UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar De rol van bacteriële flora in orale tolerantie. door.

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar De rol van bacteriële flora in orale tolerantie door Sarah BORGONJON Promotor: Prof. Dr. Eric Cox Copromotor: Dhr. Hans Van der Weken Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2016 Sarah Borgonjon

2 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar De rol van bacteriële flora in orale tolerantie door Sarah BORGONJON Promotor: Prof. Dr. Eric Cox Copromotor: Dhr. Hans Van der Weken Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2016 Sarah Borgonjon

4 Voorwoord Met deze masterproef over de rol van bacteriële flora in orale tolerantie rond ik mijn tweede masterjaar binnen de opleiding diergeneeskunde aan de Universiteit Gent af. Ik wil enkele mensen bedanken die mij geholpen hebben tijdens het schrijven van mijn masterproef. In het bijzonder wil ik mijn promotor Eric Cox en copromotor Hans Van der Weken bedanken voor de begeleiding en de constructieve feedback. Ook richt ik een woord van dank tot mijn familie en vrienden voor hun onvoorwaardelijke steun en de welgekomen momenten van ontspanning tijdens deze intensieve periode.

5 Inhoud Samenvatting... 1 Inleiding Orale tolerantie Definitie Inductie van orale tolerantie Mechanismen van orale tolerantie Regulatorische T-cellen Voorkomen TREGS bij mens en muis Voorkomen van TREGS bij het paard De rol van bacteriële flora in orale tolerantie Bacteriële flora en allergie Bacteriële flora en inflammatoire darmaandoeningen Klinisch beeld van IBD Klinisch beeld van IBD bij de mens en behandeling Klinisch beeld van IBD bij het paard en behandeling Pathogenese van IBD Genetische factoren Microbiële factoren Omgevingsfactoren TREGS Bij het paard Probiotica en fecale microbiota transplantatie als therapie voor IBD Probiotica Probiotica bij de mens in de behandeling van IBD Probiotica bij patiënten met UC Probiotica bij patiënten met CD Conclusie en opmerkingen Probiotica bij het paard Fecale microbiota transplantatie FMT bij de mens FMT bij patiënten met ulceratieve colitis FMT bij patiënten met de ziekte van Crohn Conclusie en opmerkingen Fecale microbiota transplantatie bij het paard Bespreking Referentielijst... 27

6 Samenvatting Het tolerogeen milieu in de darm beperkt inflammatie tot een fysiologisch niveau. Zowel voedselantigenen als microbiële antigenen zijn overvloedig aanwezig in de darm en betekenen beide een potentieel risico voor inflammatie. Verschillende mechanismen dragen bij tot het tolerogeen milieu, waaronder regulatorische T-cellen. Bacteriële flora spelen een rol in het induceren en onderhouden van tolerantie in de darm. Dysbiose van deze flora wordt gevonden bij aandoeningen waar het tolerogeen milieu van de darm verstoord is. Dit is onder andere beschreven bij allergie en bij inflammatoire darmaandoeningen bij de mens. Inflammatoire darmaandoeningen zijn chronisch, recidiverend en kennen een heterogeen spectrum, zowel bij mens als bij paard. Bij de mens zijn twee types beschreven: de ziekte van Crohn en ulceratieve colitis. Bij het paard zijn meerdere types beschreven: granulomateuze enteritis, multisystemische eosinofiele epitheliotropische ziekte of idiopathische eosinofiele enterocolitis en lymfocytische / plasmacytische enterocolitis. Een mogelijk aangrijpingspunt voor therapie van deze inflammatoire darmaandoeningen is de dysbiose. Hoewel er geen consensus is of de dysbiose oorzaak of gevolg is van het verlies aan tolerantie, lijkt bacteriotherapie een elegante oplossing om deze verstoring te verhelpen. Door het toedienen van probiotica of door transplantatie van fecale microbiota poogt men de verstoring van de darmflora aan te passen en zo de inflammatie een halt toe te roepen. Studies hiernaar zijn legio bij de mens. In het geval van het paard hebben deze therapieën nog geen toepassing bij inflammatoire darmaandoeningen, maar stappen worden gezet in deze richting. Sleutelwoorden: bacteriële flora, fecale microbiota transplantatie, inflammatory bowel disease, orale tolerantie, probiotica. 1

7 APC CD CDI Con A DC EC FMT FoxP3 GALT GE GIS IBD IFN Ig IL it REG LPF M cellen MEED NF- κb NK nt REG PP SPF TCR TGFβ T H TLR TNF- α T R1 T REG UC Antigeen presenterende cel Crohn s disease (ziekte van Crohn) Clostridium difficile infectie Concanavaline A Dendritische cel Eosinofiele enterocolitis Fecale microbiota transplantatie Forkhead box P3 Gastro-intestinaal geassocieerd lymfoïd weefsel Granulomateuze enteritis Gastro-intestinaal stelsel Inflammatory bowel disease Interferon Immunoglobuline Interleukine Geïnduceerde regulatorische T-cel Lymfocytische/plasmacytische enterocolitis Microfold cellen Multisystemische eosinofielen epitheliotropische ziekte Nuclear factor κb Natural killer cel Natuurlijke regulatorische T-cel Peyerse platen Specific pathogen free T cel receptor Tumor growth factor β T-helper cel Toll-like receptor Tumor necrosis factor α Type 1 regulatorische T-cel Regulatorische T-cel Ulceratieve colitis 2

8 Inleiding Tolerantie tegenover antigenen in de darm is een fenomeen dat al van voor de eeuwwisseling gretig wordt bestudeerd, maar van de immuunprocessen die er achter schuilgaan en van de rol er van in pathologische processen kennen we nog maar het topje van de ijsberg. Het tolerogeen milieu in de darm is het resultaat van het samenspel van verschillende anatomische, immunologische en genetische factoren. Immunologisch is er een centrale rol voor T-cellen en het evenwicht tussen verschillende subsets van T-cellen stuurt de omgeving naar een pro-inflammatoire of anti-inflammatoire toestand. In het bijzonder staan de regulatorische T-cellen op de voorgrond. Deze subpopulatie CD4+ T-cellen kan anti-inflammatoir ageren en de homeostase in de darm waarborgen door het neer reguleren van fysiologische inflammatie. Tolerantie in het darmmilieu waarborgt de integriteit van de darm. Een belangrijke speler in deze tolerantie in de darm is de microbiota. Waar ze voorheen als indifferente spelers gedacht werden, duiken nu indicaties op dat ze zelf bijdragen aan tolerantie en tolerantie kunnen induceren. Verstoring van deze tolerantie resulteert in een inflammatie die niet onder controle is en die het organisme schaadt. Vooropgestelde gevallen waarin gebrek aan tolerantie schadelijk is, zijn allergie en inflammatory bowel disease. Bij inflammatory bowel disease is tolerantie tegenover de bacteriële flora van de darm verstoord. Deze chronische, recidiverende aandoening met inflammatie van de darm komt onder andere voor bij mens en bij paard. De pathogenese van deze aandoening is complex en behalve de microbiële factoren spelen ook genetische en omgevingsfactoren een rol. Het doelwit van therapieën als probiotica en fecale microbiota transplantatie is het aanpakken van de verstoring in de bacteriële flora en deze herstellen naar een normale samenstelling. 3

