UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Aanwezigheid en functie van microbiota in het gastro-intestinaal stelsel van runderen door Tessa SOER Promotoren: Nathalie De Clercq Prof. Dr. Lynn Vanhaecke Literatuurstudie in het kader van de masterproef 2015 Tessa Soer

2

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Aanwezigheid en functie van microbiota in het gastro-intestinaal stelsel van runderen door Tessa SOER Promotoren: Nathalie De Clercq Prof. Dr. Lynn Vanhaecke Literatuurstudie in het kader van de masterproef 2015 Tessa Soer

5 VOORWOORD Bij deze wil ik graag mijn beide promotoren, Nathalie De Clercq en Prof. Lynn Vanhaecke, bedanken voor het vlotte reageren op mijn mails en ingeleverde stukken, hun hulp en tips bij het schrijven en het nalezen van mijn masterproef. Eveneens wil ik mijn vriendinnen, mijn ouders en mijn vriend bedanken voor hun steun en begrip tijdens het schrijven van deze masterproef.

6 VOORBLAD TITELBLAD VOORWOORD INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING p. 1 INLEIDING... p. 2 LITERATUURSTUDIE......p Ontwikkeling en functie van het gastro-intestinaal stelsel bij runderen p Pre- en postnatale ontwikkeling van het gastro-intestinaal stelsel bij het kalf..... p Gastro-intestinaal stelsel bij ruminerende dieren....p Microbiota aanwezig in het gastro-intestinaal stelsel bij runderen.....p Pensmicrobiota p Invloed van voeding op de pensmicrobiota bij het kalf p Invloed van voeding op de pensmicrobiota bij het volledig ruminerende dier......p Invloed van de verschillende koolhydraten op de pensmicrobiota bij het volledig ruminerende dier......p Invloed van eiwit op de pensmicrobiota bij het volledig ruminerende dier......p Fecale microbiota....p Invloed van voeding op de fecale microbiota bij het kalf...p Invloed van voeding op de fecale microbiota bij het volledig ruminerende dier...p Verschil in microbiota tussen vlees- en melkvee p Verschil in de pensmicrobiota tussen vlees- en melkvee p Verschil in fecale microbiota tussen vlees- en melkvee....p Beïnvloeding van de microbiota...p Toepassing van prebiotica...p Toepassing van probiotica.p. 24 BESPREKING.....p. 26 REFERENTIELIJST p. 27

7 SAMENVATTING De microbiota in het gastro-intestinaal stelsel van een rund zijn noodzakelijk om de vertering van planten mogelijk te maken. Het voeder dat het rund opneemt wordt voor een groot deel afgebroken door fermentatie. Hierbij worden stoffen vrijgesteld die nuttig zijn voor het rund zelf of voor de microbiota. Een verstoring van de aanwezige microbiota leidt vaak tot ziekte of verminderd presteren van de dieren. Reeds enkele dagen nadat een kalf geboren is, vindt er kolonisatie plaats van het gastro-intestinaal stelsel. Hoewel deze flora minder belangrijk zijn voor de vertering van het voedsel op zeer jonge leeftijd, is ze wel van belang voor een goede ontwikkeling van het gastro-intestinaal stelsel. Sommige van deze micro-organismen die zeer vroeg koloniseren, blijven aanwezig en vormen later een belangrijk onderdeel van de microbiota bij ruminerende dieren. Welk voeder het dier krijgt heeft een belangrijke invloed op de microbiota die aanwezig zijn. De aanpassing van de microbiota aan een voeder bestaat meestal uit een toename van de microorganismen die in staat zijn de verbindingen in het voeder af te breken. Wanneer bijvoorbeeld een voeder aangeboden wordt dat rijker is aan vezel, ziet men een toename in de cellulolytische bacteriën, terwijl bij een dieet rijk aan zetmeel de amylolytische flora toenemen. De samenstelling van de microbiota heeft ook een invloed op de melk- en vleesproductie. De grote variatie in de samenstelling van deze microbiota, maakt dan ook dat de productie van de verschillende dieren niet gelijk is. Daarnaast wordt in de vleesveesector vaak meer hoog-energetisch gevoerd dan in de melkveesector, wat ook een verschil geeft in samenstelling van de microbiota. Tot slot wordt de groei van gewenste micro-organismen gestimuleerd door het toevoegen van pre- of probiotica aan het voeder. Op deze manier wordt de kans op het ontstaan ziekte verminderd of wordt de productie van het dier beïnvloed. Sleutelwoorden: Gastro-intestinaal systeem Melk Microbiota Vlees Voeding 1

8 INLEIDING De werking van het gastro-intestinaal systeem is vrij complex bij runderen. Naast een enzymatische vertering vindt ook een groot deel van de vertering plaats door de microbiota, aanwezig in het gastrointestinaal stelsel. Deze microbiota zijn zeer complex en vooral uitgesproken aanwezig in de pens en in de dikke darm. Veel runderen worden gehouden voor de productie van melk of vlees. Om deze productie zo optimaal mogelijk te laten verlopen, is het van belang dat de juiste microbiota aanwezig zijn in het gastro-intestinaal stelsel. Onder invloed van voeding ontstaan er verschuivingen in de samenstelling van deze microbiota. Het is nuttig voor de veehouder om te weten welk voeder de optimale productie geeft bij runderen. De gastro-intestinale microbiota spelen ook een rol bij de gezondheid van de dieren, waardoor een verstoring van de normale microbiota kan leiden tot ziekte. Met behulp van voeding en pre- en probiotica kunnen de microbiota gestuurd worden, waardoor er minder kans is op het ontstaan van ziekte en/of een betere productie behaald kan worden. Momenteel wordt er nog volop onderzoek verricht naar de exacte functie van deze microbiota en wat de optimale samenstelling van deze microbiota is. Nog niet alle micro-organismen in het gastro-intestinaal stelsel zijn immers geïdentificeerd en ook de functie van alle mico-organismen is nog niet gekend. 2

9 LITERATUURSTUDIE 1. Ontwikkeling en functie van het gastro-intestinaal stelsel bij runderen Een rund is een herkauwer, waarbij het gastro-intestinaal stelsel bestaat uit de mond, slokdarm, magencomplex, dunne darm en dikke darm (figuur 1). Het magencomplex specifiek voor herkauwers, is opgebouwd uit vier magen, de pens (rumen), netmaag (reticulum), boekmaag (omasum) en lebmaag (abomasum). De lebmaag kan gezien worden als de eigenlijke maag zoals deze ook voorkomt bij monogastrische dieren (Dyce en Wensing, 1983). Figuur 1. Magencomplex bij de volwassen herkauwer (naar McDonald et al., 2011) 1.1. Pre- en postnatale ontwikkeling van het gastro-intestinaal stelsel bij het kalf Bij een kalf is dit magencomplex echter nog niet zo uitgebreid en ontwikkeld als bij het volwassen dier. Tijdens het foetale en postnatale leven van een kalf verandert er behoorlijk wat in de verhoudingen van de verschillende compartimenten van het magencomplex. Zo is de pens tijdens het foetale leven lange tijd het grootste compartiment, richting de partus verandert deze verhouding en wordt de lebmaag het grootste compartiment. Zodra het kalf vast voer op begint te nemen, beginnen de pens en netmaag spectaculair te groeien en vormen uiteindelijk het grootste deel van het magencomplex, zoals dit ook het geval is bij een volwassen rund (Dyce en Wensing, 1983). Dat er veranderingen optreden ter hoogte van het magencomplex wordt veroorzaakt door het feit dat een kalf ander voer opneemt dan een volwassen rund. Het pasgeboren kalf neemt namelijk eerst colostrum en later melk op. Deze melk bereikt via de slokdarmsleuf de boekmaag en lebmaag, waardoor er weinig van deze melk in de netmaag of pens terecht komt (McDonald et al., 2011). In de lebmaag wordt de melk gestremd, waardoor deze niet te snel doorschuift en goed enzymatisch verteerd kan worden verderop in het gastro-intestinaal stelsel (Porter, 1969). Het volwassen rund neemt vast voedsel op dat wel in de pens en netmaag terecht komt, want de slokdarmsleuf sluit niet bij opname van vast voedsel. Bij het volwassen rund kan de slokdarmsleuf enkel nog sluiten bij opname van bepaalde oplossingen. Voor de vertering van vast voedsel is microbiële fermentatie noodzakelijk. Dit fermenteren kan gebeuren in het pens-netmaag compartiment, waarin zich een microbiële flora bevindt. Wanneer een kalf vast voedsel op begint te nemen, neemt niet enkel de grootte van het pens-netmaag compartiment toe, maar vindt er ook een differentiatie van de wand van de pens plaats. De dikte van 3

