Aantonen van Lipoxygenase-activiteit in Sojabonen

Transcriptie

1 Aantonen van Lipoxygenase-activiteit in Sojabonen Analyse van linolzuur-reactieproducten met TLV en UV-spectroscopie Soja-lipoxygenase Lipoxygenases zijn enzymen die moleculaire zuurstof (O 2 ) inbouwen in meervoudig onverzadigde vetzuren met een 1-cis, 4-cis, pentadiëen-systeem, zoals linolzuur Producten die hierbij gevormd worden zijn ondermeer linolzuur-hydroperoxyden en linolzuur-oxodieenzuren Soja-lipoxygenase heeft een molgewicht van en komt in de extreem hoge hoeveelheid van 1 gram per kilo sojabonen voor Functies als een regulerende rol bij groei en kieming, infecties en veroudering worden aan het enzym toegedacht De hieronder beschreven experimenten worden niet uitgevoerd met zuiver soja-lipoxygenase, maar met een ongezuiverd, ruw extract Stappen als centrifugeren, ammoniumsulfaatprecipitatie, dialyse, kolomchromatografie en fractie-selectie op basis van gemeten activiteit zijn overgeslagen Er wordt dus gewerkt met een smoothie waarin naast structuureiwitten, honderden andere enzymen voorkomen De volgende aspecten komen aan bod: biologie (kieming), biochemie, chromatografie (polariteit), zuur-base chemie (ph-keuze buffers) en UV-spectroscopie Ondanks het werken met een ruw extract kan wel degelijk de werking van het lipoxygenase worden aangetoond met dunne laagchromatografie en uv-spectroscopie De reactie van linolzuur met moleculaire zuurstof kan ook niet-enzymatisch verlopen; dit heet autoxidatie Dit proces duurt echter duizenden keren langer Verkleuring margarine na 1 week:

2 De reactievergelijking van de aerobe reactie: De UV-absorbtie bij het gevormde linolzuurhydroperoxide wordt veroorzaakt door vorming van een geconjugeerd system van twee naastgelegen dubbele banden naast de binding naar de zuurstof-atomen De reactie prodcten van de anaerobe reactie: oxodieenzuren en keo-verbindingen

3 Uitvoering Controle van de kiemkracht Leg de bonen een week in een petrischaal op vochtige watten en/of filtreerpapier Plaatsing tegen de wand in een bekerglas met nat filtreerpapier is ook mogelijk Zorg hierbij dat de bonen klem zitten en niet naar beneden kunnen zakken, bijvoorbeeld door er een kleiner bekerglas in te zetten Dek het buitenste bekerglas af met een kristalliseerschaal tegen uitdrogen Na een aantal dagen zijn de twee afzonderlijke zaadlobben te onderscheiden en vormt zich het begin van een wortel Zwellen en blenden van de bonen Neem 50 gram bonen en laat deze overnacht zwellen in een laag water Schenk het water de volgende dag af om losgeraakte schilletjes ed te verwijderen en plaats de bonen in een blender, samen met een nieuw volume van 100 ml water Maal de bonen gedurende een paar minuten tot een gladde massa en laat deze dan overnacht in een erlenmeijer afgedekt in de koelkast staan om te bezinken Wanneer je school wel de beschikking heeft over een (tafel-)centrifuge, centrifugeer dan op de hoogste snelheid, decanteer (schenk af) en laat deze vloeistof ook een nacht verder bezinken in de koelkast De volgende dag schenk je de bovenste 20 ml voorzichtig zonder te mengen over in een andere erlenmeijer Met deze hoeveelheid ga je verder

