Wiley & Sons, Hoboken, N.J. Maxson, J. E., J. Gotlib, D. A. Pollyea, A. G. Fleischman, A. Agarwal, C. A. Eide, D. Bottomly, B. Wilmot, S. K. McWeeney, C. E. Tognon, J. B. Pond, R. H. Collins, B. Goueli, S. T. Oh, M. W. Deininger, B. H. Chang, M. M. Loriaux, B. J. Druker and J. W. Tyner (2013) Oncogenic CSF3R Mutations in Chronic Neutrophilic Leukemia and Atypical CML. New Engl J Med. 368, Medicine, U. S. N. L. o. (2013) MYD88 myeloid differentiation primary response 88 [Homo sapiens (human)] Meggendorfer, M., T. Alpermann, T. Haferlach, C. Schrauder, R. Konietschke, C. Haferlach, W. Kern and S. Schnittger (2013a) Mutational Screening Of CSF3R, ASXL1, SETBP1, and SRSF2 In Chronic Neutrophilic Leukemia (CNL), Atypical CML and CMML Cases. American Society of Hematology. Meggendorfer, M., U. Bacher, T. Alpermann, C. Haferlach, W. Kern, C. Gambacorti-Passerini, T. Haferlach and S. Schnittger (2013b) SETBP1 mutations occur in 9% of MDS/ and in 4% of cases and are strongly associated with atypical CML, monosomy 7, isochromosome i(17)(q10), ASXL1 and CBL mutations. Leukemia. 27, Metzeler, K. H., H. Becker, K. Maharry, M. D. Radmacher, J. Kohlschmidt, K. Mrozek, D. Nicolet, S. P. Whitman, Y. Z. Wu, S. Schwind, B. L. Powell, T. H. Carter, M. Wetzler, J. O. Moore, J. E. Kolitz, M. 96

104 R. Baer, A. J. Carroll, R. A. Larson, M. A. Caligiuri, G. Marcucci and C. D. Bloomfield (2011) ASXL1 mutations identify a high-risk subgroup of older patients with primary cytogenetically normal AML within the ELN Favorable genetic category. Blood. 118, Millipore (2014) MultiScreen-HV Modlich, U., N. Heinz, S. Kohlscheen, L. Latorre and F. Schenk (2013) Thrombopoietin-induced genes and pathways for the regeneration of hematopoietic stem cells. Movva, S. (2013) Understanding Cancer -- the Basics Mozziconacci, M. and D. Birnbaum (2010) ASXL1 (additional sex combs like 1 (Drosophila)). Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. Neumann, M., S. Heesch, C. Schlee, S. Schwartz, N. Goekbuget, D. Hoelzer, N. P. Konstandin, B. Ksienzyk, A. Graf, S. Krebs, H. Blum, T. Raff, M. Brueggemann, W. K. Hofmann, S. K. Bohlander, P. A. Greif and C. D. Baldus (2012) Exome Sequencing Identifies Recurring DNMT3A Mutations in Adult ETP- ALL. Blood O'Neill, L. A. and A. G. Bowie (2007) The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signalling. Nature reviews. Immunology. 7, Ogino, S., M. L. Gulley, J. T. den Dunnen, R. B. Wilson, T. Association for Molecular Patholpogy and C. Education (2007) Standard mutation nomenclature in molecular diagnostics: practical and educational challenges. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 9, 1-6. Olivier, M., Eeles, R., Hollstein, M., Khan, M.A., Harris, C.C. & Hainaut, P. (2005) The IARC TP53 Database: new online mutation analysis and recommendations to users. Olsen, R. J., C. H. Dunphy, D. P. O'Malley, L. Rice, A. A. Ewton and C. C. Chang (2008) The implication of identifying JAK2 ( V617F ) in myeloproliferative neoplasms and myelodysplastic syndromes with bone marrow fibrosis. Journal of hematopathology. 1, Oncology, I. (2013) MPL Mutation Analysis Ondrejka, S. L., J. J. Lin, D. W. Warden, L. Durkin, J. R. Cook and E. D. Hsi (2013) MYD88 L265P Somatic Mutation Its Usefulness in the Differential Diagnosis of Bone Marrow Involvement by B-Cell Lymphoproliferative Disorders. Am J Clin Pathol. 140, Owen, R. G., S. L. Barrans, S. J. Richards, S. J. M. O'Connor, J. A. Child, L. A. Parapia, G. J. Morgan and A. S. Jack (2001) Waldenstrom macroglobulinemia - Development of diagnostic criteria and identification of prognostic factors. Am J Clin Pathol. 116, Pardanani, A., P. Guglielmelli, T. L. Lasho, A. Pancrazzi, C. M. Finke, A. M. Vannucchi and A. Tefferi (2011) Primary myelofibrosis with or without mutant MPL: comparison of survival and clinical features involving 603 patients. Leukemia. 25, Pardanani, A., T. L. Lasho, R. R. Laborde, M. Elliott, C. A. Hanson, R. A. Knudson, R. P. Ketterling, J. E. Maxson, J. W. Tyner and A. Tefferi (2013) CSF3R T618I is a highly prevalent and specific mutation in chronic neutrophilic leukemia. Leukemia. 27, Parekh, S. (2012) Taking it up a notch in MCL. Blood. 119, Park, M. J., T. Taki, M. Oda, T. Watanabe, K. Yumura-Yagi, R. Kobayashi, N. Suzuki, J. Hara, K. Horibe and Y. Hayashi (2009) FBXW7 and NOTCH1 mutations in childhood T cell acute lymphoblastic leukaemia and T cell non-hodgkin lymphoma. Brit J Haematol. 145, Park, S. H., H. S. Chi, S. K. Min, B. G. Park, S. Jang and C. J. Park (2011) Prognostic impact of c-kit mutations in core binding factor acute myeloid leukemia. Leukemia research. 35, Paschka, P., R. F. Schlenk, V. I. Gaidzik, M. Habdank, J. Kronke, L. Bullinger, D. Spath, S. Kayser, M. Zucknick, K. Gotze, H. A. Horst, U. Germing, H. Dohner and K. Dohner (2010) IDH1 and IDH2 mutations are frequent genetic alterations in acute myeloid leukemia and confer adverse prognosis in cytogenetically normal acute myeloid leukemia with NPM1 mutation without FLT3 internal tandem duplication. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 28, Patel, K. P., B. A. Barkoh, Z. Chen, D. Q. Ma, N. Reddy, L. J. Medeiros and R. Luthra (2011a) Diagnostic Testing for IDH1 and IDH2 Variants in Acute Myeloid Leukemia An Algorithmic Approach Using High-Resolution Melting Curve Analysis. Journal of Molecular Diagnostics. 13,