9 1. Orale tolerantie 1.1. Definitie Orale tolerantie wordt gedefinieerd als een toestand waarin lokale en systemische immuniteit niet reageren, een toestand die geïnduceerd wordt door orale toediening van onschadelijk antigen zoals voedseleiwitten (1). Het gastro-intestinaal stelsel (GIS) vormt een complex ecosysteem waarin het epitheel, immuuncellen en de microflora nauw samenwerken om een delicaat evenwicht te behouden (2). Het heeft dagelijks een hele lading antigeen (Ag) te verwerken, onder de vorm van het opgenomen voedsel of van de commensalen gehuisvest in de darm (1,3). Deze enorme hoeveelheid antigen wordt van het verworven immuunsysteem gescheiden door een enkele laag epitheliale cellen. Het immuunsysteem moet de onschuldige en schadelijke antigenen kunnen onderscheiden. In het geval dat er geen tolerantie is tegenover onschadelijke intestinale antigenen, ontstaat er inflammatie met mogelijks nadelige gevolgen (4). In de dunne darm is tolerantie nodig tegenover voedselantigenen om schadelijke overgevoeligheidsreacties te voorkomen. In de dikke darm is er tolerantie nodig tegenover de commensalen. Een verstoring in tolerantie kan mogelijks een afwijkende immuunrespons tot gevolg hebben die leidt tot inflammatoire darmaandoeningen (5,6). Voor dit onderscheid is het intestinale immuunsysteem verantwoordelijk. Het intestinale immuunsysteem of ook het gastro-intestinaal-geassocieerd lymfoïd weefsel (GALT), bestaat uit lymfocyten verspreid in het epitheel en georganiseerde weefsels als de Peyerse platen (PP), en kleinere, aparte lymfoïde follikels verspreid doorheen het maagdarmkanaal (7). De mesenteriale lymfeknopen behoren hier niet toe omdat zij zowel mucosale als systemische weefsels draineren. Hoewel de meeste GALT cellen geactiveerd zijn en pro-inflammatoire mediatoren aanwezig zijn, wordt lokale inflammatie tegengewerkt door regulatorische factoren (5). Orale tolerantie is verschillend van centrale tolerantie. Centrale tolerantie zorgt dat het lichaam niet reageert op lichaamseigen antigenen. Dit gebeurt door negatieve selectie van T-lymfocyten in de thymus en B-lymfocyten in het beenmerg. Daarnaast zullen enkele T-cellen die eigen antigeen herkennen met lage affiniteit FoxP3 tot expressie brengen en differentiëren tot natuurlijke TREGS. Hiervoor is herkenning van antigeen door de T cel receptor (TCR) nodig. Orale tolerantie wordt lokaal geïnduceerd maar kan ook het systemisch immuunsysteem beïnvloeden. De inductie van orale tolerantie gebeurt door orale toediening van onschadelijk antigeen. Het omvat ook een meer lokaal proces ter hoogte van de darmmucosa dat tolerantie tegenover commensalen bewerkstelligd. Er is een belangrijk verschil tussen tolerantie tegenover voedseleiwitten en bacteriën: tolerantie tegenover voedseleiwitten geïnduceerd in de dunne darm heeft een invloed op de lokale en systemische immuunrespons, tolerantie tegenover darmbacteriën in het colon heeft geen effect op de systemische immuunrespons (1). De definitie van Strobel et al. Orale tolerantie is gedefinieerd als het niet systemisch reageren op een voorheen opgenomen antigen wanneer het parenteraal wordt tegengekomen (8), heeft het enkel over tolerantie tegenover voedselantigenen. Omdat in veel literatuur orale tolerantie tegenover voedselantigenen en commensalen vaak in één adem worden vernoemd, pleiten Pabst et al. (1) voor het gebruik van de term orale tolerantie om tolerantie tegenover oraal toegediend antigeen te 4

10 beschrijven. De term mucosaal geïnduceerde tolerantie wordt naar voren geschoven om tolerantie geïnduceerd door andere antigenen in andere delen van de darm te beschrijven. In deze masterproef zal orale tolerantie de definitie volgens Strobel et al. volgen, tenzij expliciet anders vermeld Inductie van orale tolerantie Zoals hierboven beschreven, induceert orale toediening van voedselantigenen tolerantie. Om herkend te worden door het immuunsysteem moeten voedselantigenen eerst het epitheel van de dunne darm voorbij (9). Antigen kan opgenomen worden in GALT en de lamina propria dankzij microfold cellen (M cellen) en dendritische cellen (DC s). M cellen zijn gespecialiseerde epitheliale cellen in GALT die partikels uit het intestinaal lumen opnemen en doorgeven aan DC s. DC s kunnen ook zelf antigen direct opnemen uit het lumen. Antigen dat diffundeert doorheen de epitheliale tight junctions of dat door transcellulair transport in de lamina propria is terecht gekomen, kan hier door CD103 + DC s worden opgenomen. Maar ook CX3CR1 high macrofagen kunnen luminale antigenen opnemen door uitlopers tussen epitheelcellen te sturen. Ze kunnen deze antigenen doorgeven aan CD103 + DC s (1). Het antigen komt dus terecht in antigeen presenterende cellen (APC). Deze presenteren het antigen aan naïeve T- cellen. Daarvoor migreren ze naar de mesenterische lymfeknopen waar de naïeve T-cellen zich bevinden. Een antigeen-specifieke CD4 + T-cel die wordt gestimuleerd door deze DC s kan verschillende kanten uit differentiëren afhankelijk van de cytokines aanwezig in zijn omgeving. Hoge concentraties TGF-β en retinoïnezuur in de mesenterische lymfeknoop bevorderen een tolerogene omgeving die de differentiatie naar regulatorische T-cellen stimuleert. Deze TREGS migreren terug naar de lamina propria van de dunne darm waar ze zich uitbreiden en ongewenste responsen op voedselantigenen onderdrukken door het produceren van interleukine 10 (IL-10), tumor growth factor β (TGF-β) en IL-35 (9) Mechanismen van orale tolerantie Verschillende mechanismen die bijdragen tot orale tolerantie zijn beschreven, die niet exclusief en mogelijks overlappend zijn. Dit zijn onder andere de inductie van regulatorische T-cellen en inductie van anergie of deletie (10). Recente studies focussen voornamelijk op het omschrijven en definiëren van de regulatorische T-cellen, maar ook andere factoren dan deze TREGS kunnen de inductie en expressie van immuunresponsen beïnvloeden (10). Onder andere zijn er aanwijzingen voor specifieke cytotoxische T-cellen die de immuunrespons kunnen inperken door B-cellen te doden (11). Klonale deletie is een ander mechanisme waarbij T helper 1 (TH1) en T helper 2 (TH2) cellen verwijderd worden door een hoge dosis van oraal toegediend antigen (12) of inactivatie van antigeen-specifieke T-cellen - een proces dat zowel in de thymus als in de periferie kan doorgaan (12). Daarenboven is er TGF-β als immuunregulator (4,13-15). In het kader van deze masterproef zal ik enkel de rol van TREGS toelichten. 5

