Het gebruik van platelet-rich plasma in de plastische heelkunde

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar Het gebruik van platelet-rich plasma in de plastische heelkunde Casper SOMMELING Promotor: Prof. Dr. S. Monstrey Co-promotor: H. Hoeksema Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot MASTER IN DE GENEESKUNDE

2 De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. Datum Casper Sommeling Prof. Dr. S. Monstrey

3 Voorwoord Deze scriptie werd geschreven in het kader van mijn opleiding tot Master in de Geneeskunde en handelt over het gebruik van platelet-rich plasma in de plastische heelkunde. Graag wil ik Prof. Dr. S. Monstrey bedanken voor het aanbieden van dit scriptie-onderwerp. Ik heb mij gedurende de voorbije twee jaar met veel enthousiasme verdiept in dit intrigerende onderwerp en kon hierbij rekenen op zijn deskundige en inspirerende begeleiding waardoor het voltooien van deze scriptie een waar plezier was. Daarnaast gaat mijn dank ook uit naar Dhr. H. Hoeksema die mij de eerste maanden van mijn scriptie begeleid heeft bij het verzamelen van de basisinformatie over platelet-rich plasma.

4 Inhoudstabel Abstract Inleiding Doelstelling Definities Platelet-rich plasma Platelet gel Thrombocyten Fysiologie Thrombocyten en het wondgenezingsproces Algemene wondgenezing De inflammatoire fase Primaire hemostase Secundaire hemostase Inhibitie van de coagulatie en fibrinolyse De proliferatie fase De remodellering De functie van de thrombocyten Methodologie Resultaten Plaatjes concentratie in platelet-rich plasma Bereidingstechniek Algemene principes Variabiliteit in de productiemethodes Enkele systemen als voorbeeld Groeifactoren Algemeen Groeifactoren in de α granules Platelet-derived growth factor (PDGF) Transforming growth factor-beta (TGF-β) Epidermal growth factor (EGF) Transforming growth factor-alfa (TGF-α) Vascular endothelial growth factor (VEGF) Fibroblast growth factor (FGF) Dense granules Kwantificatie van de groeifactoren concentratie...34

5 3.4 Verwerking en aanbrengen van platelet-rich plasma Klinisch gebruik Wondzorg Chronische wonden Acute wonden Brandwonden Fat grafting Studies Rol van platelet-rich plasma Antimicrobieel effect Discussie Gunstige effecten van platelet-rich plasma Nadelige effecten van platelet-rich plasma De veiligheid van platelet-rich plasma Algemene opmerkingen Toekomstperspectief Conclusie Bibliografie Literatuur Figuren...65

6 Abstract Inleiding Platelet-rich plasma (PRP) is een autoloog product dat verkregen wordt door de centrifugatie van bloed en gekenmerkt wordt door een hoge concentratie thrombocyten. Plaatjes vervullen een belangrijke rol bij de hemostase, de stolling en de wondgenezing. Door het lokaal aanbrengen van PRP worden deze fysiologische mechanismen gestimuleerd en bevorderd. Het toegeschreven positieve effect op het wondgenezingsproces treedt op door de vrijstelling van groeifactoren en andere cytokines aanwezig in de plaatjes. Door het toevoegen van een activator aggregeren en degranuleren de bloedplaatjes en wordt hun inhoud vrijgesteld. Vanaf dit moment wordt gesproken over platelet gel (PG). De vrijgekomen cytokines binden aan receptoren op doelorganen en zullen aanleiding geven tot product specifieke processen. Platelet-derived growth factor, transforming growth factor-beta en vascular endothelial growth factor zijn de belangrijkste groeifactoren aanwezig in de thrombocyten. Deze producten hebben een noemenswaardige rol bij de genezing van zowel zachte als harde weefels. Platelet-rich plasma is al sinds lange tijd onderwerp van onderzoek binnen verschillende disciplines. Ondanks positieve resultaten in studies is het gebruik van PRP in de klinische praktijk nog lang niet ingeburgerd. Het doel van deze uiteenzetting is het gebruik van PRP in de plastische heelkunde nader te bekijken. Hiervoor zullen de verschillende effecten, productiemethoden, aanwezige groeifactoren en hun functie, voor- en nadelen en de verschillende indicaties van PRP worden besproken. Meer specifiek zal in gegaan worden op het gebruik van PRP bij brandwonden, fat grafting, chronische en acute wonden. Methodologie Voor deze literatuurstudie werd gebruik gemaakt van de zoekmachine PubMed om een eerste selectie van 61 artikels aan te leggen. In eerste instantie werd algemene informatie ingewonnen over het onderwerp. Vervolgens werden bijkomende artikels gezocht die: (a) de behandeling van brandwonden, chronisch en acute wonden met PRP en (b) het gebruik van PRP in combinatie met fat grafting, beschreven. Resultaten Het gebruik van PRP kent verschillende indicaties. In het kader van de plastische en reconstructieve heelkunde kan een mogelijk positief effect weerhouden worden voor de behandeling van chronische en acute wonden aan de hand van verschillende onderzoeken. Chronische wonden vertonen tekorten aan verscheidene groeifactoren en deze worden gecompenseerd door het aanbrengen van PRP. Er is 1

7 voornamelijk een positief profylactisch effect bij acute wonden. Er kan niet met zekerheid gezegd worden dat de behandeling van brandwonden met PRP een verbetering van de genezing geeft door een gebrek aan studies en random clinical trials. Het gecombineerd gebruik van fat grafts en PRP leidt tot een verbeterde overleving van de adipocyten. Deze toepassing is echter een recente ontwikkeling en het is nog te vroeg om hierover duidelijke uitspraken te formuleren. Daarnaast wordt ook dieper op PRP als een biologisch product ingegaan. Op dit moment wordt als richtlijn voor de thrombocyten concentratie in PRP plaatjes/µl voorgesteld. Dit betekent een drie tot vijfvoudige toename van de baseline waarden. Beneden deze waarde is nog geen duidelijk effect van PRP aangetoond op de wondheling en boven deze waarde werd nog geen verdere toename van het positief effect beschreven. Door de hoge concentratie van thrombocyten worden ook verhoogde hoeveelheden groeifactoren en andere cytokines teruggevonden. Verschillende systemen zijn beschikbaar om PRP met de overeengekomen concentratie te bereiden. Het is echter aangeraden toestellen te gebruiken die door de Food and Drug Administration (FDA) of Certification Europe organisatie werden goedgekeurd, zowel voor het gebruik in de praktijk als voor het gebruik van PRP in wetenschappelijk onderzoek. Bij het aanbrengen van PRP moet voldaan worden aan de richtlijnen die door de fabrikant worden meegegeven. Het antimicrobieel effect van PRP is voornamelijk gebasseerd op in vitro onderzoek en geeft een beschermend effect weer tegen de belangrijkste microorganismen die teruggevonden worden in chirurgische wonden. Conclusie Platelet-rich plasma bezit de capaciteit om een positief effect uit te oefenen op het behandelde weefsel en het gebruik ervan op regelmatige basis zal eventueel mogelijk zijn, als algemene methodes voor de bereiding geformuleerd kunnen worden en verder onderzoek naar de werkzaamheid van dit autoloog bloedproduct uitgevoerd wordt. 2

