UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Methicilline resistente Staphylococcus aureus bij dieren door Agi JACOBS Promotor: Prof. Dr. K. Hermans Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

2 De auteur geeft de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individuele geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur is niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

3 Voorwoord Ik zou graag mijn promotor Prof. Dr. Katleen Hermans willen bedanken voor de nodige uitleg en achtergrond bij dit onderwerp en het nodige verbeterwerk. Tot slot wil ik ook mijn vriend Vincent Vantorre bedanken voor de tijd en hulp die hij gestoken heeft in de layout en het uitleggen van de vele toepassingen die mogelijk zijn.

4 Inhoudsopgave SAMENVATTING INLEIDING LITERATUURSTUDIE METHICILLINE RESISTENTE STAPHYLOCOCCUS AUREUS: DE KIEM Geschiedenis Methicilline resistentie DIAGNOSE VAN MRSA Fenotypisch door middel van diffusietesten Genotypisch: het meca gen aantonen Verdere moleculaire typering in functie van de epidemiologie MRSA BIJ DE MENS Hospital-acquired MRSA Community-acquired MRSA MRSA BIJ DIEREN Geschiedenis Varkens Runderen Pluimvee Paarden Gezelschapsdieren MRSA in dierlijke producten ST398 bij dierenartsen BESPREKING LITERATUURLIJST... 19

5 Samenvatting In deze literatuurstudie wordt er een overzicht gegeven van meldingen in de literatuur van methicilline resistente Staphylococcus aureus isolaten bij dieren. Na de bespreking van de eigenschappen van de bacterie en een korte geschiedenis volgt de problematiek van antibioticaresistentie bij deze kiem. De resistentie aan penicilline en later aan methicilline wordt besproken. Verder wordt dieper ingegaan op de diagnose en typering van MRSA isolaten met fenotypische en genotypische technieken. Nadien volgt een bespreking van de verschillende groepen van MRSA, namelijk hospital-acquired, community-acquired en livestock-associated MRSA (LA-MRSA). Voornamelijk deze laatste wordt verder uitgediept in deze studie. Per diersoort wordt er een overzicht gegeven van de eerste MRSA isolaten die gevonden werden alsook de eerste LA-MRSA isolaten. De risicofactoren die mede verantwoordelijk geacht worden voor de kolonisatie en infectie van dier en mens worden per species weergegeven. Ook de mogelijke transmissieroutes en verspreiding van LA-MRSA en MRSA worden besproken. Tot slot volgt een korte bespreking van MRSA in dierlijke producten en LA-MRSA bij dierenartsen. Sleutelwoorden: Infectie Kolonisatie LA-MRSA Resistentie Transmissie

6 1. INLEIDING Methicilline resistente Staphylococcus aureus werd voor het eerst onderkend halverwege de twintigste eeuw door M. Barber (Barber, 1961). Het resistentiemechanisme van deze kiemen berust op de expressie van PBP2a of penicillinebindend proteïne, dat ongevoelig is aan de werking van β-lactam antibiotica. Het verantwoordelijke gen voor deze expressie is het meca gen (Hartman en Tomasz, 1984). Fenotypisch aantonen van methicilline resistentie bij S. aureus gebeurt door middel van diffusietesten, genotypisch gebeurt dit door het aantonen van het meca gen. Voor een verdere moleculaire typering kunnen pulsed-field gel elektrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST), S. aureus proteïne A typering (spa-typing) en multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) gebruikt worden. In de literatuur wordt een onderscheid gemaakt tussen hospital-acquired (HA), community-acquired (CA) en livestock-associated (LA) MRSA. HA-MRSA komt voornamelijk voor in humane ziekenhuizen (Hartman en Tomasz, 1986) en CA-MRSA wordt geassocieerd met groepen van mensen die kort bij elkaar leven, bijvoorbeeld gevangenen (Gosbell, 2005). Deze humane genotypes worden ook teruggevonden bij dieren (Devriese et al., 1972; Scott et al., 1988; Cefai et al., 19949; Shimizu et al., 1997). Recent ontdekte men een livestock-associated type, eerst bij varkens (Voss et al., 2005) en later bij runderen (Graveland et al., 2010). LA-MRSA of MRSA clonal complex (cc) 398 omvat verschillende multilocus sequence types, het meest voorkomende is ST398 (Huijsdens et al., 2006). Dit type werd ondertussen geïsoleerd bij pluimvee (Nemati et al., 2008), paarden en gezelschapsdieren maar ook bij mensen die in contact komen met dieren (Witte et al., 2007; Denis et al., 2009). Ook in dierlijke producten kon men ST398 isolaten aantonen maar tot hiertoe werden er slechts twee uitbraken beschreven (Kluytmans et al., 1995; Jones et al., 2002). Dierenartsen blijken ook frequent drager te zijn van MRSA waaronder ook van LA-MRSA (Wulf et al., 2006; Wulf et al., 2008). Infecties van dieren of mensen door LA-MRSA worden echter zelden gerapporteerd (Hermans et al., 2008; van Duijkeren et al., 2008; Vanderhaeghen et al., 2010). Het doel van deze literatuurstudie is bovenstaande problematiek verder uit te werken op basis van de literatuur, waarbij de nadruk zal worden gelegd op de LA-MRSA als zogenaamde opkomende pathogeen. 2

7 2. LITERATUURSTUDIE 2.1. Methicilline resistente Staphylococcus aureus: de kiem Geschiedenis In 1884 ontdekten Ogston en Rosenbach de bacterie Staphylococcus aureus. Deze species behoort tot de klasse Bacilli, orde Bacillales, familie Staphylococcaceae en het genus Staphylococcus. De kiem behoort tot de commensale flora van mens en dier en is facultatief pathogeen (Williams, 1963). Het is een Grampositieve (paarse kleur op Gramkleuring) en facultatief anaerobe coccus die geen sporen vormt en zich in druiventrossen groepeert (Mouton R.P., 1987). Op bloedagar (Fig. 1) vertoont de kiem hemolyse (Chapman et al., 1934) en de gouden kleur van S. aureus is te wijten aan carotenoïden die als antioxidantia fungeren (Liu et al., 2005). Om S. aureus te differentiëren van de andere Staphylococcus species kan men onder andere een serum coagulatie test uitvoeren (Chapman et al., 1934; Lowy, 1998). Fig. 1 Foto s van S. aureus van dezelfde stam op schapen bloedagar platen na een incubatie van 48u. Schaal = 1 cm. (a) Normale grootte van kolonies (b) Kleinere varianten van kolonies (Sendi en Proctor, 2009) Methicilline resistente Staphylococcus pyogenes werd voor het eerst ontdekt in 1961 kort na het in gebruik nemen van het antibioticum methicilline. De ontdekking werd gedaan in een Brits ziekenhuis door M. Barber en verspreidde zich wereldwijd. Later werd S. pyogenes hernoemd tot S. aureus wat resulteerde in de benaming methicilline resistente S. aureus (MRSA) (Jevons et al., 1961) Methicilline resistentie In de jaren 40 werden de penicillines (Fig. 2) geïntroduceerd en zij veranderden drastisch de prognose van personen die infecties met stafylokokken opliepen. Echter in 1942 doken de eerste penicilline resistente Staphylococcus aureus stammen op. Nu bevatten meer dan 90% van de geïsoleerde stafylokokken het enzym penicillinase. 3

