MAAGDARMMIRCROBIOOM VAN HET RUND

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar MAAGDARMMIRCROBIOOM VAN HET RUND door Wouter VANROSTENBERGHE Promotor: Prof. Dr. Opsomer Geert Medepromotor: Drs. Elke Depreester Literatuurstudie in het kader van de masterproef 2016 Wouter Vanrostenberghe

2

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar MAAGDARMMIRCROBIOOM VAN HET RUND door Wouter VANROSTENBERGHE Promotor: Prof. Dr. Opsomer Geert Medepromotor: Drs. Elke Depreester Literatuurstudie in het kader van de masterproef 2016 Wouter Vanrostenberghe

5 VOORWOORD Bij deze wil ik vooral mijn promotor Prof. Dr. Geert Opsomer bedanken voor de vele hulp die hij geboden heeft tijdens het opstellen van deze literatuurstudie, voor mij wegwijs te maken in de wereld der literatuur en voor de snelle respons op mijn vragen. Verder zou ik nog graag mijn vriendin willen bedanken voor de mentale steun tijdens het opstellen van deze literatuurstudie en mijn ouders om mijn diergeneeskundige opleiding op financieel vlak mogelijk te maken.

6 INHOUDSTABEL SAMENVATTING...1 INLEIDING...2 LITERATUURSTUDIE: HET MAAGDARMMICROBIOOM VAN HET RUND Humane geneeskunde: belang maagdarmmicrobioom Onderzoeksmethoden Voorbeelden van gezondheidsproblemen gerelateerd aan het maagdarmmicrobioom Obesitas Astma en andere allergieën Mentale gezondheid Mogelijke pathogeneses Het belang van het maagdarmmicrobioom bij het rund De opbouw van het gastro-intestinaal stelsel en de verschillen met de mens Het magencomplex De darmen Spijsverteringsklieren Het maagdarmmicrobioom van het rund in de literatuur Pensmicrobiota Darmmicrobiota Factoren die de samenstelling van het maagdarmmicrobioom doen wijzigen Voorbeelden van gezondheidsproblemen gerelateerd aan het maagdarmmicrobioom bij het rund Diarree Fat cow syndrome Wat is het fat cow syndrome? Mogelijke oorzaken van het fat cow syndrome Laminitis BESPREKING REFERENTIES... 18

7 SAMENVATTING Verstoringen in de samenstelling van het maagdarmmicrobioom spelen een belangrijke rol in het ontstaan van verschillende aandoeningen bij mens en dier. Gastro-intestinale microbiota kunnen via verschillende wegen een invloed hebben op de hersenen en vooral op metabole functies van verschillende organen. In deze literatuurstudie wordt eerst kort uitgelegd hoe de verschillende bacteriële species in het maagdarmmicrobioom worden geïdentificeerd. Tegenwoordig zijn alle onderzoeksmethoden gerelateerd aan het herkennen van specifieke sequenties in het 16S rrna gen. Verder wordt de rol van het maagdarmmicrobioom in obesitas, astma en andere allergieën, mentale gezondheid en hun mogelijke pathogenese besproken. Veranderingen in een relatieve overvloed aan bepaalde species of phyla of in de diversiteit van de gastro-intestinale microbiota lijken belangrijke triggers te zijn in de besproken aandoeningen. Vervolgens wordt overgeschakeld van de mens naar het rund en wordt er besproken wat er zoal te vinden is in de literatuur over het maagdarmmicrobioom bij het rund en welke gelijkenissen er zijn met bevindingen bij de mens. Er is vooral al veel bestudeerd over de gastro-intestinale microbiota bij kalveren en voornamelijk bij melkvee. Uiteindelijk wordt besproken welke aandoeningen er kunnen gerelateerd zijn aan het maagdarmmicrobioom bij het rund. Het fat cow syndroom lijkt de belangrijkste te zijn. Via een endotoxemie hebben de gastro-intestinale microbiota hier een invloed op het metabolisme in de lever. 1

8 INLEIDING Het maagdarmmicrobioom bij de mens vertegenwoordigt ongeveer 1 kg van het lichaamsgewicht (Gérard, 2016) en bevat tussen de 3 en 10 keer zoveel organismen dan menselijke cellen (Blaser en Webb, 2014). De gastro-intestinale microbiota bezitten beschermende, immunologische, nutritionele en ontwikkelingsfuncties die de gastheer baat bijbrengen en kunnen eigenlijk als dusdanig als een orgaan aanzien worden met veel meer metabole functies en capaciteiten dan de weefsels van de gastheer. Om de innige relatie tussen de gastheer en zijn symbiotische microbiota te beschrijven, wordt door sommige auteurs de term superorganisme gebruikt (Morgavi et al., 2013). Recente grote vooruitgang in het uitrafelen van de structuur van het maagdarmmicrobioom heeft de weg vrijgemaakt voor de huidige en toekomstige studies over de functionele interacties tussen de microbiota en de gastheer. Studies over de functie van microbiota zijn essentieel in het begrijpen van de rol van microbiota in de menselijke gezondheid en in de pathogenese van ziekten (Shreiner et al., 2015). Vooral het gebruik van kiemvrije muizen en microbiota-transplantatie heeft al aangetoond dat de darmmicrobiota een oorzakelijke rol spelen in de ontwikkeling van obesitas en gerelateerde metabole ziekten (Gérard, 2016). Deze hype in de humane geneeskunde heeft de bal doen rollen en zo is ook het maagdarmmicrobioom van de nutsdieren tegenwoordig het onderwerp van heel wat onderzoeken. Hierdoor is al heel wat inzicht verworven in het tot stand komen van metabole ziekten bij het rund en kan men deze kennis toepassen in de preventie ervan. 2