4 Aerobe incubatie van linolzuur met soja-extract De incubatie wordt uitgevoerd in 0,1M boraatbuffer bij ph 9,0 in een open erlenmeijer 3,09 g boorzuur H 3 BO 3 wordt opgelost in 500 ml demi-water en aan de ph meter op de gewenste ph gebracht met 3 M NaOH De hoeveelheid linolzuur wordt toegevoegd uit een voorraadoplossing van 100 mm, zodanig dat de eindconcentratie 100 M is Bij een incubatie-volume van 25 ml is dat 25 l Voeg dit volume voorzichtig toe met een eppendorf-pipet of idealiter met een glazen microspuit zoals die bij gaschromatografie gebruikt wordt De incubatie wordt uitgevoerd op een magneetroerder De reactie wordt gestart door toevoegen van 100 l van het sojaextract De reactietijd is ongeveer min Leerlingvraag: Waarom wordt geincubeerd bij ph 9? Deze ph is niet fysiologisch: De meeste enzymen en ook lipoxygenases hebben ph-optimum rond ph 7 Opwerken incubatiemengsel Het overgebleven linolzuur wordt samen met de reactieproducten geisoleerd door te extraheren over een reversed-phase silica-c18 kolommetje De kolommetjes zijn per stuk verkrijgbaar bij Wim Staal Het kolommetje wordt eerst schoongespoeld met 6 ml zuivere methanol Om te voorkomen dat de vetzuren bij opbrengen van het mengsel door de kolom heen lopen, wordt de kolom eerst gespoeld met 6 ml water Leerlingvraag: Waarom wordt kolom na reinigen met methanol, eerst voorgespoeld met demi-water, voordat monster wordt opgebracht? Vervolgens wordt het incubatiemengsel opgebracht Wanneer het doorlopen aan het eind te langzaam gaat, kan mbv een slang langzaam door te blazen wat druk op het kolommetje worden gezet Laat de kolom niet drooglopen Was de kolom met 1 ml demi-water en elueer daarna de vetzuur-metabolieten van de kolom af door 6 ml zuivere methanol op te brengen Vang dit eluaat apart in een schoon afsluitbaar buisje of flesje

5 Analyse reactieproducten met dunnelaag-chromatografie TLC TLC-plaatjes: Merck, art , 5 x 10 cm silica met F254 UV-indicator Loopmiddel: hexaan / ether / azijnzuur = 60 / 40 / 0,5 In plaats van hexaan kan ook petroleumether of een mengsel van alkanen gebruikt worden Ether kan om veiligheidsredenen vervangen worden door isopropanol Leerlingvraag: Waarom wordt azijnzuur aan het loopmiddel toegevoegd? Gebruik een smal en hoog passend bekerglas, vul dit van tevoren met een laagje van 0,5 cm loopmiddel en sluit dit af met een kristalliseerschaal of petrischaal Gebruik van een jampot kan ook Trek op het TLC-plaatje op 1 cm vanaf de onderkant een startlijn met potlood en stip ook 2 of 3 stippen aan waar monster opgebracht wordt Breng 25 tot 50 l van je incubatiemengsel op en 10 l van de linolzuuroplossing als referent Laat de loopvloeistof tot volledig bovenaan het plaatje lopen en droog het direct na uitnemen Voer de TLC vanwege de etherlucht bij voorkeur in de zuurkast uit Het TLC-plaatje wordt bekeken onder een UV-lamp bij 254 nm Omcirkel de waargenomen vlekken met potlood Verbindingen die geen UV-absorbtie vertonen zoals linolzuur zijn toch zichtbaar omdat de TLC-plaat een UV-indicator bevat De referent linolzuur [R] is de meest apolaire verbinding en loopt tot helemaal bovenaan Op ca 50% van het vloeistoffront zijn de oxidatieproducten van linolzuur te zien: de linolzuur-hydroperoxides Deze verbinding heeft ondermeer zuurstof-atomen ingebouwd, is polairder en hecht daardoor beter aan de polaire Silica van het TLC-plaatje en loopt minder hoog Leerlingvraag: Hoe kun je zien of de reactie goed is verlopen?