8 1 Inleiding Platelet-rich plasma (PRP) wordt in verschillende klinische disciplines gebruikt en wordt beschouwd als een product dat mogelijk een positief effect heeft op de genezing van zowel zachte als harde weefsels. Dit effect wordt toegeschreven aan het feit dat PRP een hoge concentratie aan thrombocyten bevat. Deze zijn een bron van groeifactoren en andere cytokines, die lokaal fysiologische processen op gang brengen en de genezing rechtstreeks en onrechtstreeks beïnvloeden. De thrombocyten zorgen daarnaast ook voor het tot stand komen van de primaire en secundaire hemostase. 1.1 Doelstelling Het doel van deze uiteenzetting is het gebruik van PRP in de plastische heelkunde nader te bekijken. Hiervoor worden de verschillende effecten, productiemethoden, aanwezige groeifactoren en hun functie, voor- en nadelen en de verschillende indicaties van PRP besproken. Meer specifiek zal ingegaan worden op het gebruik van PRP bij brandwonden, fat grafting, chronische en acute wonden. 1.2 Definities Platelet-rich plasma Platelet-rich plasma of plaatjesconcentraat kan gedefinieerd worden als het deel van plasma waarin de concentratie aan thrombocyten hoger is dan in normale, fysiologische omstandigheden (Marx, 2001a). Aangezien PRP een concentraat van bloedplaatjes is, zijn de hierin vervatte groeifactoren en cytokines ook in hoge concentraties aanwezig; ze zijn echter nog niet vrijgesteld uit de thrombocyten en kunnen dus nog geen effect uitoefenen. De belangrijkste groeifactoren zijn platelet-derived growth factor (PDGF-αα, -αβ, -ββ), transforming growth factor-beta (TGF-β 1, -β 2 en -β 3 ), vascular endothelial growth factor (VEGF) en epidermal growth factor (EGF) (Marx et al., 1998; Kevy and Jacobson, 2001). Doordat de plaatjes geconcentreerd zijn in een klein volume plasma, bevat PRP ook celadhesiemoleculen (fibrine, fibronectine (Fn) en vitronectine (Vn)), die een rol spelen bij de osteoconductie en functioneren als matrix voor bot, bindweefsel en epitheelmigratie (Marx, 2004). Daarnaast bevat PRP ook nog een grote hoeveelheid leukocyten, thrombine en plasmaproteïnes, waaronder het volledige systeem van stollingsfactoren (Bielecki et al., 2006; Epply et al., 2006). Platelet-rich plasma kan zowel van autologe als van homologe oorsprong zijn. Indien homoloog is het PRP afkomstig van bloed van één of meerdere verschillende humane donoren. Hierbij bestaat, hoe 3

9 klein ook, steeds de kans op de transmissie van het hepatitis C virus of het human immunodeficiency virus (HIV). Daarnaast bestaat ook de kans op het ontstaan van een immuunreactie tegen dit lichaamsvreemde product. Deze manier van werken wordt echter niet meer toegepast. De term autoloog word gebruikt indien het bloed afkomstig is van dezelfde persoon die de behandeling met PRP zal ondergaan. Dit autoloog PRP wordt gezien als het enige echte PRP (Marx, 2004) Platelet gel Platelet gel (PG) is een gelatineuse substantie die ontstaat nadat PRP in contact wordt gebracht met een activator, een combinatie van thrombine en CaCl 2 wordt hiervoor frequent gebruikt. De gevormde gel bevat een hoge concentratie aan thrombocyten en een mengeling van autologe cytokines (Anitua et al.,2004). Onmiddellijk na de vorming van de PG zullen de aanwezige thrombocyten de vooraf gesynthetiseerde groeifactoren vrijstellen en starten met de productie van bijkomende cytokines. Deze worden gedurende de resterende levensduur van de thrombocyt gesecreteerd. Bij de activatie wordt 95% van de groeifactoren binnen het eerste uur vrijgesteld (Pallua, 2009). De termen PRP en PG worden in de literatuur gebruikt om de effecten van het geactiveerde PRP en zijn vrijgestelde cytokines te omschrijven. 1.3 Thrombocyten Fysiologie In het menselijk lichaam maakt het bloedvolume, dat bij een volwassene 5 tot 6 liter bedraagt, ongeveer 7% uit van het totale lichaamsgewicht. Bloed is samengesteld uit verschillende componenten, die na centrifugatie van elkaar gescheiden kunnen worden op basis van hun verschil in soortelijk gewicht (Welsh, 2000). De bovenste laag bevat het bloedplasma (55%). Plasma is een heldere, lichtgele vloeistof die bestaat uit water, plasmaproteïnen (albumine, globulinen en fibrinogeen), elektrolyten (natrium, kalium, calcium, fosfaat, bicarbonaat en chloor), nutriënten (glucose, aminozuren, vetzuren, glycerol en vitaminen), hormonen en afvalstoffen (ureum, urinezuur, koolstofdioxide en bilirubine). De onderste laag bevat erythrocyten (45%). Tussen deze twee lagen in bevinden zich leukocyten en thrombocyten (<1%). De leukocyten maken deel uit van het immunologisch stelsel van het lichaam en zijn noodzakelijk voor het elimineren en neutraliseren van exo- en endogene pathogenen. 4

