Microscopische beeldvorming in biofysisch en biomedisch onderzoek M. Ameloot

Maat: px

Weergave met pagina beginnen:

Download "Microscopische beeldvorming in biofysisch en biomedisch onderzoek. 23.01.2012 M. Ameloot"

Annemie de Jong
8 jaren geleden
Aantal bezoeken:

1 Microscopische beeldvorming in biofysisch en biomedisch onderzoek M. Ameloot

2 Interactieve websites

3 De microscoop oculair objectief preparaat

4 De microscoop

5 De microscoop

6 Vergroting microscoop M tot M obj M oc M? tot

7 Licht is een elektromagnetische golf l l Elektrisch veld l golflengte c = lichtsnelheid (=lf)

8 Animatie: elektromagnetische golf

9 Situering golflengten elektromagnetische straling l 1 nm = 1 miljoenste deel van 1 mm

10 l Blauw licht l l Rood licht Afstand

11 Golfkarakter van het licht l?

13 Diffractie iffraction/index.html

14 Diffractie

15 Diffractie d sinq = l (1 e min)

16 Diffractie ronde opening d sinq = 1,22 l (1 e min) d = diameter opening q

17 Diffractiepatronen naburige punten ageformation/airydiskbasics/index.html

18 Diffractie: Rayleigh criterium

19 Criterium van Rayleigh

20 Resolutie d d 0,61 l Numerieke apertuur n sin E. Abbe 1873 d l 2

21 Resolutie en openingshoek P r e p a r a a t?

25 Diffractie: conclusies 1. Geometrische optica: punt punt. 2. Golfkarakter van licht:punt vlekje. 3. Opening van het objectief, breedte vlekje. 4. Breedte vlekje, afstand tussen 2 naburige punten om afzonderlijk te worden waargenomen. 5. Resolutie mede bepaald door golflengte invallend licht

26 Diffractielimiet d 0,61 n sin l Fundamentele beperking d l 2

27 Resolutie versus grootte-orde afmetingen d l 2 d nm 1 nm = 1 miljoenste deel van 1 mm Dikte hoofdhaar: 0,1 mm = nm Diameter RBC: 0,008 mm= 8000 nm HIV virus: 90 nm Dikte biologisch membraan: 5 nm

28 Optische microscopie versus elektronenmicroscopie 1. Elektronenbundel golflengte. 2. Snelheid elektronen golflengte 3. Diffractielimiet evenzeer geldig. 4. Resolutie 0,5 nm. 5. Dunne preparaten vereist. 6. Omgeving niet biologisch vriendelijk. d l 2

29 Celbiologische toepassing Detectie van specifieke structuren en moleculen in cellen, weefsels,?

30 Fluorescentie

31 FITC Fluorescein-5-isothiocyanaat

32 Fluorescentie-microscopie

34 Verschillende fluorescente labels

35 Celbiologische toepassing Detectie van specifieke structuren en moleculen in cellen, weefsels, Specifieke fluorescerende merkers

36 Confocale fluorescentiemicroscopie

37 Scanning galvanometers Point Scanning x y Laser out To Microscope Laser in

38 Scanning process X Y Sequentially illuminated sample Sequentially generated image

39 Vergelijking widefield en confocale microscopie confocalvswidefield/index.html

40 Optical slicing Y X Z

41 Optische secties 3D reconstructie

42 Mitochondria gemerkt met Mitotracker Green

43 MDCK cellen onder metabolische inhibitie A B C

44 Mitochondriale calcium concentratie Combinatie van twee fluorescente probes: 1 Mito Tracker Green (200 nm)

45 Calcium probe: Rhod2 2 Rhod2 (4 mm)

46 MTG masker voor selectie Rhod2 mito MTG beeld X = Binair MTG masker Rhod2 beeld Rhod2 mito

47 Kleinere afstanden via fluorescentie? Door gebruik te maken: - twee fluorescerende moleculen - Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 47

48 FRET principe Excitatie Stralingsloze koppeling!!! D A A k T Donor fluorescentie Acceptor fluorescentie E F D F DA F A 1 F F DA D Bij langere golflengte dan voor de donor 48

49 E 1 F F DA D 1 Å = 0.1 nm 49

50 Spectroscopische meetlat 50

51 E 1 F F DA D E R 6 0 R 6 0 R R ( R 0 ) 6 R o =30 Å R o =50 Å R o =70 Å 1 Å = 0.1 nm

52 Toepassingen FRET 52

53 Cyan FP & Yellow FP R 0 = 48 Å = 4,8 nm Nature Reviews / Molecular Cell Biology 53

54 Cyan FP & Yellow FP R 0 = 48 Å = 4,8 nm

55 FRET en membraanpotentiaal depolarizatie tot +60 mv Acceptor Donor Amelie Perron, Hiroki Mutoh, Walther Akemann, Sunita Ghimire Gautam, Dimitar Dimitrov, Yuka Iwamoto and Thomas Knöpfel 55

56 Diffractielimiet FRET: indirecte wijze voor afstanden kleiner dan de diffractielimiet Zijn directe waarnemingen van afstanden kleiner dan de diffractielimiet mogelijk?