6 Anaerobe incubatie van linolzuur met soja-extract In water lost bij kamertemperatuur 240 M moleculaire zuurstof op Wanneer een incubatie wordt uitgevoerd in een afgesloten flesje zonder luchtbellen met een linolzuurconcentratie van 500 M, ipv 100 M, dan is na toevoegen van het soja-extract op een gegeven moment de zuurstof op Er treedt depletie op: een tekort aan zuurstof Lipoxygenases zijn op zo n moment in staat om een tweede soort reactie tot stand te brengen Er vindt een anaerobe reactie plaats Er ontstaan onder meer oxodieenzuren van linolzuur Oxodieenzuren hebben een absorbtiemaximum in het UV-spectrum bij 285 nm Reactiecondities: Volume 25 ml 0,1 M boraatbuffer ph 9,0 afgesloten flesje, zonder luchtbellen Luchtverzadigd = 240 M zuurstof Linolzuur 500 M Reactietijd 20 min Leerlingvraag: Hoe voorspel je dat de reactie gaat verlopen? Realiseer je dat bij de anaerobe reactie eerst linolzuur-hydroperoxiden ontstaan, totdat alle zuurstof is opgebruikt Het incubatiemengsel wordt op dezelfde manier met een C18-extractiekolommetje opgewerkt als bij de aerobe reactie TLC wordt op dezelfde wijze uitgevoerd Wanneer de TLC goed lukt is een licht verschil in Rfwaarde te zien tussen de linolzuur-hydroperoxiden, ontstaan bij de aerobe reactie en de oxodieenvetzuren van de anaerobere reactie R = referent linolzuur; L = aerobe incubatie; D = depletie-experiment; anaeroob

7 UV-spectroscopie UV-spectra worden opgenomen met kwarts-cuvetten (kwaliteit QS); glazen of kunstof cuvetten absorberen te veel UV-licht Beide cuvetten worden gevuld met zuivere methanol om een blanco spectrum op te nemen Vervolgens wordt aan de ca 2 ml methanol van de blanco-meting 0,5 ml van het monster toegevoegd met een glazen pasteurpipet en vervolgens gemengd In de spectra is duidelijk het verschil te zien tussen de twee reacties: de aerobe vertoont een maximum bij 234 nm; de anaerobe bij zowel 234 als bij 285 nm UV-spectrum aerobe incubatie linolzuur UV-spectrum anaerobe incubatie linolzuur

8 Leerlingvraag: Welke incubatie is niet uitgevoerd om aan te tonen dat werkelijk sprake is van lipoxygenase-activiteit? Tips: Laat leerlingen zelf de bonen kiemen en zwellen Laat leerlingen de buffers zelf maken Laat de TLC-loopvloeistof zelf maken Laat zelf de C18-kolom spoelen en equilibreren Benodigdheden Eppendorf-pipet 200 l Magneetroerder Blender TLC-plaatjes [bv Merck] Linolzuuroplossing 100 M verkrijgbaar via U-talent Sojabonen via zaadhandel (internet) UV-spectra opnemen bij Scheikunde-practicum UU; contact via U-talent Bronnen * Proefschrift J Verhagen Hoofstuk 1, Introduction * Plant Lipoxygenases GA Veldink, JFG Vliegenthart and J Boldingh Prog Chem Fats and other Lipids Vol 15, , 1977 * Lipoxygenases, JFG Vliegenthart and GA Veldink - Free Radicals in Biology, Vol V, 1982 * Proefschrift S Slappendel, Hoofdstuk 8, Large scale isolation * HW Gardner and D Weisleder, Lipids 8, 678, 1978 * GJ Garssen, JFG Vliegenthart and J Boldingh, Biochem J,122, 327, 1971 Fridolin van der Lecq, januari 2016

9

10 Aantonen van lipoxygenase in sojabonen Analyse van reactieproducten van linolzuur

11 Aantonen van lipoxygenase in sojabonen Analyse van reactieproducten van linolzuur Wat komt er voorbij: Biologie (kieming) Biochemie Chromatografie Zuur-base-chemie UV-Spectroscopie

12 Lipoxygenase Molgewicht: Voorkomen: 1 gram per kilo sojabonen Functie: regulerende rol bij groei en kieming, infecties, wondgenezing (plant), veroudering Werking: oxidatie van meervoudig onverzadigde vetzuren tot hydroperoxyde-vetzuren

13 Lipoxygenase uit sojabonen Lipoxygenases bouwen moleculaire zuurstof (O 2 ) in in het dubbel banden systeem van meervoudig onverzadigde vetzuren: bv linolzuur

14 Reactievergelijking aerobe reactie

15 Reactievergelijking aerobe reactie

16 Auto-oxidatie Inbouw van zuurstof (oxidatie) verloopt ook vanzelf: auto-oxidatie Enzymatische oxidatie, zoals door lipoxygenases, verloopt duizenden keren sneller