9 HET MAAGDARMMICROBIOOM VAN HET RUND 1. HUMANE GENEESKUNDE: BELANG MAAGDARMMICROBIOOM 1.1. ONDERZOEKSMETHODEN Een groot deel van de darmbacteriën bij de mens, 70 tot 80 procent, kan men onmogelijk in cultuur brengen (Furet et al., 2009). Cultuurgebaseerde methoden nemen zeer veel tijd in beslag en tot op de dag van vandaag is er maar ongeveer 1% van de maagdarmmicrobiota van het rund effectief in cultuur gebracht. Deze methoden zijn dus extreem partijdig in hun evaluatie van de microbiële diversiteit en overschatten bijvoorbeeld het belang van species zoals Escherichia coli omdat deze makkelijk in cultuur te brengen zijn (Dowd et al., 2008). De kennis van het maagdarmmicrobioom is dus lange tijd gelimiteerd geweest door de onderzoeksmethode. In de jaren 80 is er een nieuwe cultuur-onafhankelijke methode ontwikkeld waarmee men alle bacteriën uit de darm kan identificeren nl. de sequencing van het 16S rrna gen (Turnbaugh et al., 2007). Maar ook deze cultuuronafhankelijke methoden hebben echter nadelen omdat ze naast de levensvatbare ook nietlevensvatbare bacteriën opsporen (Dowd et al., 2008). Later heeft de dalende kost en verhoogde snelheid van DNA-sequencing, samen met de vooruitgang in de bio-informatica ervoor gezorgd dat men de bacteriële 16S rrna genen van microbiota die op de huid en in de mond, slokdarm, maag, colon en vagina leven in een stijgend aantal groepen kon sorteren (Turnbaugh et al., 2007). Recente vooruitgang in cultuur-onafhankelijke methoden heeft er ook voor gezorgd dat men de structuur en functies van het humaan microbioom uitgebreid kan onderzoeken (Kim et al., 2014). Eind de jaren 2000 heeft een Amerikaans project, The Human Microbiome Project (HMP) en een Europees project, Metagenomics of the Human Intestinal Tract (MetaHit) de diversiteit van het menselijke microbioom aangetoond via metagenomics (Kim et al., 2014; Wang et al., 2015). Hierbij wordt alle genetische informatie van alle bacteriën van één individu tezamen onderzocht en geanalyseerd via bio-informatica. De grote hoeveelheden data van de verschillende individuen worden dan met elkaar vergeleken (Kim et al., 2014; Raes, 2011; Wang et al., 2015). Wanneer men bijvoorbeeld faecale monsters gaat onderzoeken, worden grofweg volgende stappen doornomen. Eerst gaat men DNA-extractie uitvoeren via een al dan niet commerciële DNA isolatie kit. Daarna gebeurt de DNA-amplificatie via de polymerase ketting reactie (PCR). De primers die gebruikt worden bij PCR zijn primers die geconserveerde sequenties in het 16S rrna gen herkennen. Tussen deze geconserveerde sequenties bevinden zich variabele sequenties die dan vermeerderd worden. Deze variabele regio s zijn de unieke vingerafdruk van de verschillende bacteriële species (James, 2010). De bacteriële species worden tegenwoordig vooral geïdentificeerd via pyrosequencing (Armougom en Raoult, 2008). 3

10 1.2. VOORBEELDEN VAN GEZONDHEIDSPROBLEMEN GERELATEERD AAN HET MAAGDARMMICROBIOOM Obesitas Onderzoek met muizen heeft aangetoond hoe belangrijk het maagdarmmicrobioom is voor de vertering van voedsel dat onverteerbaar is voor kiemvrije individuen. De kolonisatie van volwassen kiemvrije muizen met microbiota uit de distale darm van conventioneel gekweekte muizen zorgt bij die muizen voor een dramatische stijging van het lichaamsvet, zelfs wanneer ze tegelijkertijd minder voedsel gaan opnemen (Turnbaugh et al., 2006). Bij verder onderzoek heeft men microbiota uit het caecum van obese en magere muizen in de dunne darm van magere kiemvrije muizen geïnoculeerd en die kiemvrije muizen van een gelijke hoeveelheid voedsel voorzien. Er was een grotere stijging van lichaamsvet bij de muizen die geïnoculeerd werden met microbiota van obese donors dan bij de muizen die microbiota kregen van magere donors (Turnbaugh et al., 2006; Kallus en Brandt, 2012). De twee meest voorkomende bacteriële phyla van het maagdarmmicrobioom zijn de Firmicutes en Bacteroidetes en onderzoekers hebben gevonden dat de verhouding van deze twee phyla anders is bij obese muizen dan bij magere. Obese muizen hebben relatief gezien meer Firmicutes dan magere muizen. Dit is belangrijk omdat Firmicutes voor een meer volledige vertering van een bepaalde energiebron zorgen en zo een efficiëntere absorptie van calorieën in de hand werken (Kallus en Brandt, 2012). Enkele andere, meer recentere publicaties, spreken echter deze constatatie tegen en vinden geen link tussen obesitas bij de mens en de Bacteroidetes: Firmicutes ratio. Er zijn zelfs publicaties waar er bij obese individuen hogere ratio s van Bacteroidetes tegenover Firmicutes zijn gevonden (Finucane et al., 2014). Een andere hypothese, die gesteund wordt door Turnbaugh et al. (2009) en door Le Chatelier et al. (2013), is dat BMI niet geassocieerd is met de relatieve overvloed van bepaalde taxa maar eerder met de diversiteit van de aanwezige taxa. Een darmmicrobioom met grote diversiteit zou volgens hen een beschermend effect hebben tegen obesitas (Finucane et al., 2014). Deze hypothese werd echter weerlegd door Finucane et al. (2014). Deze tegenstrijdige resultaten zijn waarschijnlijk te wijten aan variabele onderzoeksmethoden en het verschillend profiel van de onderwerpen (Petra et al., 2015). Obesitas is net als diabetes een metabole ziekte die gekarakteriseerd is door insulineresistentie en een lage graad van ontsteking. Bacterieel lipopolysaccharide (LPS) zou de trigger zijn die de aanzet geeft tot insulineresistentie, obesitas en diabetes. Tijdens de gevoederde of vastende toestand is er respectievelijk een verhoogde en verlaagde endotoxemie. Belangrijk hierbij is dat bij een dieet met hoog vetgehalte de proportie met LPS-bevattende microbiota in de darm stijgt (Cani et al., 2007). De rol van LPS in de circulatie in metabole ziekten is aangetoond door LPS-infusie. Wanneer men dezelfde plasma-concentraties van LPS bereikt zoals deze gemeten in muizen gevoederd met een vetrijk dieet, produceren ze hetzelfde fenotype als die muizen die gevoederd zijn met een hoog vetgehalte (Cani en Delzenne, 2010). 4