10 de wand neemt toe en er ontwikkelen zich epitheelpapillen die zorgen voor een oppervlaktevergroting. Deze differentiatie wordt gestimuleerd door de vluchtige verzuren, die geproduceerd worden door de zich ontwikkelende microbiota in de pens (Dyce en Wensing, 1983). De opname van vast voer is dus zeer belangrijk voor een goede ontwikkeling en differentiatie van vooral de pens, maar ook het colostrum dat als eerste voedsel wordt, opgenomen heeft een invloed op de ontwikkeling van het gastro-intestinaal stelsel. Vooral ter hoogte van het duodenum waar het de villus ontwikkeling stimuleert. Daarnaast heeft ook de energie en eiwitopname de eerste dagen na de geboorte een invloed op de groei en ontwikkeling van de darmen (Bühler et al., 1998). De secreties van het gastro-intestinaal stelsel spelen een belangrijke rol bij de vertering van voedsel. Het voedsel komt eerst in contact met speeksel in de mond, vervolgens wordt het in de lebmaag gemengd met maagsap en dan komt het in de dunne darm in contact met gal en pancreassap. De verschillende secreties bevatten enzymen die zorgen voor de vertering van het voedsel. Deze enzymen werken enkel wanneer de omstandigheden optimaal zijn, de ph is bijvoorbeeld een belangrijke parameter die de juiste waarde moet hebben voor een goede werking van de enzymen en een goede vertering. De lebmaagsecretie bevat verschillende bestanddelen, zoals chymosine, lysozyme, pepsine, HCl, gastrine en protease. Chymosine is hierbij vooral van belang voor het stremmen van de melk in de lebmaag en kan al voor de geboorte door het kalf aangemaakt worden. Chymosine wordt het meest geproduceerd de eerste twee levensdagen, waarna de productie daalt, ook de productie van het lysozyme daalt de eerste dagen (Le Huerou-luron et al., 1992). Naast chymosine blijkt pepsine, hoewel in mindere mate, ook een rol te spelen bij het stremmen van de melk in de lebmaag. Het protease en gastrine is al in belangrijke mate aanwezig op dag 1 in de lebmaag (Huber et al, 1961; Guilloteau et al., 2009). Ondanks dat gastrine de secretie van HCl stimuleert, is de secretie van HCl laag kort na de geboorte, de productie hiervan stijgt de eerste levensdagen. Hoewel de pancreas bij een pasgeboren kalf volledig ontwikkeld is, is de secretie van pancreassap kort na de geboorte laag (Guilloteau et al., 2009). Ook de activiteit van het protease aanwezig in het pancreassap is laag, in tegenstelling tot het protease geproduceerd in de lebmaag (Huber et al., 1961). Door deze lage secretie van pancreassap kunnen immunoglobines aanwezig in het colostrum intact aankomen in de dunne darm, waar ze doorheen de darmwand opgenomen worden. Met het ouder worden van de kalveren stijgt de pepsine, chymotrypsine, trypsine, lipase en colipase activiteit in het gastro-intestinaal stelsel. Het dier begint immers gradueel meer vast voer op te nemen, waarbij deze enzymen noodzakelijk zijn voor de vertering ter hoogte van de dunne darm (Guilloteau et al., 1984). Daarnaast is er bij de opname van vast voer minder fluctuatie te zien in de pancreassecretie dan bij dieren die melk of colostrum opnemen. Dit zou verklaard kunnen worden door het feit dat voedingsstoffen uit het vaste voedsel meer continu doorschuiven naar de dunne darm, terwijl er bij melk en colostrum vooral kort na opname voedingsstoffen aankomen in de dunne darm (Zabielski et al., 1997). Het lactasegehalte in de dunne darm is de eerste levensdag het hoogst en neemt af als de dieren ouder worden. Hoge lactasegehalten zijn vroeg in het leven van het kalf noodzakelijk voor de vertering van melk. Het maltasegehalte in de dunne darm is bij het kalf erg laag vergeleken met de gehalten aan lactase. Sucrase kan bij kalveren niet gedetecteerd worden in de dunne darm, terwijl het pancreasamylase erg varieert gedurende de eerste levensdagen (Huber et al., 1961) Gastro-intestinaal stelsel bij ruminerende dieren Zodra het dier vast voedsel begint op te nemen, wordt naast de enzymatische vertering, de microbiële fermentatie ook steeds belangrijker. Melk wordt direct doorgeslikt, terwijl vast voedsel wat langer in de 4

11 mond verblijft om gekauwd te worden. Tijdens dit kauwen wordt het voedsel goed vermengd met speeksel en wat fijner gemaakt, door de mechanische krachten van het kauwen. Dit speeksel komt in grote hoeveelheden vrij en heeft vooral een bufferende functie, zodat het juiste milieu voor fermentatie blijft bestaan in de pens en de zuren geproduceerd tijdens fermentatie worden geneutraliseerd. Het rund heeft verschillende grotere en ook vele kleine speekselklieren, waarbij sommige vooral een waterig secreet produceren en andere een meer slijmerig secreet (figuur 2). Zo produceert de parotisspeekselklier bijna continu een vooral waterig secreet. Deze speekselklier begint te groeien naarmate de ruwvoederopname toeneemt. Een nog grotere speekselklier is de mandibulaire speekselklier. Deze produceert een meer slijmerig secreet, vooral tijdens de opname of het herkauwen van ruwvoer. Andere grotere speekselklieren aanwezig bij het rund zijn de sublingualis polystomatica, de sublingualis monostomatica en de wangspeekselklier (Dyce en Wensing, 1983). Figuur 2. Speekselklieren bij het rund (naar Fubini en Ducharme, 2004) Als het rund de voedselbrok doorslikt, komt het in het pens-netmaag compartiment. De microbiota in dit compartiment staan in voor de fermentatie van het opgenomen voedsel. In de pens en de netmaag wordt de inhoud continu gemengd door ritmische contracties van de wand (McDonald et al., 2011). De netmaag bevindt zich craniaal van de pens en tussen beide bevindt zich een plooi die de twee compartimenten min of meer scheidt. De netmaag is echter wel vaak betrokken bij de verschillende contracties van de pens. Er is immers een ruime verbinding tussen de netmaag en de pens. Door deze ritmische contracties is het rund in staat gas te laten ontsnappen uit de pens, wat men de ructus noemt, of een voedselbrok terug te brengen naar de muil om het te herkauwen (Dyce en wensing, 1983). De microbiota aanwezig in de pens zijn onder andere betrokken bij de fermentatie van cellulose, de hydrolyse van eiwitten en de hydrolyse van vetten. Daarnaast kunnen de microbiota ook verschillende vitaminen aanmaken, waaronder de B-vitaminen, waardoor veel van deze vitaminen niet essentieel zijn in de voeding van runderen (Reece, 2004). De vluchtige vetzuren geproduceerd door de microbiota, worden rechtstreeks door de penswand opgenomen. Bij de fermentatie worden ook de gassen methaan en koolstofdioxide gevormd, die vooral via de ructus de pens verlaten (McDonald et al., 2011). De vluchtige vetzuren die het meest worden gevormd zijn acetaat, propionaat en butyraat. Deze vluchtige vetzuren kunnen alle drie aanleiding geven tot ATP wat een belangrijke energiebron is voor de cel. Het rund neemt weinig glucose als dusdanig op met het voeder, waardoor het rund voor de glucosebehoefte vooral afhankelijk is van propionzuur. Vanuit propionzuur kan immers in de lever, 5

12 via de gluconeogenese, glucose aangemaakt worden (Dijkstra, 1994). De ph aanwezig in de pens bepaald onder andere de mate waarin de vluchtige vetzuren worden opgenomen doorheen de penswand. Ter hoogte van de mucosa van de pens vindt metabolisatie plaats van de vluchtige vetzuren, waarna ze in de vena porta terecht komen en richting de lever vervoerd worden (Bergman, 1990). Slechts een klein deel van de vluchtige vetzuren schuift door naar de boekmaag, samen met wat microbiële cellen en onverteerde voedseldelen (McDonald et al., 2011). De boekmaagwand bevat uitgesproken plooien die zorgen voor oppervlaktevergroting, waardoor er efficiënt absorptie van water en andere kleine molecules kan plaatsvinden. De boekmaagcontracties zorgen er samen met de penscontracties voor dat het voedsel doorschuift. Het voedsel komt na de boekmaag in de lebmaag die, in tegenstelling tot de andere magen, klieren heeft in zijn wand, waardoor enzymatische vertering kan plaatsvinden (Dyce en Wensing, 1983). Na het spenen van kalveren daalt de chymosinesecretie spectaculair in de lebmaag, terwijl het pepsine en lysozyme stijgt. Bij het spenen schakelt het kalf over van melk naar vast voedsel en begint het rantsoen te lijken op dit wat een volledig ruminerend dier eet. Wanneer men dieren vergelijkt van de zelfde leeftijd, waarbij de ene groep wel gespeend werd en de andere groep nog niet, dan valt op dat deze dieren een verschil hebben in samenstelling van de secreties ter hoogte van de lebmaag en dunne darm (Le Huerou-luron et al., 1992). Waarschijnlijk worden deze veranderingen in samenstelling dus veroorzaakt door het feit dat het dier vast voedsel op begint te nemen en begint te rumineren. Andere voedingscomponenten bereiken de lebmaag en dunne darm, waardoor andere enzymen noodzakelijk zijn voor de vertering hier. De lysozymesecretie die stijgt in de lebmaag, maakt het mogelijk dat het peptidoglycaan in de celwand van bacteriën afkomstig uit de pens, afgebroken kan worden. Ook de pepsine secretie stijgt in de lebmaag na het spenen en speelt mogelijks een rol bij de vertering van eiwitten die de lebmaag bereiken (Guilloteau et al., 2009). Dit kan micobieel eiwit zijn geproduceerd door de microbiota van de pens of afkomstig zijn vanuit het voeder (Sutton, 1985). Na de lebmaag komt het voedsel in dunne darm, bestaande uit het duodenum, jejunum en ileum. In de dunne darm vindt ook enzymatische vertering plaats door de enzymen die hier geproduceerd of vrijgesteld worden. Contracties in de dunne darm worden gestimuleerd als er inhoud in de dunne darm komt. Deze contracties zorgen voor het opschuiven van de inhoud in de dunne darm en het vermengen van de inhoud met verteringssappen (Dyce en Wensing, 1983; McDonald et al., 2011). De pancreas levert een belangrijke bijdrage aan de productie van verteringenzymen. De samenstelling van sap dat de pancreas secreteert verandert wanneer het kalf gespeend wordt. Men ziet een stijging in de ribonucleasesecretie ter hoogte van de pancreas. Dit ribonuclease zorgt voor de afbraak van nucleïnezuren van micro-organismen die doorschuiven vanuit de pens, doorheen de lebmaag naar de dunne darm. Ook de lipaseproductie door de pancreas stijgt, dit is van belang voor de vertering van vetten die niet in de pens afgebroken zijn en dus in de dunne darm terecht komen (Guilloteau et al., 2009). De dunne darm is immers zo ongeveer de enige plek waar de absorptie van lange keten vetzuren plaatsvindt. Een groot deel van de langketenige vetzuren wordt hier dan ook opgenomen vanuit de darm. Het feit dat er meer van deze vetzuren in de dunne darm aankomen dan aanwezig zijn in het voeder, doet vermoeden ook een deel van deze lange keten vetzuren wordt aangemaakt door de microbiota in de pens, al zou het ook van endogene bronnen afkomstig kunnen zijn (Sutton, 1985). De stijging van het pancreasamylase en het intestinale maltase en isomaltase is de dunne darm na het spenen, maakt het mogelijk dat koolhydraten die het duodenum bereiken verteerd kunnen worden. Zetmeel is één van de koolhydraten die verteerd kan worden en zo een directe bron van glucose vormt voor het dier. De mate van vertering van dit zetmeel is onder andere afhankelijk van het voer dat het dier opneemt en hoeveel het opneemt. De hoeveelheid zetmeel dat verteerd kan worden in de dunne darm is immers beperkt bij herkauwers (Guilloteau et al., 2009). Wat in de dunne 6