8 Fig. 2 Chemische structuur van A) Penicilline en B) Methicilline. De β-lactam ring staat in het rood en het blauwe staat voor de carbonylgroep zijketen die β-lactamase resistentie faciliteert (Morell en Balkin, 2010). Het mechanisme van resistentie berust op het blaz gen dat codeert voor β-lactamase (of penicillinase) (Fig.3). Dit enzym wordt gesynthetiseerd wanneer stafylokokken in aanraking komen met β-lactam antibiotica en hydrolyseert de aanwezige β-lactam ringen (Lowy, 2003). In 1961 kwamen de methicillines (Fig. 2) op de markt, deze waren de eerste semisynthetische penicillinase resistente penicillines. Helaas werden ook hier snel methicilline resistente isolaten opgemerkt (Barber, 1961). Het mechanisme (Fig. 3) kan omschreven worden als de modificatie van de doelwitten van β-lactam antibiotica en wordt waargenomen bij MRSA (Haesebrouck et al., 2006). Het meca gen dat zich in het mec operon bevindt, speelt hierbij de hoofdrol (Matsuhashi et al., 1986). Het gen codeert voor een extra penicilline bindend proteïne (PBP) waarvoor β-lactam antibiotica een lage affiniteit vertonen: PBP2a (Hartman en Tomasz, 1984). De penicilline bindende proteïnes zijn enzymen die de cross-linking katalyseren tussen N-acetylglucosamine en N-acetylmuraminezuur polymeren. Deze laatste zijn een onderdeel van het peptidoglycaan dat aanwezig is in de celwand van bacteriën. De β-lactam antibiotica zijn in staat deze enzymen te inactiveren (Chambers, 1988). Het PBP2a blijft echter wel functioneel en zorgt dat de aanmaak van peptidoglycaan doorgaat (Chambers, 1997). 4

9 Fig. 3 a) Inductie van β-lactamase synthese door stafylokokken in aanwezigheid van het β-lactam antibioticum penicilline. b) Mechanisme van S. aureus resistentie tegenover methicilline (Lowy, 2003) MRSA bevat een 52-kb genomisch eiland genaamd staphylococcal cassette chromosome mec of SCCmec, dat geassocieerd wordt met resistentie tegenover β-lactam antibiotica (Song et al., 1987; Katayama et al., 2000). SCCmec bevat twee belangrijke complexen van genen: het mec-complex, dat het meca gen bevat en het ccrcomplex (Ito et al., 2001). Op basis van deze complexen werden er reeds tien SCCmec types (I tot en met X) beschreven voor MRSA (Vanderhaeghen et al., 2010; Li et al., 2011). 5

10 2.2. Diagnose van MRSA Fenotypisch door middel van diffusietesten Om resistente S. aureus op te sporen kan men het best beroep doen op diffusietesten met methicilline- (minder stabiel dus niet echt aan te raden) of oxacillineschijfjes. Recent wordt door verschillende studies het gebruik van cefoxitine aangeraden (Skov et al., 2006; Mathews et al., 2010). De schijfjes worden op een Mueller-Hinton of IsoSensitest agar gelegd en deze platen worden dan geïnoculeerd met S. aureus en geïncubeerd aan 30 C. Rond de schijfjes wordt een inhibitiezone gevormd en wanneer hierin stafylokokkenkolonies groeien, kan men spreken van resistentie en zelfs van resistentie tegenover alle β-lactam antibiotica (Haesebrouck et al., 2006). Screening van MRSA kan nu ook met behulp van de Oxoid Brilliance MRSA medium (Fig. 4). De sensitiviteit bedraagt 99,6% en de specificiteit 97,3% na een incubatieperiode van 20 uur (Verkade et al., 2009). De meeste fenotypische testen nemen echter vier tot vierentwintig uur in beslag voor het opkweken van de bacteriën en zijn daarom niet geschikt voor een snelle screening van patiënten (Witt et al., 2010). Fig. 4 Typische kleur en morfologie van MRSA op een Oxoid Brilliance plaat (Verkade et al., 2009) Genotypisch: het meca gen aantonen Detectie van het meca gen door middel van (real-time) polymerase chain reaction (PCR) wordt wereldwijd gezien als de gouden standaard voor het identificeren van MRSA (Brakstad et al., 1993). PCR, bedacht door Kary Mullis in 1983, laat toe om individuele genen te klonen om deze vervolgens aan een gedetailleerde biochemische analyse te onderwerpen. Wanneer de sequenties gekend zijn van de aanpalende delen van een desoxyribonucleïnezuur (DNA) segment dan kan men het aantal kopieën van dit segment serieus opdrijven door middel van PCR. De reactie omvat drie fasen: een denaturatiefase aan 94 C waardoor DNA strengen worden gescheiden, hybridisatie bij 45 C tot 65 C waarbij oligonucleotide primers binden aan de gedenatureerde strengen en een elongatiefase door het toevoegen van DNA polymerase dat nieuw DNA aanmaakt bij 72 C. Dit proces wordt minimaal dertig keer herhaald (Nelson en Cox, 2005). 6