11 Astma en andere allergieën Verschillende studies suggereren dat het darmmicrobioom niet alleen een lokaal immuun-regulerend effect heeft maar ook een systemisch. Kinderen die astma of andere allergieën ontwikkelen zouden in hun eerste levensjaar een minder hoge diversiteit in hun darmmicrobioom hebben dan gezonde kinderen (Legatski et al., 2014). In een artikel van Amund Riiser (2015) gaat het over the hygiene hypothesis of op dit moment misschien beter gedefinieerd als the western lifestyle hypothesis die zegt dat mensen die in hun kindertijd meer in contact kwamen met bacteriën, fungi, luchtweginfecties, honden en katten of andere dieren minder kans hebben om astma of andere allergieën te ontwikkelen. Dit zou komen omdat de Th1 cellen bij te weinig contact met pathogenen niet genoeg gestimuleerd worden om in balans te zijn met de Th2 cellen. Onevenwicht in de Th2 cel populatie leidt tot de productie van interleukines (IL-4 en IL-5), die dan de productie van IgE en eosinofielen induceert die atopische ziekten veroorzaakt. Een ander gevolg van de westerse levensstijl is dat er verstoringen kunnen zijn in samenstelling van het maagdarmmicrobioom door het gebruik van antibiotica en de samenstelling van het dieet maar ook door bijvoorbeeld keizersnedes en het al dan niet gebruik maken van borstvoeding (Riiser, 2015). Dysbiose bij baby s van 1 maand oud waarbij de hoeveelheid Clostridium difficile verhoogd is, hebben een significant grotere kans om gevoelig te zijn voor allergieën op de leeftijd van 2 jaar (Inoue en Shimojo, 2015). Een verhoogd aantal C. difficile komt vooral voor bij baby s die via keizersnede zijn geboren. Dit komt omdat hun darm gekoloniseerd wordt door bacteriën die afkomstig zijn vanuit de omgeving van het hospitaal en van de huid van andere mensen dan de moeder. Op die manier hebben ze een verschillende samenstelling van maagdarmmicrobioom, vooral minder Bifidobacterium en Bacteroides dan kinderen die vaginaal zijn geboren. Maar het maagdarmmicrobioom is niet alleen afhankelijk van de manier van geboorte, ook de plaats is van belang. Kinderen geboren per viam naturalis in het ziekenhuis hebben een verschillend microbioom dan kinderen die thuis geboren worden, onder andere ook meer C. difficile (van Nimwegen et al., 2012) Mentale gezondheid Verschillende studies hebben al aangetoond dat er een vorm van communicatie bestaat tussen het microbioom van de darm, de darm zelf en de hersenen. De focus vandaag de dag ligt vooral op de richting van het microbioom naar de hersenen (Cryan en O Mahony, 2011). In de huidig beschikbare literatuur zijn verschillende mogelijke routes beschreven waarop het darmmicrobioom nu juist een invloed kan hebben op het zenuwstelsel en vooral op de hersenen en gedrag van individuen. Het microbioom speelt een kritische rol in de ontwikkeling van de immuunrespons, onder andere in het endotheel dat zich in de darm bevindt en in de bloed-hersen barrière (BHB). Dit is bewezen in testen met kiemvrije muizen. De permeabiliteit van de BHB is verhoogd in kiemvrije muizen en dit kon hersteld worden als ze geïnoculeerd werden met darmmicrobioom van andere muizen (Braniste et al., 2014). Psychische problemen zijn gelinkt aan het immuunsysteem en een opkomend concept is dat 5

12 de darmbacteriën de emotionele staat van de gastheer kunnen beïnvloeden (Flowers en Ellingrod, 2015). Klinisch gezien zijn episoden van depressie geassocieerd met een verstoring in de hypothalamohypofyse-bijnier as (HPA) en de oplossing van depressie ligt in de normalisatie van die as. Een directe link tussen microbiota en de HPA-as werd blootgelegd in een onderzoek uit 2004 met muizen. Het toonde aan dat kiemvrije muizen een overdreven corticosteron en adrenocorticotroop hormoon (ACTH) respons hadden op gecontroleerde stress in vergelijking met conventioneel gekweekte SPFmuizen (Foster en McVey Neufeld, 2013). Op dit moment zijn er bewijzen beschikbaar dat een verstoring van het darmmicrobioom een sleutelrol speelt in de ontwikkeling van zelfs autisme, maar het mechanisme is nog niet helemaal opgehelderd. Clostridium spp. zouden kunnen verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling ervan (Dowd et al., 2008). Er zijn al experimenten uitgevoerd waarbij modulators van de darmmicrobiota als therapie werden gebruikt voor autisme met weinig maar veelbelovend resultaat (Mangiola et al., 2016) MOGELIJKE PATHOGENESES Het is dus duidelijk dat we een symbiotische relatie delen met de bacteriën die in onze darm leven. De microbiota uit onze darm regelen fysiologische processen via een bidirectioneel communicatienetwerk dat gekend staat in de literatuur als the microbiota-gut-brain axis (MGB-as) (Sherwin et al., 2016). De MGB-as heeft betrekking tot het endocrien systeem (HPA-as), het immuunsysteem (chemokines, cytokines), het autonoom en het enterisch zenuwstelsel (Petra et al., 2015). Korte keten vetzuren (SCFA) worden geproduceerd door de darmmicrobiota via fermentatie van voornamelijk verteerbare en onverteerbare polysacchariden. De belangrijkste zijn acetonzuur, proprionzuur en boterzuur. Deze SCFA s doen zich voor als signaalmolecules en kunnen veel fysiologische functies beïnvloeden. SCFA s kunnen ook door de bloed-hersen barrière migreren en zo neurotransmissie en gedrag moduleren. Een chronische behandeling met boterzuur bijvoorbeeld, zorgde voor een antidepressief effect in ratten en was geassocieerd met een stijging van brain derived neurotrophic factor (BDNF) (Sherwin et al., 2016). BDNF is betrokken bij de regeling van verschillende aspecten van cognitief en emotioneel gedrag en speelt een sleutelrol in de overleving van neuronen net als de differentiatie van nieuwe neuronen en synapsen. Serum concentraties van BDNF zijn significant verlaagd in het plasma van depressieve patiënten en in postmortem weefsel uit de hippocampus van depressieve individuen die zelfmoord pleegden (Forsythe et al., 2012). 6

13 Fig. 1: Bidirectionele communicatie tussen de darmmicrobiota en onderdelen van de darm-hersen as beïnvloeden de normale homeostase en kan zo bijdragen aan het risico op ziekte. Storingen in het gastro-intestinaal stelsel, het centraal zenuwstelsel, het autonoom zenuwstelsel en het immuunsysteem door microbiota kunnen leiden tot storingen in (a) vetopslag en energiebalans; (b) gastro-intestinale barrière; (c) algemene lage graad van ontsteking; (d) een stijgende stressrespons; en (e) een meer angstig en depressief gedrag (uit Foster en McVey Neufeld, 2013). Het darmmicrobioom is verondersteld één van de factoren te zijn die bijdraagt tot de chronische lage graad van ontsteking die geassocieerd is met obesitas en metabole malfuncties zoals insuline resistentie. Het aangeboren immuunsysteem is één van de sleutelspelers in de communicatie tussen de gastheer en de microbiota. De herkenning van specifieke microbiële componenten zoals LPS en DNA is gemedieerd door onder andere de Toll-like-receptor familie (TLR) die tot expressie komt in epitheelcellen en antigeen-presenterende cellen. Een stijgende expressie van TLR s komt voor in de meeste weefsels die ontstoken zijn en TLR s worden geactiveerd door diëtaire vetten. Zo wordt de communicatie tussen de darmmicrobiota, het aangeboren immuunsysteem van de gastheer en het gehele lichaamsmetabolisme gemedieerd. Verzadigde vetzuren triggeren de expressie van TLR s en hun activatie die samen bijdraagt met de microbiota-afgeleide producten tot een stijgende hoeveelheid van inflammatoire cytokines in bijvoorbeeld vetweefsel en de lever. Die inflammatoire cytokines kunnen metabole functies verstoren wanneer het weefsels bereikt die betrokken zijn in het glucose en vetmetabolisme zoals de lever en vetweefsel (Sanz en Moya-Pérez, 2014). 7