13 darm niet verteerd wordt, schuift door naar de dikke darm, bestaande uit cecum en colon (Dyce en Wensing, 1983). Koolhydraten die niet enzymatisch verteerbaar zijn door de gastheer en ook nog niet in de pens zijn gefermenteerd, vormen een belangrijk substraat voor de microbiota in het cecum van het rund. Ook wel enzymatisch verteerbare componenten, die niet de kans hebben gehad verteerd en opgenomen te worden in de lebmaag en dunne darm komen aan in de dikke darm en worden hier gefermenteerd. Daarnaast vormen cellen die afschilferen, mucus en endogene secreties ook een substraat voor de microbiota aanwezig in de dikke darm. De microbiota in de dikke darm vormen net als in de pens ook in belangrijke mate vluchtige vetzuren, zoals acetaat, propionaat en butyraat. Ook de gassen methaan en koolstofdioxide worden gevormd tijdens de fermentatie in de dikke darm. De vluchtige vetzuren kunnen vlot vanuit de dikke darm worden opgenomen, ook hier worden ze gemetaboliseerd tijdens hun absorptie (Bergman, 1990). Andere microbiële producten en ook de micobiota kunnen niet verwerkt worden en komen met de feces mee naar buiten (McDonald et al., 2011). 2. Microbiota aanwezig in het gastro-intestinaal stelsel bij runderen Microbiota zijn bij het rund vooral aanwezig in de pens en in de dikke darm. In de rest van het gastrointestinaal stelsel is de concentratie aan micro-organismen minimaal (McDonald et al., 2011). Al op de eerste dag na de geboorte kunnen micro-organismen aangetoond worden in het gastro-intestinaal stelsel van kalveren. Het kalf wordt immers al zeer snel blootgesteld aan verschillende bacteriën. Deze kunnen afkomstig zijn vanuit het speeksel, de huid of de vagina van de moeder, daarnaast komt het kalf direct na de geboorte in aanraking met kiemen uit de omgeving. Sommige van deze bacteriën, bijvoorbeeld Escherichia coli, zijn in staat het gastro-intestinaal stelsel van het kalf te koloniseren (Lukas et al., 2007) Pensmicrobiota Bij de geboorte van een kalf zijn er niet of nauwelijks micro-organismen aanwezig in het gastrointestinaal stelsel. Na 1 dag kunnen er echter al micro-organismen aangetoond worden in de pens (Jami et al., 2013). De bacteriën Escherichia coli en streptococci zijn de eerste bacteriën die de pens in grote mate koloniseren, E. coli begint na dag 1 alweer te dalen, terwijl de streptococci pas na enkele dagen beginnen te dalen (Minato et al., 1992). Deze bacteriën lijken nodig te zijn voor een goede ontwikkeling van de pens. Hoewel de melk normaal gesproken niet in de pens komt, heeft het een belangrijke invloed op het ontstaan van de microbiota in de pens. De melk zorgt onder andere voor de aanvoer van belangrijke nutriënten en energie (Jami et al., 2013). De microbiota bij nog nietruminerende dieren vormt een belangrijke basis voor het ontstaan van de microbiota nodig in het latere leven voor een goede fermentatie van vast voedsel. Deze microbiota kun je opdelen in verschillende taxonomische eenheden, bijvoorbeeld verschillende fyla (Li et al., 2011). In de studie van Jami et al. (2013) kregen de kalveren van 1 tot 3 dagen oud enkel colostrum en de kalveren van 2 maand oud, melk samen met een vast startervoeder. Deze beide groepen rumineerden dus nog niet of niet volledig, terwijl de dieren van 6 maand en 2 jaar wel volledig vast voeder kregen en al rumineerden. Uit deze studie blijkt dat de fyla Bacteroidetes, Firmicutes en Proteobacteria de belangrijkste fyla vormen bij runderen van verschillende leeftijden (figuur 3). Deze fyla zijn zowel bij het nog niet ruminerende dier als bij het ruminerende dier in belangrijke mate aanwezig (Li et al., 2011; Jami et al. 2013). Het fylum Proteobacteria afneemt met de leeftijd, terwijl het aandeel van de Firmicutes en Bacteroidetes wat varieert tot de leeftijd van 2 jaar. 7

14 Figuur 3. Fyla die voorkomen in de pens bij verschillende leeftijdsgroepen (naar Jami et al., 2013) Binnen de verschillende fyla is een verdere taxomische opdeling mogelijk in klassen, ordes, families, genera en species. De genera die voorkomen bij dieren van verschillende leeftijd varieert. Zo bleek het genus Streptococcus, behorend tot het fylum Firmicutes, in grote mate aanwezig te zijn in de pens van kalveren van 1 tot 3 dagen oud. Terwijl dit genus nog maar in beperkte mate aangetoond kon worden bij de oudere dieren. Binnen het fylum Bacteroidetes zijn ook andere genera aanwezig afhankelijk van de leeftijd. Bij kalveren van 1 tot 3 dagen oud vormde het genus Bacteroides de belangrijkste vertegenwoordiger, terwijl dit bij oudere dieren het genus Prevotella was. Bij kalveren van één tot enkele dagen oud is het verschil in microbiota in de pens, tussen de verschillende dieren van dezelfde leeftijd, groter dan bij de oudere dieren (Jami et al., 2013; Li et al., 2011). Tabel 1. Belangrijke bacteriën in de pens (naar McDonald et al., 2011; Jami et al., 2013) Species Substraat Aantoonbaar in de pens vanaf Streptococcus bovis Zetmeel, glucose 1 dag leeftijd Ruminococcus albus Cellobiose, xylaan 3 dagen leeftijd Ruminococcus flavefaciens Cellobiose, xylaan 1 dag leeftijd Fibrobacter succinogenes Cellulose, glucose, zetmeel 2 maanden leeftijd Prevotella ruminicola Glucose, xylaan, zetmeel, 1 dag leeftijd pectine, hemicellulose Prevotella briantii Xylaan, pectine, hemicellulose 2 maanden leeftijd Selenomonas ruminantium Lactaat, succinaat Enkele dagen leeftijd Megasphaera elsdenii Lactaat, glucose, glycerol Enkele dagen leeftijd Lachnospira multipara Pectine, glucose, fructose 2 maand leeftijd Relatief veel van de belangrijke bacteriën in de pens van het ruminerende dier zijn al op zeer jonge leeftijd aan te tonen in de pens (tabel 1). Enkele species zijn al direct in belangrijke mate aanwezig, zoals bijvoorbeeld Streptococcus bovis, terwijl andere species zoals bijvoorbeeld Prevotella ruminicola slechts minimaal aantoonbaar zijn bij dieren van enkele dagen oud. Het genus Prevotella wordt later in het leven veel belangrijker en kan tot 70% van de pensflora gaan vormen bij het ruminerende dier. 8

15 De bacteriën aanwezig in de pens worden aangevallen door proteasen geproduceerd door de gastheer. De bacteriën beschermen zich hier tegen door anti-proteasen te produceren, onder andere serpentines. Deze anti-proteasen en ook andere stoffen die wijzen op een interactie tussen de flora en de gastheer, zijn meer aanwezig bij oudere kalveren dan bij zeer jonge kalveren. Dit wijst mogelijks op een betere meer geïntegreerde interactie tussen gastheer en de microbiota aanwezig bij deze oudere kalveren (Li et al., 2011). Figuur 4. Nutritionele interactie tussen de verschillende organismen betrokken bij de koolhydraat afbraak in de pens (naar Flint, 1997; Van Houtert, 1993) In de pens heerst een anaeroob milieu waarin, bij het ruminerende dier, door fermentatie de afbraak van het opgenomen voedsel gebeurt. Koolhydraten zijn in belangrijke mate aanwezig in het voeder dat een ruminerend dier opneemt en worden voor een groot deel afgebroken in de pens. De verschillende micro-organismen die hier een rol bij spelen zijn op te delen in verschillende groepen, waarbij de metabolieten van de ene groep een substaat vormen voor een andere groep (figuur 4). Acetaat, propionaat en butyraat kan het rund zelf gebruiken voor zijn energiebehoeften en metabolisme. Bij het ruminerende dier zijn naast bacteriën ook protozoa aanwezig in de pens. Deze komen echter in veel kleinere aantallen voor dan de bacteriën. Vooral ciliaten van de families Isotrichidae en Ophryoscolecidae komen voor in de pens (McDonald et al., 2011). Anaerobe schimmels, behorende tot de genera Neocallimastix, Piromyces, Caecomyces, Orpinomyces, Anaeromyces en Cyllamyces, kunnen ook aangetoond worden in de pens van een rund. Veel van deze schimmels zijn in staat de voedingsstoffen aanwezig in slecht verteerbaar plantenmateriaal te bereiken. Verder zorgen ze ervoor dat eiwit beschikbaar wordt voor de gastheer, door de werking van proteolytische enzymen en de aanmaak van eiwitten. De schimmels zelf kunnen ook door de gastheer verteerd worden indien ze de pens verlaten en doorschuiven naar de lebmaag en dunne darm (Nagpal et al., 2009). 9

16 Invloed van voeding op de pensmicrobiota bij het kalf De eerste dagen na de geboorte neemt het kalf enkel colostrum op. De samenstelling van de microbiota in de pens deze eerste dagen is echter niet dezelfde. Er is een daling te zien in het voorkomen van het aantal aerobe en faculatief anaerobe genera, terwijl het aantal strikt anaerobe genera toeneemt (Jami et al., 2013). Ook tijdens de periode dat de dieren melk opnemen, is er een verandering te zien in de samenstelling van de microbiota. In de studie van Li et al. (2011) kregen zowel kalveren van 14 dagen als van 42 dagen kunstmelk, toch veranderde de samenstelling van de microbiota. Zo nam bijvoorbeeld het aandeel van het genus Bacteroides toe, terwijl het aandeel van de genera Ruminococcus en Fusobacterium afnam. Als je kijkt naar de functionele groep waartoe de verschillende bacteriën behoren, dan verandert dit minder in de tijd. Toch is er wel een lichte evolutie te zien in de mate waarin de verschillende functionele groepen voorkomen (tabel 2). Tabel 2. Functionele groepen in de pens bij kalveren die nog niet rumineren (naar Minato et al., 1992) Voeding: Colostrum Leeftijd: 1 dag 3 dagen Functionele groepen: Amylolytische bacteriën (10 8 cfu/g) Pectine fermenteerders (10 4 cfu/g) Sulfaat verwerkers (10 4 cfu/g) Xylaan fermenteerder (10 3 cfu/g) Lactaat verwerkers (10 2 cfu/g) Amylolytische bacteriën (10 9 cfu/g) Pectine fermenteerders (10 9 cfu/g) Xylaan fermenteerders (10 9 cfu/g) Sulfaat verwerkers (10 7 cfu/g) Lactaat verwerkers (10 7 cfu/g) Cellulolytische bacteriën (10 3 cfu/g) Voeding: Koemelk Leeftijd: 5 dagen 7 dagen Functionele groepen: Amylolytische bacteriën (10 9 cfu/g) Pectine fermenteerders (10 9 cfu/g) Xylaan fermenteerders (10 9 cfu/g) Lactaat verwerkers (10 7 cfu/g) Sulfaat verwerkers (10 7 cfu/g) Cellulolytische bacteriën (10 5 cfu/g) Methanogene bacteriën (10 1 cfu/g) Amylolytische bacteriën (10 9 cfu/g) Pectine fermenteerders (10 9 cfu/g) Xylaan fermenteerders (10 8 cfu/g) Sulfaat verwerkers (10 8 cfu/g) Lactaat verwerkers (10 7 cfu/g) Cellulolytische bacteriën (10 5 cfu/g) Methanogene bacteriën (10 2 cfu/g) Het valt op dat gedurende de hele studie van Minato et al. (1992) de amylolytische bacteriën in grote mate aanwezig waren (tabel 2 en 3). Voor de functionele groepen waar er een evolutie te zien was in de tijd, zou de volgorde waarin de verschillende groepen stegen, een indicatie kunnen zijn van een interactie tussen de groepen. Bijvoorbeeld lactaat als metaboliet van amylolytische bacteriën is een substraat voor andere bacteriën (Flint, 1997). Deze lactaatverbruikende bacteriën kunnen pas toenemen als er voldoende lactaat gevormd is. Dit zou een mogelijke verklaring kunnen zijn voor het feit dat op dag 1 de amylolytische bacteriën al in belangrijke mate aanwezig waren, terwijl de lactaatverbruikers pas enkele dagen later toenamen. Het feit dat eerst de cellulolytische bacteriën toenamen en pas later de methanogene bacteriën, kan ook een indicatie zijn van een mogelijke interactie tussen deze beide groepen (Minato et al., 1992). Vanaf 10 dagen leeftijd kregen de kalveren in de studie van Minato et al. (1992) onbeperkt toegang tot hooi en dieren ouder dan 2 weken kregen ook krachtvoer aangeboden. Ook hier was er een lichte verschuiving te zien in de verhoudingen van de groepen (tabel 3). 10