11 Aan deze methode, waarbij PCR direct wordt uitgevoerd op de genomen swabs, zijn echter beperkingen verbonden: de stalen moeten aangerijkt worden en meca gen detectie kan niet rechtstreeks gecombineerd worden met de identificatie van S. aureus isolaten door het verstorende effect van methicilline resistente coagulase negatieve stafylokokken (Witt et al., 2010). In 2004 werd een nieuwe methode beschreven voor het direct identificeren van MRSA met behulp van realtime multiplex PCR en is commercieel beschikbaar als de BD GeneOhm MRSA assay (Huletsky et al., 2004). De kwaliteit van dit soort directe testen is nog voor verbetering vatbaar en positieve resultaten dienen nog verder getest te worden (Witt et al., 2010) Verdere moleculaire typering in functie van de epidemiologie Een eerste methode is pulsed-field gel elektrophoresis (PFGE) en wordt momenteel gezien als gouden standaard voor het typeren van S. aureus (Murchan et al., 2003). PFGE is een variatie van gel elektroforese en is in staat om zeer grote DNA segmenten te scheiden (Nelson, 2005). Voor S. aureus wordt standaard het restrictie-enzym smai gebruikt (Tenover et al., 1995). Multilocus sequence typing (MLST) in combinatie met Staphylococcal cassette chromosome mec typing (SCCmec) (Robinson en Enright, 2004) is een methode waarbij DNA fragmenten van zeven huishoud-genen gesequeneerd worden. Daarna wordt aan de hand van de MLST database ( een sequentietype (ST) toegekend (Robinson en Enright, 2004). Wanneer stammen slechts op één of twee loci verschillen dan spreekt men respectievelijk van single locus variants (SLVs) en double locus variants (DLVs) en ze worden samen met de STs gegroepeerd in clonal complexes (CCs) (Enright et al., 2002). De SCCmec cassette varieert in grootte maar bevat steeds het meca gen, delen van het regulatoire gen mecr1 en chromosomal cassette recombinase genen (ccr) (Robinson en Enright, 2004). De verschillende SCCmec types worden toegekend aan de hand van PCR technieken (Vanderhaeghen et al., 2010). In 1996 ontwikkelden Frénay et al. een single-locus sequence typing test voor S. aureus, genaamd spa typering of S. aureus proteïne A typering. De polymorfe regio X van het spa gen bevat een variabel aantal identieke stukjes DNA die zich herhalen (Frénay et al., 1994). Een groot voordeel is dat men slechts een eenvoudige locus moet sequeneren. Wat het differentiërend vermogen van de test betreft, kan men stellen dat spa typering zich tussen de PFGE en MLST methode situeert (Malachowa et al., 2005). Een recentere methode om MRSA te typeren werd ontwikkeld in 2003 door Sabat et al., namelijk multiplelocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA). Deze op PCR gebaseerde methode heeft hetzelfde differentiërend vermogen als PFGE en kan snel een groot aantal isolaten analyseren. Bovendien bevat deze test ook alle voordelen van PCR: lage kostprijs, snel en gemakkelijk uit te voeren (Sabat et al., 2003). 7

12 2.3. MRSA bij de mens Hospital-acquired MRSA Vanaf de jaren 70 is MRSA een veel voorkomend en belangrijk infectieus agens geworden (Bran et al., 1972). Er wordt een onderscheid gemaakt tussen hospital-acquired MRSA, community-acquired MRSA en livestock-associated MRSA. Hospital-acquired MRSA (HA-MRSA) of ziekenhuis geassocieerde infecties worden veroorzaakt door vijf grote methicilline resistente S. aureus klonen die zich gemanifesteerd hebben in humane ziekenhuizen wereldwijd (Hartman en Tomasz, 1986). Met HA-MRSA worden de types SCCmec I tot III geassocieerd (Robinson en Enright, 2003). Door het zware chromosoom cassette wordt de adaptatie beperkt tot het gunstige milieu van de gezondheidszorg (Ito et al., 1999). Tot de risicopersonen behoren de opgenomen patiënten in een ziekenhuis en personen in direct contact met deze mensen, personen die recent een operatie of catheterisatie ondergingen en dialyse patiënten. De voornaamste reden van infectie is het veelvuldig antibioticum gebruik dat een positieve selectie bevordert van MRSA (Thompson et al., 1982; Coll et al., 1994) Community-acquired MRSA Eind jaren 70 werd een MRSA epidemie opgemerkt bij intraveneuze druggebruikers in de Verenigde Staten (Saravolatz et al., 1982) en vanaf de jaren 90 doken de eerste zogenaamde community-acquired MRSA (CA- MRSA) op (Udo et al., 1993). CA-MRSA of MRSA die zich ophoudt in de gemeenschap buiten de ziekenhuizen, bevat meestal de iets kleinere SCCmec types IV en V waardoor de antimicrobiële resistentie verschilt van HA-MRSA (Okuma et al., 2002; Ito et al., 2004). Sommige stammen bevatten het cytotoxine Panton-Valentine leukocidine (PVL), ontdekt door van de Velde in De genen voor dit dermonecrotisch toxine (Ward en Turner, 1980) komen in S. aureus terecht via bacteriofagen (Kaneko et al., 1997). PVL wordt geassocieerd met huid en zachte weefsel infecties of skin and soft tissue infection (SSTI) (Prevost et al., 1995). Soms wordt dit ook geassocieerd met necrotiserende pneumonie bij de mens met CA-MRSA zoals aangetoond in een studie van Lina et al. (1999). Andere virulentiefactoren beschreven bij CA-MRSA en andere S. aureus zijn het toxic shock syndrome toxin-1 (TSST- 1), enterotoxines (Humphreys et al., 1989) en exfoliatieve toxines (Johnson et al., 1975). Intraveneuze druggebruikers, gevangenen, personen die een contactsport beoefenen, homoseksuelen, militairen en andere groepen van personen die in nauw contact komen met elkaar hebben een risico op infectie, dit geldt ook voor personen die antibiotica gebruiken (Gosbell, 2005). Algemeen kan men zeggen dat slechte hygiëne, drukte, scheren en huidcontact een infectierisico vormen (Whitman, 2008). Ter preventie vermeldt Whitman T.J. (2008) dat Soft Skin and Tissue Infection prevention lies in the Five C s of CA-MRSA transmission : contact, cleanliness, compromised skin, contaminated objects, and crowded conditions. maar hij geeft zelf aan dat dit niet sluitend is. 8

13 2.4. MRSA bij dieren Geschiedenis MRSA werd in 1972 bij Belgische koeien met mastitis geïsoleerd, maar de isolaten waren wellicht van humane herkomst (Devriese et al., 1972). Daarna werd MRSA nu en dan geïsoleerd uit voornamelijk runderen, paarden en gezelschapsdieren maar ook hier werd meestal gesteld dat het om humane isolaten ging. In de jaren 90 beschreef men voor het eerst MRSA isolatie uit merries in Japan (Shimizu et al., 1997). De eerste gekoloniseerde kat werd in 88 gemeld door Scott et al. en de eerste hond in 94 door Cefai et al., waarbij men een staal had onderzocht van de conjunctiva. In 2003 isoleerde Lee MRSA uit kippen in Zuid-Korea. Recent komt MRSA meer en meer voor bij varkens en vleeskalveren (Leonard en Markey, 2008) waarbij het hier niet altijd over humane genotypes gaat (Weese, 2008) maar ook over de zogenaamde livestockassociated MRSA (LA-MRSA), waar men uitgebreid actief onderzoek naar voert sedert het manuscript van Voss et al. (2005). In 2004 en 2005 cultiveerden Voss et al. (2005) immers een tot dan toe niet frequent teruggevonden MRSA uit drie Nederlandse patiënten die in direct of indirect contact kwamen met varkens. De isolaten bleek niet typeerbaar te zijn met de klassieke PFGE met SmaI digestie en te behoren tot het CC398 en wordt momenteel meestal LA-MRSA genoemd. Ook bij vleeskalveren in Nederland werd deze LA-MRSA aangetroffen (Graveland et al., 2010). In een Belgisch onderzoek kon men aantonen dat 10,5% van de paarden bij aankomst op een dierenkliniek drager was van CC398 (Van den Eede et al., 2009), ook in Nederland (van Duijkeren et al., 2010) en Zweden trof men equiene dragers aan (Catry et al., 2010). De CC398 stammen werden ook teruggevonden bij vee (Monecke et al., 2007) en pluimvee (Nemati et al., 2008). De European Food Safety Authority (EFSA) rapporteert dat MRSA bij varkens al in 17 verschillende landen in Europa werd geïsoleerd en dat de overgrote meerderheid niet typeerbaar was door PFGE na SmaI digestie (EFSA, 2008). De CC398 isolaten zijn niet typeerbaar door PFGE omdat ze een restrictie modificatie enzym bevatten dat de SmaI knipplaats methyleert (Bens et al., 2006). MRSA CC398 bevat acht multilocus sequentie types, waarbij de meest voorkomende sequentie type 398 is (Huijsdens et al., 2006) en door middel van spa typering (Harmsen et al., 2003) vond men voornamelijk spa types t011 en t108 (de Neeling et al., 2007). Deze kunnen gerelateerd worden aan respectievelijk SCCmec IV, IVa en V (van Belkum et al., 2008). MRSA CC398 of LA-MRSA werd dus voor het eerst geassocieerd met varkens maar de oorsprong is nog onduidelijk. Belangrijk is wel dat LA-MRSA niet gastheer specifiek is en dat overdracht tussen mens en dier mogelijk is (Vanderhaeghen et al., 2010). Klinische infecties door LA-MRSA bij dieren zijn reeds beschreven in Nederland bij varkens met dermatitis na het spenen, met een sterftepercentage van 1 op 5. Het ging hier om MRSA CC398 spa type t011 (van Duijkeren et al., 2008). Ook in België trof men infectie aan bij dieren door CC398, hier ging het om paarden (Hermans et al., 2008) en koeien met mastitis en subklinische mastitis (Vanderhaeghen et al.,2010). 9