14 2. HET BELANG VAN HET MAAGDARMMICROBIOOM BIJ HET RUND 2.1. OPBOUW VAN HET GASTRO-INTESTINAAL STELSEL EN VERSCHILLEN MET DE MENS Het magencomplex Het spijsverteringsstelsel van het rund en dat van de mens bevat heel wat belangrijke verschillen. Niet alleen anatomisch maar zeker ook fysiologisch. Het opvallendste verschil is dat het rund een magencomplex bezit met zogezegd 4 magen maar eigenlijk zijn dit compartimenten in één groot geheel. In de pens (rumen), bij het volwassen rund met voorsprong het grootste compartiment en de netmaag (reticulum) gebeurt voornamelijk alle fermentatie in het magencomplex en deze twee compartimenten worden soms ook als één orgaan bekeken (Van Soest, 1994). Na de passage in de pens en netmaag gaat het voedsel via de boekmaag (omasum) naar de eigenlijke maag, de lebmaag (abomasum). De lebmaag kan men vergelijken met de maag van monogastrische dieren en de mens. De pens, netmaag en boekmaag zijn nonglandulair en zouden in de evolutie afgeleid zijn van de slokdarm of van de cardiaregio. Voedsel wordt op deze manier gescheiden van de zure omgeving in de lebmaag en zo kan microbiële groei ontstaan (Dehority, 2002). Fig. 2: Een doorsnede doorheen het mediaal verticaal vlak van het magencomplex bij het rund gezien vanuit de rechterkant. ABO: abomasum; D: duodenum; DBS, DSR, VBS, VSR: rumen; OM: omasum; RET: reticulum (uit Harfoot, 1978) De fermentatie in de voormagen door microbiota heeft 3 belangrijke nutritionele voordelen voor het rund. Ten eerste wordt cellulose en andere plantaardige polysacchariden afgebroken en komen ze beschikbaar als energiebron. Ten tweede kunnen de microbiota niet-eiwitgebonden stikstof (NPN) gebruiken voor hun groei en kunnen ze het omzetten tot eiwit dat beschikbaar is voor het rund. Ten derde zorgen de microbiota ervoor dat het rund via de synthese van vitaminen virtueel onafhankelijk wordt van diëtaire bronnen van vitaminen behalve voor vitamine A en D (Dehority, 2002) De darmen De opbouw van het darmstelsel van het rund en de mens is meer gelijklopend. Net als bij de mens bestaat de dunne darm beginnend van bij de (leb)maag uit het duodenum, jejunum en ileum. Het ileum mondt uit in de dikke darm ter hoogte van de overgang van het caecum en het colon ascendens. Het caecum bij het rund bevat geen appendix op het einde zoals bij de mens. Het colon ascendens gaat in craniale richting en bevindt zich rechts waarna het overgaat in het colon transversum dat naar links loopt en op zijn beurt overgaat in het colon descendens dat in caudale richting gaat. Juist vóór de ingang naar de bekkenholte vertoont het colon een ventraal gerichte bocht 8

15 (colon sigmoideum). In het bekkenkanaal spreken we van het rectum en dit verbindt het colon met het anaalkanaal (Simoens, 2013). Fig. 3: Overzicht van het spijsverteringskanaal bij de mens (uit De Sesso en Jacobson, 2001) Spijsverteringsklieren Het rund heeft verschillende speekselklieren. De parotisklier en de mandibulaire speekselklier zijn de grootste, daarnaast heb je de glandulae sublingualis monostomatica en polystomatica en de wangspeekselklieren (Simoens, 2013). De speekselklieren secreteren stikstof in de vorm van ureum dat werd opgenomen uit het bloed. Ureum is een afvalproduct dat ontstaat na katabolisme van proteïnes in de lever. Dit gesecreteerd ureum samen met ureum dat getransporteerd wordt door het epitheel van de pens is een belangrijke nutritionele factor voor microbiële groei in de pens (Dix et al., 2013). Het rund heeft een lever met een grote galblaas die uitmondt op een kleine papilla duodeni major in het duodenum. De afvoerwegen van de pancreas monden uit op de papilla duodeni minor via de ductus pacreaticus accessorius (Simoens, 2013). De ductus pancreaticus van Wirsung is niet aanwezig bij het rund maar wel bij de mens (Stern, 1986) HET MAAGDARMMICROBIOOM IN DE LITERATUUR De samenstelling en functie van de gastro-intestinale microbiota is net zoals bij de mens zeer belangrijk bij het rund omdat het niet alleen essentieel is in de vertering van voedsel en van invloed is op de gezondheid van runderen in het algemeen maar ook bijvoorbeeld op belangrijke parameters zoals melkproductie bij melkvee (Mao et al., 2015). 9

16 Pensmicrobiota De pens van een gezond volwassen rund is dus een anaerobe kamer die in hoge dichtheid wordt bewoond door microbiota bestaande uit bacteriën, protozoa, archaea en fungi. De bacteriën domineren want ze zijn verantwoordelijk voor ongeveer 95% van alle microbiota in de pens (Mao et al., 2015). Bij het neonataal kalf is de pens nog onderontwikkeld en bevat het amper microbiota. Neonatale herkauwers worden dan ook eerder aanzien als monogastrische dieren omdat hun gastrointestinaal stelsel fysiek en functioneel verschillend is met dat van een volwassen herkauwer (Uyeno et al. 2010). Melk gaat via de slokdarmsleuf en onderontwikkelde boekmaag rechtstreeks naar de lebmaag en enkel vast voedsel komt in de pens terecht (Van Soest, 1994). De kolonisatie van de pens door microflora gebeurt geleidelijk aan na de geboorte. In de eerste levensdag van het kalf worden vooral E. coli, streptococcen en lactobacillen gevonden. Amylolytische bacteriën die zetmeel en suiker verteren, de xylaan- en pectine-fermenteerders, lactaat- en sulfaatverwerkers worden ook al na de eerste dag gevonden en hun aantal stijgt tot ongeveer de leeftijd van 3 dagen en blijft daarna constant. Cellulolytische bacteriën verschijnen ook al vroeg in de pens, hun aantal is in de studie van Minato et al. (1992) 10 2 c.f.u./g in 3 dagen oude kalveren en stijgt geleidelijk tot 10 7 c.f.u./g op de leeftijd van 3 weken en blijft daarna relatief constant. Deze aantallen zijn ook afhankelijk van de hoeveelheid vezelrijk voeder het dier opneemt. Methanogene bacteriën verschijnen in de pens op de leeftijd van 1 week en hun aantal stijgt tot de leeftijd van 3 weken waarna hun aantallen constant blijven. Protozoa worden in de pens pas teruggevonden vanaf 8 à 10 weken. De vluchtige vetzuren (VFA) in de pens waarvan azijnzuur, proprionzuur en boterzuur de belangrijkste zijn, stijgen ook van bij de geboorte tot aan de leeftijd van 10 weken (Minato et al., 1992). VFA s ontstaan door fermentatie en zijn belangrijk in de ontwikkeling van de penspapillen en de morfologische ontwikkeling van het epitheel van de pens. Een bepaalde hoeveelheid voedsel in de pens is vooral nodig voor de groei van de pens en de ontwikkeling van de pensmusculatuur (Lane en Jesse, 1997). Uit een studie van Jamie en Mizrahi (2012) blijkt dat de gemiddelde samenstelling van pensbacteriën van volwassen lacterende melkkoeien hoofdzakelijk bestaat uit de phyla Firmicutes en Bacteroidetes, voor respectievelijk 43% en 50%; Proteobacteria dragen voor 5,5% bij aan de pensbacteriën en Actinobacteria en Tenericutes voor respectievelijk 0,9% en 0,7%. Belangrijk om hierbij te vermelden is dat deze ratio s een grote variatie kenden tussen de verschillende individuen. In dit onderzoek bleek ook dat er 32 genera door alle individuen worden gedeeld. Hun relatieve aantallen varieerden wel van 0.1% tot 50% maar aangezien al de dieren in deze studie deze microbiota bezitten wil dit waarschijnlijk zeggen dat ze een essentiële functie vervullen Darmmicrobiota Net zoals bij de pens zijn ook de darmen zo goed als steriel bij pasgeboren runderen en bij uitbreiding bij alle mensen en dieren maar de kolonisatie van het gastro-intestinaal stelsel begint direct na de geboorte (Uyeno et al., 2010). Wanneer men de faecaliën van neonatale kalveren onderzoekt, dan vindt men vooral facultatieve anaeroben zoals Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus en 10