11 1.4. Regulatorische T-cellen Een van de best onderzochte mechanismen van orale tolerantie is de inductie van regulatorische T- cellen (1). TREGS doen hun intrede in de immunologie in de jaren 70 en veroveren hun plaats dankzij studies bij muizen na thymectomie. Het weghalen van de thymus vroeg na de geboorte geeft aanleiding tot het ontwikkelen van auto-immuniteit (16). Introductie van de subpopulatie CD45RB high CD4 + T-cellen bij dit diermodel resulteert in leukocyteninfiltraties in verschillende organen en ernstige ziekte. Toedienen van de subpopulatie CD45RB low CD4 + T-cellen veroorzaakt geen ziekte, zowel bij aparte toediening als bij toediening in combinatie met de CD45RB high CD4 + T-cellen. Deze observaties duiden een subpopulatie T-cellen die een regulerende invloed heeft op andere T-cellen (17,18). De ontdekking dat deze subpopulatie een hoge constitutieve expressie van CD25 [de α keten van de interleukine (IL) -2 receptor] heeft, betekende ook de mogelijkheid om ze te isoleren. CD4 + CD25 + T-cellen blijken nodig om auto-reactieve T-cellen onder controle te houden. Ze krijgen de naam regulatorische T-cellen (17). De merker CD25 is evenwel niet specifiek. Ook bij geactiveerde T- en B-cellen komt CD25 tot expressie (17-19). Een ander kenmerk is hun expressie van FoxP3. FoxP3 is een transcriptiefactor en is onmisbaar voor de functie en ontwikkeling van TREGS bij muizen (16,20). Het programmeert de ontwikkeling van de TREGS in de thymus (21). FoxP3 kan ook gebruikt worden om deze subpopulatie te identificeren (16, 22). TREGS kunnen ingedeeld worden naargelang hun plaats van ontwikkeling. Natuurlijk voorkomende TREGS (ntregs) ontstaan uit stamcellen vanuit het beenmerg en matureren in de thymus. Ze hebben voor hun ontwikkeling de interactie van de T-cel receptor met zijn respectievelijk antigeen nodig (23). Costimulatorische moleculen zijn nodig voor hun ontwikkeling. Ze migreren vanuit de thymus naar de periferie. ntregs hebben een constitutieve expressie van de transcriptie factor FoxP3, die hun ontwikkeling in de thymus programmeert (24). Deze cellen zijn anergisch en hebben suppressieve eigenschappen (25). Geïnduceerde TREGS (itregs) ontwikkelen in de periferie uit naïeve CD4 + T-cellen. Deze kunnen FoxP3 + of FoxP3 - zijn (24). DC s in de lamina propria kunnen antigeen uit het lumen opnemen door met hun uitlopers tussen epitheelcellen tot in het lumen te gaan. Deze DC s migreren vervolgens naar de PP of mesenteriale lymfeknopen. Daar worden dan FoxP3 + TREGS geïnduceerd uit naïeve precursoren (26). Er kunnen twee subsets onderscheiden worden binnen de itregs. Type 1 regulatorische T-cellen (TR1) en T-helper 3 cellen (TH3) zijn de voornaamste subsets van de itregs. TR1-cellen worden in de periferie geïnduceerd door IL-10, TH3-cellen door TGF-β. Ze zijn gekenmerkt doordat ze het cytokine dat hen induceerde in hoge concentraties produceren. TR1-cellen verschillen nog van TH3-cellen omdat ze geen FoxP3 tot expressie brengen, terwijl TH3 cellen dit wel doen na inductie (22). Behalve de TR1-cellen zijn er nog regulatorische T-cellen beschreven die enkel IL-10 secreteren. TR1- cellen secreteren naast IL-10 ook interferon γ (IFN-γ) en IL-5. Andere IL-10 producerende TREGS produceren geen andere cytokines (27). Ook CD8 + T-cellen, B regulatorische cellen, natural killer (NK) cellen en subpopulaties van DC s spelen een rol in regulatie van het immuunsysteem (28). 6

12 Voorkomen TREGS bij mens en muis TREGS zijn een heterogene populatie lymfocyten die immunosuppressieve eigenschappen bezitten (29). Verschillende subsets van T-cellen met regulatorische activiteit zijn beschreven. Zoals hierboven beschreven wordt een onderscheid gemaakt tussen ntregs en itregs. De ntregs (CD4 + CD25 + FoxP3 + T-cellen) zijn vroeg postnataal aanwezig bij muizen en mensen. Kenmerkend zijn de hoge expressie van CD25 (CD4 + CD25 +/high ) samen met expressie van FoxP3 (4). In tegenstelling tot bij de muis, waar FoxP3 expressie zich beperkt tot T-cellen met een regulatorische functie, is bij de mens FOXP3 expressie meer verspreid (10). Geactiveerde CD4 + CD25 + T-cellen kunnen FOXP3 tot expressie brengen zonder dat ze suppressieve eigenschappen verwerven (22). Mutaties in FOXP3 resulteren in immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome (IPEX) bij de mens, een auto-immuun aandoening die fataal is (30). De functie van TREGS is bij deze individuen verstoord. Bij de muis leiden mutaties in FoxP3 tot Scurfy en tot afwezigheid van functionele TREGS (31). Hoewel niet zo zwart-wit als bij de muis, heeft FOXP3 een sleutelrol in de regulatie van TREGS bij de mens (22). De itregs worden geïnduceerd in de periferie uit CD4 + CD25 - FoxP3 - cellen en kunnen ingedeeld worden in drie subsets: TH3-cellen, TR1-cellen en itregs. TH3-cellen onderscheiden zich als een aparte subset door hun inductie door en secretie van TGF-β. TR1-cellen worden geïnduceerd door IL-10. Karakteristiek voor deze cellen is de afwezigheid van FOXP3 expressie, lage expressie van CD25 (CD25 -/low ) en een uniek cytokine profiel (IL-4 -, IL-5 +, IL-10 +, TGF-β + ) (4). Ze worden geassocieerd met het onderhouden van perifere tolerantie en controle van auto-immuniteit (32) Voorkomen van TREGS bij het paard Bij het paard is een populatie CD4 + IFN-γ + IL-10 + cellen beschreven. Dit profiel komt overeen met dit van TR1-cellen bij de mens (27). Ook ntregs circuleren in de bloedbaan bij paarden. Een studie beschreef CD4 + TREGS met een constitutieve expressie van FOXP3 bij paarden (33). Een andere studie isoleerde CD4 + CD25 + FOXP3 + cellen. Deze prolifereerden niet na activatie en hadden suppressieve eigenschappen. Zoals bij de mens en de muis worden deze CD4 + CD25 + FOXP3 + cellen voornamelijk teruggevonden als subpopulatie van CD4 + CD25 high cellen. Bij paarden brengt evenwel maar een minderheid van de CD4 + CD25 high cellen FOXP3 tot expressie. Ook in de CD4 + CD25 dim populatie kunnen TREGS aanwezig zijn. itregs kunnen geïnduceerd worden uit CD4 + CD25 - FOXP3 - cellen in vitro met een cocktail van IL-2, concanavaline A (Con A) en TGF-β1. Na inductie zijn deze cellen anergisch en kunnen ze proliferatie van T-cellen onderdrukken. Daarnaast hebben ze een verhoogde expressie van IL-10 en TGF-β mrna. Ook CD8 + FoxP3 + cellen zijn beschreven (24). FOXP3 speelt zoals bij de mens een ambigue rol, met een verhoogde expressie zowel aanwezig bij activatie van lymfocyten als bij TREGS. Het is aangetoond dat ook bij het paard FOXP3 gecorreleerd is met de suppressieve eigenschappen van TREGS. Het volledig FoxP3 mrna van het paard werd gekloond en gesequeneerd. Er is een hoog percentage homoloog aan het mrna van mens, muis, hond, kat en rund (24). Veulens hebben tijdens de eerste drie maanden een relatief hoger aandeel functioneel mature CD4 + CD25 + FOXP3 + TREGS in circulatie dan volwassen dieren (34). De proportie circulerende TREGS daalt met ouder worden (33,34). CD4 + CD25 - hebben bij veulens een bias naar CD4 + CD25 high itregs. 7