10 Thrombocyten of bloedplaatjes worden gevormd uit afbrokkelingen van het cytoplasma van megakaryocyten, een witte bloedceltype gelokaliseerd ter hoogte van het rode beenmerg. Uit één megakaryocyt kunnen ongeveer 4000 tot 8000 thrombocyten gevormd worden. Na de afsnoering komen de thrombocyten in de circulatie terecht, twee derde blijft circuleren in het bloed, één derde wordt opgenomen ter hoogte van de milt. De normaalwaarden voor het aantal plaatjes bedraagt 1.6 tot 3.5 x 10 5 thrombocyten/µl circulerend bloed. De in vivo levensduur bedraagt tussen de vijf en negen dagen, hierna worden ze uit de circulatie verwijderd door macrofagen of het reticuloendotheliaal systeem (Welsh, 2000; Conley, 2004). Plaatjes zijn kleine discoïde bloedlichaampjes met een diameter van ongeveer 1-3 µm, hebben geen kern en zijn bijgevolg niet in staat zich te vermenigvuldigen. Ze hebben een trilaminaire celmembraan met glycoproteïne receptoren. De aanwezige receptoren zijn onder andere nodig voor de binding van collageen, von Willebrand factor, epinefrine, adenosinedifosfaat (ADP), platelet-activating factor (PAF), thromboxaan en thrombine. De submembranaire regio bevat microfilamenten, bestaande uit actine en myosine, die morfologische veranderingen toelaten en het cytoskelet opbouwen. Het cytoplasma van thrombocyten bevat een open, canaliculair systeem. Dit zorgt voor een toename van het effectieve oppervlak waar opname van stimulerende agonisten en afgifte van secreten gebeurt (Welsh, 2000). In het cytoplasma zelf zijn organellen en andere structuren te vinden zoals mitochondriën, microtubuli, glycogeen, lysosomen en drie soorten granules (α, δ en λ), waarvan de α granules en dense (δ) granules de meest relevante zijn voor dit onderwerp. Per thrombocyt zijn er ongeveer 50 tot 80 α granules aanwezig, deze worden gevormd tijdens de maturatie van de megakaryocyt en hebben een diameter van 200 tot 500 nm. Deze granules bevatten meer dan 30 bioactieve cytokines waarvan verscheidene een belangrijke rol spelen bij het tot stand komen van de hemostase en wondgenezing. Deze producten zijn groeifactoren zoals PDGF (αα, ββ en αβ), TGF-β (β 1, β 2 en β 3 ), transforming growth factor-alfa (TGF-α), platelet factor 4 (PF-4), interleukine-1 (IL-1), platelet-derived angiogenesis factor, VEGF, EGF, platelet derived endothelial growth factor (PDEGF), epithelial cell growth factor (ECGF) en insulin-like growth factor (IGF), maar ook cytokines, antimicrobiële peptides, catecholamines, serotonine, ostocalcine, osteonectine, von Willebrand factor, proaccelerine, fibrinogeen (Fg), Vn, Fn en thrombospondine-1 (TSP-1) (Harrison and Cramer, 1993; Welsh, 2000; Bhanot and Alex, 2002; Weibrich et al., 2002c; Anitua et al., 2004; Marx, 2004). De lysosomen bevatten actieve hydrolasen, cathepsines D en E, elastase en andere degeneratieve enzymes (Rendu and Brohard-Bohn, 2001). De dense granules bevatten ADP, adenosinetrifosfaat (ATP), serotonine, calcium en histamine (Anitua et al., 2004). Al deze verschillende factoren afkomstig uit thrombocyten werken op een gereguleerde manier samen om tot inflammatie, celproliferatie, differentiatie en regeneratie te komen. 5

11 1.3.2 Thrombocyten en het wondgenezingsproces Algemene wondgenezing Oorspronkelijk werd aangenomen dat de functie van de thrombocyten beperkt was tot de vorming van een plaatjesplug in het begin van de hemostase. Dit blijkt echter niet hun enige rol te zijn; ze vervullen een vooraanstaande, als niet kritische, functie bij de primaire en secundaire hemostase en bij de initiatie van het wondgenezingsproces. De genezing van zachte en harde weefsels wordt gereguleerd door complexe intra- en extracellulaire interacties, die nog niet volledig verklaard zijn (Anderson, 2000; Bhanot and Alex, 2002; Anitua et al., 2004). Vanaf het moment dat weefselbeschadiging optreedt, wordt de wondheling geïnitieerd. Dit proces start met de activatie van thrombocyten en de vorming van een plaatjesplug en bloedklonter. Hierbij komen biologisch actieve cytokines vrij door degranulatie van de thrombocyten. Gedurende de eerste twee dagen heeft een inflammatoir proces plaats dat geïnitieerd wordt door de migratie van neutrofielen, en later van macrofagen, naar het letsel. Geactiveerde macrofagen zullen ook groeifactoren vrijstellen. Na de derde dag start de angiogenese en fibroplasiefase, gevolgd door de start van de collageensynthese tussen dag drie en dag vijf. Door dit proces ontstaat er een vroege stijging van de wound breaking strength, dit is een belangrijke parameter om de wondgenezing van chirurgische letsels te beoordelen. Hierna treedt epithelialisatie en remodellering op. Bij elk van deze processen spelen de groeifactoren en cytokines afkomstig uit de thrombocyten een belangrijke regulerende rol (Hunt, 1990; Robson, 1991). De graad en de kwaliteit van het wondgenezingsproces is afhankelijk van de patiënt, behandelingsvariabelen en het te herstellen weefsel. Dit proces kan onderverdeeld worden in drie opeenvolgende en overlappende fasen: (a) de inflammatoire of ontstekingsfase; (b) de proliferatieve of hyperplasiefase en (c) de remodellering, rijpings- of maturatiefase. (Pietrzak and Eppley, 2005; Monstrey, 2007) De inflammatoire fase Het wondgenezingsproces begint met de inflammatoire of ontstekingsfase. Bij het optreden van een letsel worden de omliggende bloedvaten beschadigd waardoor bloed vrijkomt en zich een hematoom vormt, dat de ontstane ruimte opvult; dit noemt men de primaire hemostase. In het hematoom bevinden zich geactiveerde thrombocyten en andere cellen, die verschillende groeifactoren en cytokines vrijstellen waardoor celmigratie, -proliferatie, -differentiatie en matrixsynthese op gang komt (Anderson, 2000; Buckwalter et al., 1996). Het tijdens de secundaire hemostase gevormde netwerk van fibrine dient als basis voor celmigratie en -proliferatie en als leverancier van nutriënten (Anderson, 2000). 6