17 Enterobacteriaceae spp. Deze species gaan dan het vereiste milieu creëren dat nodig is voor de groei van obligaat anaerobe darmbacteriën. Maar naast de facultatief anaeroben zijn er toch ook al anaerobe Bifidobacterium species in hoge aantallen aanwezig in de darmen van kalveren in hun eerste levensweek. Die samenstelling verandert naarmate de tijd vordert in de eerste 12 levensweken. Ruminococcus flavefaciens en Fibrobacter spp. verschijnen en Bifidobacterium, Enterobacteriaceae, Streptococcus en Lactobacillus spp. verdwijnen (Malmuthuge et al., 2014). In het onderzoek van Oikonomou et al. (2013) heeft men bij 61 kalveren elke week vanaf de geboorte tot de speenleeftijd stalen van faeces genomen en het meest voorkomende phylum was Firmicutes met percentages van 63,84% tot 81,90%, gevolgd door Bacteroidetes (8,36% tot 23,93%), Proteobacteria (3,72% tot 9,75%), Fusobacteria (0,76% tot 5,67%) en Actinobacteria (1,02% tot 2,35%). De studie van Malmuthuge et al. (2014) toont aan dat er een significant verschil is in de samenstelling van het microbioom dat te vinden is in de voedselbrij en hetgeen geassocieerd is met de mucosa van de darm en dat de samenstelling ook wijzigt naargelang de regio in de darm. Fig. 4: Samenstelling van microbiota op het niveau van de phyla bij kalveren in hun eerste levensweek (uit Oikonomou et al., 2013). Leden van de phyla Firmicutes en Bacteroidetes zijn dus de dominante bewoners van de pens én de darmen. Maar toch zijn er enkele bacteriële groepen (Ruminococcus albus, Ruminococcus bomii, Selenomonas spp. en andere) die niet gevonden zijn in faeces van kalveren maar die wel gedetecteerd werden in de pens van Holstein vaarzen. Dit kan suggereren dat de bacteriële populatie van de faeces een verschillende samenstelling heeft dan de bacteriële populatie van de pens op vlak van fysiologische karakteristieken en functie (Uyeno et al., 2010). 11

18 Factoren die de samenstelling van het maagdarmmicrobioom doen wijzigen De voornaamste factor die de samenstelling van de gastro-intestinale microbiota kan wijzigen lijkt het dieet te zijn. Bij kalveren stijgt het voorkomen van Firmicutes van de eerste tot de vierde levensweek en daalt daarna geleidelijk en het omgekeerde patroon wordt opgemerkt voor Bacteroidetes. Waarschijnlijk zijn deze wijzigingen te wijten aan de geleidelijke overschakeling van melkconsumptie naar een dieet van ruwvoer. Wanneer er gekeken wordt op het genusniveau, dan wordt deze veronderstelling bevestigd want de concentraties van Lactobacillus spp. en Bifidobacterium spp. (gerelateerd aan de vertering van melk) stijgen geleidelijk tot de leeftijd van 4 weken en dalen daarna stelselmatig. Het is geweten dat de consumptie van ruwvoer door kalveren significant stijgt op de leeftijd van 4 weken (Oikonomou et al., 2013). Het pasteuriseren van melk doet het aantal pathogene bacteriën zoals Mycoplasma, Mycobacterium Paratuberculosis en Salmonella maar ook het aantal goedaardige bacteriën aanzienlijk verminderen. Men moet echter wel in acht houden dat de rekolonisatie van die melk snel gebeurt (Edrington et al., 2012). Het effect op de microflora in het colon van kalveren gevoederd met gepasteuriseerde melk werd onderzocht in een studie van Edrington et al. (2012). Men vond de resultaten ietwat verrassend aangezien de bacteriële diversiteit bij kalveren gevoederd met gepasteuriseerde melk niet lager maar juist hoger lag. Dit kan aangeven dat de rekolonisatie van gepasteuriseerde melk zorgt voor een betere bron van gastro-intestinale bacteriën. Ook werd gevonden dat de hoeveelheid Salmonella in de darmen van kalveren gevoederd met gepasteuriseerde en niet-gepasteuriseerde melk gelijklopend was. Dit geeft dan weer aan dat melk niet de belangrijkste vector is voor een Salmonella-infectie. Tajima et al. (2001) onderzocht via real-time PCR wat een plotse wijziging van een dieet bestaande uit enkel hooi naar een dieet bestaande uit graan teweeg bracht aan de samenstelling van de pensmicrobiota. Er werd een drastische daling van fibrolytische bacteriën gevonden. De hoeveelheid F. succinogenes DNA was op de 3 e dag na de wijziging al 20 keer minder en op de 28 e dag reeds 57 keer minder. De concentratie aan R. flavefaciens op dag 3 was maar ongeveer 10% meer van zijn oorspronkelijke concentratie en bleef op dit niveau op dag 28. Tijdens de overgangsperiode (dag 3) was de hoeveelheid DNA van 2 Prevotella species aanzienlijk verhoogd. P. ruminicola was 7 keer hoger en P. bryantii zelfs 263 keer hoger. Op dag 28 was P. ruminicola gedaald tot 3 keer minder dan de originele hoeveelheid tijdens het dieet met hooi, P. bryantii was nog 10 hoger op dag 28 dan de originele concentratie. De amylolytische bacteriën zoals Selenomonas ruminantium stegen dan weer in concentratie bij een graan-dieet. Streptococcus bovis, ook een amylolytische bacterie steeg wel 67 keer in de overgangsperiode maar was weer lager dan de oorspronkelijke concentratie na die periode. Dit impliceert dat S. bovis nog andere belangrijke functies heeft zoals het verteren van polysacchariden afkomstig van planten. Stijgingen van S. ruminantium, P. bryantii en S. bovis in de overgangsperiode werden ook gevonden in een studie van Fernando et al. (2010). De samenstelling van het maagdarmmicrobioom is ook afhankelijk van de leeftijd. Bij kalveren stijgt de bacteriële diversiteit met de leeftijd (Edrington et al., 2012). Hierboven werd al beschreven dat het maagdarmmicrobioom van kalveren anders is dan dat van volwassen runderen en in een studie van 12