13 Veulens kunnen FOXP3 beter opreguleren in vergelijking met jaarlingen of volwassen paarden en het aantal itregs is beduidend hoger na in vitro stimulatie (34). 8

14 2. De rol van bacteriële flora in orale tolerantie De darm van zoogdieren wordt bevolkt door een dense en diverse gemeenschap van micro-organismen (35). Het merendeel van deze micro-organismen zijn bacteriën, maar ook eukaryoten, virussen (36) en zelfs Archaea zijn aanwezig (37). Het overgrote deel van de microflora zijn anaerobe, niet-pathogene kiemen en hebben een symbiotische relatie met de gastheer. Hun aantallen in de darm zijn enorm en vermoed wordt dat bij de mens tot 400 verschillende species in de darm voorkomen (38). Bacteriële flora van de moeder en vanuit de omgeving koloniseren de darm kort na de geboorte (39). Grote veranderingen in de microbiota ontstaan bij het spenen van jonge dieren (40). Het ecosysteem evolueert gradueel naar een stabiele gemeenschap die voornamelijk uit obligate anaëroben bestaat (41-42). De compositie van de intestinale microflora kan veranderen doorheen de tijd. Genetica speelt een rol, alsook de omgeving. Een studie toonde de invloed van het genotype aan bij de mens door de gelijkenissen tussen fecale flora van tweelingen en getrouwde koppels te bepalen. Tweelingen hadden een grote graad van gelijkenis, bij getrouwde koppels was deze laag (43). Een omgevingsinvloed op de microflora is het gebruik van antibiotica (44). Andere factoren zijn genetica, dieet, leeftijd, medicatie, roken en mogelijks nog veel meer (45). De verandering in samenstelling kan belangrijke verstoringen betekenen voor de metabolisatie van het microbioom (46). Het gastro-intestinaal microbioom van de mens wordt gedomineerd door vier grote bacteriële fyla: Firmicutes, Bacterioidetes (37,45,47) en in mindere mate Proteobacteria en Actinobacteria (45, 47). De intestinale bacteriën dragen op verschillende manieren bij tot het welzijn van de gastheer. Zo bevorderen ze de efficiëntie van vertering (48). Daarnaast zijn ze ook nodig voor de ontwikkeling van het GALT (8). Het houden van muizen onder kiemvrije omstandigheden geeft immers aanleiding tot een reductie in grootte van de PP met weinig en onduidelijk afgelijnde germinale zones (49). Associatie met E. coli of B. infantis induceert de ontwikkeling van de PP, maar er zijn nog geen germinale zones aanwezig (8). B-cellen zijn aanwezig in de PP van kiemvrije dieren, T-cellen daarentegen in lage aantallen. Bij SPF dieren kunnen in contrast veel T-cellen worden aangetroffen. Dit duidt mogelijks een rol voor de bacteriële flora in de kolonisatie en expansie van T-cellen in de PP aan (8). Ook beperken ze kolonisatie door pathogenen (48). In ruil daarvoor kunnen ze gebruik maken van een beschermde, voedselrijke omgeving (50). Hoewel de relatie vaak als commensaal wordt bestempeld, is de term symbiotisch beter (35). Er is een stijgende gradiënt van koloniserende microflora naarmate men meer distaal in het GIS gaat. De maag en proximale dunne darm bevatten lage aantallen bacteriën door de aanwezigheid van lage ph en de snelle flow in dit gebied. De distale dunne darm bevat een meer diverse microflora en vormt een overgangszone naar de dikke darm. De dikke darm en met name het colon is de belangrijkste plaats van microbiële kolonisatie. Ieder compartiment van de darm kan opgedeeld worden in verschillende niches, waaronder het intestinaal lumen, de oppervlakkige mucuslaag, de diepe mucuslaag en het oppervlak van mucosale epitheliale cellen (51). In een stabiel gastro-intestinaal ecosysteem worden alle niches ingenomen door de intestinale microflora (52). 9

