De invloed van menstrueel bloedverlies en leeftijd op de isotopische samenstelling van Fe, Cu en Zn in volbloed via MC-ICP-MS

Transcriptie

1 Vakgroep Analytische Chemie Onderzoeksgroep Atoom- en Massaspectrometrie De invloed van menstrueel bloedverlies en leeftijd op de isotopische samenstelling van Fe, Cu en Zn in volbloed via MC-ICP-MS Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master of Science in de Chemie door Olivier DELTOMBE Academiejaar Promotor: prof. dr. Frank Vanhaecke Copromotor: dr. Karen Van Hoecke Begeleidster: Lana Van Heghe

2

3 Vakgroep Analytische Chemie Onderzoeksgroep Atoom- en Massaspectrometrie De invloed van menstrueel bloedverlies en leeftijd op de isotopische samenstelling van Fe, Cu en Zn in volbloed via MC-ICP-MS Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master of Science in de Chemie door Olivier DELTOMBE Academiejaar Promotor: prof. dr. Frank Vanhaecke Copromotor: dr. Karen Van Hoecke Begeleidster: Lana Van Heghe

4

5 Dankwoord Na vijf jaar de opleiding Chemie aan de Universiteit Gent te volgen, worden de inspanningen beloond met deze masterscriptie als resultaat. Tijdens het laatste academiejaar heb ik met veel plezier mogen meewerken aan dit onderzoek en ik wil het dan ook met groot genoegen presenteren aan alle mensen die mij hebben gesteund, niet alleen tijdens dit thesisjaar maar ook tijdens de vijf jaren van studie. Dankzij hun steun was het mogelijk om de opleiding Chemie te kunnen afronden en om deze masterscriptie af te leveren. Daarom wil ik deze personen in het bijzonder danken. Allereerst wens ik mijn promotor, Prof. dr. Frank Vanhaecke te bedanken voor het wekken van mijn interesse in dit onderzoeksdomein. Zijn enthousiasme tijdens de gevorderde Massaspectrometrie & Isotopenanalyse les, samen met de vele linken die hij legde tussen het onderzoek en het dagelijks leven, zorgde ervoor dat ik koos om binnen zijn onderzoeksgroep mijn masterscriptie aan te vatten. Ik wil hem tevens bedanken voor de kennis die ik kon opdoen, want in de praktijk leer je nog steeds meer dan tijdens de theorielessen. Het was dan ook een eer om gebruik te mogen maken van de infrastructuur en de instrumenten van de onderzoeksgroep. Op de tweede plaats bedank ik graag mijn begeleidster, Lana Van Heghe, om me elke dag opnieuw bij te staan en steeds bereid te zijn om te antwoorden op mijn vele vragen. Ik dank haar ook graag om me te ondersteunen en me advies te geven bij het schrijven van deze masterscriptie. Ik wil ook een dankwoord uitbrengen aan mijn ouders, Patrik Deltombe en Lena Deroo. Zonder hun steun was deze academische ervaring niet mogelijk geweest. Ik bedank graag mijn vriendin, Debbie Lauwers, om er steeds te zijn voor me. Ook een dankjewel om advies te geven en de nodige uitleg te verschaffen inzake deze masterscriptie. Tenslotte gaat er nog een speciaal woord van dank naar mijn vrienden die me gesteund hebben tijdens de vijf jaar en tijdens deze masterscriptie. Zij zorgden steeds voor de nodige steun en uitleg, alsook voor het nodig leedvermaak. Olivier 4 juni 2013

6 Inhoudsopgave Dankwoord Inleiding De Isotopische Samenstelling van de Elementen Isotopenanalyse voor Biomedische Toepassingen Doel van de Studie Inductief Gekoppeld Plasma- Massaspectrometrie Monsterintroductie Pneumatische Verstuiving De Verstuiverkamer Inductief Gekoppeld Plasma De Interface De Massaspectrometer De Quadrupoolfilter De Sector-veld Massaspectrometer De Detector De Elektronenvermenigvuldiger De Faraday Cup Massaresolutie Voor- en Nadelen van ICP-MS De Gebruikte ICP-MS Toestellen Interferentie Spectrale Interferentie De Botsings/Reactiecel Niet-Spectrale Interferentie Massadiscriminatie en Correctie Space-Charge Effect Nozzle-Separation Effect Massadiscriminatie versus Massafractionatie Correctiemethoden Externe Standaardisatie i