12 Primaire hemostase De primaire hemostase is een uiterst gebalanceerd samenspel tussen thrombocyten, bloedvaten, stollingsfactoren en laag moleculair gewicht substanties (afbeelding 1). Het optreden van weefselschade gaat vrijwel altijd gepaard met een onderbreking van de bloedvatenstructuur en dus met een bloeding. De reactie van de plaatjes en de bloedvatwand is van doorslaggevend belang om zo snel mogelijk deze bloeding te stoppen. De vasculaire reactie houdt een kortdurende vasoconstrictie in ten gevolge van de contractie van gladde spiercellen in de bloedvatwand. Beschadiging van de Afbeelding 1 Het verloop van weefselbeschadiging tot de bloedvatwand zorgt voor contact vorming van een stabiele bloedklonter. van thrombocyten met subendotheliale microfibrillen, Fn en von Willebrand factor en de expressie van subendotheliaal collageen, aanwezig in de basale membraan van de capillairen (Conley, 2004). De thrombocyten gaan zich aan vrijgekomen Von Willebrand factor, collageen en Fn binden met behulp van respectievelijk de glycoproteïne Ib/IX receptor, de glycoproteïne IV en Ia receptor en de integrine receptor. Deze receptoren zorgen met andere woorden voor de verbinding tussen de bloedplaatjes en de bloedvatwand. Dit proces wordt plaatjesadhesie genoemd. Door de plaatjesadhesie ontstaat een outside-in signaal dat zorgt voor de activatie van de plaatjes en bijgevolg aanleiding geeft tot aggregatie. Onder aggregatie verstaan we het onderling aaneenklitten van verschillende thrombocyten. Fibrine verbindt de glycoproteïne IIb/IIIa receptoren van de naast elkaar gelegen thrombocyten en draagt zo bij tot het tot stand komen van de aggregatie; het fibrine wordt gevormd uit fibrinogeen en is het eindresultaat van de secundaire hemostase. De activatie wordt bevorderd doordat de thrombocyten van hun ronde vorm overgaan in een meer grillige vorm met pseudopodia (afbeelding 2). Samen met deze vormverandering gaan ook de α granules en dense granules hun inhoud, onder andere ADP, serotonine en calcium, vrijstellen. Dit gebeurt door fusie van de membraan van de granules Afbeelding 2 Plaatjesactivatie (Everts et al., 2006b). met thrombocytenmembraan de ter hoogte 7

13 van het canaliculair systeem, degranulatie genaamd. Activatie van de thrombocyten bestaat dus uit een vormverandering en degranulatie. Door de activatie vormen de plaatjes een uitstekend oppervlak voor de coagulatiereacties. Gesecreteerd serotonine veroorzaakt een vasoconstrictie waardoor de bloedflow naar het beschadigde gebied afneemt. De activatie en degranulatie van nabijgelegen thrombocyten wordt gestimuleerd door ADP. Ook thrombine en adrenaline worden vrijgesteld. Elk van deze stoffen werken op een auto- en/of para- en/of endocriene manier in op de bloedplaatjes. Fosfolipase A 2 wordt geactiveerd ter hoogte van de plaatjesmembraan en gaat de secretie van cytokines uit de thrombocyten bevorderen. Daarnaast gaat fosfolipase A 2 arachidonzuur, vrijgesteld door de fosfolipiden membraan, omzetten tot thromboxane A 2 (TXA2). Thromboxane A 2 veroorzaakt een conformationele wijziging ter hoogte van de glycoproteïne IIb/IIIa receptoren op de plaatjesmembraan waardoor de plaatjes covalent gebonden worden aan fibrine, dit is een inside-outsignaal. Naast TXA2 en ADP, waardoor de aggregatie autokatalytisch wordt, gaat ook thrombine plaatjesaggregatie en degranulatie veroorzaken (Offner, 2008). Door dit mechanisme, de primaire hemostase, ontstaat er een plaatjesplug, die het bloedverlies probeert in te perken. Indien het gaat over een kleine beschadiging zal dit mechanisme volstaan, gaat het over een groter letsel zal de vorming van een bloedklonter noodzakelijk zijn en wordt de secundaire hemostase geactiveerd. Beide systemen vloeien in elkaar over en treden op tijdens de inflammatoire fase van de wondgenezing Secundaire hemostase Het doel van de secundaire hemostase of stolling of coagulatie is de vorming van een bloedklonter. Deze klonter bestaat uit een fibrinenetwerk dat de eerder gevormde plaatjesplug stabiliseert en bevat geactiveerde plaatjesaggregaten en rode en witte bloedcellen. De secundaire hemostase werd in het verleden opgesplitst in een intrinsieke, extrinsieke en gemeenschappelijke weg. Deze benamingen zijn voornamelijk nog van belang bij het uitvoeren van stollingstesten. Afbeelding 3 Vereenvoudige weergave van Volgens de huidige inzichten wordt het de secundaire hemostase. stollingssysteem (afbeelding 3 en 4) geïnitieerd door de expressie van tissue factor (TF of factor III) ter hoogte van beschadigd endotheel. Naast zijn functie als initiator is TF ook een natuurlijke regulator van de angiogenese (Carmeliet et al., 8

14 1996). Factor VII hecht zich vast aan TF in aanwezigheid van het calcium ion (Ca 2+ ) en vormt zo het TF-fVIIa complex dat de omzetting van factor X naar factor Xa, de geactiveerde vorm, katalyseert. Ook fix wordt door het TF-fVIIa complex geactiveerd. Tijdens de stolling wordt ook de kinine cascade geactiveerd, waarbij kallikreïne wordt gevormd. Kallikreïne activeert fxii en verknipt high-molecular weight kininogeen (HK) in twee fragmenten, bradykinine en kininogeen. Bradykinine is een vasodilator en verhoogt de capillaire doorlaatbaarheid. Kininogeen bevordert de accumulatie van prekallikreïne en fxi op het plaatjesoppervlak. Het gevormde fxiia activeert op zijn beurt fxi tot fxia, dat dan fix activeert. Vervolgens zet fixa, samen met fviiia, fx om in fxa. Deze laatste activeert, in associatie met fva, o.a. aanwezig op het plaatjesoppervlak, en in aanwezigheid van Ca 2+, prothrombine tot thrombine (factor IIa). Thrombine katalyseert de omzetting van factoren V, VII, VIII, XIII naar hun geactiveerde vorm en fibrinogeen tot fibrine, op dit moment in de cascade nog oplosbaar. Het geproduceerde fibrine zorgt voor de onderlinge verbinding tussen de plaatjes aanwezig in de plaatjesplug. Door inwerking van fxiiia, geactiveerd door thrombine, wordt fibrine onoplosbaar gemaakt. Dit onoplosbaar maken en de conformationele wijzigingen die opgetreden zijn ter hoogte van de glycoproteïne IIb/IIIa receptoren zorgen ervoor dat de thrombocyten een solide plug vormen. Deze bloedklonter zal verder bloedverlies voorkomen en de basis vormen voor een goede wondgenezing. Twintig minuten tot één uur na de vorming van de bloedklonter, gaat de klonter retraheren door contractie van de actine-myosine vezels aanwezig in de bloedplaatjes (Welsh, 2000). Deze contractie draagt bij tot het verder afsluiten van het bloedvat. Dit proces wordt mede bevorderd door de vrijstelling van TXA2 en serotonine. Deze stoffen zorgen immers voor een lokale vasoconstrictie (Bhanot and Alex, 2002). In de praktijk zal voornamelijk activatie van fix door het TF-fVIIa complex de start van het stollingssysteem vormen. Vervolgens gaat fixa, samen met fviiia, Ca 2+ en de von Willebrand factor, fx omzetten tot fxa. Indien men bloed ex vivo wil gebruiken of beïnvloeden zal men rekening moeten houden met het feit dat bloed stolt, zodra het buiten de circulatie komt. Om dit tegen te gaan kan gebruik gemaakt worden van het gegeven dat Ca 2+ een essentiële cofactor is bij de plaatjesaggregatie en de secundaire hemostase (Anitua et al., 2004). Door Ca 2+ uit te schakelen kan het zijn functie als cofactor niet vervullen en zal het bloed niet kunnen stollen. Het citraat ion wordt hiervoor frequent toegevoegd aan de gebruikte anticoagulantia. Citraat bindt Ca 2+ en vormt zo een oplosbare, maar niet-ioniseerbare substantie. De twee voornaamste gebruikte citraatproducten zijn acid citrate dextrose (ACD) en citrate phosphate dextrose. Deze producten bevatten naast citraat ook nog andere stoffen die de cellulaire viabiliteit bevorderen en worden gebruikt bij de afname van bloed dat verwerkt zal worden tot PRP. 9