105 Patel, K. P., F. Ravandi, D. Ma, A. Paladugu, B. A. Barkoh, L. J. Medeiros and R. Luthra (2011b) Acute myeloid leukemia with IDH1 or IDH2 mutation: frequency and clinicopathologic features. Am J Clin Pathol. 135, Pavletich, N. P., K. A. Chambers and C. O. Pabo (1993) The DNA-Binding Domain of P53 Contains the 4 Conserved Regions and the Major Mutation Hot-Spots. Gene Dev. 7, Pekova, S., O. Mazal, R. Cmejla, D. W. Hardekopf, R. Plachy, L. Zejskova, R. Haugvicova, T. Jancuskova, M. Karas, V. Koza, L. Smolej, L. Bezdickova and T. Kozak (2011) A comprehensive study of TP53 mutations in chronic lymphocytic leukemia: Analysis of 1287 diagnostic and 1148 follow-up CLL samples. Leukemia research. 35, Perkins, A. (2013) Harnessing tumour banks to improve patient outcomes. Perrotti, D. and P. Neviani (2008) Protein phosphatase 2A (PP2A), a drugable tumor suppressor in Ph1(+) leukemias. Cancer metastasis reviews. 27, Piazza, R., S. Valletta, N. Winkelmann, S. Redaelli, R. Spinelli, A. Pirola, L. Antolini, L. Mologni, C. Donadoni, E. Papaemmanuil, S. Schnittger, D. W. Kim, J. Boultwood, F. Rossi, G. Gaipa, G. P. De Martini, P. F. di Celle, H. G. Jang, V. Fantin, G. R. Bignell, V. Magistroni, T. Haferlach, E. M. Pogliani, P. J. Campbell, A. J. Chase, W. J. Tapper, N. C. Cross and C. Gambacorti-Passerini (2013) Recurrent SETBP1 mutations in atypical chronic myeloid leukemia. Nat Genet. 45, Pietra, D., A. Brisci, E. Rumi, S. Boggi, C. Elena, A. Pietrelli, R. Bordoni, M. Ferrari, F. Passamonti, G. De Bellis, L. Cremonesi and M. Cazzola (2011) Deep sequencing reveals double mutations in cis of MPL exon 10 in myeloproliferative neoplasms. Haematologica. 96, Pollard, J. A., T. A. Alonzo, R. B. Gerbing, P. A. Ho, R. Zeng, Y. Ravindranath, G. Dahl, N. J. Lacayo, D. Becton, M. Chang, H. J. Weinstein, B. Hirsch, S. C. Raimondi, N. A. Heerema, W. G. Woods, B. J. Lange, C. Hurwitz, R. J. Arceci, J. P. Radich, I. D. Bernstein, M. C. Heinrich and S. Meshinchi (2010) Prevalence and prognostic significance of KIT mutations in pediatric patients with core binding factor AML enrolled on serial pediatric cooperative trials for de novo AML. Blood. 115, Pospisilova, S., D. Gonzalez, J. Malcikova, M. Trbusek, D. Rossi, A. P. Kater, F. Cymbalista, B. Eichhorst, M. Hallek, H. Dohner, P. Hillmen, M. van Oers, J. Gribben, P. Ghia, E. Montserrat, S. Stilgenbauer, T. Zenz and C. L. L. European Research Initiative on (2012) ERIC recommendations on TP53 mutation analysis in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 26, Pospisilova, S., J. Malcikova, J. Damborsky, J. Smardova, M. Trbusek, B. Tichy, Y. Brychtova, M. Doubek, J. Vorlicek and J. Mayer (2006) Role of p53 gene mutation type in B-CLL prognosis. Blood. 108, 159b-160b. Pratcorona, M., S. Abbas, M. A. Sanders, J. E. Koenders, F. G. Kavelaars, C. A. Erpelinck-Verschueren, A. Zeilemakers, B. Lowenberg and P. J. Valk (2012) Acquired mutations in ASXL1 in acute myeloid leukemia: prevalence and prognostic value. Haematologica. 97, Prensner, J. R. and A. M. Chinnaiyan (2011) Metabolism unhinged: IDH mutations in cancer. Nature medicine. 17, Qiu, Z. Y., L. Fan, L. Wang, C. Qiao, Y. J. Wu, J. F. Zhou, W. Xu and J. Y. Li (2013) STAT3 mutations are frequent in T-cell large granular lymphocytic leukemia with pure red cell aplasia. Journal of hematology & oncology. 6, 82. Ranganathan, P., K. L. Weaver and A. J. Capobianco (2011) Notch signalling in solid tumours: a little bit of everything but not all the time. Nat Rev Cancer. 11, Ribeiro, A. F. T., M. Pratcorona, C. Erpelinck-Verschueren, V. Rockova, M. Sanders, S. Abbas, M. E. Figueroa, A. Zeilemaker, A. Melnick, B. Lowenberg, P. J. M. Valk and R. Delwel (2012) Mutant DNMT3A: a marker of poor prognosis in acute myeloid leukemia. Blood. 119, Riera, L., F. Marmont, D. Toppino, C. Frairia, F. Sismondi, E. Audisio, C. Di Bello, S. D'Ardia, P. F. Di Celle, E. Messa, G. Inghirami, U. Vitolo and A. Pich (2013) Core binding factor acute myeloid leukaemia and c-kit mutations. Oncology reports. 29, Roller, A., V. Grossmann, U. Bacher, F. Poetzinger, S. Weissmann, N. Nadarajah, L. Boeck, W. Kern, C. Haferlach, S. Schnittger, T. Haferlach and A. Kohlmann (2013) Landmark analysis of DNMT3A mutations in hematological malignancies. Leukemia. 27, Royster, J. (2010) Diagnosing GIST Ryan, K. M., A. C. Phillips and K. H. Vousden (2001) Regulation and function of the p53 tumor suppressor protein. Current opinion in cell biology. 13,