7 4.4.2 Interne Standaardisatie Vergelijking van de Verschillende Methodes Monstername en -voorbereiding Bloedafname Het Clean Lab Digestie van het Bloed Ionenuitwisselingschromatografie Het Elutieprofiel Metingen Elementbepaling met de Thermo Scientific XSeries II Elementbepaling met de Thermo Scientific Element XR Isotopenanalyse met de Thermo Scientific Neptune Resultaten Isotopenanalyse Populatie Het Hormoonspiraaltje De Menopauze Statistische Methoden Fe-isotopenanalyse Onderscheidbaarheid van de Verschillende Groepen Correlatie met de Leeftijd? Cu-isotopenanalyse Onderscheidbaarheid van de Verschillende Groepen Correlatie met de Leeftijd? Zn-isotopenanalyse Onderscheidbaarheid van de Verschillende Groepen Correlatie met de Leeftijd? Overzicht Resultaten Isotopenanalyse Vergelijkende Isotopenstudie Besluit Referenties Bijlagen Bijlage 1: Informatiebrief voor de Deelnemers aan Experimenten Bijlage 2: Vragenlijst Invloed van menstruatie en leeftijd op de isotopische samenstelling van ijzer in bloed bij gezonde vrouwen Bijlage 3: Goedkeuring Commissie voor Medische Ethiek Bijlage 4: Reinigingsprocedure van Savillex bekers in het Clean Lab van de A&MS groep van de UGent 71 Bijlage 5: Overzicht van de Monsters en hun Deltawaarden Bijlage 6: δ 56 Fe versus δ 57 Fe met Onzekerheid ii

8 Bijlage 7: δ 65 Cu met Onzekerheid Bijlage 8: δ 66 Zn versus δ 67 Zn met Onzekerheid Samenvatting iii

9 1 Inleiding 1.1 De Isotopische Samenstelling van de Elementen Isotopen zijn nucliden van hetzelfde element die een verschillend aantal neutronen in de kern bezitten, resulterend in een verschillend massagetal. In een eerste benadering is de isotopische samenstelling van de elementen een constante in de natuur, wat wordt verklaard door de grondige menging van de elementen tijdens de vorming van ons zonnestelsel. Toepassingen zoals isotopendilutie en tracerexperimenten baseren zich hier op. [1],[2] Deze constante abundantie is echter niet helemaal correct. Zo ontstaan er kleine variaties in de isotopische samenstelling door: (i) het verval van natuurlijk voorkomende, - lang-levende radionucliden (bv. ); (ii) natuurlijke isotopenfractionatie, gebaseerd op het relatief verschil in massa tussen de verschillende isotopen van hetzelfde element. Hoe lichter een element, des te groter het relatief verschil in massa tussen de isotopen (100% voor 1 H ten opzichte van 2 H). Door dit massaverschil vertonen deze isotopen een licht verschillend fysisch en chemisch gedrag. Een eenvoudig voorbeeld is het fysisch proces waarbij water overgaat van de vloeibare fase naar de gasfase: het overwinnen van intermoleculaire krachten tussen de watermoleculen vergt minder energie bij deze met een lichtere isotopische samenstelling dan bij deze met een zwaardere isotopische samenstelling. Afhankelijk of er zich een chemisch evenwicht kan instellen, wordt er een onderscheid tussen kinetische en thermodynamische isotopenfractionatie gemaakt. In het geval van bijvoorbeeld enzymatische reacties is de reactie unidirectioneel en kan er bijgevolg geen chemisch evenwicht bereikt worden. Men spreekt dan van kinetische isotopenfractionatie. Omdat de mate van isotopenfractionatie afhangt van het massaverschil tussen de isotopen wordt dit ook massa-afhankelijke isotopenfractionatie genoemd. Ook massa-onafhankelijke isotopenfractionatie werd aangetoond voor een aantal elementen (S, 1

10 Mo, Ru, Sn en Hg) en een verklaring hiervoor is onder andere het verschil in kernspin tussen de isotopen. (iii) De interactie van kosmische straling met materie en (iv) menselijke activiteiten kunnen tevens een bron van variatie in de natuurlijke abundanties van isotopen zijn. [1],[2] Deze kleine variaties in de isotopische samenstelling van een bepaald element zijn dankzij de precisie van multi-collector inductief gekoppeld plasma-massaspectrometrie (zie 2.8) te bestuderen. [1],[2] 1.2 Isotopenanalyse voor Biomedische Toepassingen Stabiele metaalisotopen worden al langer bestudeerd in de geochemie om de geschiedenis van de Aarde en het zonnestelsel te ontrafelen [3],[4],[5] of in de archeologie om onder meer de herkomst van gevonden metalen voorwerpen te bepalen. [6] De laatste jaren wordt de isotopische samenstelling van deze metalen ook in levende organismen bepaald voor onder andere (i) milieutoepassingen (metaal als spoorelement aanwezig in het organisme kan de herkomst van bijvoorbeeld vervuiling bepalen) en (ii) biomedische toepassingen (met diagnose en behandeling als uiteindelijk doel). [7] De verschillende reacties die in het lichaam optreden kunnen leiden tot isotopenfractionatie. Wanneer een persoon een afwijkend metabolisme heeft en er dus andere reacties optreden in het lichaam kan dit in essentie leiden tot een andere isotopische samenstelling voor een bepaald element. Isotopenanalyse van metabolische relevante spoorelementen zou bijgevolg kunnen leiden tot nieuwe methodes om ziektes op een minder invasieve manier én in een vroeger stadium te detecteren. Eerder onderzoek heeft reeds aangetoond dat het bloed van hemochromatose patiënten een afwijkende isotopische samenstelling van Fe vertoont ten opzichte van het bloed van gezonde personen (verhoogde 56 Fe/ 54 Fe verhouding). Hemochromatose is een erfelijke genetische aandoening, gekenmerkt door een niet-gereguleerde, te hoge ijzerabsorptie ter hoogte van de dunne darm. Het menselijk lichaam heeft geen metabolische weg om deze overmaat aan Fe uit te scheiden waardoor dit overmatig Fe opgeslagen wordt in weefsels (zoals de lever), wat op termijn leidt tot orgaanschade. Vandaag de dag wordt de ziekte vastgesteld via eenvoudige 2