15 De intestinale microflora is belangrijk in het reguleren van inflammatie in de darm en homeostase van de immuniteit (53). De symbiotische aard van deze relatie is afhankelijk van het beperken van penetratie van de bacteriën in het weefsel van de gastheer. De eerste lijn van verdediging is het mucosale oppervlak van de darm (35). Epitheelcellen produceren antimicrobiële peptiden zoals α defensines en mucines die verhinderen dat bacteriën de mucosale barrière doorbreken (54-56). Secretie van immunoglobuline A (IgA) in het intestinaal lumen vormt één van de lagen van de mucosale barrière die bacteriële penetratie beperkt en inflammatie tegengaat (57). Er is continue productie van IgA die commensale bacteriën en voedselantigenen bindt. Bij muizen deficiënt in T-cellen was er na orale toediening van E. coli IgA aanwezig. Deze IgA productie geïnduceerd door commensalen is bovendien onafhankelijk van georganiseerd lymfoïd weefsel, zoals aangetoond door muizen met rudimentaire PP die in het lumen een normaal gehalte IgA gebonden aan commensalen vertoonden. Deze IgA secretie werd ook geïnduceerd door toedienen van membraanproteïnen of lipopolysaccharide van bacteriën. Kolonisatie van de darm met microflora is nodig om deze IgA te secreteren, want bij kiemvrije muizen was dit IgA er niet (58). Ook DC s dragen bij tot deze IgA productie, doordat de DC s die commensale antigenen transporteren niet verder gaan dan de mesenteriale lymfeknopen. Zo wordt een systemische infectie voorkomen en de commensaal-specifieke IgA respons beperkt tot de mucosa van de darm (57) en is er minder contact met het systemisch immuunsysteem. Commensalen kunnen enige tijd persisteren in de DC s (59). Er is nog discussie of deze T-helper cel onafhankelijke IgA productie ook bij de mens bestaan. Bij andere diersoorten dan de muis werd dit tot hiertoe nog niet aangetoond (57). Bacteroides thetaiotaomicron, een anaeroob die prevalent is in de darm van de mens, moduleert de expressie van inflammatoire genen. De bacterie zwakt de productie van pro-inflammatoire cytokines af door in te werken op nuclear factor κb (NF-κB) die betrokken is in de regulatie van de transcriptie van inflammatoire genen. Het verhoogt de nucleaire export van NF-κB naar het cytoplasma, waar het zijn functie niet meer kan uitoefenen (53). Ook niet-virulente Salmonella stammen kunnen in vitro bij een model van menselijke epithelia door directe interactie de synthese van inflammatoire moleculen verzwakken. Ze gaan degradatie van IκB-α tegen. Proteolyse van IκB-α zorgt dat NF-κB naar de nucleus kan en kan zorgen voor transcriptie van effector genen (60). Steinhoff et al. stellen voorop dat dergelijke mechanismen ook door de commensale microflora kunnen gebruikt worden (59). Studies als deze tonen aan dat commensalen actief intestinale inflammatie kunnen beperken door in te werken op activatie van NF-κB (61). Moleculaire nabootsing van gastheermolecules houdt in dat bacteriën oppervlakte molecules hebben die gelijken op deze die aanwezig zijn op het oppervlak van de gastheer. De commensale stam Bacteroides fragilis kan dit en is zo in staat om in nauw contact met de intestinale enterocyten te leven (62) Bacteriële flora en allergie Bacteriële flora moduleren tolerantie tegenover voedselantigenen via verschillende mechanismen. De stijgende prevalentie van atopie (neiging tot allergie) in Westerse geïndustrialiseerde landen gaf aanleiding tot de hypothese dat een overmatig hygiënische levensstijl het normale patroon van intestinale kolonisatie tijdens de kindertijd verstoort en zo een gebrek aan tolerantie veroorzaakt (63). 10

16 Hierboven is kort orale tolerantie tegenover voedselantigenen besproken. Ook tegenover de commensalen in de darm is er tolerantie. Daarenboven dragen deze commensalen bij tot tolerantie tegenover voedselantigenen. Zo kan bij kiemvrije muizen een immuunreactie worden opgewekt tegen oraal toegediend antigen. Mono-associatie van deze muizen met bacteriën zoals Escherichia coli en Bifidobacterium infantis herstelt orale tolerantie tot op een niveau zoals bij specific pathogen free (SPF) muizen (8) Bacteriële flora en inflammatoire darmaandoeningen Inflammatory bowel disease (IBD) is een chronische, recidiverende inflammatoire aandoening van het gastro-intestinaal stelsel die klinisch heterogeen is. Bij de mens omvat ze twee types: de ziekte van Crohn (CD) en ulceratieve colitis (UC) (64-65). De oorzaak is tot op heden onbekend, maar de mechanismen zijn immunologisch. Gedereguleerde immuunresponsen tegenover ongevaarlijke luminale microflora in genetisch gevoelige individuen worden algemeen beschouwd als sleutelfactoren in de pathogenese van IBD (9). Ontwikkeling van nieuwe moleculaire technieken om het darmmicrobioom in zijn geheel te bestuderen en het identificeren van susceptibiliteitsgenen voor de ziekte van Crohn in het bijzonder hebben geleid tot een beter begrip van de etiopathogenese van IBD. Microbiële studies hebben de normale compositie van het darmmicrobioom opgehelderd en de verstoringen bij IBD aangetoond (66). Een gebrek aan tolerantie tegenover de microflora stuurt mogelijk de verandering in de relatie tussen intestinale bacteriën en hun gastheer (63). Verschillende observaties impliceren de rol van bacteriële flora in IBD. Studies van experimentele diermodellen tonen aan dat intestinale inflammatie niet wordt gezien bij kiemvrije muizen. Vergelijking van muizen met een deletie van het IL-10 gen in SPF of kiemvrije omstandigheden toonde dat colitis zich enkel ontwikkelt bij de SPF muizen (67). Antibiotica of afleiding van de fecale stroom kan inflammatie reduceren bij experimentele diermodellen en bij mensen in klinische omgeving. Toediening van breedspectrum antibiotica bij CD patiënten vermindert de totale vrijgave van IL-8 en eicosanoïden (68). Ook bij ratten is aangetoond dat breedspectrum antibiotica significante reductie van inflammatie tot gevolg heeft (69). Gereseceerd ileum van drie CD patiënten vertoonde na contact met intestinale inhoud inflammatie (70). Daarenboven zijn zowel CD als UC geassocieerd met significante verschuivingen in de samenstelling van de enterische microbiota. Dit veranderd microbioom of dysbiose is een sleutelelement in het langdurig verloop van de inflammatie bij IBD. Zowel de samenstelling van de microflora als mucosale kolonisatie door microflora verschilt bij IBD. Bij gezonde mensen is het mucosale oppervlak bijna steriel (71). IBD patiënten daarentegen hebben meer bacteriën op het mucosale oppervlak en er is ook invasie van de mucosa door bacteriën (72). Het immuunsysteem is niet tolerant tegenover microbiële antigenen bij IBD. Individuen met IBD hebben een overdreven mucosale immuunrespons tegen cytoplasmatische eiwitten van bacteriën. Een studie die de antigene oorsprong van de aanwezige verhoogde IgG bij patiënten met IBD onderzocht, vond dat IgG reageerde met een reeks eiwitten van niet-pathogene commensale fecale bacteriën (73). Een andere studie bevestigde dat in vergelijking met de gezonde controlegroep, bij IBD patiënten een hoger percentage van Ig gecoate fecale bacteriën voorkomt (74). Er zijn aanwijzingen dat orale tolerantie verstoord is bij IBD en dat dit kan bijdragen tot de inflammatie. Een studie die de reactiviteit van perifere 11