15 Afbeelding 4 De secundaire hemostase met activatoren (rood) en inhibitoren (zwart) Inhibitie van de coagulatie en fibrinolyse Gelijktijdig met de procoagulatiefase start ook de anticoagulatiefase. Gezond vasculair endotheel inhibeert de coagulatie met behulp van verscheidene factoren, zodanig dat enkel coagulatie optreedt op plaatsen waar dit nodig is. Thrombomoduline is een voorbeeld van een anticoagulerend product. Het wordt geactiveerd door vrijgekomen thrombine. Andere stoffen zijn weefsel plasminogeen activator (t-pa), prostaglandine I2 (prostacycline) en stikstofoxide (NO). De combinatie van thrombine-thrombomoduline-ca2+ activeert proteïne C en samen met proteïne S zorgt dit eiwit voor de degradatie van fva en fviiia. Het eindresultaat is een inhibitie van de verder vorming van thrombine, direct door inhibitie van fva en indirect door inhibitie van fviiia. Hierbij moet opgemerkt worden dat thrombine van een procoagulatie component evolueert naar een anticoagulatie component. Tenslotte wordt de fibrinolyse, gemedieerd door plasmine, opgestart (afbeelding 4). De omzetting van het precursor plasminogeen naar plasmine verloopt proteolytisch via weefsel plasminogeen activator (t-pa), waarna vervolgens de fibrineklonter wordt gelyseerd. De activiteit van t-pa op zijn beurt wordt gereguleerd door plasminogeen activator inhibitoren (PAI s) en α-2 antiplasmine. 10

16 Tijdens de inflammatoire fase treden naast de primaire en secundaire hemostase nog andere processen op, zoals de activatie van het complementsysteem, de kinine cascade en de arachidonzuurcascade, waardoor een groot aantal vaso-actieve en chemotactische mediatoren vrijkomen. Cytokines zoals leukotriënen, complementfactoren, fibrine afbraakproducten, prostaglandines, serotonine en histamine zijn hier voorbeelden van en veroorzaken een lokale vasodilatatie en een verhoogde permeabiliteit van de capillairen. Hierdoor ontstaan de typische kenmerken van een ontsteking (calor, rubor, dolor, tumor en functio laesa) (Monstrey, 2007). Door chemotaxis migreren verschillende soorten cellen naar de plaats van het trauma. Thrombocyten zullen de eerst aanwezige bloedelementen zijn. Hun functie in de hemostase, de eigenlijke inflammatie en bij de start van de wondgenezing, komt tot stand door de aanwezigheid van lysosomen, α en dense granules. Neutrofielen of granulocyten zijn de eerste inflammatoire cellen die ter hoogte van de wonde zullen verschijnen. Zij zorgen voor een vroegtijdige bescherming tegen infectie en voor debridement (Monstrey, 2007; Hantash, 2008). Deze cellen hebben een levensduur van uren tot dagen en vervullen geen essentiële rol bij de wondgenezing (Bhanot and Alex, 2002; Anderson, 2000; Marx, 2004; Buckwalter et al., 1996). Na de neutrofielen volgt er een influx van monocyten en T-lymfocyten (Buckwalter et al., 1996). Deze lymfocyten spelen een rol bij de cellulaire immuniteit, maar hun functie om tot een succesvolle wondgenezing te komen is niet volledig duidelijk (Szpaderska et al., 2003) De proliferatie fase Gedurende de proliferatie, hyper- of fibroplasie fase wordt granulatieweefsel aangemaakt. Dit granulatieweefsel heeft een roze, zacht granulair uitzicht. Het is transiënt, goed gevasculariseerd weefsel, arm aan zenuwen, maar rijk aan fibroblasten, capillairen en chronische inflammatoire cellen. Deze eigenschappen veroorzaken een rijk metabool milieu om een optimale wondgenezing mogelijk te maken (Anderson, 2000). Tijdens deze fase wordt het beschadigde en necrotische weefsel verwijderd en vervangen door viabel weefsel, specifiek voor de beschadigde plaats. De gemigreerde mesenchymale stamcellen (MSCs) functioneren als uncommitted cellijn en differentiëren tot het normale, lokaal aanwezige weefsel onder invloed van lokale factoren, zoals groeifactoren en cytokines, hormonen, nutriënten, ph, zuurstofspanning en de elektrische en mechanische omgeving (Buckwalter et al., 1996). Het dominante celtype tijdens deze fase is de macrofaag, gevormd uit geactiveerde monocyten. De macrofagen komen voor ter hoogte van het beschadigde weefsel na een drietal dagen en hebben een levensduur van dagen tot maanden. Deze macrofagen ondersteunen de neutrofielen bij het uitvoeren van hun functie en secreteren groeifactoren (TGF-α, TGF-β, PDGF, IL- 1, IL-6, TNF-α, EGF en FGF), die instaan voor de controle van het wondgenezingsproces (Buckwalter et al., 1996; Anderson, 2000; Marx, 2004; Barrientos et al., 2008). Thrombocyten secreteren Fn, één 11