106 Sala, E., L. Ruggiero, G. Di Giacomo and O. Cremona (2012) Endocytosis in Notch Signaling Activation Sanger, F. and A. R. Coulson (1975) A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of molecular biology. 94, Sano, H., K. Ohki, M. Park, Y. Hara, N. Shiba, D. Tomizawa, T. Taga, A. Saito, J. Fujimoto, A. Tawa, K. Horibe, S. Adachi and Y. Hayashi (2013) CSF3R Gene Mutations In Myeloid Malignancy Of Childhood. American Society of Hematology. Schmitt-Graeff, A. H., S. S. Teo, M. Olschewski, F. Schaub, S. Haxelmans, A. Kim, P. Reinecke, U. Germing and R. C. Skoda (2008) JAK2(V617F) mutation status identifies subtypes of refractory anemia with ringed sideroblasts associated with marked thrombocytosis. Haematol-Hematol J. 93, Schnittger, S., U. Bacher, C. Haferlach, R. Dengler, A. Krober, W. Kern and T. Haferlach (2008) Detection of an MPLW515 mutation in a case with features of both essential thrombocythemia and refractory anemia with ringed sideroblasts and thrombocytosis. Leukemia. 22, Schnittger, S., C. Eder, S. Jeromin, T. Alpermann, A. Fasan, V. Grossmann, A. Kohlmann, T. Illig, N. Klopp, H. E. Wichmann, K. A. Kreuzer, C. Schmid, P. Staib, R. Peceny, N. Schmitz, W. Kern, C. Haferlach and T. Haferlach (2013) ASXL1 exon 12 mutations are frequent in AML with intermediate risk karyotype and are independently associated with an adverse outcome. Leukemia. 27, Schnittger, S., T. M. Kohl, T. Haferlach, W. Kern, W. Hiddemann, K. Spiekermann and C. Schoch (2006) KIT- D816 mutations in AML1-ETO-positive AML are associated with impaired event-free and overall survival. Blood. 107, Scholten, L. (2013) Morfologie van bloed en beenmerg Deventer Schuit, F. C. (2000) Medische biochemie, Bohn Stafleu Van Loghum Schwind, S., C. G. Edwards, D. Nicolet, K. Mrozek, K. Maharry, Y. Z. Wu, P. Paschka, A. K. Eisfeld, P. Hoellerbauer, H. Becker, K. H. Metzeler, J. Curfman, J. Kohlschmidt, T. W. Prior, J. E. Kolitz, W. Blum, M. J. Pettenati, P. Dal Cin, A. J. Carroll, M. A. Caligiuri, R. A. Larson, S. Volinia, G. Marcucci, C. D. Bloomfield and O. Alliance for Clinical Trials in (2013) inv(16)/t(16;16) acute myeloid leukemia with non-type A CBFB-MYH11 fusions associate with distinct clinical and genetic features and lack KIT mutations. Blood. 121, Science, W. I. o. (2013) The GeneCards Human Gene Database Sheer, D., M. Lurantos and A. Pitt (1997) High Throughput Sample Preparation for Protein/Peptide Structural Characterization. Shih, A. H., O. Abdel-Wahab, J. P. Patel and R. L. Levine (2012) The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies. Nat Rev Cancer. 12, Shivarov, V., R. Gueorguieva, A. Stoimenov and R. Tiu (2013) DNMT3A mutation is a poor prognosis biomarker in AML: Results of a meta-analysis of 4500 AML patients. Leukemia research. 37, Shlush, L. I., S. Zandi, A. Mitchell, W. C. Chen, J. M. Brandwein, V. Gupta, J. A. Kennedy, A. D. Schimmer, A. C. Schuh, K. W. Yee, J. L. McLeod, M. Doedens, J. J. Medeiros, R. Marke, H. J. Kim, K. Lee, J. D. McPherson, T. J. Hudson, H. P.-L. G. P. Consortium, A. M. Brown, F. Yousif, Q. M. Trinh, L. D. Stein, M. D. Minden, J. C. Wang and J. E. Dick (2014) Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia. Nature. 506, Sigma-Aldrich (2014) Gel Filtration Chromatography Silva, A., P. Y. Jotta, A. B. Silveira, D. Ribeiro, S. R. Brandalise, J. A. Yunes and J. T. Barata (2010) Regulation of PTEN by CK2 and Notch1 in primary T-cell acute lymphoblastic leukemia: rationale for combined use of CK2-and gamma-secretase inhibitors. Haematol-Hematol J. 95, Soussi, T. (2012a) TP53 Mutations In Human Cancer Soussi, T. (2012b) The TP53 Web Site Swerdlow, S. H., E. Campo, N. L. Harris, E. S. Jaffe, S. A. Pileri, H. Stein, J. Thiele and J. W. Vardiman (2008) WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, 4th ed., International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon Technologies, L. (2014) 3500xL Genetic Analyzer for Human Identification Tefferi, A., P. Noel and C. A. Hanson (2011) Uses and abuses of JAK2 and MPL mutation tests in myeloproliferative neoplasms a paper from the 2010 William Beaumont hospital symposium on molecular pathology. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 13,