14 Varkens In Europa zien we voornamelijk MRSA ST398 bij varkens (EFSA, 2008), net zoals in Canada (Khanna et al., 2008) en Midden-Amerika (Smith et al., 2009). In Azië wordt dan weer vaker ST9 aangetroffen bij varkens (Guardabassi et al., 2009; Wagenaar et al., 2009). Kolonisatie of dragerschap wil zeggen dat een individu of dier positief test voor MRSA in nasale of keelswabs (of andere) als gevolg van vermenigvuldiging en vasthechting van MRSA, zonder dat klinische symptomen aanwezig zijn (EFSA, 2009). In een studie van Moodley et al. (2010) gebruikt men twee modellen om de kolonisatie van S. aureus te onderzoeken bij varkens. Een eerste model was het nasaal-gastro-intestinaal inoculatie model waarbij vijf weken oude biggen geïnoculeerd werden met ST398 (t108, t011, t034) en ST9 (t899). Uit de resultaten konden de onderzoekers besluiten dat directe kolonisatie verhinderd werd door ongekende gastheer specifieke-, bacteriële of omgevingsfactoren. Onder gastheer specifieke factoren verstond men hier ras, geslacht en andere immuniteitsfactoren. Een tweede model omvatte de vagina van een drachtige zeug die met dezelfde stammen werd geïnoculeerd niet lang voor het werpen. Hieruit bleek dat de pasgeboren biggen persisterende dragers waren van ST398-t011 en ST9-t899 waardoor men kon besluiten dat LA-MRSA zich kan spreiden via verticale perinatale transmissie. Bij de twee modellen maakte men gebruik van tetracycline om de kans op kolonisatie te verhogen, vermits de meeste LA-MRSA stammen resistent zijn aan de tetracyclines (Kadlec en Schwarz, 2009), maar ook andere risicofactoren spelen een rol in de kolonisatie van varkens. In de praktijk heerst het probleem van foute dosering van antibiotica, zoals gezien werd in Belgische varkensbedrijven (Timmerman et al., 2006) en onderdosering (Catry et al., 2003). Een studie van Smith et al. (2009) toonde een groot verschil aan tussen gesloten bedrijven onderling. Oorzaken hiervoor schreef men toe aan rasverschillen, aantallen per groep en de oorsprong van de zeugen die geïmporteerd werden uit gebieden waar LA-MRSA voorkomt in de varkenspopulatie. Kolonisatie van varkens op een bedrijf door het inbrengen van gekoloniseerde varkens van een ander bedrijf toont transmissie aan van MRSA tussen bedrijven (van Duijkeren et al., 2008). De leeftijd zou ook een rol spelen, zo toonde men aan dat kolonisatie toenam tot de laatste staalname op 70 dagen ouderdom (Weese et al., 2010). Een andere studie vond echter geen verschil tussen verschillende leeftijdsgroepen (Khanna et al., 2008). Verder onderzoek omtrent de rol van de leeftijd is dus noodzakelijk. 10

15 Fig. 5 Verspreiding in varkensbedrijven van epidemische MRSA stammen behorend tot spa type t011-sccmec type IV, t011- SCCmec type V en andere types, België, A) Bewoners en werknemers op bedrijven; B) Varkens. (uit Denis et al., 2009) Infectie van het varken zelf door MRSA ST398 is nog niet frequent gemeld geweest. Een exsudatieve epidermitis (van Duijkeren et al., 2008) en infecties ter hoogte van het urogenitaal stelsel, uterus en tepels (Schwarz et al., 2008) werden beschreven. Humane dragers van spa types behorende tot ST398 worden geassocieerd met gekoloniseerde varkens (Denis et al., 2009). Varkensbedrijven worden gezien als een risicofactor voor de overdracht van MRSA naar de mens (Fig. 6) (Armand-Lefevre et al., 2005). In Nederland komt ST398 bij mensen minder voor dan andere MRSA stammen maar men vond wel een invasieve infectie waardoor men stelde dat LA-MRSA pathogeen zou zijn voor de mens (van Rijen et al., 2008). Infecties van personen door MRSA ST398 worden echter zelden gerapporteerd: endocarditis door isolaten afkomstig van het varken (Ekkelenkamp et al., 2006), ventilator-geassocieerde pneumonie (Witte et al., 2007) en infecties bij medewerkers en patiënten op een chirurgische afdeling (Wulf et al., 2008a) zijn beschreven. In Denemarken is er een lage incidentie van MRSA waardoor men besloot om een Search and Destroy aanpak toe te passen door middel van een actieve screening van risicopersonen die opgenomen worden in een ziekenhuis (Lewis et al., 2008) net zoals dit het geval is in Nederland sinds 2006 (Mulders et al., 2010) Runderen Bij volwassen runderen heeft men nog niet kunnen aantonen of er een reservoir van LA-MRSA aanwezig is. Bij vleeskalveren in Nederland en België heeft men al nasale dragers kunnen aantonen maar de kolonisatiecapaciteit bij melkvee werd nog niet onderzocht (Vanderhaeghen et al., 2010). 11