19 Tajima et al. (2007) is beschreven dat oudere volwassen koeien relatief meer Bacteroidetes hadden dan jonge volwassen koeien. In ditzelfde onderzoek is het effect van temperatuur en relatieve vochtigheid op de pensmicrobiota onderzocht en men kwam tot de constatatie dat deze factoren de samenstelling doet wijzigen maar dat de diversiteit onveranderd blijft. De samenstelling van de gastro-intestinale microbiota kan ook wijzigen naargelang het ras (melkvee versus vleesvee). Durso et al. (2010) heeft de faecale microbiota van vleesvee geïdentificeerd en kwam tot de vaststelling dat er op het niveau van de phyla weinig verschil was, enkel de verhoudingen in relatieve hoeveelheden lagen iets anders. Op genusniveau was er echter wel significant verschil op te merken. Het meest gemeenschappelijke genus bij vleesvee in deze studie was Prevotella dat 24% uit maakte van de faecale microbiota terwijl dit in een studie bij melkvee maar 5,5% was. Clostridium vertegenwoordigde 1,5% in deze studie in tegenstelling tot bij melkvee waar het 19% uitmaakte van de faecale microbiota. Ook de geografische locatie speelt een rol in de variatie in gastro-intestinale microbiota (Jamie en Mizrahi, 2012) VOORBEELDEN VAN GEZONDHEIDSPROBLEMEN GERELATEERD AAN HET MAAGDARMMICROBIOOM BIJ HET RUND Diarree Diarree bij kalveren is geassocieerd met een lagere diversiteit aan intestinale microbiota en omgekeerd worden kalveren met een hogere gewichtstoename gelinkt met een hogere diversiteit aan intestinale microbiota (Oikonomou et al., 2013). In de studie van Oikonomou et al. (2013) wordt de aanwezigheid van Faecalibacterium spp. en voornamelijk F. prauznitsii geassocieerd met een stijgende gewichtstoename bij kalveren vóór het spenen. Een andere studie heeft al aangetoond dat de hoeveelheid F. prauznitsii bij in de feaces bij obese kinderen aanzienlijk hoger lag dan bij nietobese kinderen. Faecalibacterium behoort tot het phylum Firmicutes en er is reeds aangetoond er bij obese muizen een hogere Firmicutes:Bacteroidetes ratio heerst zoals hier ook eerder vermeld. Bij kalveren die in hun eerste levensweek meer Faecalibacterium spp. in hun faeces hebben, komt ook veel minder diarree voor. Deze resultaten zorgen dus voor een sterke fundering om experimenten uit te voeren om het probiotisch effect van Faecalibacterium spp. te evalueren (Oikounomou et al., 2013) Fat cow syndrome Wat is het fat cow syndrome? Het fat cow syndrome of fatty liver syndrome is een metabole ziekte die optreedt na het kalven. Het wordt gekarakteriseerd door opstapeling van lipiden in de lever die 12 tot 25% van het gewicht van de lever kunnen bevatten. Leververvetting kan zorgen voor littekenweefsel en verharding van de lever met de dood van de koe tot gevolg. Specifieke symptomen voor het fatty liver syndrome zijn er niet maar men denkt hieraan als andere ziekten komen opdagen. Het voorkomen van ziekten zoals 13

20 kalfziekte, ketose, mastitis, metritis, lebmaagdilatatie en retentio secundinarum komt meer voor bij dieren met leververvetting (Ametaj, 2005) Mogelijke oorzaken van het fat cow syndrome De conventionele kijk op de oorzaak van leververvetting is de negatieve energiebalans (NEB) die ontstaat als gevolg van een daling in de energieopname rond de partus en een stijging in energiebehoefte, vooral wanneer de lactatie start. Het energietekort zorgt ervoor dat de koeien grote hoeveelheden vetzuren gaan mobiliseren uit de vetdepots en dit zorgt voor een stijging van het aantal niet-veresterde vetzuren (NEFA s) in het bloed. Omdat de mobilisatie en accumulatie van vetzuren afkomstig uit de vetdepots groter is dan de capaciteit van de lever om vetzuren te secreteren of verbranden, stapelt het vet op in de lever en leververvetting ontstaat. Recent is echter een nieuwe mogelijke oorzaak gevonden die gerelateerd is aan het maagdarmmicrobioom van het rund (Ametaj, 2005). Leververvetting zou samen met de NEB ook het gevolg zijn van een verandering in de gastrointestinale microbiota (Ametaj et al., 2010). Er is reeds door verschillende onderzoekers aangetoond dat een dieet met een hoog graangehalte en een laag ruwvoedergehalte bij melkvee geassocieerd is met verschillende metabole ziekten zoals leververvetting. Nu heeft recent onderzoek aangetoond dat de metabole ziekten in melkvee gevoederd met een dieet met hoge energiegehaltes voorafgegaan worden door een acute fase respons (APR). Een hoog-energie dieet bij melkvee zorgt voor subacute pensacidose (SARA) en zoals reeds hoger vermeld voor een wijziging in de samenstelling van de gastro-intestinale microbiota. Er zou een shift ontstaan naar meer gram-negatieve bacteriën in de pens zoals E. coli, Prevotella albensis en Megasphaera elsdenii (Ametaj et al., 2010). In een onderzoek van Emanuel et al. (2007) heeft men de wijzigingen aan metabolieten en acute fase proteïnen in de pensvloeistof en in het plasma geëvalueerd tijdens het voederen van stijgende proporties gerstgraan in het dieet van melkvee. Men vond dat de concentratie van endotoxine in de pensvloeistof stijgt als men de hoeveelheid gerstgraan in het voeder doet stijgen. De groep koeien die gevoederd werd met de grootste hoeveelheid graan hadden de laagste ph in de pens en de hoogste concentratie aan endotoxine in hun pens. Verder werd in de studie gevonden dat de plasmaconcentraties van serum amyloid A (SAA), lipopolysaccharide-binding protein (LBP) en C- reactive protein (CRP) stegen wanneer het graangehalte in het voeder steeg. Metabolieten in het plasma zoals β-hydroxy boterzuur, NEFA s en cholesterol daalden bij stijgend graangehalte in het dieet maar de glucose- en lactaatgehaltes stegen. Een stijgende hoeveelheid graan in het dieet zorgde ook voor dalende plasmaconcentraties van Ca 2+ en Fe 2+ en een stijgende plasmaconcentratie van Cu 2+. Endotoxine komt vrij in de pens bij lyse van gram-negatieve bacteriën. De ph van de pens zou een rol spelen in de vrijstelling van endotoxine vanwege zijn effecten op de metabole processen en veranderingen in de celmembraan van pensbacteriën. Figuur 1 geeft de relatie weer tussen de ph in de pens en de concentratie van endotoxine in de pensvloeistof van melkvee gevoederd met stijgende proporties van gerstgraan in hun dieet (Ametaj et al., 2010). 14