17 van de belangrijkste bouwelement van de intercellulaire matrix, waarlangs fibroblasten kunnen migreren in het wondbed. De zo aangetrokken fibroblasten prolifereren onder invloed van groeifactoren afkomstig uit plaatjes en vormen de extracellulaire matrix (ECM) (Buckwalter et al., 1996). De endotheliale cellen van de omliggende bloedvaten zullen prolifereren en zorgen voor de angiogenese, een proces dat gestimuleerd wordt door de vrijstelling van VEGF uit thrombocyten en macrofagen die zich in een hypoxisch milieu bevinden (Bhanot and Alex, 2002; Buckwalter et al., 1996) De remodellering Tijdens de laatste fase, de rijpings- of maturatiefase of remodellering, optredend na drie weken, vindt zowel een synthese als een afbraak van collageen plaats. De absolute hoeveelheid collageen na drie weken blijft dezelfde, maar de wondsterkte neemt progressief toe. Het type collageen verandert van type 3 naar type 1, de hoeveelheid vocht en intercellulaire grondstof verminderen, de crosslinking neemt toe en de cellulaire densiteit en vascularisatie nemen af (Bhanot and Alex, 2002; Buckwalter et al., 1996; Monstrey, 2007). Het uiteindelijke doel van de remodelleringsfase is het aanpassen en reorganiseren van het nieuw gevormde weefsel om zo goed mogelijk het originele weefsel te evenaren. Een laatste proces is de wondcontractie. Een proces dat een jarenlang verloop kent (Bhanot and Alex, 2002; Buckwalter et al., 1996). Contractie houdt in dat de wondranden samentrekken en de wonde verkleint. Dit proces van wondcontractie treedt op dankzij myofibroblasten en mogelijk ook door collageen. Het in vivo proces is echter nog niet volledig opgehelderd De functie van de thrombocyten De circulerende thrombocyten spelen zowel in de primaire en secundaire hemostase, als in de eigenlijke wondgenezing een belangrijke rol. Dit komt ondermeer tot uiting bij patiënten met thrombocytopenie. Dit is een toestand waarbij er minder dan 1.6 x 10 5 plaatjes per µl aanwezig zijn en die klinisch gekenmerkt wordt door petechiën, ecchymosen, het lekken van bloed uit het vasculaire bed en persisterende bloedingen uit wonden (Conley, 2004). Eerst en vooral zijn thrombocyten van belang bij het stoppen van de Afbeelding 5 FVIIIa en fva op geactiveerde plaatjes. initiële bloeding door de vorming van een plaatjesplug. Deze plug vormt de basis voor de andere processen die optreden tijdens de secundaire hemostase en wondgenezing. Een eerste aanwijzing hiervoor is de aanwezigheid van factoren Va en VIIIa op het oppervlak van geactiveerde thrombocyten (afbeelding 5). Deze factoren zorgen, 12

18 respectievelijk, voor een activatie van fii tot fiia (thrombine) en van fx tot fxa. Factor VIIIa gaat in combinatie met fixa zorgen voor de activatie van fx tot fxa. Dit gevormde fxa zal in combinatie met fva zorgen voor de omzetting van fii tot fiia. Het uiteindelijke resultaat hiervan is een toename van de hoeveelheid thrombine gevormd per geactiveerd plaatje. Dit leidt tot de vorming van een stabiel fibrinenetwerk, zelf wanneer er geen optimale initiële plaatjesplug aanwezig is (Hoffman et al., 1998). Activatie van fx heeft tot doel een fibrineklonter, opgebouwd uit met elkaar verbonden thrombocyten, te vormen die verder bloedverlies zal voorkomen en de basis vormt voor een goede wondgenezing. Verder werd aangetoond dat sommige, door plaatjes gesecreteerde, cytokines niet aanwezig zijn bij personen met chronische, niet helende wonden (Welsh, 2000). De bloedplaatjes vervullen hun rol in de hemostase en wondgenezing door de aanwezigheid van verschillende biologisch actieve cytokines in hun granules. Door plaatjesactivatie wordt de inhoud van deze granules vrijgesteld. Groeifactoren worden op een actieve manier vrijgegeven binnen de 10 minuten na het begin van de klontervorming; hierbij zal meer dan 95% van de vooraf gesynthetiseerde groeifactoren binnen het uur gesecreteerd worden. Na deze initiële massale vrijstelling van aan thrombocyten gerelateerde groeifactoren, produceren en secreteren de plaatjes nog extra groeifactoren en cytokines en dit gedurende de rest van hun levensduur. De vrijgekomen groeifactoren zijn gedurende de volledige wondgenezing actief. Uit onderzoek is gebleken dat adulte MSCs, osteoblasten, fibroblasten, endotheliale cellen en epidermale cellen receptoren exprimeren waardoor ze gevoelig zijn voor de inwerking van deze groeifactoren (Marx et al., 1998). Na binding aan de tyrosine kinase receptoren treedt activatie op van een intracellulair signaaleiwit dat de expressie van een bepaalde gensequentie bepaalt, deze sequentie dirigeert onder andere cellulaire proliferatie, matrixformatie, osteoïdproductie en collageensynthese (Marx et al.,2004). Aanwezige macrofagen worden verantwoordelijk geacht voor de verdere regulering van de wondgenezing door de secretie van bijkomende cytokines. Deze macrofagen komen ter plaatse door de vasculaire ingroei die gestimuleerd wordt door de thrombocyten. De verschillende cytokines afgescheiden door de thrombocyten hebben een belangrijke rol bij de eigenlijke genezing. Zo heeft Anitua et al. (2004) aangetoond dat PDGF chemotactisch is voor macrofagen en dat PDGF, TGF-β en IGF chemotactisch en mitogeen zijn voor stamcellen en osteoblasten, de angiogenese stimuleren en zo aanleiding geven tot ingroei van capillairen en de vorming van de botmatrix en de collageensynthese stimuleren. De adhesieve proteïnes Fg, Fn, Vn en TSP-1 nemen deel aan de vorming van de thrombus en sommige hebben ook een mitogeen effect (Anitua et al., 2004). De functie van de andere vrijgestelde groeifactoren worden later besproken. Uit dit alles kan afgeleid worden dat thrombocyten in fysiologische omstandigheden een essentiële rol vervullen bij het tot stand komen van de hemostase, stolling en wondgenezing en dat het aantal plaatjes in de bloedklonter de wondgenezingsratio zal bepalen. 13

19 De rationale achter het gebruik van PRP en PG is dat hierbij de thrombocyten en de groeifactoren in hogere concentraties aanwezig zijn en op die manier de wondgenezing lokaal gestimuleerd wordt. Dit volgt uit het stimuleren door PRP van de verschillende mechanismen waarbij de plaatjes in tussen komen en door tekorten in bepaalde cytokines te corrigeren. Door de grote hoeveelheid plaatjes aanwezig wordt een toename van de wondgenezingsratio verwacht (Marx, 2004). Een duidelijke manier waarop PRP inwerkt op de wondgenezing kon nog niet worden aangetoond. Hom et al. (2005) stellen dat PG, door vorming van granulatieweefsel, de epithelialisatie stimuleert en de wondcontractie verbetert waardoor de sluiting van de wonde beter verloopt. Zo zou onder invloed van TGF-β 1 en PDGF fibroblasten omgevormd worden tot myofibroblasten en daarnaast ook contractie van deze cellen optreden (Clark et al., 1989; Broughton et al., 2006). Deze contractie kan ook verbeterd worden door calcium dat gedurende de omzetting van PRP tot PG toegevoegd wordt. Calcium op zich is een potentiële regulator in de wondgenezing door invloed uit te oefenen op de keratinocytenproliferatie en -differentiatie (Lansdown, 2002). 14