17 lymfocyten tegen bacteriële en voedselantigen onderzocht bij CD patiënten, kon aantonen dat reactiviteit algemeen aanwezig is bij deze patiënten en dat deze lymfocyten kunnen bijdragen tot het inflammatoir proces (75). Pirzer et al. (76) onderzochten de reactiviteit van T-cellen uit normale en abnormale mucosa bij CD patiënten. T-cellen afkomstig van de normale mucosa reageerden niet op microbiële antigenen, maar deze uit ontstoken mucosa wel. Waar de gezonde mucosa fecale bacteriën op afstand kan houden en er voor kan zorgen dat er geen nauw contact is tussen de aanwezige microflora en het epitheliaal oppervlak, is dit niet het geval bij IBD. Swidsinski et al. (71) postuleren dat deze functie verstoord is bij patiënten voordat er lokale inflammatoire veranderingen zijn Klinisch beeld van IBD Klinisch beeld van IBD bij de mens IBD omvat bij de mens twee verschillende aandoeningen, UC en CD. Beiden worden gekenmerkt door chronische inflammatie van de darm in genetisch gepredisponeerde individuen blootgesteld aan bepaalde risicofactoren vanuit de omgeving (77-78). De ziekte van Crohn kan ieder deel van het maagdarmstelstel aantasten, vaak op een discontinue manier, maar treft meestal het distale ileum en colon. Alle lagen van de darmwand kunnen aangetast worden (76). Ulceratieve colitis daarentegen is beperkt tot het colon, waar de ziekte zich distaal uitstrekt vanaf het rectum en enkel de mucosa is aangetast (76, 79-80) Klinisch beeld van IBD bij het paard De literatuur beschrijft IBD bij het paard als een idiopathische aandoening (81). Het is een verzamelnaam voor een groep van infiltratieve intestinale ziektes waarin chronisch gewichtsverlies een centraal gegeven is (77-78). Het klinisch beeld kan variëren van malabsorptie en gewichtsverlies tot diarree en koliek (80-82). Meestal is de dunne darm aangetast, occasioneel ook de dikke darm bij vergevorderde ziekte. De diagnose gebeurt aan de hand van de mate van inflammatie en het overheersende celtype in het cellulaire infiltraat in een biopt (77), samen met klinische tekenen (78-80). Op basis van het histologisch uitzicht en de betrokkenheid van andere organen kan IBD geclassificeerd worden in verschillende types namelijk granulomateuze enteritis (GE), multisystemische eosinofiele epitheliotropische ziekte (MEED) of idiopathische eosinofiele enterocolitis (EC) en lymfocytische / plasmacytische enterocolitis (LPE) (78,80). GE kenmerkt zich door diffuse granulomateuze laesies, voornamelijk in de dunne darm. Er is infiltratie van lymfocyten en macrofagen in de lamina propria van de mucosa en het aantal plasmacellen en reuzecellen varieert (77-78). Er is duidelijk atrofie van de villi (77-78) en typisch is het ileum het meest aangetaste deel van het GIS (83). Aangetaste paarden vertonen meestal chronisch en progressief gewichtsverlies en anorexie. Huidlaesies, voornamelijk rond het hoofd, op ledematen en op de kroon komt in enkele gevallen voor (84). Anemie komt in sommige gevallen voor. Vooropgesteld wordt dat deze anemie immuungemedieerd is ten gevolge van chronische inflammatie of dat ze ontstaat door malabsorptie en tekort van een onderdeel nodig voor erytropoëse. Neutropenie en neutrofilie zijn beschreven, de variaties in hun aantallen mogelijks veroorzaakt door absorptie van endotoxines doorheen aangetaste intestinale mucosa. Hypo-albuminemie is een van de meest consistente 12

18 bevindingen bij paarden met GE (80). Andere tekenen indicatief voor gastro-intestinale ziekten (diarree en koliek) zijn ongewoon (78). GE kan voorkomen op iedere leeftijd en bij ieder ras of geslacht, maar lijkt meest voor te komen bij jongvolwassen (<1-5 jaar) Standardbred paarden en er lijkt een familiale predispositie te zijn (78,80, 85). MEED wordt ook eosinofiele gastro-enteritis, eosinofiele colitis, eosinofiele granulomatose, hypereosinofilie syndroom en exfoliatieve eosinofiele dermatitis en stomatitis genoemd (78). Correcter zijn de termen EC en MEED. Deze aandoening wordt gekenmerkt door infiltratie van de darm en extraintestinale weefsels met eosinofielen. De term eosinofiele enteritis wordt voorbehouden voor deze gevallen waarin laesies beperkt zijn tot het GIS (80). Kenmerkend is de diffuse inflammatoire cellulaire infiltratie van lymfocyten en eosinofielen in de mucosa van de dunne darm. EC wordt gekenmerkt door terugkerende koliek. De aandoening kan diffuus of focaal zijn (77). Ter hoogte van de wand van de dunne darm kunnen banden ontstaan die de omtrek van de darm omgeven. Dit is een gevolg van eosinofiele enzymen die fibrose stimuleren van de wand van de dunne darm (77-78). Deze banden kunnen het lumen van de dunne darm partieel verhinderen. Deze obstructie kan leiden tot chronische koliek of resulteren in een acute episode van koliek als een significante obstructie of distensie voorkomt (77-78, 85-87). Andere bevindingen zijn mucosale ulceratie, vergroting van de ileale PP en mesenterische lymfadenopathie (78). Als er ook een eosinofiele infiltratie van andere organen en weefsels waaronder huid, lever, pancreas, mondholte, oesophagus, longen en mesenterische lymfeknopen is, wordt de term MEED gebruikt (77). MEED wordt gekenmerkt door een ernstige dermatitis gelijkend op pemfigus foliaceus met huidlaesies op het aangezicht, ledematen en ventraal abdomen (88). Deze dermatitis gaat gepaard met alopecie, hyperkeratose en lichenificatie (80). Ulceratie van de kroonrand en mondholte is ook algemeen aanwezig (88). Als de lever aangetast is, kunnen er verhoogde waarden van γ-glutamyltransferase zijn, (78) en alkalisch fosfatase (80). Tien percent van de paarden vertoont anemie. Eosinofilie is aanwezig (80). Paarden van elke leeftijd, geslacht of ras kunnen aangetast worden met EC of MEED, maar het lijkt meest algemeen bij jonge (twee- tot vierjarige) Standardbred of Thoroughbred paarden (78,80,89). De pathologische veranderingen zijn over het algemeen infiltraties door eosinofielen en lymfocyten, maar in sommige gevallen kunnen basofielen het primaire inflammatoire infiltraat zijn (78). De diagnose wordt gemaakt door een biopsie van de huid, het rectum en/of de lever. Eosinofiele infiltraten van de wand van het rectum zijn een algemene bevinding bij normale paarden, maar eosinofiele granulomen geassocieerd met vasculitis en fibrinoïde necrose van intramurale vaten worden als pathognomonisch beschouwd voor MEED (78, 90-91). LPE is weinig gerapporteerd (80). Het wordt gekarakteriseerd door mucosale infiltratie van lymfocyten en plasmacellen in de afwezigheid van een granulomateuze verandering (92-93). Klinisch vertonen de meeste aangetaste paarden chronisch gewichtsverlies, met of zonder diarree of recurrente koliek. De ziekte lijkt paarden van elke leeftijd, elk ras en elk geslacht aan te tasten (78,80). In het algemeen wordt er gerapporteerd dat langdurige behandeling van IBD bij paarden niet succesvol is (94). Wanneer correct behandeld kunnen paarden echter beteren en zelfs genezen. Behandeling is 13