21 Fig. 1: De grafiek geeft de relatie weer tussen de concentratie aan endotoxine in de pensvloeistof en de preprandiale ph in de pens van lacterende primipare Holstein koeien die 0% ( ), 15% ( ), 30 % (o) of 45% ( ) graan in hun voeder kregen (uit Ametaj et al., 2010). Als de concentratie van endotoxine in het lumen van het gastro-intestinaal stelsel stijgt dan verplaatst luminaal endotoxine zich tot in de systemische bloedsomloop. Een mogelijk mechanisme van de translocatie van endotoxine is dat de permeabiliteit van het gastro-intestinaal stelsel stijgt omdat endotoxine apoptose veroorzaakt en vervolgens de tight junctions worden verbroken. Deze translocatie van endotoxine zorgt voor de vrijstelling van tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukine (IL)-1 en IL-6 door de macrofagen van de lever en dit zorgt op zijn beurt voor de secretie van acute fase proteïnes zoals LBP, SAA en CRP uit de hepatocyten. De relatie tussen endotoxine in de pens en plasma LBP is weergegeven in figuur 2 (Ametaj et al., 2010). Fig. 2: De grafiek geeft de relatie weer tussen de hoeveelheid LBP in het plasma en de concentratie van vrij endotoxine in de pensvloeistof van lacterende primipare Holstein koeien die 0% ( ), 15% ( ), 30 % (o) of 45% ( ) graan in hun voeder kregen (uit Ametaj et al., 2010). 15

22 Mineralen in het plasma zoals Ca en Fe en metabolieten zoals cholesterol en lactaat geven niet alleen belangrijke informatie over het mineralen- en lipidenmetabolisme maar ook over hoe de gastheer omgaat met de translocatie van endotoxine in de bloedsomloop. Cholesterol is bijvoorbeeld een precursor van de galzuren en de gedaalde plasmaconcentratie kan op een stijgende behoefte aan galzuren wijzen voor de detoxificatie van endotoxine in het gastro-intestinaal stelsel. Het limiteren van beschikbaar ijzer in het plasma kan dan weer wijzigen op een verdedigingsmechanisme van de gastheer omdat dit essentieel is voor de groei van micro-organismen (Ametaj et al., 2010). Eén van de hoofdfuncties van de acute fase proteïnes is het binden en neutraliseren van endotoxine. Men veronderstelt dat leververvetting ontwikkelt als resultaat van het snel verwijderen van endotoxine uit de bloedcirculatie door endocytose van lipoproteïnes door de hepatocyten in de lever. Endotoxine dat in het bloed terecht komt, wordt gebonden door SAA dat op zijn beurt gebonden is aan lipoproteïnes, vooral high-density lipoproteïnes. Het verwijderen van endotoxine uit de circulatie wordt bereikt door het verwijderen van endotoxine-saa-lipoproteïne complexen door de hepatocyten. Dit zorgt voor een snelle accumulatie van triglyceriden-rijke lipoproteïnes in de lever en veroorzaakt leververvetting (Ametaj et al., 2010). Het patroon van de concentratie van APP rond de partus bij het rund is ook opgemerkt bij de mens (Ametaj et al., 2010) Laminitis Onderzoekers hebben ook reeds gevonden dat laminitis geassocieerd is met een hoog graangehalte in het dieet en de ontwikkeling van pensacidose. De voornaamste oorzaken van laminitis lijken endotoxine en metalloproteïnases die geactiveerd zijn door S. bovis uit het gastro-intestinaal stelsel. In een recent experiment zijn melkkoeien oraal behandeld met een vaccin tegen LPS van E. coli alleen of in combinatie met lipoteichoïnezuur (LTA), een celwandcomponent van gram-positieve bacteriën. Men vond dat het voorkomen van laminitis daalde wanneer men enkel vaccin tegen LPS gebruikte maar de prevalentie van laminitis daalde nog meer in combinatie met het vaccin tegen LTA. Dit toont aan dat celwandcomponenten van gram-negatieve én gram-positieve bacteriën zoals S. bovis zouden kunnen betrokken zijn in de pathogenese van laminitis. Verder onderzoek is hier echter nodig om de juiste pathogenese te achterhalen (Ametaj et al., 2010). 16

23 BESPREKING Onderzoek naar het maagdarmmicrobioom staat in de humane geneeskunde al heel wat verder dan in de diergeneeskunde. Het valt wel op dat er gelijkenissen zijn in de pathogenese van metabole ziekten die in verband staan met het maagdarmmicrobioom zoals diabetes melitus bij de mens en leververvetting bij het rund ondanks dat er zo n grote anatomische en fysiologische verschillen zijn in hun gastro-intestinale stelsels. Misschien kan dit doorgetrokken worden en bestaat er ook bij het rund een relatie tussen de gastro-intestinale microbiota en astma of andere allergieën. Er is reeds veel onderzoek gebeurd naar het maagdarmmicrobioom van muizen en naar het effect van wijzigingen in de samenstelling er van. De informatie die hiermee bekomen wordt, wordt soms heel snel geëxtrapoleerd naar de humane geneeskunde. De vraag is of dit altijd zomaar mag gebeuren. Het feit dat verschillende studies elkaar regelmatig tegenspreken doet hun geloofwaardigheid in sommige gevallen dalen. Een bekend voorbeeld daarvan is de Firmicutes:Bacteroidetes ratio in de gastro-intestinale microbiota bij obese mensen. De meeste studies verklaren dat die hoger is bij obese individuen maar er zijn enkele studies die juist het omgekeerde hebben vastgesteld. De vraag is altijd welke studie de juiste vaststelling heeft gedaan. Vaak hebben ze beiden juist gehandeld maar zijn het de hoge intra- en interindividuele variaties die voor verschillende resultaten zorgen. Ook heeft elk onderzoek zijn eigen onderzoeksmethode die voor variatie in de metingen kan zorgen. Aangezien men met dieren werkt kan men ook nooit identiek dezelfde proefobjecten gebruiken. Verder zijn ook de specifieke omgevingsfactoren van groot belang. Vaak heeft men het in de studies ook over hypotheses en vermoedelijke pathogeneses. Het hier beschreven onderzoeksdomein staat nog in zijn kinderschoenen en het onderliggende mechanisme van een aangetoonde interactie tussen het maagdarmmicrobioom en de gastheer is vaak nog niet volledig opgehelderd. Er wordt in dit domein veel meer onderzoek uitgevoerd op melkvee dan op vleesvee en dit zorgt ervoor dat er nog maar zeer weinig bekend is over gezondheidsproblemen in vleesvee gerelateerd aan het maagdarmmicrobioom. Het moge echter wel duidelijk zijn dat wat er al bekend is over de gastro-intestinale microbiota bij melk- én vleesvee ruimte biedt voor heel wat therapeutische mogelijkheden. 17