16 De risicofactoren die een rol spelen bij de kolonisatie van vleeskalveren werden geanalyseerd in een studie van Graveland et al. (2010). Hieruit bleek dat kalveren behandeld met antibiotica gevoeliger waren dan deze zonder antibiotica (Fig. 7), net zoals de oudere kalveren en kalveren van grote bedrijven. Ook de kolonisatie van mensen die werkten op een vleeskalverenbedrijf of ermee in contact kwamen werd onderzocht. Voornamelijk boeren bleken MRSA positief te zijn. De belangrijkste factor bleek hier het hoge aantal uren per week dat men doorbracht in de stallen. Fig. 6 De correlatie tussen leeftijd en dragerschap van MRSA bij vleeskalveren die drager zijn van MRSA voor kalveren behandeld met antibiotica en zonder antibiotica als groepstherapie (uit Graveland et al., 2010). MRSA is meestal verwaarloosbaar als pathogeen voor mastitis (Hendriksen et al., 2008) maar in een Belgische studie waren 10% van de S. aureus kiemen, geïsoleerd uit koeien met subklinische en klinische mastitis, MRSA isolaten behorende tot CC398. Men kon echter niet aantonen dat deze LA-MRSA een rol speelden in het verwekken van de mastitis (Vanderhaeghen et al., 2010). LA-MRSA vertonen resistentie tegenover de β-lactam antibiotica, de aminoglycosiden en de macroliden die vaak ingezet worden tegenover mastitis (Sawant et al., 2005). Dit zou dus tot een behandelingsprobleem kunnen leiden (Vanderhaeghen et al., 2010) Pluimvee De eerste MRSA isolaten bij pluimvee werden geïsoleerd door Lee (2003) in Zuid-Korea en waren afkomstig van de gewrichten van twee kippen met artritis. In 2007 vond men in Nederland voor de eerste maal LA-MRSA bij kippen in hun uitwerpselen (Vanderhaeghen et al., 2010). Later in 2008, rapporteerden Nemati et al. (2008) multilocus sequence type 398 isolaten afkomstig van gezonde kippen. De stalen werden genomen in 2006 uit de neus en cloaca van broilers en er bleken tien isolaten te behoren tot ST398 (t011 en t567). Een andere Belgische studie werd uitgevoerd door Persoons et al. (2009) waar 50 legkippen en 75 broilers getest werden op MRSA, ook hier werden stalen genomen in de cloaca en neusholte. Bij de legkippen vond men geen MRSA isolaten waaruit men zou kunnen concluderen dat dit te maken kan hebben met het beperkt 12

17 antimicrobieel gebruik bij deze kippen. Acht broilers werden wel MRSA positief bevonden en alle isolaten behoorden tot ST398 (t1456). Dit spa type zou geassocieerd kunnen zijn met broilers maar dit moet nog verder onderzocht worden. Mulders et al. (2010) onderzocht 405 broilers afkomstig van 40 tomen, in zes slachthuizen en het slachthuispersoneel op MRSA. Faryngeale swabs werden genomen bij de broilers en uit de resultaten bleken 6,9% LA-MRSA positief te zijn bij aankomst in het slachthuis. Bij de werknemers werden nasale swabs genomen en hieruit kom men vaststellen dat 5,6% drager waren van MRSA. Van alle MRSA die in deze studie geïsoleerd werden, behoorden de meesten tot ST398, 27,7% van de isolaten kon men identificeren als ST9 (t1430). Een verhoogd risico voor dragerschap was aanwezig bij mensen die in contact kwamen met de levende kippen en dan voornamelijk degene die de broilers aan de slachtlijn hingen. Ook het elektrisch bedwelmen van de kippen toonde een hoger risico dan de bedwelming door CO2. De kippen worden pas na de CO2 bedwelming aan de slachtlijn gehangen. Meer studie van de impact van LA-MRSA op pluimvee is noodzakelijk, ook betreffende de resistentie die voorkomt tegenover tetracyclines, macroliden, lincosamiden en trimethoprim waardoor de mogelijke behandeling van pluimvee in geval van infectie met deze MRSA in het gedrang komt (Nemati et al., 2008) Paarden In 93 werd in Michigan de eerste uitbraak gezien van MRSA bij elf gehospitaliseerde paarden (Seguin et al., 1999). Nadien werden meerdere ziekenhuisinfecties vastgesteld bij paarden door MRSA onder andere in Canada (Weese et al., 2005), Groot-Brittannië (Baptiste et al., 2005), Oostenrijk (Cuny et al., 2006) en Ierland (O'Mahony et al., 2005). Walther et al. (2009) onderzochten de verschillende stammen die aanwezig zijn bij gekoloniseerde paarden. Men vond voornamelijk CC8 met sequentie types 254 voornamelijk en enkele ST8, verder vond men ook ST22. Deze stammen werden reeds beschreven als MRSA isolaten van zowel humane als equiene origine (Enright et al., 2002; Weese et al., 2005; Cuny et al., 2006) en de studie van Walther et al. (2009) toonde een moleculaire verwantschap aan tussen deze stammen van verschillende oorsprong waardoor men kon concluderen dat een potentiële interspecies overdracht mogelijk is. Weese et al. (2006a) hebben het risico onderzocht van het gebruik van ceftiofur en aminoglycosiden op de kolonisatie van de neus bij paarden en beide middelen konden hiermee geassocieerd worden als mogelijke risicofactoren. Ze haalden in deze studie ook aan dat geïnfecteerde of gekoloniseerde paarden, diergeneeskundig personeel en ziekenhuisomgeving als bronnen kunnen dienen voor MRSA transmissie. Zowel gekoloniseerde als niet-gekoloniseerde paarden kunnen geïnfecteerd raken door MRSA (Weese et al., 2006b). Verschillende infecties werden gemeld zoals septische artritis, osteomyelitis (Cuny et al., 2006) en omphalitis (Baptiste et al., 2005). 13