107 Testa, U. and E. Pelosi (2013) The Impact of FLT3 Mutations on the Development of Acute Myeloid Leukemias. Leukemia research and treatment. 2013, Thol, F., F. Damm, A. Ludeking, C. Winschel, K. Wagner, M. Morgan, H. Y. Yun, G. Gohring, B. Schlegelberger, D. Hoelzer, M. Lubbert, L. Kanz, W. Fiedler, H. Kirchner, G. Heil, J. Krauter, A. Ganser and M. Heuser (2011a) Incidence and Prognostic Influence of DNMT3A Mutations in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Clinical Oncology. 29, Thol, F., I. Friesen, F. Damm, H. Yun, E. M. Weissinger, J. Krauter, K. Wagner, A. Chaturvedi, A. Sharma, M. Wichmann, G. Gohring, C. Schumann, G. Bug, O. Ottmann, W. K. Hofmann, B. Schlegelberger, M. Heuser and A. Ganser (2011b) Prognostic significance of ASXL1 mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 29, Thol, F., K. J. Suchanek, C. Koenecke, M. Stadler, U. Platzbecker, C. Thiede, T. Schroeder, G. Kobbe, S. Kade, P. Loffeld, S. Banihosseini, G. Bug, O. Ottmann, W. K. Hofmann, J. Krauter, N. Kroger, A. Ganser and M. Heuser (2013) SETBP1 mutation analysis in 944 patients with MDS and AML. Leukemia. 27, Tiacci, E., V. Trifonov, G. Schiavoni, A. Holmes, W. Kern, M. P. Martelli, A. Pucciarini, B. Bigerna, R. Pacini, V. A. Wells, P. Sportoletti, V. Pettirossi, R. Mannucci, O. Elliott, A. Liso, A. Ambrosetti, A. Pulsoni, F. Forconi, L. Trentin, G. Semenzato, G. Inghirami, M. Capponi, F. Di Raimondo, C. Patti, L. Arcaini, P. Musto, S. Pileri, C. Haferlach, S. Schnittger, G. Pizzolo, R. Foa, L. Farinelli, T. Haferlach, L. Pasqualucci, R. Rabadan and B. Falini (2011) BRAF mutations in hairy-cell leukemia. The New England journal of medicine. 364, Treon, S. P., L. Xu, G. Yang, Y. Zhou, X. Liu, Y. Cao, P. Sheehy, R. J. Manning, C. J. Patterson, C. Tripsas, L. Arcaini, G. S. Pinkus, S. J. Rodig, A. R. Sohani, N. L. Harris, J. M. Laramie, D. A. Skifter, S. E. Lincoln and Z. R. Hunter (2012) MYD88 L265P somatic mutation in Waldenstrom's macroglobulinemia. The New England journal of medicine. 367, Umehara, Y., K. Hanaoka and D. Watanabe (2013) Distinct functions of Dnmt3a and Dnmt3b de novo DNA methyltransferases in ES cell proliferation and differentiation. Stem Cell Discovery. 3, UniProt (2014) Protein knowledgebase Vainchenker, W. and S. N. Constantinescu (2013) JAK/STAT signaling in hematological malignancies. Oncogene. 32, Van der Reijden, B. A., M. Massop, A. Simons, T. de Witte, M. Breuning and J. H. Jansen (2010) The NDE1 gene is disrupted by the inv(16) in 90% of cases with CBFB-MYH11-positive acute myeloid leukemia. Leukemia. 24, Van Vlierberghe, P. and A. Ferrando (2012) The molecular basis of T cell acute lymphoblastic leukemia. The Journal of clinical investigation. 122, Vanderbilt (2013) My Cancer Genome Vannucchi, A. M. and P. Guglielmelli (2008) Molecular pathophysiology of Philadelphia-negative myeloproliferative disorders: beyond JAK2 and MPL mutations. Haematologica. 93, Varettoni, M., L. Arcaini, S. Zibellini, E. Boveri, S. Rattotti, R. Riboni, A. Corso, E. Orlandi, M. Bonfichi, M. Gotti, C. Pascutto, S. Mangiacavalli, G. Croci, V. Fiaccadori, L. Morello, M. L. Guerrera, M. Paulli and M. Cazzola (2013) Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenstrom's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121, Verma, S., W. O. Greaves, F. Ravandi, N. Reddy, C. E. Bueso-Ramos, S. O'Brien, D. A. Thomas, H. Kantarjian, L. J. Medeiros, R. Luthra and K. P. Patel (2012) Rapid Detection and Quantitation of BRAF Mutations in Hairy Cell Leukemia Using a Sensitive Pyrosequencing Assay. Am J Clin Pathol. 138, Verstovsek, S. (2013) Advanced systemic mastocytosis: the impact of KIT mutations in diagnosis, treatment, and progression. European journal of haematology. 90, Vogelstein, B., D. Lane and A. J. Levine (2000) Surfing the p53 network. Nature. 408, W.J.Wiersinga and T. v. d. Poll (2005) Toll-like receptoren en de betekenis voor de kliniek. Ned Tijdschr Geneeskd. 149, Wagner, K., F. Damm, G. Gohring, K. Gorlich, M. Heuser, I. Schafer, O. Ottmann, M. Lubbert, W. Heit, L. Kanz, G. Schlimok, A. A. Raghavachar, W. Fiedler, H. H. Kirchner, W. Brugger, M. Zucknick, B. 100

108 Schlegelberger, G. Heil, A. Ganser and J. Krauter (2010) Impact of IDH1 R132 Mutations and an IDH1 Single Nucleotide Polymorphism in Cytogenetically Normal Acute Myeloid Leukemia: SNP rs Is an Adverse Prognostic Factor. Journal of Clinical Oncology. 28, Watters, T. M., E. F. Kenny and L. A. O'Neill (2007) Structure, function and regulation of the Toll/IL-1 receptor adaptor proteins. Immunol Cell Biol. 85, West, R. R., A. P. Hsu, S. M. Holland, J. Cuellar-Rodriguez and D. D. Hickstein (2014) Acquired ASXL1 mutations are common in patients with inherited GATA2 mutations and correlate with myeloid transformation. Haematologica. 99, Whitfield, E. (2013) Mutation nomenclature WHO (2012) Cancer Prevention and Control Willander, K., R. K. Dutta, J. Ungerback, R. Gunnarsson, G. Juliusson, M. Fredrikson, M. Linderholm and P. Soderkvist (2013) NOTCH1 mutations influence survival in chronic lymphocytic leukemia patients. BMC cancer. 13, 274. Willenbacher, W., E. Willenbacher, A. Brunner and C. Manzl (2013) Improved accuracy of discrimination between IgM Multiple Myeloma and Waldenstrom Macroglobulinaemia by testing for MYD88 L265P mutations. Brit J Haematol. 161, Wong, K. B., B. S. DeDecker, S. M. V. Freund, M. R. Proctor, M. Bycroft and A. R. Fersht (1999) Hot-spot mutants of p53 core domain evince characteristic local structural changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, Xu, L., A. R. Sohani, L. Arcaini, Z. Hunter, G. Yang, Y. S. Zhou, X. Liu, Y. Cao, R. Manning, C. J. Patterson, L. Ioakimidis, C. Tripsas, G. S. Pinkus, N. L. Harris, S. J. Rodig and S. Treon (2011) A Somatic Variant in MYD88 (L265P) Revealed by Whole Genome Sequencing Differentiates Lymphoplasmacytic Lymphoma From Marginal Zone Lymphomas. Blood. 118, Yang, H., D. Ye, K. L. Guan and Y. Xiong (2012) IDH1 and IDH2 mutations in tumorigenesis: mechanistic insights and clinical perspectives. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, Yu, H., M. Kortylewski and D. Pardoll (2007) Crosstalk between cancer and immune cells: role of STAT3 in the tumour microenvironment. Nature Reviews Immunology. 7, Zainuddin, N., F. Murray, M. Kanduri, R. Gunnarsson, K. E. Smedby, G. Enblad, J. Jurlander, G. Juliusson and R. Rosenquist (2011) TP53 Mutations are infrequent in newly diagnosed chronic lymphocytic leukemia. Leukemia research. 35, Zenz, T., B. Eichhorst, R. Busch, T. Denzel, S. Habe, D. Winkler, A. Buhler, J. Edelmann, M. Bergmann, G. Hopfinger, M. Hensel, M. Hallek, H. Dohner and S. Stilgenbauer (2010) TP53 mutation and survival in chronic lymphocytic leukemia. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 28, Zhu, Y. M., W. L. Zhao, J. F. Fu, J. Y. Shi, Q. Pan, J. Hu, X. D. Gao, B. Chen, J. M. Li, S. M. Xiong, L. J. Gu, J. Y. Tang, H. Liang, H. Jiang, Y. Q. Xue, Z. X. Shen, Z. Chen and S. J. Chen (2006) NOTCH1 mutations in T-cell acute lymphoblastic leukemia: prognostic significance and implication in multifactorial leukemogenesis. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 12, Ziai, J., R. Torres and C. Tormey (2010) Chronic Neutrophilic Leukemia: A Rare and Difficult Diagnosis of Exclusion. Journal of Blood Disorders & Transfusion. 101