19 gericht op verminderen van de blootstelling van het paard aan mogelijke voedsel, parasitaire of omgevingsantigenen. Een goed verteerbaar en uitgebalanceerd dieet staat centraal gepaard met uitvoerige parasitaire controle (77). Corticosteroïden zijn dé geneesmiddelen die aangewend worden bij paarden met een bevestigde diagnose van IBD. Deze worden gebruikt om de intestinale inflammatie te verminderen. Een bijkomende optie die kan overwogen worden is metronidazole voor zijn antimicrobiële en anti-inflammatoire effecten (94). Deze behandeling kent wisselend succes bij mensen met de ziekte van Crohn (77). Hydroxurea is een antineoplastisch geneesmiddel waarvan een gunstige respons bij sommige paarden met MEED is aangetoond. Dit wordt ook gebruikt om mensen met het hypereosinofiel syndroom te behandelen (95). De globale respons voor deze aandoening is laag, vaak omdat de ziekte meestal in een vergevorderd stadium is bij het moment van diagnose (94). Als de aandoening focaal voorkomt kan chirurgische resectie een succesvolle behandeling zijn, maar deze situatie is ongewoon (96-97). In veel gevallen is euthanasie aangewezen door de slechte prognose en omdat er te weinig reactie op de behandeling is (80) Pathogenese van IBD Zoals hierboven kort aangehaald is de etiologie van IBD grotendeels onbekend en omvat het een complexe interactie tussen genetische factoren, omgevingsfactoren of microbiële factoren en immuunresponsen (98). IBD resulteert uit veranderde interacties tussen intestinale microflora en het intestinaal immuunsysteem, maar de aard van de dysfunctie van de microflora is nog niet duidelijk (99) Genetische factoren Van de vier componenten die een rol spelen bij IBD, is er de meeste vooruitgang geboekt in het genetische luik (98). Genetische gevoeligheid leidt tot een complexe interactie tussen het darmmicrobioom en het lokale aangeboren immuunsysteem. Bepaalde onderdelen van de flora kunnen gevaarlijk worden en bijdragen tot de pathogenese van IBD (66). Bij de mens is er een genetische predispositie voor IBD. Er zijn 163 susceptibiliteitsloci genen die merkers zijn voor de gevoeligheid voor de ziekte voor IBD bekend. Ondanks het groot aantal loci, kan dit maar een klein deel van de variatie in risico op de aandoening verklaren. Zeldzamere genetische variaties die door de mazen glippen van de genetische studies en omgevingsfactoren hebben een belangrijke bijdrage (100). Twee derden van deze loci worden gedeeld tussen CD en UC, er zijn 30 loci specifiek voor CD en 23 specifiek voor UC. Voor iedere locus moet bepaald worden wat de bijdrage van hun allelen is voor gevoeligheid voor de aandoening (101). Een groot deel van de IBD-gerelateerde genetische loci worden gedeeld door UC en CD. Dit impliceert dat deze ziektes gemeenschappelijke pathways hebben (99). Ontdekking van deze susceptibiliteitsgenen hebben inzicht gegeven in de rol van autofagie en barrière functie in IBD (102). Veel susceptibiliteitsloci suggereren een gebrekkige respons tegenover bacteriën bij de aandoening, maar oorzaak en gevolg zijn onduidelijk in deze relatie (103). Zo werd er abnormale intestinale permeabiliteit opgemerkt bij IBD patiënten en bij verwanten van de eerste graad (62). Onder andere polymorfismen in het E-cadherine gen (CDH1) zijn geassocieerd met CD. Een studie toonde aan dat patiënten met deze polymorfismen een verkorte vorm van E-cadherine vertoonden. Deze verkorte vorm resulteerde in abnormale accumulatie intracellulair van zowel E- cadherine en β-catenine en verhinderde hun normale lokalisatie in de zonulae adherens (104). Men 14

20 heeft aangetoond dat defecten in het verwerken van intracellulaire bacteriën een centrale rol spelen bij CD. Genen geassocieerd met dit defect zijn onder andere NOD2 (102) en ATG16L1 (105,106). Autofagie speelt een belangrijke rol in intracellulaire homeostase en draagt bij tot het afbreken en opruimen van cytosolische inhoud en organellen. Ook is het van belang bij resistentie tegen infectie en het verwijderen van intracellulaire bacteriën. NOD2 initieert autofagie door ATG16L1 te rekruteren naar de celmembraan waar de bacterie binnenkomt (107). DC van patiënten met CD met mutaties in NOD2 of ATG16L1 hebben gebrekkige autofagie, gebrekkige verwerking van bacteriën en gebrekkige antigeen presentatie (108). Α-defensines worden geproduceerd door Paneth-cellen. Deze cellen staan in voor de productie van antimicrobiële peptiden waaronder de α-defensines (109). Bij CD patiënten met NOD2 mutaties kon aangetoond worden dat er een significante daling was α defensines. Α defensines zijn belangrijk om bacteriën buiten de mucosale barrière te houden. Wehkamp et al. postuleerden dat deze daling onderdeel kan zijn van bacterieel geïnduceerde inflammatie van de mucosa (110). Een latere studie onder leiding van Wehkamp toonde aan dat er bij patiënten met ileale CD een gedaalde expressie van α-defensines was, maar niet van andere antimicrobiële peptiden geproduceerd door Paneth cellen. Deze deficiëntie compromitteert de aangeboren immuniteit en initieert of propageert mogelijks de aandoening (109). De basis van IBD is de aanwezigheid van één of meer genetisch gedetermineerde effecten die resulteren in een mucosaal immuunsysteem dat over reageert op normale componenten van de mucosale microflora (111). Een belangrijke vraag die zich stelt, is deze: wat is oorzaak en gevolg? Het merendeel van het bewijs over mogelijks causale genen wijst in de richting van een essentiële rol voor verweer van de gastheer tegen infectie. In het bijzonder is de interactie tussen het mucosaal immuunsysteem van de gastheer en zijn microflora interessant. De vraag is wat de trigger is voor het veranderen van de relatie tussen onderdelen van de commensalen van een symbiotische aard naar een pathogene aard (100). Genetische factoren van de gastheer voornamelijk deze die betrekking hebben tot het aangeboren deel van de immuniteit spelen waarschijnlijk een rol in de etiopathogenese in IBD. Maar het is nog niet duidelijk of de veranderingen in het darmmicrobioom een resultaat zijn van afwijkende immuunresponsen in een genetisch gevoelig individu of dat de abnormaliteit in de darmmicrobiota leidt tot een afwijkende immuunrespons in zo n individu (66) Microbiële factoren Dysbiose of een definitieve verandering in het normale darmmicrobioom met een afbreken van het gastheer-microbiële mutualisme is waarschijnlijk het definiërende evenement in de ontwikkeling van IBD. Het verschuiven van overheersend symbiotische bacteriën naar potentieel schadelijke pathobionte bacteriën is goed gedocumenteerd (105). Veranderingen in samenstelling van de microflora zijn niet enkel structureel, maar zijn geassocieerd met belangrijke gebreken in fundamentele metabolische functies va de microflora. Dit heeft mogelijks een weerslag op de gastheer. De veranderingen in metabole activiteit bij UC en CD zijn mogelijks een afspiegeling van een shift in het microbioom naar meer bacteriën die mucine als een primaire energiebron gebruiken. Dit kan problematisch zijn voor een beschadigd IBD epitheel met een gebrekkige barrière functie (46). 15