18 Witte et al. (2007) isoleerden voor het eerst ST398 bij paarden, later konden Hermans et al. ST398 isoleren bij een geïnfecteerd paard (2008). In de kliniekafdeling van een Oostenrijkse veterinaire universiteit rapporteerde men LA-MRSA (ST398) bij paarden, naast ST1 en ST254. ST398 werd toen ook bij twee studenten waargenomen in de nasale swabs (Cuny et al., 2008). Later onderzocht men in België de nasale swabs van paarden afkomstig uit België, Nederland, Frankrijk en Luxemburg. Uit de resultaten bleek dat 10,9% drager waren van MRSA op het ogenblik van aankomst in de dierenkliniek en dat alle isolaten tot ST398 behoorden (Van den Eede et al., 2009). In 2009 werd MRSA ST398 voor het eerst geïsoleerd bij paarden in Noord-Amerika. In deze studie werd ook de kolonisatie onderzocht waaruit bleek dat 1,3% ± 5,84% drager was van MRSA ter hoogte van de neus en dat het hier voornamelijk om CMRSA-5 ging (Tokateloff et al., 2009). Canadian epidemic MRSA-5 (CMRSA-5) of USA500 is een humane kloon die predominant aanwezig is in Noord-Amerika (Weese et al., 2004) en behoort tot sequentie type 8 (Hanselman et al., 2006) Gezelschapsdieren Reeds vroeg suggereerde Mann (1959) dat honden en katten in staat zijn om de mens te besmetten met S. aureus. De eerste MRSA bij gezelschapsdieren werd teruggevonden in Nigeria in 1972 door Ojo (Loeffler et al., 2010c). Scott et al. onderzochten in 1988 de bewoners van een bejaardentehuis waar 38% van de aanwezige personen drager bleek van MRSA en zij leefden samen met een gekoloniseerde kat. Na hygiënemaatregelen en het wegdoen van de kat zag men een snelle daling in het voorkomen van MRSA (Haesebrouck et al., 2006). Tien jaar later konden Lilenbaum et al. (1998) MRSA isoleren uit diepe huidafkrabsels ter hoogte van de lumbosacraalstreek bij klinisch gezonde katten. In 1994 konden Cefai et al. een verband vinden tussen menselijke MRSA stammen en deze bij de hond door gebruik te maken van faagtypering. Later, in 2003, toonde Manian de link aan tussen de MRSA isolaten van een hond en zijn eigenaars met behulp van PFGE. Uit studies in Groot-Brittannië (Rich et al., 2005) en Ierland (O Mahony et al., 2005) constateerde men dat de MRSA stammen die teruggevonden werden bij hond en kat identiek waren aan de stammen die het meest infectie veroorzaken bij de mens. Loeffler et al. (2010) toonden MRSA aan in nasale swabs van dierenartsen en eigenaars die in contact kwamen met MRSA-geïnfecteerde huisdieren. Bijna alle isolaten bij deze mensen en dieren behoorden tot CC22 en CC30, welke typische ziekenhuis MRSA stammen zijn in Groot-Brittannië. Hoewel men aanvankelijk aan een humanose dacht, doordat HA-MRSA stammen werden gevonden bij de hond (Loeffler et al., 2005; Morris et al., 2006), isoleerde men in 2003 voor het eerst een MRSA stam van dierlijke oorsprong bij mensen in Nederland (van Duijkeren et al., 2003). Men zou kunnen stellen dat huisdieren eventueel kunnen fungeren als reservoir of bron van infectie voor hun eigenaars (Haesebrouck et 14

19 al., 2006). Strommenger et al. (2006) suggereerden dan weer op basis van hun studie dat de mens de bron van infectie of kolonisatie van gezelschapsdieren kan zijn en dat dieren op hun beurt drager worden en zo MRSA overdragen op de mens (cross-transmission). De transmissie van MRSA tussen honden onderling blijkt laag te zijn in goed onderhouden kennels. Wanneer er dragers aanwezig zijn blijkt de kiem niet te persisteren en leidt deze ook niet tot infectie van de honden wanneer er geen additionele risicofactoren aanwezig zijn (Loeffler et al., 2010b). Een slechte staat of ontsteking van de huid bevoordeelt MRSA kolonisatie bij katten (Abraham et al., 2007). Met antibiotica behandelde huisdieren maar ook dragers van coagulase positieve stafylokokken (niet MRSA) hebben een groter risico om gekoloniseerd te worden door MRSA (Loeffler et al., 2010a). Het aantal antimicrobiële behandelingen, het aantal dagen opgenomen in een kliniek en de aanwezigheid van chirurgische implantaten zijn risicofactoren die aanleiding kunnen geven tot MRSA-infecties bij honden en katten (Soares-Magalhes et al., 2010). Infecties van honden door MRSA werden al enkele keren beschreven in de literatuur door Tomlin et al. (1999) in Groot-Brittannië en VSA, en door van Duijkeren et al. (2004) in Nederland. Het ging voornamelijk over postoperatieve infecties en wondinfecties maar ook over pneumonie, huid- en urinair stelsel infecties (Tomlin et al., 1999; Weese, 2005). In 2003 isoleerden Rankin et al. (2005) MRSA stammen die Panton Valentine Leukocidine (PVL) genen bevatten bij gezelschapsdieren. PVL heeft een belangrijk cytotoxisch effect op humane neutrofielen (Löffler et al., 2010). Transmissie van een PVL positieve stam van MRSA werd aangetoond tussen mens en hond door van Duijkeren et al. (2004). MRSA ST398 werd recent geïsoleerd uit een wondinfectie van een hond in Duitsland. De personen die hem verzorgd hadden, bleken ook drager te zijn van LA-MRSA (Witte et al., 2007) MRSA in dierlijke producten MRSA werd de voorbije jaren uit verschillende dierlijke producten geïsoleerd: Normanno et al. (2007) isoleerde stammen uit boviene melk, Van Loo et al. (2007) uit vleesproducten en Kitai et al. (2005) uit rauw kippenvlees. In een studie van de Boer et al. (2009) behoorden 85% van de MRSA isolaten, gevonden op diverse vleessoorten, tot ST398. Er werd geen correlatie aangetoond tussen specifieke delen of types van vlees en het voorkomen van MRSA. Tijdens het slachtproces bestaat de kans dat karkassen gecontamineerd worden met S. aureus (de Boer et al., 2009). Bhalla et al. (2007) toonden het voorkomen van de kiem aan in het gastro-intestinaal stelsel. 15

20 Slechte hygiëne in het omgaan met besmet vlees zou een transmissie kunnen veroorzaken naar de mens, maar vermits er meestal kleine aantallen MRSA worden aangetroffen, is de kolonisatie onwaarschijnlijk (de Boer et al., 2009). Er werden slechts twee uitbraken aangetoond van foodborne acquired MRSA (FBA-MRSA) na het opnemen van gecontamineerd voedsel (Kluytmans et al., 1995; Jones et al., 2002) ST398 bij dierenartsen Verschillende studies werden uitgevoerd om het percentage MRSA dragers na te gaan bij dierenartsen. Hiervoor werden meestal stalen genomen op internationale bijeenkomsten. Wulf et al. konden in 2006 aantonen dat 3,9% van de aanwezige dierenartsen drager bleek te zijn van ST398 MRSA. Later in een Deense studie vond men 12,5% gekoloniseerde dierenartsen waarbij 91,2% van de isolaten behoorden tot LA-MRSA. De positief geteste personen waren afkomstig uit België, Denemarken, Canada, Duitsland, Italië, Nederland, Spanje en Thailand (Wulf et al., 2008b). Er moet opgemerkt worden dat het niet altijd om ST398 gaat wanneer dierenartsen die in contact komen met grote huisdieren door MRSA gekoloniseerd zijn (Hanselman et al., 2006; Anderson et al., 2008). 16