109 Bijlage I: Overzicht positieve stalen Tabel 37: Overzicht positieve stalen ASXL1-gen Patiënt Mutatie Staaltype Diagnose Moleculaire testen (Mutaties) CI c.2110g>a Beenmerg AML EVI1 overexpressie (p.gly704arg) HEVI afwezig FLT3-ITD DNA afwezig NPM1 afwezig CEBPA afwezig FISH FICSF1R afwezig Verwijzing Figuur 52 DA CI DB CG CF c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) c.1900_1922del (p.glu635argfsx15) c.2122c>t (p.gln708x) c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) Beenmerg AML EVI1 geen overexpressie HEVI afwezig FLT3-ITD DNA afwezig NPM1 type A aanwezig CEBPA afwezig Beenmerg AML EVI1 geen overexpressie HEVI afwezig FLT3-ITD DNA afwezig NPM1 afwezig CEBPA afwezig Beenmerg MDS/ BCRABL afwezig JAK2 V617F afwezig CALR afwezig MPL afwezig SETBP1 afwezig Beenmerg MDS/ BCRABL afwezig EVI1 geen overexpressie HEVI afwezig FLT3-ITD DNA afwezig NPM1 mutatie afwezig CEBPA mutatie afwezig Perifeer bloed AML BCRABL afwezig JAK2 V614F afwezig CALR afwezig HEVI afwezig Leuven: geen Figuur 58 breukpunten vastgesteld, kleine celfractie met trisomie 3 / Figuren 54 en 55 / Figuur 53 / Figuur 58 / Figuur 58 BD BB OF L J BI C c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) c.1772dupa (p.tyr591x) c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) Beenmerg MDS/ BCRABL afwezig JAK2 V617F afwezig FLT3-ITD DNA afwezig NPM1 afwezig CEBPA aanwezig 40,9% mutant TAD1 & BZIP Beenmerg MDS/ BCRABL afwezig JAK2 V617F afwezig Beenmerg MDS/ BCRABL afwezig JAK2 V617F afwezig Beenmerg MDS/ BCRABL afwezig JAK2 V617F afwezig SETBP1 aanwezig Beenmerg MDS/ JAK2V617F afwezig SETBP1 aanwezig / Figuur 58 / Figuren 56 en 57 / Figuur 58 / Figuur 58 / Figuur 58 Beenmerg MDS SETBP1 aanwezig FICSF1R Figuur 58 afwezig Beenmerg Fibrose JAK2 V614F aanwezig / Figuur

110 Figuur 52: Patiënt CI c.2110g>a (p.gly704arg) Figuur 53: Patiënt DB c.2122c>t (p.gln708x) Figuur 54: Patiënt CI c.1900_1922del (p.glu635argfsx15) c.1900_1922del p.glu635argfsx15 Wild type: Mutant: GAGAGGTCACCACTGCCATAGAGAGGCGGCCACCACTGCCATCGGAGGGGGGGGTGGCCCGGG GAGAGGTCACCACTGCCA TCGGAGGGGGGGGTGGCCCGGG Figuur 55: Voorstelling c.1900_1922del (p.glu635argfsx15) patiënt CI

111 Figuur 56: patient BB c.1772dupa (p.tyr591x) c.1772dupa p.tyr591x Wild type:cccacttaccagatatgcccccggatcatccccaccacggagtcctcctgccggggttggactgg Mutant: CCCACTTAACCAGATATGCCCCCGGATCATCCCCACCACGGAGTCCTCCTGCCGGGGTTGGACTGG Figuur 57: Voorstelling van c.1772dupa (p.tyr591x) patiënt BB Figuur 58: patiënt 9L c.1934dupg (p.gly646trpfsx12) 104