17 Tabel 3. Functionele groepen in de pens bij kalveren die naast melk ook vast voedsel aangeboden krijgen (naar Minato et al., 1992) Voeding: Koemelk + ad lib hooi Koemelk + ab lib hooi + krachtvoer Leeftijd: 2 weken 3 weken Functionele groepen: Pectine fermenteerders (10 9 cfu/g) Amylolytische bacteriën (10 9 cfu/g) Xylaan fermenteerders (10 9 cfu/g) Sulfaat verwerkers (10 7 cfu/g) Lactaat verwerkers (10 7 cfu/g) Cellulolytische bacteriën (10 6 cfu/g) Methanogene bacteriën (10 4 cfu/g) Amylolytische bacteriën (10 10 cfu/g) Pectine fermenteerders (10 9 cfu/g) Xylaan fermenteerders (10 9 cfu/g) Sulfaat verwerkers (10 8 cfu/g) Cellulolytische bacteriën (10 7 cfu/g) Lactaat verwerkers (10 7 cfu/g) Methanogene (10 6 cfu/g) Voeding: Koemelk + ad lib hooi + krachtvoer Leeftijd: 4 weken 6 weken Functionele groepen: Amylolytische bacteriën (10 9 cfu/g) Pectine fermenteerders (10 9 cfu/g) Xylaan fermenteerders (10 9 cfu/g) Sulfaat verwerkers (10 8 cfu/g) Cellulolytische bacteriën (10 8 cfu/g) Lactaat verwerkers (10 7 cfu/g) Methanogene bacteriën (10 6 cfu/g) Pectine fermenteerders (10 10 cfu/g) Amylolytische bacteriën (10 9 cfu/g) Xylaan fermenteerders (10 9 cfu/g) Sulfaat verwerkers (10 8 cfu/g) Lactaat verwerkers (10 8 cfu/g) Cellulolytische bacteriën (10 8 cfu/g) Methanogene bacteriën (10 6 cfu/g) Voeding: Koemelk + ad lib hooi + krachtvoer Leeftijd: 8 weken 10 weken Functionele groepen: Amylolytische bacteriën (10 9 cfu/g) Pectine fermenteerders (10 9 cfu/g) Xylaan fermenteerders (10 9 cfu/g) Sulfaat verwerkers (10 8 cfu/g) Lactaat verwerkers (10 7 cfu/g) Methanogene bacteriën (10 7 cfu/g) Cellulolytische bacteriën (10 6 cfu/g) Amylolytische bacteriën (10 10 cfu/g) Xylaan fermenteerders (10 9 cfu/g) Pectine fermenteerders (10 9 cfu/g) Cellulolytische bacteriën (10 8 cfu/g) Methanogenen bacteriën (10 7 cfu/g) Sulfaat verwerkers (10 7 cfu/g) Lactaat verwerkers (10 6 cfu/g) Vooral de methanogene en cellulolytische bacteriën namen toe met het ouder worden. Of dit het gevolg was van meer vaste voedselopname of de leeftijd, is niet helemaal uit te maken op basis van deze studie. De cellulolytische bacteriën begonnen immers al te stijgen voordat er toegang was tot vast voedsel. Ook werd er in deze studie geen controlegroep meegenomen. Uit de studie van Malmuthuge et al. (2013) bleek dat er geen significant verschil aangetoond kon worden tussen de bacteriën aanwezig in de pens bij kalveren enkel gevoerd met kunstmelk en kalveren gevoerd met kunstmelk en een startervoeding. Alle kalveren kregen in deze studie naast kunstmelk of kunstmelk + startervoeding, ook onbeperkt toegang tot hooi. De partikelgrootte aanwezig in beide voeders was dus gelijk, enkel de samenstelling tussen beide diëten verschilde. Het leek alsof kalveren die het startervoer bijgevoerd kregen een grotere diversiteit aan microbiota hadden dan de andere groep. Dit verschil bleek echter niet significant te zijn. De kunstmelk, die in beide diëten in belangrijke mate aanwezig was, zou een mogelijk effect van de startervoeding kunnen maskeren. Wat de exacte samenstelling van de microbiota in de pens bij beide groepen was, wordt niet vermeld in de studie van 11

18 Malmuthuge et al. (2013), waardoor er geen vergelijking gemaakt kan worden met de studie van Minato et al. (1992). De partikelgrootte van het vaste voeder dat het kalf krijgt, blijkt wel een invloed te hebben op de samenstelling van de microbiota. In de studie van Beharka et al. (1998) kregen 2 groepen kalveren al op 3 dagen leeftijd een volledig vast voeder aangeboden. De voeders aangeboden aan de kalveren hadden dezelfde samenstelling, maar verschilden in partikelgrootte. De kalveren werden bemonsterd op 2, 4, 6, 8 en 10 weken leeftijd. Bij kalveren die een dieet kregen met een kleinere partikelgrootte, was er bij elke meting een lagere ph aanwezig in de pens dan bij kalveren die een voeder kregen met een grotere partikelgrootte. Ook was het aandeel cellulolytische bacteriën lager bij de dieren met een fijner voeder, terwijl het aandeel amylolytische bacteriën groter was bij deze groep, in vergelijking met de andere groep (Beharka et al., 1998). Bij een kleinere partikelgrootte is de relatieve oppervlakte die de microbiota kunnen bereiken groter dan bij grotere partikels, hierdoor zijn de microbiële enzymen beter in staat het voeder te verteren. Bij kleinere partikels zijn de structurele componenten al voor een groot deel afgebroken. De cellulolytische bacteriën zorgen normaal voor de afbraak van deze structurele componenten in het voeder. In voeders met kleine partikelgrootte, zijn de cellulolytische bacteriën dus minder noodzakelijk en dalen in aantal (Jouany et al., 2000) Invloed van voeding op de pensmicrobiota bij het volledig ruminerende dier Ruminerende dieren kunnen verschillende voeders aangeboden krijgen die een invloed kunnen hebben op de microbiota in de pens. De mate waarin er vezels of meer snel fermenteerbare koolhydraten aanwezig zijn in het voeder, blijkt van belang te zijn voor de samenstelling van deze microbiota. Ook de hoeveelheid eiwit in een voeder heeft daarnaast een belangrijk invloed (Fernando et al., 2010; Belanche et al., 2012) Invloed van de verschillende koolhydraten op de pensmicrobiota bij het volledig ruminerende dier In de studie van Fernando et al. (2010) werd het effect nagegaan van het gradueel toevoegen van graan aan een dieet, dat eerst enkel uit hooi bestond. Pas wanneer het dieet voor het grootste deel uit graan bestond, zag men een verandering in de microbiële samenstelling (tabel 4). Het fylum Fibrobacteres was in significant hogere mate aanwezig bij de dieren die enkel hooi kregen, terwijl het fylum Bacteroidetes in belangrijkere mate aanwezig was bij de dieren die hooi en graan gevoerd kregen. Enkel het genus Fibrobacter binnen het fylum Fibrobacteres werd aangetoond. Binnen het fylum Bacteroidetes konden vooral bacteriën behorend tot het genus Prevotella aangetoond worden (Fernando et al., 2010). Tabel 4. Invloed van graan op het voorkomen van verschillende fyla in de pens bij het volledig ruminerende dier (naar Fernando et al., 2010) Hooi dieet Hooi + graan dieet Firmicutes (35%) Bacteroidetes (45%) Bacteroidetes (24%) Firmicutes (40%) Fibrobacteres (3%) Spirochaetes (3%) Spirochaetes (2%) Proteobacteria (0,9%) Proteobacteria (2%) Fibrobacteres (0,3%) 12