21 2.5. Bespreking Vanaf de jaren 40 werden de eerste penicilline resistente isolaten waargenomen (Lowy, 2003) en later in de jaren 60 de eerste methicilline resistente (Barber, 1961). Hierdoor werd als snel duidelijk dat de behandeling van S. aureus en in het bijzonder MRSA zou bemoeilijkt worden door deze antimicrobiële resistentie. Overmatig antibioticagebruik bleek dan ook nog eens een risicofactor te zijn voor infectie van de mens door CA-MRSA en HA-MRSA (Thompson et al., 1982; Coll et al., 1994; Gosbell, 2005). Ook in de diergeneeskunde zien we een fout gebruik van antibiotica wat kan leiden tot een verhoogde kans op kolonisatie van dieren (Catry et al., 2003; Timmerman et al., 2006; Weese et al., 2006a; Graveland et al., 2010; Moodley et al., 2010) en zelfs tot infectie (Soares-Magalhes et al., 2010). Om MRSA te diagnosticeren zijn er verschillende methoden. De fenotypische testen duren echter relatief lang en de genotypische testen zoals PCR en real-time multiplex PCR zijn nog niet van hoge kwaliteit (Witt et al., 2010). De MLST database is een handig hulpmiddel maar is niet volledig te vertrouwen aangezien men willekeurige resultaten op deze website kan zetten. Een studie van Walther et al. (2009) toonde aan dat sommige MRSA isolaten zoals CC8 ST254, ST8, ST22 van zowel humane als equiene oorsprong kunnen zijn wat interspecies overdracht suggereert. Ook bij honden en katten kon men MRSA stammen isoleren die identiek bleken te zijn aan stammen die infectie kunnen veroorzaken bij de mens (O Mahony et al., 2005; Rich et al., 2005). De vraag is nog steeds of gezelschapsdieren als bron van infectie fungeren voor de mens (Haesebrouck et al., 2006) of dat de mens honden en katten koloniseert waarna men zelf kan geïnfecteerd raken door deze gekoloniseerde dieren (Strommenger et al., 2006). Toen LA-MRSA werd ontdekt in 2005 door Voss et al. dacht men dat deze isolaten hun oorsprong vonden bij varkens maar tot op heden is dit nog onbekend. Men kon wel vaststellen dat LA-MRSA niet gastheer specifiek is en dat overdracht kan gebeuren van mens naar dier en andersom (Vanderhaeghen et al., 2010). Ook transmissie tussen varkensbedrijven werd reeds vastgesteld (van Duijkeren et al., 2008). Bij melkvee kan men bij een op de tien gevallen met mastitis (subklinische en klinische) S. aureus isoleren maar de rol in de pathogenese van mastitis is nog niet bewezen (Vanderhaeghen et al., 2010). Bij pluimvee kan men een onderscheid maken tussen legkippen waar MRSA weinig voorkomt en broilers die regelmatig MRSA ST398 positief zijn (Persoons et al., 2009). Vele mensen die in contact komen met MRSA positieve dieren blijken zelf ook drager te zijn of een verhoogd risico te lopen om drager te worden (Armand-Lefevre et al., 2005; Mulders et al., 2010). Echte klinische infecties door MRSA CC398 van zowel mens (Ekkelenkamp et al., 2006; Witte et al., 2007; Wulff et al., 2008a) als dier worden niet frequent beschreven en de vraag is dan ook of dit zo in de toekomst zal blijven (Witte et al., 2007; Hermans et al., 2008; van Duijkeren et al., 2008; Vanderhaeghen et al., 2010). Wanneer er toch een toename zou zijn van klinische gevallen dan zou de behandeling een groot probleem 17

22 vormen. LA-MRSA vertoont immers resistentie tegenover β-lactam antibiotica, tetracyclines, aminoglycosiden en macroliden (Sawant et al., 2005; Nemati et al., 2008; Vanderhaeghen et al., 2010). Als conclusie kunnen we stellen dat de verschillende testen die gebruikt worden om MRSA te diagnosticeren nog voor verbetering vatbaar zijn zodat de precieze oorsprong van sommige isolaten nauwkeurig kan onderzocht worden. Dit kan helpen om meer te weten te komen over de spreiding en transmissie van MRSA van dierlijke oorsprong. Verder moet men zich afvragen wat het klinisch belang kan zijn van LA-MRSA. Deze soort wordt meer en meer geïsoleerd bij onze landbouw- en gezelschapsdieren maar echte klinische infecties zijn zelden beschreven bij dier en mens. In de toekomst zal men van nabij moeten opvolgen hoe deze stammen evolueren. 18

23 Literatuurlijst Abraham, J., Morris, D., Griffeth, G., Shofer, F., Rankin, S., 2007, Surveillance of healthy cats and cats with inflammatory skin disease for colonization of the skin by methicillin-resistant coagulase-positive staphylococci and Staphylococcus schleiferi ssp. schleiferi. Veterinary dermatology 18, Anderson, M.E.C., Lefebvre, S., Weese, J.S., 2008, Evaluation of prevalence and risk factors for methicillinresistant Staphylococcus aureus colonization in veterinary personnel attending an international equine veterinary conference. Veterinary microbiology 129, Anonymous, 2008, Analysis of the baseline survey on the prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in holdings with breeding pigs, in the EU, 2008 [1] - Part A: MRSA prevalence estimates. The EFSA Journal 2009, Anonymous, 2009, Assessment of the Public Health significance of meticillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in animals and foods. The EFSA Journal 2009, Armand-Lefevre, L., Ruimy, R., Andremont, A., 2005, Clonal comparison of Staphylococcus aureus isolates from healthy pig farmers, human controls, and pigs. Emerging infectious diseases 11, Baptiste, K., Williams, K., Willams, N., Wattret, A., Clegg, P., Dawson, S., Corkill, J., O'Neill, T., Hart, C.A., 2005, Methicillin-resistant staphylococci in companion animals. Emerging infectious diseases 11, Barber, M., 1961, Methicillin-Resistant Staphylococci. Journal of Clinical Pathology 14, 385-&. Bens, C.C.P.M., Voss, A., Klaassen, C.H.W., 2006, Presence of a novel DNA methylation enzyme in methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates associated with pig farming leads to uninterpretable results in standard pulsed-field gel electrophoresis analysis. J Clin Microbiol 44, Bhalla, A., Aron, D.C., Donskey, C.J., 2007, Staphylococcus aureus intestinal colonization is associated with increased frequency of S. aureus on skin of hospitalized patients. BMC Infect Dis 7, 105. Brakstad, O.G., Tveten, Y., Nato, F., Fournier, J.M., 1993, Comparison of various methods and reagents for species identification of Staphylococcus aureus positive or negative for the meca gene. APMIS. Acta pathologica, microbiologica et immunologica Scandinavica 101, Bran, J.L., Levison, M.E., Kaye, D., 1972, Survey for methicillin-resistant staphylococci. Antimicrobial agents and chemotherapy 1, Catry, B., Laevens, H., Devriese, L.A., Opsomer, G., De Kruif, A., 2003, Antimicrobial resistance in livestock. Journal of veterinary pharmacology and therapeutics 26, Catry, B., Van Duijkeren, E., Pomba, M.C., Greko, C., Moreno, M.A., Pyrl, S., Ruzauskas, M., Sanders, P., Threlfall, E.J., Ungemach, F., Trneke, K., Munoz-Madero, C., Torren-Edo, J., 2010, Reflection paper on MRSA in food-producing and companion animals: epidemiology and control options for human and animal health. Epidemiology and Infection 138, Cefai, C., Ashurst, S., Owens, C., 1994, Human carriage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus linked with pet dog. Lancet 344,