24 REFERENTIES Ametaj B.N. (2005) A new understanding of the causes of fatty liver in dairy cows. Advances in dairy technology. 17, Ametaj B.N., Zebeli Q., Iqbal S. (2010) Nutrition, microbiota, and endotoxin-related diseases in dairy cows. Revista Brasileira de Zootecnia. 39, Armougom F., Raoult D. (2008) Use of pyrosequencing and DNA barcodes to monitor variations in Firmicutes and Bacteroidetes communities in the gut microbiota of obese humans. BMC Genomics. 9, artnr. 576 Blaser M.J., Webb G.F. (2014) Host demise as a beneficial function of 1202 indigenous microbiota in human hosts. mbio. 5(6), e Braniste V., Al-Asmakh M., Kowal C., Anuar F., Abbaspour A., Tóth M., Korecka A., Bakocevic N., Guan L., Kundu P., Gulyás B., Halldin C., Hultenby K., Nilsson H., Hebert H., Volpe B., Diamond B., Pettersson S. (2014) The gut microbiota influences blood-brain barrier permeability in mice. Science Translational Medicine. 6(263), 263ra158 Cani P.D., Delzenne N.M. (2010) Involvement of the gut microbiota in the development of low grade inflammation associated with obesity: focus on this neglected partner. Acta gastro-enterologica Belgica. 73, Cani P.D., Amar J., Iglesias M.A., Poggi M., Knauf C., Bastelica D., Neyrinck A.M., Fava F., Tuohy K.M., Chabo C., Waget A., Delmee E., Cousin B., Sulpice T., Chamontin B., Ferrieres J., Tanti J.F., Gibson G.R., Casteilla L., Delzenne N.M., Alessi M.C., Burcelin R. (2007) Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance. Diabetes. 56, Cryan J. F., O Mahony S. M. (2011) The microbiome-gut-brain axis: from bowel to behavior. Neurogastroenterology & Motility. 23, Dehority B.A. (2002) Gastrointestinal tracts of herbivores, particularly the ruminant: Anatomy, physiology and microbial digestion of plants. Journal of applied animal research. 21, De Sesso J.M., Jacobson C.F. (2001) Anatomical and physiological parameters affecting gastrointestinal absorption in humans and rats. Food and chemical toxicology. 39, Dix L., Stewart G.S., Stewart G.S. (2013) Short communication: Urea transporter protein UT-B in the bovine parotid gland. Journal of dairy science. 96, Dowd S.E., Callaway T.R., Wolcott R.D., Sun Y., McKeehan T., Hagevoort R.G., Edrington T.S. (2008) Evaluation of the bacterial diversity in the feces of cattle using 16S rdna bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing (btefap). BMC Microbiology. 8, artnr.: 125 Durso L.M., Harhay G.P., Smith T.P.L., Bono J.L., De Santis T.Z., Harhay D.M., Andersen G.L., Keen J.E., Laegreid W.W., Clawson M.L. (2010) Animal-to-animal variation in fecal microbial diversity among beef cattle. Applied and environmental microbiology. 76, Edrington T.S., Dowd S.E., Farrow R.F., Hagevoort G.R., Callaway T.R., Anderson R.C., Nisbet D.J. (2012) Development of colonic microflora as assessed by pyrosequencing in dairy calves fed waste milk. Journal of dairy science. 95, Emmanuel D.G.V., Shanthipoosan S., Ametaj B.N. (2007) High grain diets perturb rumen and plasma metabolites and induce inflammatory responses in early lactation dairy cows. Italian journal of animal science. 6,

25 Fernando S.C., Purvis H.T., Najar F.Z., Sukharnikov L.O., Krehbiel C.R., Nagaraja T.G., Roe B.A., Desilva U. (2010) Rumen microbial population dynamics during adaptation to a high-grain diet. Applied and environmental microbiology. 76, Finucane M.M., Sharpton T.J., Laurent T.J., Pollard K.S. (2014) A Taxonomic Signature of Obesity in the Microbiome? Getting to the Guts of the Matter. Plos One. 9, e84689 Flowers S.A., Ellingrod V.L. (2015) Microbiome in mental health: Potential contribution of gut microbiota in disease and pharmacotherapy management. Pharmacotherapy. 35, Forsythe P., Kunze W.A., Bienenstock J. (2012) On communication between gut microbes and the brain. Current opinion in gastroenterology. 28, Foster J.A., McVey Neufeld K. (2013) Gut-brain axis: how the microbiome influences anxiety and depression. Trends in neurosciences. 36, Furet J., Firmesse O., le Gourmelon M., Bridonneau C., Tap J., Mondot S., Doré J., Corthier G. (2009) Comparative assessment of human and farmanimal faecal microbiota using real-time quantitative PCR. Fems microbiology and ecology. 68, Gérard P. (2016) Gut microbiota and obesity. Cellular and Molecular Life Sciences 73, Harfoot C.G. (1978) Anatomy, physiology and microbiology of the ruminant digestive tract. Progress in lipid research. 17, 1-19 Inoue Y., Shimojo N. (2015) Microbiome/microbiota and allergies. Seminars in Immunopathology 37, James G. (2010) Universal bacterial identification by PCR and DNA sequencing of 16S rrna gene. In: PCR for clinical microbiology. Springer. p Jami E., Mizrahi I. (2012) Composition and similarity of bovine rumen microbiota across individual animals. PlosOne. 7, e33306 Kallus S.J., Brandt L.J. (2012) The intestinal microbiota and obesity. Journal of clinical gastroenterology. 46, Kim Y., Koh I., Rho M. (2014) Deciphering the human microbiome using next-generation sequencing data and bioinformatics approaches. Methods 79, Lane M.A., Jesse B.W. (1997) Effect of volatile fatty acid infusion on development of the rumen epithelium in neonatal sheep. Journal of dairy science. 80, Legatzki A., Rosler B., von Mutius E. (2014) Microbiome diversity and asthma and allergy risk. Current allergy and asthma reports. 14(10), 1-9 Malmuthuge N., Griebel P.J., Guan L.L. (2014) Taxonomic Identification of Commensal Bacteria Associated with the Mucosa and Digesta throughout the Gastrointestinal Tracts of Preweaned Calves. Applied and environmental microbiology. 80, Mangiola F., Ianiro G., Franceschi F., Fagiuoli S., Gasbarrini G., Gasbarrini A. (2016) Gut microbiota in autism and mood disorders. World Journal of Gastroenterology. 22, Mao S.Y., Zhang M.L., Liu J.H., Zhu W.Y. (2015) Characterising the bacterial microbiota across the gastrointestinal tracts of dairy cattle: membership and potential function. Scientific reports. 5, artnr.: Minato H., Otsuka M., Shirasaka S., Itabashi H., Mitsumori M. (1992) Colonization of microorganisms in the rumen of young calves. Journal of general and applied microbiology. 38,