19 De diversiteit van de microbiota neemt toe naarmate de dieren meer vezelrijk voer opnemen. Dit is vooral waarneembaar bij dieren die een dieet opnamen relatief arm aan eiwit en kan mogelijks verklaard worden door het feit dat vezelrijke diëten meer verschillende koolhydraten bevatten dan zetmeelrijke diëten. Bovendien zijn veel vezelkoolhydraten moeilijker afbreekbaar dan zetmeel (Belanche et al., 2012). Vooral anaerobe schimmels zorgen voor de eerste stap in de afbraak van vezels, namelijk de afbraak van celwanden. Deze bevatten immers vaak veel lignine die deze schimmels veel beter kunnen afbreken dan andere micro-organismen zoals bacteriën of protozoa (Nagpal et al., 2009). De cellulolystische bacteriën zorgen vervolgens voor een verdere afbraak van de vezels. Het diwaterstof dat gevormd wordt tijdens de afbraak van deze vezels kan weer verbruikt worden door de methanogene bacteriën (Flint, 1997). Bij de opname van meer vezels ziet men dus een toename in anaerobe schimmels, protozoa en methanogene bacteriën (Belanche et al., 2012). Daarnaast zijn er bij de opname van meer ruwvoer meer cellulolytische bacteriën en minder amylolytische bacteriën aanwezig (Wanapat et al., 2014). Het veranderen van de ruwvoer/krachtvoer verhouding heeft gelijkaardig effecten bij vlees- en melkvee. Op species niveau ziet men een stijging in het voorkomen van Megasphaera elsdenii, Selenomonas ruminantium en Prevotella bryantii wanneer de dieren meer krachtvoer krijgen, terwijl Butyrivibrio fibrisolvens en Fibrobacter succinogenes daalt (Fernanado et al., 2010; Wanapat et al., 2014). Het feit dat Fibrobacter succinogenes minder aanwezig is bij dieren met een dieet rijker aan krachtvoer dan aan ruwvoer, valt te verwachten. Fibrobacter succinogenes is immers een cellulolytische bacterie die in staat is vezel af te breken en zal dus vooral aanwezig zijn bij dieren die een vezelrijk dieet opnemen. De aanpassing van het dieet naar meer krachtvoer gebeurde zeer geleidelijk in de studie van Fernando et al. (2010). In deze studie was de daling van Butyrivibrio fibrisolvens initieel minder uitgesproken dan van het species Fibrobacter succinogenes. Dit species is immers in staat zowel vezels als graan te fermenteren (Russel en Baldwin, 1978). Het feit dat het species Butyrivibrio fibrisolvens uiteindelijk extremer daalde, heeft vermoedelijk te maken met de lage ph aanwezig in de pens op dat moment. Er werd immers veel krachtvoer opgenomen met het voeder, wat snel fermenteerbaar is en zorgt voor een daling in de ph. Megasphaera elsdenii is samen met Selenomonas ruminantium in staat lactaat te verwerken en zo de mate van acidose in de pens te beperken. Naar het einde van de studie van Fernando et al. (2010) toe is er een daling te zien in de mate waarin Megasphaera elsdenii voorkomt. Vermoedelijk werd er op dat moment te veel lactaat gevormd om te verwerken, waardoor de ph in de pens daalde en Megasphaera elsdenii in mindere mate in staat was om te overleven (Fernando et al., 2010). Bij de dieren die het meeste krachtvoer kregen, was de daling in de ph van de pens het meest uitgesproken. Hier was ook de totale vluchtige vetzuurproductie het grootst in de pens. Van de vluchtige vetzuren bleek de acetaatproductie te dalen naarmate de dieren meer krachtvoer opnamen, terwijl de propionaatproductie steeg bij deze dieren. De methaanproductie daalde naarmate de dieren meer krachtvoer opnamen (Wanapat et al., 2014) Invloed van eiwit op de pensmicrobiota bij het volledig ruminerende dier In de studie van Belanche et al. (2012) werd het effect nagegaan van de hoeveelheid eiwit die werd opgenomen (tabel 5). Bij een dieet laag aan eiwit zag men een lager gehalte aan totaal aantal bacteriën, protozoa, anaerobe schimmels en methanogene bacteriën. Op speciesniveau was er een daling te zien van Ruminococcus albus, Fibrobacter succinogenes, Butyrivibrio fibrosolvens en Prevotella bryantii. Bij een vezel- of eiwitrijk dieet werden de microbiota niet of nauwelijks beïnvloed door de hoeveelheid eiwit, respectievelijk het type koolhydraat in het dieet. Bij dieren met een eiwitarm dieet was er echter wel een duidelijk effect te zien van het type koolhydraat. Ook bij een vezelarm 13

20 dieet was het effect van verandering in eiwitgehalte in het voeder uitgesproken. Veranderingen in de anaerobe schimmelpopulatie waren minder uitgesproken dan veranderingen in de bacteriële populatie. Mogelijk worden deze schimmels dus in het algemeen wat minder beïnvloed door de voeding (Belanche et al., 2012). Tabel 5. Invloed van veranderingen in dieet op de microbiota in de pens bij het volledig ruminerende dier (naar Belanche et al., 2012) Dieet Effect op bacteriën Effect op anaerobe schimmels Vezelrijk dieet Nauwelijks effect op de bacteriële samenstelling, bij verandering van het eiwitgehalte in het dieet Klein effect op de anaerobe schimmelpopulatie, bij verandering van het eiwit gehalte in het dieet Zetmeelrijk dieet Belangrijk effect op de bacteriële samenstelling, bij verandering van het eiwitgehalte in het dieet Belangrijk effect op de anaerobe schimmelpopulatie, bij verandering van het eiwitgehalte in het dieet Eiwitrijk dieet Nauwelijks effect op bacteriële samenstelling, bij verandering van het type koolhydraat in het dieet Klein effect op de anaerobe schimmelpopulatie, bij verandering van het type koolhydraat in het dieet Eiwitarm dieet Belangrijk effect op de bacteriële samenstelling, bij verandering van het type koolhydraat in het dieet Belangrijk effect op de anaerobe schimmelpopulatie, bij verandering van het type koolhydraat in het dieet De microbiota in de pens kunnen verschillende bronnen gebruiken om in hun stikstofbehoefte te voorzien. Pensafbreekbaar eiwit, microbieel eiwit, aminozuren en ammoniak vormen de belangrijkste stikstofbronnen voor de microbiota in de pens. De verschillende organismen aanwezig in de pens hebben ieder hun voorkeur voor een bepaalde bron van stikstof. Ammoniak is echter de belangrijkste bron van stikstof voor de meeste pensbacteriën. Terwijl protozoa een groot deel van hun stikstofbehoefte halen uit de predatie van bacteriën. Ook de gevoeligheid van de species aan relatief stikstoftekort varieert. Zo blijken species als Prevotella ruminocola, Selenomonas ruminantium, Streptococcus bovis en Megasphaera elsdenii vrij goed te kunnen overleven bij een laag stikstofgehalte in de pens. De cellulolytische bacteriën blijken hier echter vrij gevoelig aan te zijn en nemen dan ook snel af in aantal. De fermentatie in de pens neemt toe nadat de dieren gevoerd zijn. Na het voeren blijft de hoeveelheid energie tot 5 uur na het voeren hoog in de pens. De ammoniakconcentratie in de pens is het hoogst tweeënhalf uur na voederopname. Hoe hoog deze concentratie wordt, is afhankelijk van de welk type koolhydraat en hoeveel stikstof er wordt opgenomen. Bij een vezelrijk dieet blijkt de concentratie ammoniak in de pens veel hogere waarden te kunnen bereiken dan bij een zetmeel rijk dieet. Het grotere gehalte aan snel afbreekbare koolhydraten in een zetmeelrijk dieet, maakt dat het stikstof hier efficiënter gecapteerd kan worden dan in een vezelrijk dieet. Dit gecapteerde stikstof wordt gebruikt om microbieel eiwit van te maken. Het niet gecapteerde stikstof wordt omgezet tot ammoniak (Belanche et al., 2012) Fecale microbiota Net als bij andere dieren zijn er bij runderen naast een pensmicrobiota, ook microbiota aanwezig in de darm en dan vooral in de dikke darm. Een deel van deze microbiota wordt uitgescheiden met de mest. De analyse van de microbiota aanwezig in de mest geeft een indicatie van de aanwezige microbiota in de darm (McDonald et al., 2011). 14

21 De samenstelling van de microbiota aantoonbaar in de feces is eerder eenvoudig vroeg in het leven van het kalf (tabel 6). Enkele van deze bacteriën zoals Citrobacter spp. en Leuconostoc spp. verdwijnen echter snel en zijn na 24 uur niet meer aantoonbaar. De eerst aantoonbare microbiota in de feces bestaan voornamelijk uit melkzuurbacteriën zoals Lactococcus spp., Leuconostoc spp. en Lactobacillus spp. Ook Clostridium spp. is vroeg in het leven in belangrijke mate aanwezig, vooral tussen de 24 en 48 uur na de geboorte. Het aantal coliformen neemt 24 uur na de geboorte toe. Van deze coliformen is vooral Escherichia coli in belangrijke mate aanwezig. Citrobacter spp. behoort echter ook tot de coliformen, maar is al vroeger in belangrijke mate aanwezig, waarna deze ook zeer vroeg weer verdwijnt. Wanneer de dieren een week oud zijn, is er een daling te zien in het voorkomen van Escherichia coli en een stijging in het voorkomen van Bacteroides spp. (Mayer et al., 2012). Tabel 6. Bacteriën vroeg aantoonbaar in de feces van kalveren (naar Mayer et al., 2012) Species Aantoonbaar Citrobacter spp. Vanaf 6 uur na de geboorte Lactococcus spp. Vanaf 12 uur na de geboorte Leuconostoc spp. Vanaf 6 uur na de geboorte Lactobacillus spp. Vanaf enkele dagen leeftijd Clostridium spp. Vanaf 24 uur Escherichia coli Vanaf 24 uur Tussen de verschillende kalveren is er echter behoorlijk wat variatie in de fecale flora. De eerste levensdagen lijkt de flora van de verschillende kalveren het meest op elkaar. Bij dieren ouder dan 7 dagen gaat de fecale flora van de verschillende kalveren meer van elkaar verschillen en neemt de diversiteit aan species toe. Genen blijken ook een invloed te hebben op de fecale flora. De fecale flora van tweelingen blijkt immers meer op elkaar te lijken dan de fecale flora vergeleken tussen niettweeling kalveren (Mayer et al., 2012). Naast bacteriën kunnen vanaf 4 à 5 weken leeftijd ook anaërobe schimmels aangetoond worden in de feces. Deze schimmels behoren tot de genera Neocallimastix, Piromyces en Caecomyces, die men ook terug kan vinden in de pens. De schimmels kunnen vaak eerst enkel in de feces aangetoond worden, waarna ze enkele weken later ook in de pens aanwezig zijn. Het aantal schimmels aanwezig in de feces neemt toe met het ouder worden van de dieren (Theodorou et al., 1993). In de studie van Uyeno et al. (2010) werden de fecale microbiota bij kalveren opgevolgd vanaf de geboorte tot 12 weken leeftijd. De dieren werden gespeend op 8 weken. Bij de dieren van 1 week oud, waren de genera Bacteroides, Prevotella, Faecalibacterium en Atopobium de belangrijkste genera aanwezig in de feces. Ook de species Clostridium coccoides en Eubacterium rectale waren toen al in belangrijke mate aanwezig. De genera Faecalibacterium en Atopobium namen af wanneer de dieren ouder werden, terwijl de genera Bacteroides en Prevotella en de species Clostridium coccoides en Eubacterium rectale vrij constant aanwezig bleven. De Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobactrium en Enterobacteriaceae waren in veel kleinere aantallen aanwezig bij dieren van 1 week. Deze namen ook af bij toenemende leeftijd en waren op 9 weken niet meer aantoonbaar in de feces. De species Ruminococcus flavefaciens, Clostridium viride en Fibrobacter spp. konden pas later aangetoond worden. Clostridium viride was al aantoonbaar bij kalveren van 3 weken oud, terwijl Ruminococcus flavefaciens en Fibrobacter pas rond het spenen aantoonbaar waren (Uyeno et al., 2010). De samenstelling van de microbiota in de feces verschilt tussen ruminerende en nog niet ruminerende dieren (Uyeno et al., 2010). De bacteriën die voorkomen in de feces bij zeer jonge 15