112 Tabel 38: Overzicht positieve stalen CSF3R-gen Patiënt Mutatie Staaltype Diagnose Moleculaire testen (Mutaties) FISH Verwijzing CC AE c.2260c>t (p.gln754x) c.2422g>a (p.glu808lys) Eiwit-olymorfisme Beenmerg AML EVI geen overexpressie HEVI afwezig FLT3-ITD DNA afwezig NPM1 mutatie afwezig CEBPA afwezig Beenmerg MDS/ BCRABL niet gedetecteerd JAK2 V614F niet gedetecteerd / Figuur 59 / Figuur 60 9E c.2422g>a (p.glu808lys) Eiwitpolymorfisme Beenmerg AML FLT3-ITD RNA mutatie aanwezig FIEVI1 aanwezig in 15% van de cellen DNMT3A mutatie aanwezig HEVI niet gedetecteerd NPM niet gedetecteerd FIEVI 15% van de cellen vertoont een deletie van een fusie-signaal, suggestief voor verlies van 3q materiaal Figuur 60 Figuur 59: Patiënt CC c.2260c>t (p.gln754x) Figuur 60: Patiënt AE c.2422g>a (p.glu808lys) c.1502t>c (p.val501ala) c.1514g>a (p.ser505asn) Figuur 61: Patiënt DA c.1544g>t (p.trp515leu) Figuur 62: Patiënt CI c.1514g>a (p.ser505asn) en c.1502t>c (p.val501ala) 105

113 Tabel 39: Overzicht positieve stalen MPL-gen Patiënt Mutatie Staaltype Diagnose Moleculaire testen (Mutaties) FISH Verwijzing DA CI CJ CG CA DA BA BB AC AC AH F K c.1544g>t (p.trp515leu) c.1514g>a (p.ser505asn) en c.1502t>c (p.val501ala) c.1544g>t (p.trp515leu) c.1544g> (p.trp515leu) c.1544g>t (p.trp515leu) c.1544g>t (p.trp515leu) c.1514g>a (p.ser505asn) c.1544g>t (p.trp515leu) c.1514g>a (p.ser505asn) c.1514g>a (p.ser505asn) c.1544g>t (p.trp515leu) c.1544g>t (p.trp515leu) c.1544g>t (p.trp515leu) Perifeer bloed Perifeer bloed BCRABL afwezig CALR afwezig MPL aanwezig BCRABL afwezig JAK2 V617F zwak aanwezig, niet kwantificeerbaar CALR afwezig MPL aanwezig Beenmerg BCRABL afwezig JAK2 V617F afwezig CALR afwezig MPL aanwezig Perifeer bloed BCRABL afwezig JAK2 V617F afwezig CALR afwezig MPL aanwezig Beenmerg MDS/ EVI1 geen overexpressie MPL aanwezig HEVI afwezig FLT3-ITD DNA afwezig NPM1 afwezig CEBPA afwezig Perifeer bloed JAK2 V617F afwezig CALR afwezig MPL W515L zwak aanwezig Beenmerg MDS JAK2 V617F zeer zwak aanwezig MPL mutatie s505n aanwezig Beenmerg JAK2 V617F afwezig MPL W515L aanwezig Beenmerg BCRABL afwezig JAK2 V617F afwezig MPl s505n aanwezig Perifeer BCRABL afwezig bloed JAK2 V617F afwezig MPL S505N aanwezig Beenmerg JAK2 V617F afwezig MPL W515L mutatie aanwezig Perifeer bloed BCRABL afwezig JAK2 V617F afwezig MPL mutatie W515L aanwezig Beenmerg BCRABL afwezig JAK2 V617F afwezig MPL mutatie W515L aanwezig / Figuur 61 / Figuur 62 / Figuur 61 / Figuur 61 / Figuur 61 / Figuur 61 Karyotypering Figuur 62 Kloon 1: 46,XY,DEL(20)(Q11Q12) (10), niet kwantificeerbaar / Figuur 61 / Figuur 62 / Figuur 62 / Figuur 61 / Figuur 61 / Figuur

114 Tabel 40: Overzicht van de positieve stalen van het SETBP1-gen Patiënt Mutatie Staaltype Diagnose Moleculaire testen FISH Verwijzing (Mutaties) 9L c.2608g>a ( p.gly870ser) Beenmerg acml BCRABL neg / Figuur 63 JAK2 V617F neg ASXL1 aanwezig 8J c.2608g>a(p.gly870ser) Beenmerg acml JAK2 V617F neg Figuur 63 ASXL1 aanwezig CK c.2602g>a (p.asp868asn) DNA / / Figuur 64 CK c.2608g>a (p.gly870ser) Beenmerg acml / / Figuur 63 BI c.2602 G>A (p.asp868asn) beenmerg MDS ASXL1 aanwezig FICSF1R afwezig Figuur 64 AI c.2608g>a(p.gly870ser) Beenmerg CMML BCRABLafwezig JAK2 V617F afwezig / Figuur 63 Figuur 63: Patiënt 8J c.2608g>a (p.gly870ser) Figuur 64: Patiënt BI c.2602g>a (p.asp868asn) Tabel 41: Overzicht positieve stalen TP53-gen Patiënt Mutatie Staaltype Diagnose Moleculaire testen (Mutaties) BH exon 7 c.733g>a (p.gly245ser) CF exon 5 c.517g>c (p.val173leu) CC exon 7 c.743g>a (p.arg248gln) DB exon 7 c.734g>t (p.gly245val) FISH Verwijzing Beenmerg CLL / CEP12 afwezig Del(11)(q14) afwezig Del(13)(q14) aanwezig in 25% van de cellen Del (17)(p13) aanwezig in 50% van de cellen P53 locus BCL1 translocatie afwezig Figuur 65 Klier CLL VH4-59 BCL1 translocatie afwezig Figuur % Beenmerg CLL VH ,2% CEP12 afwezig Del(11)(q22) afwezig Del(13)(q14) afwezig Del(17)(p13) afwezig Figuur 67 / CLL / Del(17)(p13) aanwezig in 66% Figuur

115 Figuur 65: Patiënt BH c.733g>a (p.gly245ser) Figuur 66: Patiënt CF c.517g>c (p.val173leu) Figuur 67: Patiënt CC c.743g>a (p.arg248gln) Figuur 68: Patiënt DB c.734g>t (p.gly245val) 108