57 Diffractielimiet Abbe: diffractielimiet nm

58 1-molecule detectie Dichtheid gelabelde moleculen voldoende klein! 20 nm

59 Beweging in membraan

60 Eiwitten in lipidendubbellaag

61 SMT = single molecule tracking Marguet EMBO 2006

62 SMT = single molecule tracking Schmidt PNAS 1996

63 SMT = single molecule tracking

64 SMT = single molecule tracking

65 Van microscopie naar nanoscopie: structuren met sub-micro resolutie? Hot topic! uperresolution/stochasticblinking/index.html sh/superresolution/storm/index.html

66 Glycinereceptor HA-GlyR α3k HA-GlyR α3l 2,5 µm 2,5 µm

67 Labelvrije metingen mogelijk? 1.Dikkere preparaten moeilijk aan te kleuren. 2.Beïnvloeding door fluorofoor? (stamcellen). 3.In situ? 4.Hogere penetratiediepte. 5.Optische coupes voor 3D reconstructie. 6.Gebruik in vivo (patiënten) 7.Hot topic!

68 SHG straling (tweede harmonische) Rayleigh scattering Hyper-Rayleigh scattering Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008

69 SHG straling: 2 moleculen Constructieve interferentie Destructieve interferentie Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008

70 SHG stralingspatroon Niet-coherente verstrooiing Vermogen ~ N Coherente verstrooiing Vermogen ~ N 2 Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008

71 Ultrasnelle lasers fs-gepulste lasers Laser scanning Beeldvorming in weefsel ( diepe indringing) Optische coupes

72 Sarcomeer

73 Sarcomeer

74 In vivo measurement of sarcomeres Z-disc mitochondria Myosin TPEF 10 mm 10 mm SHG 10 mm Llewellyn et al Nature August 7; 454(7205):

75 In vivo bepaling van sarcomeren 25 mm 1000 um 500 um 350 um 1 cm Micro-endoscoop 1 cm Llewellyn et al Nature August 7; 454(7205):

76 In vivo measurement of sarcomeres lateral gastrocnemius (mouse) Llewellyn et al Nature August 7; 454(7205):

77 Gestreepte spier (rat) Courtesy of Rik Paesen (UHasselt)

78 Gestreepte spier (rat) Courtesy of Rik Paesen (UHasselt)

79 Labelvrije micro-endoscopie 1. Vroegtijdige detectie van veranderingen in de extracellulaire matrix bij kwaadaardig gezwel: veranderingen in collageen veranderingen in SHG. 2. Veranderingen in metabolisme veranderingen in autofluorescentie.

80 Beeldvorming met SHG Striated muscle Starch Rat Tail Tendon Neurons Flax (Sanen & Paesen) Cellulose

81 Cell-matrix interacties (tissue engineering) Staal van Dennis Lambrechts, Prometheus, KUL hpdc & Col I hydrogel (label vrij) 10 mm

82 Erkenning Universiteit Hasselt Prof. Dr. M. Ameloot Dr. N. Smisdom Drs. K. Notelaers Drs. Ir. B. De Clercq Drs. Ir. R. Paesen Dra. K. Saenen Dra. M. Bacalum Prof. Dr. JM. Rigo Dr. Daniel Janssen Katholieke Universiteit Leuven Prof. Dr. J. Hofkens Dra. Susana Rocha Prof. Dr. M. Roeffaers Prof. Dr. H. Van Oosterwyck Drs. D. Lambrechts Prof. Dr. D. Devos Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin Prof. Dr. J.C. Meier

Vergelijkbare documenten

Lichtmicroscopie voorbij de diffractielimiet:

$Lichtmicroscopie voorbij de diffractielimiet:$ Lichtmicroscopie voorbij de diffractielimiet: op weg naar 100 nm resolutie Rob Hendriks, Philips Natuurkundig Laboratorium Prof. Holstlaan 4, 5656 AA Eindhoven Lichtmicroscopie is een oud vakgebied, waaraan