21 Sommige van deze veranderingen in het darmmicrobioom werden gedetecteerd in de gemeenschappelijke subset van IBD patiënten maar sommige werden duidelijk afgelijnd bij UC of CD patiënten. De best gedefinieerde verandering die werd opgemerkt bij patiënten met IBD is de gedaalde aandeel van het fylum Firmicutes (106, ). Binnen het fylum Firmicutes is de gereduceerde aanwezigheid van Faecalibacterium prausnitzii in CD patiënten in vergelijking met controles goed gedocumenteerd (112, ). Echter in een pediatrische cohort studie hadden patiënten met CD een verhoogde aanwezigheid van Faecalibacterium prausnitzii wat mogelijks wijst op een meer dynamische rol voor deze bacterie, namelijk een beschermend effect bij het beginpunt van IBD (116). Daarenboven was er een duidelijke daling in diversiteit van Firmicutes met een lager aantal species bij patiënten met IBD (112, ). Daarnaast werd in enkele studies een verhoogd aantal bacteriën van het fylum Bacteroidetes aangetroffen bij patiënten met IBD ( ), in andere studies echter een reductie (112). Bacteriën behorend tot deze twee fyla maken 90% uit van de fylogenetische categorieën in een normaal microbioom en de ongelijke manier waarin ze veranderd zijn in IBD zijn interessant. De meest bekende pathogene bacteriën bij mensen behoren tot het fylum Proteobacteria, die meer en meer een sleutelrol lijken te hebben in IBD. Microbiële diversiteitsanalyses hebben een stijging aangetoond in bacteriële species van dit fylum, een agressor rol suggererend bij de initiatie van chronische inflammatie bij patiënten met IBD (66). Specifieker werden verhoogde concentraties van E. coli waaronder pathogene variatie gedocumenteerd bij ileale CD (115). Deze verschuiving in het darmmicrobioom met een daling van obligaat anaeroben van het fylum Firmicutes en een stijging in facultatieve anaeroben van Proteobacteriën hebben aanleiding gegeven tot een hypothese die stelt dat verstoring van het anaerobe milieu wijst op een rol voor zuurstof in intestinale dysbiose. Gelijkaardige functionele verstoringen geassocieerd met veranderingen in het darmmicrobioom bij patiënten met IBD kunnen meer langdurige effecten hebben. Metagenoom analyse heeft aan het licht gebracht dat het veranderd microbioom bij IBD 25% minder genen heeft en metaproteomische studies hebben aangetoond dat er een depletie van eiwitten en functionele pathways is (66). Risico allelen van twee genen NOD2 en ATG16L1 werden gelinkt aan ileale CD, een subfenotype van IBD en niet met CD van de dikke darm (66). Patiënten met IBD die mutaties in NOD2 en ATG16L1 hebben, vertonen verlaagde aanwezigheid van Faecalibacterium en verhoogde aanwezigheid van Escherichia coli (121). IBD patiënten met NOD2 mutaties hebben verhoogde aantallen mucosaadherente bacteriën (122). Mutatie in NOD2 kan ook tot gevolg hebben dat het resulterend mutant proteïne een transcriptiefactor die nodig is voor expressie van IL-10 niet kan activeren (119). Patiënten met FUT2 mutaties die verlies van functie tot gevolg hebben, brengen geen ABO antigen tot expressie op de gastro-intestinale mucosa. Hebben van een FUT2 mutatie verhoogt het risico op CD (123) en vertonen veranderingen in de mucosa-geassocieerde microbiota (124). 16

22 Omgevingsfactoren In een review over de omgevingsfactoren met invloed op IBD bij de mens komen roken, vitamine D, medicatie, stress, luchtvervuiling en dieet naar voren. Enkel de impact van roken is goed bestudeerd. Deze is beschermend bij UC maar verhoogt het risico op CD. Een grote heterogeniteit in de effecten van veel van deze omgevingsfactoren doet vermoeden dat sommige individuen gevoeliger zijn voor het effect van bepaalde omgevingsfactoren (125) TREGS Zoals in ieder inflammatoir proces worden tijdens de initiële inflammatoire fase verschillende cellen van het aangeboren immuunsysteem geactiveerd. In de darm zijn dit onder andere NK cellen, neutrofielen, macrofagen en dendritische cellen. Welke antigenen de inflammatoire reactie uitlokken is nog niet geweten. Verderzetting van de inflammatie wordt mettertijd verzorgd door het verworven immuunsysteem, voornamelijk door abnormaal geactiveerde CD4 + TH cellen. De activiteit van deze cellen zorgt voor een hogere vrijgave van verschillende pro-inflammatoire mediatoren waaronder eicosanoïden, chemokines en cytokines (126). CD4 + TH cellen hebben een functionele heterogeniteit geassocieerd met een verschillende cytokine productie. Cytokines promoten de differentiatie van T cellen en zijn voornamelijk afkomstig van cellen van het aangeboren immuunsysteem. TH1 cellen secreteren IFN-γ een krachtig signaal voor het intracellulair afdoden door macrofagen. Dit als bescherming tegen intracellulaire pathogenen die kunnen overleven of repliceren in macrofagen. TH2 cellen secreteren IL-4, IL-5 en IL-13 en werken mee aan verweer tegen helminthen. Tussen deze cellen is er een reciproque regulatie door productie van hun cytokines. Ze worden gelinkt aan immuun gerelateerde aandoeningen. CD wordt met TH1 cellen gelinkt en UC met TH2 cellen. Naïeve CD4 + T cellen in de intestinale mucosa moeten een geactiveerde APC tegenkomen om functioneel te differentiëren. Ze kunnen differentiëren naar TH1, TH2, itregs en TH17 (126). Deze TH17 cellen produceren IL-17 en andere cytokines en induceren en vermeerderen het inflammatoir proces. Mature TH17 cellen kunnen IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26, IL-8, IL10, tumor necrosis factor α (TNF-α) en granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) produceren. Ze hebben een functionele plasticiteit en kunnen omgezet worden in ofwel TH1 cellen ofwel TREGS (126). TH17 cellen infiltreren massaal de gastro-intestinale mucosa van patiënten met IBD en hun cytokines worden overmatig geproduceerd in zowel CD als UC (127). In vergelijking met controle groepen zijn er grotere aantallen IL-17 producerende cellen bij IBD patiënten (128). Maar ook is er een beschermende rol van de cytokines van TH17 cellen aangetoond bij verschillende studies met experimentele colitis (126). 17