20 2 Methodologie Via H. Hoeksema werd een aantal artikels in verband met PRP verkregen ter kennismaking met het onderwerp van deze scriptie. Nadat deze artikels en informatiebrochures doorgenomen waren, werd contact opgenomen met de vertegenwoordigers van enkele firma s die een systeem aanbieden voor de bereiding van PRP. Aan de hand hiervan werd een vergelijking opgesteld. In september 2008 werd een eerste reeks artikels geselecteerd, door gebruik te maken van de zoekmachine PubMed. Bij de start van deze scriptie was het de bedoeling een experimenteel onderzoek uit te voeren naar het gebruik van PRP in combinatie met meshed skin grafts bij patiënten met brandwonden. Met de zoekterm platelet rich plasma stemden 4576 resultaten overeen. Door vervolgens op PubMed enkele Limits in te stellen, zodat enkel artikels in het Engels of het Nederlands, die bovendien mensen, en geen dieren, als onderzoekspopulatie hadden, geïncludeerd werden, werd mijn zoekresultaat vernauwd tot Aangezien verschillende namen voor het PRP bestaan werd ook gezocht met de zoekterm platelet rich plasma OR platelet concentrate OR platelet gel, hiermee stemden 5040 resultaten overeen en met Limits Hierbij werden veel artikels gevonden die geen verband hielden met plastische chirurgie, daarom werd verder gezocht met de zoekterm platelet rich plasma OR platelet concentrate OR platelet gel AND plastic surgery, zo werden 43 artikels gevonden en 23 wanneer gebruik gemaakt werd van Limits. Indien gebruik makend van de zoektermen platelet rich plasma OR platelet concentrate OR platelet gel AND plastic surgery AND burns werden slechts 3 resultaten bekomen. In maart 2009 werd besloten het wetenschappelijk onderzoek te herleiden tot een literatuurstudie. De algemene inhoud van de scriptie werd aangepast waarbij meer aandacht geschonken zou worden aan het eigenlijke product PRP en het gebruik van PRP binnen de plastische en reconstructieve heelkunde. Verder moest meer informatie opgezocht worden over de behandeling van brandwonden met PRP, maar ook over het gebruik van PRP bij de behandeling van chronische wonden en de combinatie van PRP en fat grafting. De zoektermen die hiervoor gebruikt werden waren platelet rich plasma OR platelet concentrate OR platelet gel AND plastic surgery AND fat grafting, hiermee werden 2 resultaten bekomen. Indien gebruik gemaakt werd van de term tissue engineering in plaats van fat grafting werden meer resultaten bekomen, namelijk 97, met Limits 48. Indien bij deze termen plastic surgery werd toegevoegd werden 5 en 2 resultaten bekomen, respectievelijk zonder en met de functie Limits ingeschakeld. Er werden reeds verschillende artikels gevonden die het gebruik van PRP bij de behandeling van chronische en acute wonden beschreven. Om eventueel extra artikels hieromtrent te vinden werden de zoektermen platelet rich plasma OR platelet concentrate OR platelet gel AND plastic surgery 15

21 AND "wounds" gebruikt. Dit gaf 13 resultaten, andermaal werd de functie Limits gebruikt waardoor slecht 5 resultaten behouden werden. Vervolgens werd de zoekterm plastic surgery achterwege gelaten, zonder Limits werden 57 resultaten gevonden, met 28. Na het bekomen van de verschillende zoekresultaten werden die artikels geselecteerd die qua titel en abstract het meest relevant leken te zijn voor deze scriptie. Vervolgens werd met behulp van het Web of Science, meer bepaald met behulp van de impactfactor en times cited, nagegaan welke de meest toonaangevende artikels waren. Hierdoor heb ik een verzameling van 61 artikels kunnen aanleggen die hetzij online, hetzij in de biomedische bibliotheek van de Gentse Universiteit beschikbaar waren. Elk artikel werd gelezen en kort samengevat, om vervolgens gerangschikt te worden per onderwerp. Van interessante stellingen of bevindingen werden de referenties systematisch nagegaan. Op die manier heeft mijn verzameling artikels zich uitgebreid. Resultaat is dat niet alle 61 oorspronkelijke artikels uiteindelijk geciteerd werden en dat anderzijds wel naar enkele artikels wordt gerefereerd die ik zelf niet in handen heb gehad. 16

22 3 Resultaten In deze scriptie over PRP en PG wordt een antwoord gezocht op de volgende vragen: (a) wat is de benodigde concentratie thrombocyten; (b) op welke manier wordt PRP geproduceerd; (c) welke cytokines komen vrij, wat is hun functie en heeft de omzetting van bloed tot PRP invloed op hun concentratie; (d) op welke manier wordt PRP aangebracht; (e) wat is het klinisch gebruik en (f) heeft PRP een antimicrobieel effect. 3.1 Plaatjes concentratie in platelet-rich plasma Vooraleer PRP bereid wordt, moet de concentratie thrombocyten, noodzakelijk om een significante verbetering van het eindresultaat te bekomen in vergelijking met de standaardbehandeling, gekend zijn. Er moet met andere woorden een minimaal therapeutisch niveau bepaald worden. Verscheidene studies zijn hier omtrent in de loop der jaren verschenen, maar een strikt te bereiken concentratie kon nog niet bepaald worden. Marx et al. (1998) gaven als eerste aan dat het gebruik van PRP in combinatie met autogene bot grafts een significante verbetering gaf van het continuïteitsherstel van mandibulaire defecten. Deze RCT includeerde 88 patiënten, onderverdeeld in twee groepen. De ene groep kreeg een reconstructie van de mandibula gebruik makend van PRP, bij de andere groep werd geen PRP gebruikt. Baseline tellingen gaven een mediaan waarde aan van plaatjes/µl (range tussen en ). Na het verwerkingsproces tot PRP bedroeg de mediaan plaatjes/µl (range tussen en ). Dit kwam overeen met een toename van 338%. Hiermee leverden Marx et al. (1998) dan ook als eerste een idee over het minimaal therapeutische niveau dat een drie- tot viervoudige stijging van de baseline waarden moet bedragen. De studie van Weibrich et al. (2002c) stelt dat de mogelijkheid bestaat dat er geen absoluut minimaal therapeutisch niveau gedefinieerd kan worden en dat afhankelijk van de individuele patiënt een andere concentratie plaatjes nodig is om vergelijkbare biologisch effecten te bekomen. Haynesworth et al. (2002) bestudeerden het in vitro effect van PRP op cellulaire mechanismen van volwassen humane MSCs (ahmscs). Zowel bij de heling van zachte als harde weefsel zijn deze ahmscs essentieel. Aangetoond werd dat de proliferatie en differentiatie van de ahmscs rechtstreeks gerelateerd is aan de concentratie van de thrombocyten en dat de vrijstelling van groeifactoren uit PRP de migratie en proliferatie van ahmscs op een dosisdependente manier stimuleren. Een significante cellulaire respons werd waargenomen wanneer de concentratie aan trombocyten vier tot vijf keer hoger was dan de baseline waarden. 17