22 kalveren zijn vergelijkbaar met fecale bacteriën aanwezig bij de mens (Sghir et al., 2000). De verandering van de fecale microbiota is mogelijks geassocieerd met de ontwikkeling van de pens en de rest van het gastro-intestinaal stelsel, zodat het dier kan functioneren als herkauwer later in het leven. Een kalf wordt immers aanzien als een monogastrisch dier, terwijl een volwassen rund een herkauwer is. Dit zou mogelijks verklaren waarom de initiële fecale microbiota meer lijkt op die van de mens, die ook monogastrisch is (Uyeno et al., 2010). In het gastro-intestinaal stelsel ontstaat vrij snel een anaeroob milieu, zodat net als in de pens, ook in de dikke darm er een verschuiving plaatsvindt in de microbiota naar een voornamelijk anaerobe flora. Sommige van de fyla, zoals Bacteroidetes en Firmicutes, die in de pens in belangrijke mate aanwezig zijn, zijn ook in de feces in belangrijke mate aanwezig. Ook op speciesniveau valt op dat bepaalde bacteriën die belangrijk zijn in de pens, zoals Ruminococcus flavefaciens en Fibrobacter spp., ook in de fecale microbiota aangetoond kunnen worden. De microbiota in de pens en de dikke darm vertonen dus enkele gelijkenissen, maar zijn niet identiek (Uyeno et al., 2010) Invloed van voeding op de fecale microbiota bij het kalf In de studie van Oikonomou et al. (2013) heeft men het voorkomen van de verschillende fyla, aanwezig in de feces bij kalveren van 1 tot 7 weken, onderzocht (tabel 7). In deze studie kregen de kalveren melk en onbeperkt toegang tot water en een startervoeding tot op de leeftijd van 45 dagen. Op 45 dagen leeftijd werden de kalveren gespeend en schakelden over naar volledig vast voeder. In de eerste 7 levensweken waren er lichte verschuivingen in de mate waarin de verschillende fyla voorkwamen. De volgorde van welke fylum als meeste voorkwam en welke als minste veranderde echter weinig (tabel 7). Tabel 7. Fyla aanwezig in de feces van kalveren van 1 tot 7 weken leeftijd (naar Oikonomou et al., 2013) Fylum Mate van voorkomen Firmicutes 60-80% Bacteroidetes 8-24% Proteobacteria 4-10% Fusobacteria 1-6% Actinobacteria 1-2% Het fylum Firmicutes vormde gedurende de eerste 7 levensweken het belangrijkste fylum, toch was er een verschuiving te zien in de mate waarin dit fylum voorkomt gedurende deze periode. Het fylum nam toe van week 1 naar week 4, om vervolgens weer af te nemen. Het fylum Bacteroidetes volgde een min of meer tegenovergesteld patroon. Melkzuurbacteriën behorende tot het fylum Firmicutes spelen vroeg in het leven van het kalf een belangrijke rol bij de vertering van melk. Bifidobacterium spp. die ook een belangrijke rol zouden spelen bij de vertering van melk, steeg ook van 1 naar 4 weken leeftijd, om vervolgens weer af te nemen (Oikonomou et al., 2013). Deze veranderingen zouden mogelijks te maken kunnen hebben met een aanpassing aan de consumptie van melk de eerste weken en vervolgens een aanpassing aan de opname van meer vast voer. De dieren zullen met stijgende leeftijd immers naast melk meer vast voer op gaan nemen (Bach et al., 2007). Bifidobacterium animalis kon echter al bij kalveren van 1 dag oud worden aangetoond in de feces, waarna deze na 5 dagen ook al weer verdween. Dit viel samen met de omschakeling van het dieet 16

23 van colostrum naar melk. Wat doet vermoeden dat Bifidobacterium animalis mogelijks geassocieerd is met de vertering van colostrum (Lukas et al., 2007) Invloed van voeding op de fecale microbiota bij het volledig ruminerende dier De samenstelling van de fecale microbiota bij volledig ruminerende dieren wordt beïnvloed door het voeder dat het dier opneemt. In de studie van Kim et al. (2014) werd bekeken hoe deze microbiota veranderde onder invloed van verschillende diëten (tabel 8). De diversiteit van de microbiota bleek het grootst te zijn bij dieren gevoerd met een dieet met een gemiddeld graangehalte. Tabel 8. Mate waarin de verschillende fyla voorkomen in de feces bij volledig ruminerende dieren per dieet (naar Kim et al., 2014) Hoog graan gehalte Gemiddeld graan gehalte Ruwvoer dieet Firmicutes (76,91%) Firmicutes (50,31%) Firmicutes (70,15%) Bacteroidetes (12,82%) Bacteroidetes (37,39%) TM7 (10,92%) Actinobacteria (1,77%) Proteobacteria (6,04%) Actinobacteria (2,93%) Proteobacteria (1,30%) Cyanobacteria (1,14%) Proteobacteria (2,43%) TM7 (0,56%) TM7 (0,24%) Bacteroidetes (1,83%) Verrucomicrobia (0,10) Actinobacteria (0,14%) Verrucomicrobia (1,15%) Cyanobacteria (0,09) Verrucomicrobia (0,06%) Cyanobacteria (0,09%) Het valt op dat het fylum Firmicutes bij alle runderen het grootste aandeel uitmaakt van de fecale flora. Verder valt op dat de mate waarin een fylum voorkomt verschilt afhankelijk van het dieet dat het dier krijgt. De genera die behoren tot de verschillende fyla bleken ook te variëren in mate van voorkomen afhankelijk van het dieet dat de dieren krijgen. Bij dieren op een graandieet was het genus Prevotella meer aanwezig dan bij dieren op een ruwvoer dieet. Het hoogste gehalte aan Prevotella bleek echter aanwezig te zijn bij de dieren die een gemiddeld gehalte aan graan kregen. Ook het genus Bacteroides was slechts minimaal aanwezig bij dieren die een ruwvoer dieet kregen. De genera Prevotella en Bacteroidetes behoren tot het fylum Bacteroidetes. Het feit dat deze beide genera slechts weinig aanwezig zijn bij dieren op een ruwvoer dieet, zorgt ervoor dat het fylum Bacteroidetes ook in veel mindere mate aanwezig is bij deze dieren. Van het fylum Firmicutes was het genus Oscillibacter het meest aanwezig bij dieren die een dieet kregen rijk aan graan. Dit genus neemt toe in de fecale microbiota als er veel zetmeel de pens passeert en in de dikke darm terecht komt. De gehalten van dit genus in de feces bij dieren die vooral een ruwvoer dieet kregen, zijn dus laag. Hier is er immers nauwelijks passage van zetmeel door de pens tot in de dikke darm (Kim et al., 2014). Anaerovibrio behoort ook tot het fylum Firmicutes en staat in voor een belangrijk deel van de vetafbraak in de pens (Jouany et al., 2000). In de feces was dit genus in redelijke mate aanwezig bij dieren die een dieet kregen met een gemidddeld graangehalte, terwijl dit genus nauwelijks aanwezig was bij dieren die een ruwvoer dieet kregen. De dieren die een dieet kregen met een gemiddeld graangehalte, kregen immers ook een deel sojabonenmeel aangeboden, wat een behoorlijk gehalte aan vet bevat. Voor de afbraak van dit vet is mogelijks ook in de feces Anaerovibrio noodzakelijk. Dieren op een ruwvoer dieet kregen geen sojabonenmeel aangeboden en namen nauwelijks vet op in het voeder (Kim et al., 2014). De genera Roseburia, Fecalibacterium en Coprococcus behoren ook tot het fylum Firmicutes en zijn in staat butyraat te produceren. Dit butyraat kan door de darmmucosa als energiebron gebruikt worden (Pryde et al., 2002). Deze genera waren echter in behoorlijk mindere 17

24 mate aanwezig bij dieren die een ruwvoer dieet kregen. Het genus Akkermansia behorend tot het fylum Verrucomicrobia was juist het meest aanwezig bij dieren die die een ruwvoer dieet kregen (Kim et al., 2014). Dit genus blijkt in staat mucine af te breken, waardoor de beschermende laag van de darm verdwijnt (Derrien et al., 2004). Enkel een ruwvoer dieet is dus mogelijks minder goed voor het dier, want er is minder energie beschikbaar voor de mucosa en ook de bescherming van de mucosa is mogelijks minder goed (Kim et al., 2014). Qua ruwvoer maakt het weinig verschil of men graskuil voert of een kuil rijk aan klaver. De fecale microbiota verschilden hier immers zeer weinig tussen deze beide groepen dieren. Klaver is in staat stikstof vanuit de lucht te binden en zou dus mogelijks voor meer stikstofaanvoer zorgen in het dieet. Wanneer het dier echter zijn stikstof vanuit andere bronnen haalt, heeft dit verschil in dieet minimale invloed op de samenstelling van de fecale flora (Rudi et al., 2012) Verschil in microbiota tussen vlees- en melkvee De microbiota in het gastro-intestinaal stelsel van runderen maakt het mogelijk dat plantenmateriaal wordt verteerd, waarna de voedingsstoffen door het rund kunnen worden gebruikt om vlees of melk te produceren (Jami en Mizrahi, 2012). De voedingsstoffen nodig om melk te produceren verschillen van deze om te groeien en dus vlees te produceren. De samenstelling van de microbiota verschilt dus mogelijks afhankelijk van het hoofddoel waarvoor het dier gehouden wordt (McDonald et al., 2011). Er is echter binnen de melk- of vleeskoeien ook een behoorlijke variatie in microbiota. Deze verschillen in de microbiota kunnen een invloed hebben op de samenstelling van de melk of het vlees dat het dier produceert. De microbiota kunnen zoals eerder vermeld ook veranderen onder invloed van het voeder dat het dier krijgt. Dit kan mogelijkheden bieden voor de veehouder om de kwaliteit van het product dat hij levert te verbeteren (Khiaosa-ard en Zebeli, 2014) Verschil in pensmicrobiota tussen vlees- en melkvee Om na te gaan in hoeverre de microbiota tussen vlees- en melkvee verschillen, wordt eerst nagegaan hoe groot de variatie is in de pensmicrobiota binnen vlees- en melkkoeien. In figuur 5 zijn de species weergegeven die belangrijk zijn voor een goed functioneren van de pens. Het valt op dat voor sommige belangrijke species er een grote variatie bestaat in de mate waarin deze voorkomen, terwijl andere species veel constanter aanwezig zijn. Tot 75 % van de species die voorkomen in de pensmicrobiota komen overeen tussen de verschillende melkkoeien. De mate waarin de verschillende species voorkomen verschilt echter behoorlijk per koe, waardoor de individuele samenstelling van de pensmicrobiota bij de verschillende melkkoeien toch behoorlijk verschilt (Jami en Mizrahi, 2012). De melkkoeien in de studie van Jami en Mizrahi kregen een dieet aangeboden met vooral krachtvoer, in de studie van Petri zijn er ook analyses van vleesvee die een krachtvoerrijk dieet kregen. Uit deze studies bleek dat de belangrijke species in de pens, zoals deze vermeld staan in figuur 5, meer voorkomen bij vleesvee dan bij melkvee. Enkel Streptococcus bovis komt in vlees- en melkvee in vergelijkbare mate voor (Petri et al., 2013). Welk voeder de dieren krijgen, heeft echter een grote invloed op de samenstelling van de microbiota. Hierbij is niet enkel van belang in welke verhouding kracht- en ruwvoer wordt aangeboden in het voeder, maar ook welk soort kracht- of ruwvoer wordt aangeboden (Zhang et al., 2014). Het verschil in microbiota tussen het vlees- en melkvee in de studie van Petri et al. (2013) en Jami en Mizrahi (2012) kan dus ook veroorzaakt worden door het feit dat de kracht- en/of ruwvoerbron niet dezelfde was. 18