17 Opwerking vereenvoudigd Geen centrifugestappen Geen ammoniumsulfaatprecipitatie Geen dialyse en resuspenderen Geen kolomchromatografie Geen fracties doormeten op enzymactiviteit Voor 95% uitvoerbaar op eigen school

18 Sojabonen moeten nog kiemkracht hebben

19 Bereiden soja-extract: "Smoothie" Laat 50 gram bonen zwellen in 100 ml water Maal gezwollen bonen in blender Laat extract een nacht in koelkast bezinken Schenk bovenste helft af: schillen liggen onderin

20 Wat moet je je realiseren: Ruw preparaat Ongezuiverd Bevat honderden andere enzymen

21 Aerobe incubatie van linolzuur met soja-extract 0,1 M natriumboraat-buffer, ph 9,0 100 µm linolzuur luchtverzadigd = 240 µm zuurstof kamertemperatuur open erlenmeijer op roermotor reactietijd 20 min

22 vraag 1 Waarom wordt de incubatie uitgevoerd bij ph 9 en niet bij ph 7? Wat pleit hier tegen: geen fysiologische ph niet bij ph optimum van lipoxygenase Waarom wel?

23 Opwerken incubaties Isoleren reactieproducten C18-extractie kolom is apolair (reversed phase) kolom schoonmaken met methanol conditioneren met water incubatiemengsel opbrengen en door laten lopen Boraatbuffer en soja-mengsel lopen door Apolaire stoffen (linolzuur en producten) hechten Vetzuren eluëren met 6 ml methanol en apart opvangen

24 vraag 2 Waarom wordt kolom na schoonmaken met methanol voorgespoeld (geconditioneerd) met water?

25 Productanalyse met dunnelaagchromatografie - TLC Loopmiddel: hexaan : ether : azijnzuur = 60 : 40 : 0,5 TLC-plaat is onbehandelde silica: polaire verbindingen lopen langzaam; apolaire sneller Vervang ether desgewenst door isopropanol

26 vraag 3 Waarom wordt azijnzuur toegevoegd aan het TLC-loopmiddel?

27 Interpretatie TLC-plaatje aerobe reactie TLC-plaat bevat UV-indicator vlekken zijn aangestreept onder UV-lamp (254 nm) L = incubatie commercieel lipoxygenase R = referent: zuiver linolzuur S = incubatie soja-extract

28 vraag 4 Is de reactie volledig verlopen? L = incubatie commercieel lipoxygenase R = referent: zuiver linolzuur S = incubatie soja-extract

29 Anaerobe incubatie linolzuur met soja-extract 0,1 M natriumboraat-buffer, ph 9,0 500 µm linolzuur luchtverzadigd = 240 µm zuurstof kamertemperatuur gesloten flesje op roermotor reactietijd 20 min

30 vraag 5 Voorspel iets over het reactieverloop: wat gebeurt er? 0,1 M natriumboraat-buffer, ph 9,0 500 µm linolzuur luchtverzadigd = 240 µm zuurstof kamertemperatuur gesloten flesje op roermotor reactietijd 20 min

31 Interpretatie TLC-plaatje anaerobe reactie TLC-plaat bevat UV-indicator vlekken zijn aangestreept onder UV-lamp (254 nm) L = incubatie commercieel lipoxygenase R = referent: zuiver linolzuur S = incubatie soja-extract

32 UV-spectrum producten aerobe incubatie

33 UV-spectrum producten anaerobe incubatie

34 Producten anaerobe incubatie

35 Tips Laat leerlingen zelf bonen kiemen Laat leerlingen buffers zelf maken Laat loopvloeistof TLC zelf maken Laat leerlingen zelf C18-extractiekolom equilibreren

36 Materialen Linolzuuroplossing 100 µm verkrijgbaar bij U-talent Sojabonen via zaadhandel (internet) TLC-plaatjes Merck UV-specta opnemen bij Scheikunde-practicum UU Roermotor met vlo Eppendorfpipet 100 µl

37 Vraag 6 Welke incubatie is er vergeten om aan te tonen dat er werkelijk sprake is van lipoxygenase-activiteit?

38