23 Liu et al. (2002) toonden aan dat de proliferatie van fibroblasten en de productie van collageen type I bevorderd werden wanneer er een vier- tot vijfvoudige stijging was van de concentratie thrombocyten in het PRP en dat het antwoord grotendeels ph afhankelijk was. Het beste resultaat werd verkregen bij lagere ph-waarden. Een proefdierenexperiment van Weibrich et al. (2004) geeft aan dat de plaatjes concentratie, waarbij een positief effect van PRP optreedt, slecht een beperkte range heeft. Een gunstig biologisch effect wordt waargenomen indien de concentratie thrombocyten ongeveer /µL is. Bij lagere concentraties zou het effect suboptimaal zijn, bij hogere concentraties zou er een paradoxaal inhibitorisch effect optreden. Anitua et al. (2004) beschrijven dat als doel slechts een overmaat van thrombocyten/µl genomen moet worden. Hom et al. (2007) voerden een prospectieve, single-blind pilot study uit bij 8 gezonde vrijwilligers om het effect na te gaan van topisch aangebracht autoloog PRP bij de behandeling van geïnduceerde fullthickness huidletsels. De vrijwilligers dienden als hun eigen controle. Indien het aantal plaatjes in de PRP zes keer hoger was dan bij baseline waarden begon de epithelialisatie en granulatie drie dagen eerder dan bij de behandeling met een conventionele therapie. Na statistische analyse werd echter geen significantie aangetoond, dit is wellicht te wijten aan de te kleine testgroep. Het in vitro deel van deze studie toonde een significant verhoogde endotheliale celproliferatie aan bij het gebruik van PRP in vergelijking met de controle groep. Histologisch werd gevonden dat het grootste effect van PRP bereikt werd 14 dagen na applicatie. De normaalwaarde voor thrombocyten bedraagt tot plaatjes/µl. Op dit moment wordt plaatjes/µl voorgesteld als het minimaal therapeutische niveau, gebruik makend van een standaard zes ml aliquot (Marx, 2004). Dit betekent een drie- tot vijfvoudige toename van de baseline waarden. Platelet-rich plasma met een plaatjes concentratie lager dan deze waarde toonde geen verbetering van de wondheling aan en boven deze waarde werd nog geen verdere toename van het positief effect beschreven. Deze studies tonen aan dat het noodzakelijk is, gebruik te maken van toestellen die in staat zijn de plaatjes voldoende te concentreren. Apparaten die door de Food and Drug Administration (FDA) of de Certification Europe organisatie werden goedgekeurd zijn toestellen die accuraat de therapeutische concentratie van PRP bereiken en in staat zijn de plaatjes integriteit te bewaren en zo een therapeutisch niveau van groeifactoren vrij te stellen (Marx, 2004). 18

24 3.2 Bereidingstechniek Algemene principes Platelet-rich plasma wordt veelal bereidt om op een gegeven moment tijdens een chirurgische ingreep gebruikt te worden. Gedurende de ingreep worden constant de fysiologische eigenschappen van de thrombocyten aangesproken, dit gaat gepaard met activatie en een daling van hun aantal. Daarom wordt algemeen aangenomen dat het bloed voor het begin van de ingreep moet worden afgenomen (Man et al., 2001). Uit onderzoek is gebleken dat de concentratie thrombocyten in PRP hoger is, indien bloed gebruikt wordt afkomstig uit een perifere of een centrale vene dan wanneer arterieel bloed gebruikt wordt (Waters and Roberts, 2004). De hoeveelheid bloed die wordt afgenomen wordt enerzijds bepaald door het gebruikte systeem en anderzijds door de benodigde hoeveelheid. Deze benodigde hoeveelheid is op zijn beurt afhankelijk van de uitgevoerde ingreep. Voor de behandeling van een tendinitis zal minder PRP nodig zijn dan voor de behandeling van een uitgebreide brandwonde. Op dit moment wordt aangenomen dat het gevormde volume PRP 10% is van de hoeveelheid bloed die wordt afgenomen (Pietrzak and Eppley, 2005). De gehele procedure neemt 20 tot 30 minuten tijd in beslag en begint met een bloedafname. Het bloed wordt afgenomen in een ACD-A anticoagulans. Dit is nodig om te verhinderen dat de plaatjesactivatie en stollingscascade vroegtijdig in gang worden gezet, een fysiologisch proces dat optreedt bij extravasatie van bloed. De ACD-A citraatoplossing bindt Ca 2+ dat noodzakelijk is als cofactor in de verschillende stappen van de stollingscascade. In principe kan ook gebruik gemaakt worden van een EDTA buis voor de bloedafname, maar Marx (2001a) stelt dat het gebruik van ACD-A als anticoagulans de viabiliteit van de thrombocyten verhoogt. Het onstolbare bloed wordt vervolgens gecentrifugeerd. Door het verschil in soortelijk gewicht van de aanwezige componenten worden drie lagen gevormd (afbeelding 6). De onderste laag bevat de rode bloedcellen (soortelijk gewicht = 1.09), de middelste laag de thrombocyten en witte bloedcellen (PRP buffy coat, soortelijk gewicht = 1.06) en de bovenste laag het plaatjes arm plasma (PPP, soortelijk gewicht = 1.03) (Welsh, 2000). Gedurende deze procedure moet de integriteit van de thrombocyten zo goed mogelijk bewaard worden. Door vroegtijdige activatie, schade of door het gebruik van niet-viabele plaatjes kunnen de groeifactoren immers Afbeelding 6 De drie lagen niet meer omgezet worden in hun bioactieve vorm, waardoor het effect na centrifugatie van bloed. van de groeifactoren en cytokines ter hoogte van het toepassingsgebied sterk vermindert (Marx, 2004). Zowel het gebruik van ACD-A anticoagulans als lage G-krachten tijdens de centrifugatie spelen hierbij een belangrijke rol (Marx, 2001a). Het aantal plaatjes dat geactiveerd werd tijdens de centrifugatie kan gekwantificeerd worden door het meten van P-selectine, een glycoproteïne aanwezig aan de binnenzijde van de α granules dat de interactie tussen 19