25 Figuur 5. Mate waarin belangrijke species voorkomen in de pens bij melkvee (grijze balken = in welke mate het voorkomen van dit species varieert tussen de verschillende melkkoeien, zwarte stippen = waarde die niet binnen de grijze balk valt) (naar Jami en Mizrahi, 2012) De samenstelling van de microbiota heeft een invloed op de productie van het dier, zowel bij vlees- als bij melkvee. Bij de meeste melkkoeien is het fylum Bacteroidetes het belangrijkste fylum, maar bij enkele koeien blijkt het fylum Firmicutes het belangrijkste te zijn. De verhouding waarin Firmicutes voorkomen ten opzichte van Bacteroidetes in de pens blijkt een invloed te hebben op de melkvetproductie. De melkvet productie is hoger te bij dieren met een hoge Firmicutes/Bacteroidetes ratio. Ook andere fyla blijken een correlatie te hebben met de melkprodoductie of samenstelling (tabel 9). Het valt op dat het fylum Firmicutes enkele keren zowel een positieve als negatieve correlatie heeft. Dit komt omdat de verschillende genera van dit fylum niet allemaal hetzelfde effect hebben. Sommige genera binnen dit fylum zullen een positieve invloed hebben, terwijl andere genera een negatieve invloed hebben. Dat de samenstelling van de microbiota in de pens een invloed heeft op de productie blijkt uit de studie van Jami et al. (2014). De microbiota in de pens bij deze koeien bleek behoorlijk te variëren. Ook de samenstelling en het volume van de melk tussen de verschillende dieren bleek behoorlijk te verschillen. Aangezien de dieren werden gehouden in dezelfde omstandigheden, hetzelfde voeder kregen en tot hetzelfde ras behoren, is het aannemelijk dat de variatie in productie mogelijks wordt veroorzaakt door het verschil in samenstelling van de microbiota. Uit de studie blijkt verder dat de samenstelling van de microbiota in de pens ook een invloed heeft op de voederopname, ph van de pens en de voederconversie. 19

26 Tabel 9. Correlatie van fyla in de pens met verschillende productie parameters (naar Jami et al., 2014) fyla met een positieve correlatie fyla met een negatieve correlatie Gemiddelde melkproductie Actinobacteria Proteobacteria Bacteroidetes Firmicutes Spirochaetes Firmicutes Gemiddelde Actinobacteria Bacteroidetes melkvetproductie Firmicutes Proteobacteria Tenericutes Gemiddelde melkeiwitproductie Actinobacteria Firmicutes Bacteroidetes Firmicutes Proteobacteria Gemiddelde melklactoseproductie Actinobacteria Firmicutes Proteobacteria Bacteroidetes Firmicutes Tenericutes Afhankelijk van welke microbiota aanwezig zijn, worden er verschillen gezien in de mate waarin vluchtige vetzuren worden geproduceerd. Cellulolytische bacteriën produceren bijvoorbeeld vooral acetaat, terwijl amyolytische bacteriën vooral propionaat produceren (Russel et al., 2009; Therion et al., 1982). In de studie van Seymour et al. (2005) werd onderzocht in welke mate de verschillende vluchtige vetzuren, geproduceerd in de pens, een invloed hadden op de melkproductie (tabel 10). Van de vluchtige vetzuren bleken propionaat en butyraat het meest uitgesproken effect te hebben op de melkproductie, terwijl acetaat het meest uitgesproken effect bleek te hebben op het vetgehalte in de melk. Tabel 10. Correlatie tussen vluchtige vetzuren en melkparameters (naar Seymour et al., 2005) Correlatie met melkparameters Vluchtige vetzuren Melkproductie Melkvet Melkeiwit Acetaat Minimaal negatief Matig positief Negatief Propionaat Positief Matig negatief Minimaal positief Butyraat Positief Matig negatief Matig negatief In de studie van Sutton et al. (2003) werd gekeken naar de invloed van een verschillend voeder op de melkproductie en -samenstelling. Een groep kreeg een voeder met een krachtvoer/ruwvoer verhouding van 60/40, terwijl een andere groep een voeder kreeg met een krachtvoer/ruwvoer verhouding van 90/10. In deze studie zag men geen significant verschil in de melkproductie of het eiwitgehalte. Er was echter wel een verschil te zien in het vet- en lactosegehalte. Bij dieren die een voeder kregen laag aan ruwvoer was het melkvetgehalte in de melk erg verminderd, terwijl het lactosegehalte bij deze dieren in de melk verhoogd was. Tussen beide diëten was er ook een verschil te zien in de mate waarin de vluchtige vetzuren geproduceerd werden in de pens. Bij dieren op een dieet met een laag ruwvoergehalte viel op dat de concentratiepropionaat in de pens hoger was. De vrij hoge propionaatconcentratie kan een reden zijn voor het verschil dat gezien wordt in het melkvet- en lactosegehalte in de melk. Vanuit propionaat wordt immers in belangrijke mate glucose aangemaakt dat nodig is om lactose in de melk te doen stijgen (Dijkstra et al., 1994; Sutton et al., 2003). 20

27 In de vleesveesector worden dieren vaak gevoerd met hoog-energetisch voer, om het genetisch potentieel ten volle uit te benutten. Dit hoog-energetisch voer bestaat vaak voor een groot deel uit granen, dat vooral zetmeel bevat. Een groot deel van deze granen wordt gefermenteerd in de pens. In welke mate dit gebeurt hangt af van het type graan in het dieet en de manier waarop het graan bewerkt is. Door het bewerken van het graan kunnen bepaalde bestanddelen in het voedermiddel beter beschikbaar worden voor de microbiota in de pens en kan het graan in grotere mate gefermenteerd kan worden (Jouany et al., 2000). Door de opname van veel krachtvoer is er een verschuiving naar een meer amylolytische flora, de cellulolytische flora neemt af. Dit is één van de redenen waarom er bij een krachtvoerrijk dieet minder vertering is van vezels en dus ook meer propionaat en minder acetaat productie ontstaat (Wanapat et al., 2014). Om de negatieve effecten van veel zetmeelafbraak ter hoogte van de pens te beperken, zou men kunnen proberen een groot deel van het zetmeel door te schuiven naar de dunne darm. In de dunne darm kan het dan enzymatisch verteerd worden, maar zoals eerder vermeld is er een limiet op de mate van enzymatische zetmeelvertering in de dunne darm (Guilloteau et al., 2009). Één van de nadelige effecten van te veel zetmeelafbraak in de pens is pensverzuring. Pensverzuring kan acuut of subacuut zijn. Bij een acute pensverzuring is er te veel melkzuur aanwezig in de pens, door een verhoogde productie en een verminderde verwerking van dit melkzuur (Nagaraja en Titgemeyer, 2007). Bij de subacute vorm zijn bacteriën die lactaat verwerken in staat te overleven en ontstaat er dus geen verzuring door de accumulatie van melkzuur, maar wel door de accumulatie van vluchtige vetzuren (Goad et al., 1998). Ook bij melkkoeien kan pensverzuring voorkomen, vooral tijdens de vroege of midden in de lactatie. Wanneer bij melkkoeien pensverzuring ontstaat dan gaat het vaak om de subacute vorm (Khafipour et al., 2009). Het ontstaan van pensverzuring is het gevolg van de reactie van de microbiota op een toegenomen beschikbaarheid van de hoeveelheid snel fermenteerbaar substraat. De microbiota gaan hierdoor meer groeien en fermenteren. De veranderingen in microbiota die ontstaan bij pensverzuring lijken op de veranderingen die ontstaan bij een aanpassing aan een dieet rijk aan krachtvoer. Bij een acute pensverzuring waarbij de dieren snel veel graan gevoerd krijgen, vindt daarnaast een explosieve groei van Streptococcus bovis plaats. Zodra de dieren zich hebben aangepast aan het dieet rijk aan graan neemt Streptococcus bovis weer af. Door deze explosieve groei van Streptococcus bovis ontstaat eveneens een massale productie van lactaat. De ph daalt, veel micro-organismen zijn minder in staat te overleven en de lactobacillen krijgen de overhand. Men denkt dat de massale groei van Streptococcus bovis een belangrijke stap is in het ontstaan van acute pensverzuring. De protozoa nemen ook initieel toe wanneer de dieren een dieet rijk aan graan opnemen. Protozoa zijn echter veel gevoeliger aan een lage ph dan bacteriën en zullen dan ook afnemen zodra de ph in de pens daalt. Bij pensverzuring kunnen de protozoa zelfs volledig verdwijnen (Nagaraja en Titgemeyer, 2007). In welke verhouding er kracht- en ruwvoer aanwezig is in het voeder dat men gebruikt om een dier vet te mesten, heeft een effect op de karkaskwaliteit. Bij een krachtvoerrijk dieet groeien de dieren sneller, maar zal het karkas ook vetter worden dan bij de dieren op een ruwvoerrijk dieet. Tegenwoordig wenst men echter eerder magere karkassen. Het vet dat aanwezig is in het karkas bij dieren gevoerd met een graanrijk dieet, bestaat vooral uit triglyceriden met verzadigde vetzuren. De onverzadigde vetzuren zijn echter gezonder en daarom heeft men liever meer onverzadigde vetzuren in het vlees. Veel van de poly-onverzadigde vetzuren in het dieet worden in de pens verwerkt en omgevormd tot meer verzadigde vetzuren. De verwerking van vetten in de pens gebeurt vooral door Anaerovibrio lipolytica en in mindere mate door lipasen afkomstig van protozoa. Nadat de vetzuren zijn afgesplitst, vindt er hydrogenatie plaats. De poly-onverzadigde vetzuren worden hierbij omgevormd tot meer verzadigde vetzuren die vervolgens in het vlees of de melk terecht kunnen 21