116 Tabel 42: Overzicht positieve stalen NOTCH1-gen Patiënt Mutatie Staaltype Diagnose Moleculaire testen (Mutaties) FISH CA c.7544_7545del Beenmerg CLL VHSEQ VH % CEP12 afwezig CT Del(11)(q22) afwezig (p.pro2515argfs Del(13)(q14) aanwezig in 40% X4) Del(17)(p13) afwezig CJ CK CK c.5094c>t (p.asp1698asp) SNP EN c.4754t>c (p.leu1585pro) c.5094c>t (p.asp1698asp) SNP c.5094c>t (p.asp1698asp) SNP Beenmerg T-ALL HOX11L2 en HOX11 zwak aanwezig, niet kwantificeerbaar HEVI niet gedetecteerd FLT3-ITD DNA niet gedetecteerd NPM1 niet gedetecteerd CEBPA mutatie niet gedetecteerd EVI1 geen overexpressie Beenmerg T-ALL HOX11L2, HOX11 zwak aanwezig, niet kwantificeerbaar HEVI niet gedetecteerd FLT3-ITD RNA niet gedetecteerd Beenmerg T-ALL of B-ALL? HEVI aanwezig BCR/ABL-t(9;22) p190 aanwezig HOX11L2 overexpressie niet gedetecteerd / Kloon 1 : 46,XY,T(9;22)(Q34;Q11) (7) FISH onderzoek bevestigt uw diagnose van B-ALL met t(9;22)bcr-abl1. Verwijzing Figuren 69 en 70 Figuur 74 Figuur 71 Figuur 74 Figuur 74 BF OG CE AA CH CE c.5094c>t (p.asp1698asp) SNP c.5094c>t (p.asp1698asp) SNP c.4821g>c (p.lys1607asn) c.5094c>t (p.asp1698asp) SNP c.5094c>t (p.asp1698asp) c.4732_4734del GTG (p.val1578del) c.4733t>c (p.leu1593pro) Beenmerg T-ALL HOX11L2 en HOX11 zijn zwak aanwezig HEVI niet gedetecteerd Beenmerg T-ALL HOX 11L2 zwak aanwezig HOX11 aanwezig HEVI niet gedetecteerd Beenmerg T-ALL HOX11L2, HOX11 zwak aanwezig, niet kwantificeerbaar HEVI niet gedetecteerd FLT3-ITD DNA niet gedetecteerd Beenmerg T-ALL HOX11 zwak aanwezig, niet kwantificeerbaar HOX 11L2 geen overexpressie aanwezig HEVI niet gedetecteerd Beenmerg T-ALL HEVI niet gedetecteerd HOX 11L2 geen overexpressie gedetecteerd HOX 11 overexpressie aanwezig Beenmerg T-ALL HOX11L2 zwak aanwezig, niet kwantificeerbaar HOX11 aanwezig HEVI niet gedetecteerd / Figuur 74 / Figuur 74 Figuur 72 / Figuur 74 / Figuur 74 Karyotypering Figuur 75 Kloon 1: 47,XY,+MAR (1) FISH:5q35(HOX11L2),7p14(TCRG), 7q34(TCRB),9p21(p16,CDKN2A),C EP9,9q34(ABL1),11q23(MLL),14q 11(TCRAD), 22q11(BCR). Besluit: T-ALL met een breukpunt in de regio 14q11(TCRAD) en verlies van beide regio's 9p21:recurrente afwijkingen in T-ALL. / Figuur

117 Figuur 69: Patiënt CA c.7544_7545delct (p.pro2515argfsx4) c.7544_7545delct p.pro2515argfsx4 Wild type: AGCACCCCTTCCTCACCCCGTCCCCTGAGTCCCCTGACCAGTGGTCCAGCTCGTCCCC Mutant: AGCACCCCTTCCTCACCCCGTCCCGAGTCCCCTGACCAGTGGTCCAGCTCGTCCCC Figuur 70: Voorstelling c.7544_7545delct (p.pro2515argfsx4) patiënt CA

118 Figuur 71: Patiënt CJ c.4754t>c (p.leu1585pro) Figuur 72: Patiënt 0G c.4821g>c (p.lys1607asn) Figuur 73: Patiënt CE c.4733t>c (p.leu1593pro) Figuur 74: Patiënt CE c.5094c>t (p.asp1698asp) Figuur 75: Patiënt CH c.4735_4737delgtg (p.val1579del) 111

119 Tabel 43: Overzicht positieve stalen c-kit-gen Patiënt Mutatie Staaltype Diagnose Moleculaire testen (Mutaties) CG c.2394c>t(p.ile798ile) Perifeer AML EVI1 overexpressie afwezig SNP bloed HEVI afwezig FLT3-ITD DNA aanwezig NPM1 aanwezig type A CEBPA afwezig CG L BA AB L CI c.2394c>t(p.ile798ile) SNP c.1255_1257delgac (p.asp419del) c.2466t>g (p.asn822lys) c.2394c>t (p.ile798ile) SNP c.2447a>t (p.asp816val) c.2394c>t (p.ile798ile) SNP Beenmerg AML EVI1 overexpressie afwezig HEVI afwezig FLT3-ITD DNA aanwezig NPM1 afwezig CEBPA afwezig Beenmerg AML HEVI type AML1-ETO aanwezig FLT3-ITD RNA afwezig NPM mutatie afwezig QAML1ETO aanwezig QINV16A afwezig QINV16E afwezig Beenmerg AML AML1/ETO-t(8;21) aanwezig EVI1 geen overexpressie FLT3-ITD DNA afwezig NPM1 mutatie afwezig CEBPA mutatie afwezig Beenmerg Mastocytose CKIT afwijkende sequentie in exon 10 (codon 541) en exon 17 (codon 798); het betreft polymorfismen. uitgevoerd in CME Leuven BCRABL afwezig Beenmerg Mastocytose Mutatie aanwezig in codon 816 van exon 17 van ckit uitgevoerd in CME BCRABL afwezig FIP1L1 afwezig JAK2 V617F afwezig Beenmerg Mastocytose Er werd een KIT p.d816v mutatie vastgesteld in 0.09 % van de cellen in dit staal. CME Leuven BCRABL afwezig Opmerking: Bij patiënt CI werd naast het gevonden polymorfisme in het AZ Sint-Jan Brugge, eveneens nog een tweede mutatie gevonden bij analyse door CME Leuven. De mutatie werd slechts vastgesteld in 0.09% van de cellen, wat meteen ook verklaart waarom dit niet waargenomen werd tijdens de analyse d.m.v. Sanger sequencing, aangezien de gevoeligheid hier 20% bedraagt. FISH Verwijzing / Figuur 79 / Figuur 79 kloon 1: 45,X,- Y,del(7)(p12p13 of p14p15), t(8;21)(q22;q22) (11) Karyotypering 45,X,- Y,t(8;21)(q22;q22) (7) Figuren 76 en 78 Figuur 77 / Figuur 79 / Figuur 78 / Figuur