24 Chambers, H.F., 1988, Methicillin-resistant staphylococci. Clinical microbiology reviews 1, Chambers, H.F., 1997, Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clinical microbiology reviews 10, Chapman, G.H., Berens, C., Peters, A., Curcio, L., 1934, Coagulase and Hemolysin Tests as Measures of the Pathogenicity of Staphylococci. Journal of bacteriology 28, Coll, P.P., Crabtree, B.F., O'Connor, P.J., Klenzak, S., 1994, Clinical risk factors for methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteriuria in a skilled-care nursing home. Archives of family medicine 3, Cuny, C., Kuemmerle, J., Stanek, C., Willey, B., Strommenger, B., Witte, W., 2006, Emergence of MRSA infections in horses in a veterinary hospital: strain characterisation and comparison with MRSA from humans. Euro surveillance 11, Cuny, C., Strommenger, B., Witte, W., Stanek, C., 2008, Clusters of infections in horses with MRSA ST1, ST254, and ST398 in a veterinary hospital. Microbial Drug Resistance 14, de Boer, E., Zwartkruis Nahuis, J.T.M., Wit, B., Huijsdens, X.W., de Neeling, A.J., Bosch, T., van Oosterom, R.A.A., Vila, A., Heuvelink, A.E., 2009, Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in meat. International journal of food microbiology 134, de Neeling, A.J., van den Broek, M.J.M., Spalburg, E.C., van Santen-Verheuvel, M.G., Dam-Deisz, W.D.C., Boshuizen, H.C., van de Giessen, A.W., van Duijkeren, E., Huijsdens, X.W., 2007, High prevalence of methicillin resistant Staphylococcus aureus in pigs. Veterinary microbiology 122, Devriese, L.A., Van Damme, L.R., Fameree, L., 1972, Methicillin (cloxacillin)-resistant Staphylococcus aureus strains isolated from bovine mastitis cases. Zentralblatt für Veterinärmedizin. Reihe B 19, Ekkelenkamp, M.B., Sekkat, M., Carpaij, N., Troelstra, A., Bonten, M.J.M., 2006, [Endocarditis due to meticillin-resistant Staphylococcus aureus originating from pigs]. Nederlands tijdschrift voor geneeskunde 150, Enright, M., Robinson, D.A., Randle, G., Feil, E., Grundmann, H., Spratt, B., 2002, The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, Frénay, H.M., Theelen, J.P., Schouls, L.M., Vandenbroucke-Grauls, C.M., Verhoef, J., van Leeuwen, W.J., Mooi, F.R., 1994, Discrimination of epidemic and nonepidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains on the basis of protein A gene polymorphism. J Clin Microbiol 32, Gosbell, I.B., 2005, Epidemiology, clinical features and management of infections due to community methicillin-resistant Staphylococcus aureus (cmrsa). Intern Med J 35 Suppl 2, S Graveland, H., Wagenaar, J., Heesterbeek, H., Mevius, D., van Duijkeren, E., Heederik, D., 2010, Methicillin resistant Staphylococcus aureus ST398 in veal calf farming: human MRSA carriage related with animal antimicrobial usage and farm hygiene. PLoS ONE 5, e10990-e Guardabassi, L., O'Donoghue, M., Moodley, A., Ho, J., Boost, M., 2009, Novel lineage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Hong Kong. Emerging infectious diseases 15,

25 Haesebrouck, F., Vancraeynest, D., Hermans, K., Catry, B., Butaye, P., Decostere, A., 2006, Methicillineresistente Staphylococcus aureus-stammen bij dieren: een gevaar voor de gezondheid van dier en mens? Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 75, Hanselman, B., Kruth, S., Rousseau, J., Low, D., Willey, B., McGeer, A., Weese, J.S., 2006, Methicillinresistant Staphylococcus aureus colonization in veterinary personnel. Emerging infectious diseases 12, Harmsen, D., Claus, H., Witte, W., Rothgnger, J., Claus, H., Turnwald, D., Vogel, U., 2003, Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J Clin Microbiol 41, Hartman, B.J., Tomasz, A., 1984, Low-affinity penicillin-binding protein associated with beta-lactam resistance in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 158, Hartman, B.J., Tomasz, A., 1986, Expression of methicillin resistance in heterogeneous strains of Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 29, Hendriksen, R.S., Mevius, D.J., Schroeter, A., Teale, C., Meunier, D., Butaye, P., Franco, A., Utinane, A., Amado, A., Moreno, M., Greko, C., Stark, K., Berghold, C., Myllyniemi, A.L., Wasyl, D., Sunde, M., Aarestrup, F.M., 2008, Prevalence of antimicrobial resistance among bacterial pathogens isolated from cattle in different European countries: Acta Vet Scand 50, -. Hermans, K., Lipinska, U., Denis, O., Deplano, A., Struelens, M., Nemati, M., Pasmans, F., Butaye, P., Martens, A., P., D., F., H., 2008, MRSA clone ST398-SCCmec IV as a cause of infections in an equine clinic. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 77, Huijsdens, X.W., van Dijke, B.J., Spalburg, E., van Santen-Verheuvel, M.G., Heck, M.E., Pluister, G.N., Voss, A., Wannet, W.J., de Neeling, A.J., 2006, Community-acquired MRSA and pig-farming. Ann Clin Microbiol Antimicrob 5, 26. Huletsky, A., Giroux, R., Rossbach, V., Gagnon, M., Vaillancourt, M., Bernier, M., Gagnon, F., Truchon, K., Bastien, M., Picard, F.J., van Belkum, A., Ouellette, M., Roy, P.H., Bergeron, M.G., 2004, New real-time PCR assay for rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from specimens containing a mixture of staphylococci. J Clin Microbiol 42, Humphreys, H., Keane, C.T., Hone, R., Pomeroy, H., Russell, R.J., Arbuthnott, J.P., Coleman, D.C., 1989, Enterotoxin production by Staphylococcus aureus isolates from cases of septicaemia and from healthy carriers. Journal of medical microbiology 28, Ito, T., Katayama, Y., Hiramatsu, K., 1999, Cloning and nucleotide sequence determination of the entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus N315. Antimicrobial agents and chemotherapy 43, Ito, T., Katayama, Y., Asada, K., Mori, N., Tsutsumimoto, K., Tiensasitorn, C., Hiramatsu, K., 2001, Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial agents and chemotherapy 45, Ito, T., Ma, X., Takeuchi, F., Okuma, K., Yuzawa, H., Hiramatsu, K., 2004, Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrc. Antimicrobial agents and chemotherapy 48,