28 komen (Jouany et al., 2000). Ook de vetzuren die worden opgenomen met het voeder kunnen in het vlees of de melk terecht komen. Een deel van deze vetzuren ontsnapt immers aan de werking van de pens en worden direct door het dier gebruikt. De verwerking van vetzuren in de pens is nauw verbonden met de penswerking, waardoor een verandering in de penswerking ook een invloed kan hebben het vetzuurmetabolisme. Om de samenstelling van vetten aanwezig in melk of rundvlees aan te passen, kan men vetten of oliën gaan supplementeren (Lourenço et al., 2010). Men kan lijnzaad- of sojaolie gaan supplementeren om meer geconjugeerd linolzuur in de het melkvet te verkrijgen, wat gezond is voor de mens. Het toevoegen van deze oliën aan het dieet van het rund heeft echter een effect op het metabolisme ter hoogte van de pens. Deze oliën geven aanleiding tot minder vluchtige vetzuurproductie ter hoogte van de pens en een lager gehalte aan cellulolytische bacteriën. De vertering van vezels kan dus minder goed doorgaan wanneer men deze oliën supplementeert. Daarnaast worden ook protozoa ter hoogte van de pens geremd door deze oliën, terwijl de proteolytische bacteriën gestimuleerd worden. De mate waarin de onverzadigde vetzuren de microbiota ter hoogte van de pens beïnvloeden, is afhankelijk van de mate van verzadiging van de vetzuren. Hoe meer onverzadigd ze zijn, hoe meer de microbiota ter hoogte van de pens beïnvloed wordt (Yang et al., 2009). Het verschil in de pensmicrobiota tussen vlees- en melkvee ontstaat vooral door het verschil in voederstrategie in beide sectoren. In de vleesveesector ligt de nadruk vooral op krachtvoer, terwijl bij melkvee er vaak wat meer ruwvoer in het dieet zit. Daarnaast bestaat er een invloed van genetica op de samenstelling van de microbiota, wat mogelijks ook een deel van de variatie verklaart tussen vleesen melkvee. Tussen de rassen die behoren tot de vleestypische dieren is echter ook een verschil te zien in de samenstelling van de pensmicrobiota in de pens. Hoe de microbiota in de pens eruit zien, wordt dus bepaald door een complexe interactie van verschillende factoren (Hernandez-Sanabria et al., 2013) Verschil in fecale microbiota tussen vlees- en melkvee De belangrijkste fyla aanwezig in de fecale microbiota komen overeen tussen vlees- en melkvee. De mate waarin de verschillende fyla voorkomen is echter verschillend (tabel 11), maar ook binnen het vlees- en melkvee is hierin variatie te zien. In de studie van Mao et al. (2012) werd de fecale bacteriële flora bepaald bij melkkoeien gevoederd met twee verschillende soorten diëten. Bij de ene groep bestond 40% van de drogestofopname uit krachtvoer terwijl dit bij de andere groep 70% was. De percentages weergegeven in tabel 11 zijn genomen over beide groepen en dit kan dus beschouwd worden als een soort kernsamenstelling van de bacteriën aanwezig in de feces bij melkkoeien. In de studie van Durso et al. (2010) wordt de kernsamenstelling van de fecale microbiota bij vleesvee weergegeven. Tabel 11. Belangrijkste fyla aanwezig in de feces (naar **Durso et al., 2010; *Moa et al., 2012) Fyla aanwezig in feces melkvee* Fyla aanwezig in feces vleesvee** Firmicutes (63,7%) Firmicutes (62,8%) Proteobacteria (18,3%) Bacteroidetes (29,5%) Bacteroidetes (7,6%) Proteobacteria (4,4%) Actinobacteria (6,8%) Actinobacteria (0,79%) 22

29 Er zijn genera die continue aangetoond kunnen worden bij vlees- en/of melkvee (Tabel 12). Zo is het genus Prevotella blijkt het belangrijkste genus te zijn bij vleesvee. Dit genus komt ook voor bij melkvee maar in veel mindere mate. Bij melkvee blijkt het genus Clostridium het belangrijkste genus te zijn aanwezig in de feces. Dit genus komt bij vleesvee dan weer in veel mindere mate voor (Dowd et al., 2008; Durso et al., 2010). Tabel 12. Fyla en genera in feces van melkvee en vleesvee (naar *Dowd et al., 2008; **Durso et al, 2010) Melkvee* Vleesvee** Fylum Genus Fylum Genus Firmicutes Clostridium Firmicutes Faecalibacterium Ruminococcus Ruminococcus Lachnospira Roseburia Clostridium Bacteroidetes Bacteroides Bacteroidetes Prevotella Porphyromonas Bacteroides Alistipes Prevotella Tussen de verschillende melk- en vleeskoeien is echter ook een behoorlijke variatie te zien. Waar deze variatie aan toe te schrijven is, is nog niet geheel duidelijk (Durso et al., 2010; Ozutsumi et al., 2005). Mogelijks speelt hier ook de voeding en de genetica een belangrijke rol. Afhankelijk van de samenstelling van de microbiota komen er andere voedingsstoffen en metabolieten vrij, die dan door de darmwand kunnen worden opgenomen. De voedingsstoffen die op deze manier worden opgenomen kunnen, naast de voedingsstoffen opgenomen in de pens, ook zorgen voor een variatie in de productie en samenstelling van de producten die het rund levert (Bergman, 1990). 3. Beïnvloeding van de microbiota De microbiota in het gastro-intestinaal stelsel van runderen wordt door vele factoren beïnvloed. Factoren als leeftijd, ras en voeding zijn hierboven al vermeld. Via de supplementie van functionele voeding (pre- en probiotica) kan de samenstelling van de microbiota ook gestuurd worden (Sánchez et al., 2010). Prebiotica zijn componenten die aan het voeder worden toegevoegd, maar die niet verteerbaar zijn voor het dier. Deze componenten blijven in het gastro-intestinaal stelsel en stimuleren de groei van de goede bacteriën hier. Probiotica zijn levende microbiële voedingssupplementen die zorgen dat de microbiota in het gastro-intestinaal stelsel in balans blijven, zodat pathogene kiemen niet of minder in staat zijn te koloniseren (McDonald et al., 2011) Toepassing van prebiotica Het effect van prebiotica is onderzocht bij zowel volwassen runderen als bij kalveren. In de studie van Sánchez et al. (2010) werd het effect onderzocht van het toevoegen van amino-oligosacchariden aan het voeder van melkkoeien. Dieren die dit prebioticum kregen, hadden een lager aantal melkzuurproducerende bacteriën in de pens dan de controle groep, terwijl ze een hoger aantal aan cellulolytische bacteriën hadden. Er is dus een betere vertering mogelijk van vezels en minder productie van melkzuur. Het prebioticum verhoogt de melkproductie, maar geeft een verlaagd 23

30 percentage vet in de melk. Ook zag men een stijging in de butyraatproductie en een daling in propionaatproductie. Deze veranderingen in vluchtige vetzuren kunnen voor een deel de veranderingen in de productie van melk verklaren. Bij nog niet gespeende kalveren is er een onderzoek geweest naar het effect van het toevoegen van cello-oligosacchariden aan het voeder. Dit prebioticum zorgt voor een betere groei en voederconversie bij gespeende kalveren (Hasunuma et al., 2011). Wanneer de kalveren volle melk kregen waaraan cello-oligosaccharide was toegevoegd, dan zag men een hoger gehalte van de Clostridium coccoides en Eubacterium rectale in de fecale microbiota in vergelijking met dieren die dit prebioticum niet kregen. Wanneer de dieren kunstmelk kregen zag men dit verschil niet. Ook was er bij dieren die volle melk kregen, na toediening van het prebioticum, een hogere concentratie aan butyraat aanwezig in de feces in vergelijking met de controlegroep (Uyeno et al., 2013). De betere groei en voederconversie van dieren die cello-oligosaccharide kregen, kan mogelijk verklaard worden door de hogere butyraatconcentraties in de darm bij deze dieren. Dit butyraat kan immers als energiebron door de darmmucosa worden gebruikt en kan zorgen voor een betere groei en differentiatie van de darmwand, waardoor de vertering en absorptie van het voeder beter kan gebeuren (Pryde et al., 2002). Het voeder waaraan je het prebioticum toevoegt speelt een rol in de mate waarin veranderingen optreden ter hoogte van het gastro-intestinaal stelsel. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat de microbiota bij dieren gevoerd met melk of kunstmelk niet dezelfde zijn en mogelijks niet hetzelfde kunnen reageren op het toevoegen van een prebioticum. De samenstelling van melk en kunstmelk is daarnaast ook niet volledig gelijk, wat eventueel ook een verklaring zou kunnen zijn voor het feit dat er een verschil is in het effect van het supplementeren van een prebioticum (Uyeno et al., 2013) Toepassing van probiotica Bij pasgeboren kalveren is er van nature een zeer vroege kolonisatie van het gastro-intestinaal stelsel. Zo heeft de aanwezigheid van Fecalibacterium prausnitzii in de feces, tijdens de eerste levensweek, een positieve invloed op de groei tijdens de periode voor het spenen. Hoewel het species natuurlijk kan voorkomen in de feces, kan het ook toegediend worden als probioticum om zo de groei en gezondheid van de kalveren te ondersteunen (Oikonomoi et al., 2013). Figuur 6. Schematische voorstelling van hoe de normale microbiota ervoor zorgen dat pathogenen niet kunnen koloniseren (a) verstoorde microbiota, pathogene kiemen kunnen koloniseren (b) normale flora, pathogene kiemen kunnen niet koloniseren (naar McDonald et al., 2011) 24