120 Figuur 76: Patiënt 8L c.1255_1257delgac (p.asp419del) Figuur 77: Patiënt BA p.asn822lys of c.2466t>g c.1255_1257delgac p.asp419del Wild type: GAAATCCTGACTTACGACAGGCTCGTGAATGGCATGCTCCAATGTGTGGCA Mutant: GAAATCCTGACTTACAGGCTCGTGAATGGCATGCTCCAATGTGTGGCA Figuur 78: Voorstelling c.1255_1257delgac (p.asp419del) patiënt 8L Figuur 79: Patiënt 0L p.asp816val of c.2447a>t Figuur 80: Patiënt CI c.2394 C>T (p.ile798ile) 113

121 Tabel 44: Overzicht positieve stalen DNMT3A-gen Patiënt Mutatie Staaltype Diagnose Moleculaire testen (Mutaties) FISH Verwijzing CL CC CD D CF CG E c.2645g>a (p.arg882his) c.2644c>t (p.arg882cys) c.2645g>a (p.arg882his) c.2645g>a (p.arg882his) c.2645g>a (p.arg882his) c.2645g>a (p.arg882his) c.2645g>a (p.arg882his) Beenmerg AML EVI1 overexpressie afwezig HEVI afwezig FLT3-ITD DNA aanwezig NPM1 mutatie aanwezig NPM1 mutatie type A aanwezig CEBPA afwezig Beenmerg AML EVI1 overexpressie afwezig HEVI afwezig FLT3-ITD DNA afwezig NPM1 mutatie afwezig CEBPA afwezig Chimerisme 26,8% donor Beenmerg AML EVI1 overexpressie afwezig HEVI afwezig FLT3-ITD DNA afwezig NPM1 afwezig CEBPA afwezig Beenmerg AML HEVI afwezig FLT3-ITD DNA afwezig NPM1 afwezig Beenmerg AML EVI1 overexpressie afwezig HEVI afwezig FLT3-ITD afwezig NPM1 aanwezig nieuw type CEBPA afwezig QNPMA afwezig Beenmerg AML EVI1 overexpressie afwezig HEVI afwezig FLT3-ITD DNA aanwezig NPM1 aanwezig CEBPA afwezig Beenmerg AML FLT3-ITD RNA mutatie aanwezig HEVI niet gedetecteerd NPM mutatie niet gedetecteerd / Figuur 81 / Figuur 82 / Figuur 81 / Figuur 81 / Figuur 81 / geen structurele noch numerische afwijkingen aan van de regio 11q23, noch van de regio's 3q21 en 3q26. FIEVI1 aanwezig in 15% van de cellen Figuur 81 Figuur 81 Figuur 81: Patiënt CL c.2645g>a (p.arg882his) Figuur 82: Patiënt CC c.2644c>t (p.arg882cys) 114

122 Tabel 45: Overzicht positieve stalen IDH1- en IDH2-gen Patiënt Mutatie Staaltype Diagnose Moleculaire testen (Mutaties) 0I IDH1: c.394c>t Beenmerg AML HEVI afwezig (p.arg132cys) FLT3-ITD RNA afwezig NPM1 mutatie afwezig c.315c>t CEBPA afwezig (p.gly106gly) QNMPA afwezig 0G IDH2: c.419g>a (p.arg140gln) Beenmerg AML/RAEB(t) HEVI afwezig FLT3-ITD RNA afwezig NPM1 mutatie afwezig QNPMa afwezig FISH Verwijzing / Figuur 83 / Figuur 84 Figuur 83: Patiënt OI (p.arg132cys) c.394c>t Figuur 84: Patiënt 0G (p.arg140gln) c.419g>a Tabel 46: Overzicht positieve stalen STAT3-gen Patiënt Mutatie Staaltype Diagnose Moleculaire testen FISH Verwijzing (Mutaties) CB c.1919a>t (p.tyr640phe) Beenmerg T-LGL TCR monoclonaal / Figuur 85 BD c.1919a>t (p.tyr640phe) Beenmerg T-LGL TCR monoclonaal / Figuur 85 AJ c.1919a>t (p.tyr640phe) Beenmerg T-LGL TCR monoclonaal / Figuur 85 BE c.1981g>t (p.asp661tyr) Beenmerg T-LGL TCR monoclonaal / Figuur 86 Figuur 85 : Patiënt AJ c.1919a>t (p.tyr640phe) Figuur 86: Patiënt BE c.1981g>t (p.asp661tyr) 115

123 Tabel 47: Overzicht positieve stalen MYD88-gen Patiënt Mutatie Staaltype Diagnose Moleculaire testen (Mutaties) FISH Verwijzing BF c.794t>c (p.leu265pro) Beenmerg Waldenström IGHFR3, IGHKA, IGKB, IGK, IGH monoclonaal / Figuur 87 BD c.794t>c (p.leu265pro) Beenmerg Waldenström IGHFR1 polyclonaal / Figuur 87 Figuur 87: Patiënt BD c.794t>c (p.leu265pro) 116

124 Bijlage II: Overzicht vergelijkende studie MPL Tabel 48: Overzicht vergelijkende studie MPL Patiënt + mutatie MPL met originele primers MPL met behulp van nieuwe M13- primers CI c.1514g>a (p.ser505asn ) en c.1502t>c (p.val501ala) 20% 20% CJ c.1544g>t (p.trp515leu) 20% 10% 117

125 20% 10% CG c.1544g>t (p.trp515leu) CA c.1544g>t (p.trp515leu) 100% 100% DA c.1544g>t (p.trp515leu) 20% 20% 118

126 DA c.1544g>t (p.trp515leu) BA c.1514g>a (p.ser505asn) 10% <1% BB c.1544g>t (p.trp515leu) 20% 20% 20% 10% 119

127 AC c.1514g>a (p.ser505asn) 20% 20% AC c.1514g>a (p.ser505asn) 20% 15% AH c.1544g>t (p.trp515leu) 100% 100% 120

128 0F Resultaten verloren door computercrash c.1544g>t (p.trp515leu) 0K c.1544g>t (p.trp515leu) Resultaten verloren door computercrash 20% 100% 121