11 biochemische parameters (serum ijzergehalte, transferrine saturatie, serum ferritinegehalte) en dit pas op een later stadium waarbij er al een hoge ijzeropstapeling is. Bovendien hangen de referentiewaarden van deze parameters af van de leeftijd, wat een negatief effect heeft op hun betrouwbaarheid. Eigenlijk kan deze ziekte enkel met zekerheid worden vastgesteld via een leverbiopsie of het opsporen van de mutatie via DNA-analyse. Leverbiopsie is echter invasief en gaat gepaard met enkele risico s. DNA-analyse geeft uiteindelijk ook alleen een indicatie voor de aanleg van een persoon om de ziekte te ontwikkelen. Er zijn namelijk personen met hemochromatose die geen mutaties in hun DNA hebben, net zoals er personen zijn met mutaties die geen hemochromatose ontwikkelen. [8],[9],[10] Voor men kan overgaan naar diagnostiek via isotopenanalyse van volbloed is het belangrijk een zo volledig mogelijk beeld te krijgen van de mogelijke variaties in isotopische samenstelling van belangrijke transitiemetalen in menselijk volbloed van gezonde individuen. Hiertoe dient de invloed van verschillende parameters (geslacht, dieet, menstruatie, leeftijd, ) binnen de gezonde populatie (referentiepopulatie) geëvalueerd te worden. In dit werk worden de ijzer- ( 54 Fe, 56 Fe, 57 Fe en 58 Fe), koper- ( 63 Cu en 65 Cu) en zinkisotopen ( 64 Zn, 66 Zn, 67 Zn en 68 Zn) bestudeerd daar de betreffende elementen een belangrijke katalytische, structurele en regulerende rol vervullen in het menselijk metabolisme. [11],[12] Voorgaand onderzoek heeft reeds aangetoond dat de isotopische samenstelling van Fe in menselijk volbloed significant verschilt tussen mannen en vrouwen: het bloed van mannen is aangerijkt in de lichtere ijzerisotopen ten opzichte van het bloed van vrouwen. [11],[13] De isotopische samenstelling van Zn in menselijk volbloed verschilt significant tussen omnivoren en vegetariërs: het bloed van omnivoren is aangerijkt in de lichtere zinkisotopen. Er werd geen significant verschil gevonden voor zink tussen mannelijke en vrouwelijke vegetariërs of omnivoren. [11] Voor koper werd recent aangetoond dat er een significant verschil is tussen mannen en vrouwen, alsook dat er geen significant verschil is tussen vegetariërs en omnivoren. [14],[15] 3

12 1.3 Doel van de Studie Deze studie heeft als doel om te evalueren of de leeftijd en/of menstruatie een invloed hebben/heeft op de isotopische samenstelling van Fe, Cu en Zn in volbloed bij gezonde vrouwen. Hiervoor worden bloedstalen van gezonde vrouwen in de menopauze en van jongere vrouwen die een specifiek voorbehoedsmiddel (dat de menstruatie voorkomt) gebruiken, vergeleken met die van jonge menstruerende vrouwen tussen de 20 en 25 jaar. De deelname van elke gezonde vrouw gebeurde op volledige vrijwillige basis. De bloeddonoren werden geïnformeerd via een Informed Consent (Bijlage 1) en een vragenlijst (Bijlage 2) werd ingevuld. Deze studie werd goedgekeurd door een onafhankelijke commissie voor medische ethiek verbonden aan het UZ Gent (Bijlage 3). Ze werd uitgevoerd volgens de richtlijnen voor goede klinische praktijken en de verklaring van Helsinki, ter bescherming van de vrijwilligers die deelnemen aan experimenten. De bloedafname (zie 5.1) werd uitgevoerd door Prof. dr. H. Depypere van het Universitair Ziekenhuis in Gent. De volledige monstervoorbereiding (Hoofdstuk 5) vond plaats in een clean lab klasse 10 en isotopenanalyse werd uitgevoerd door middel van multi-collector ICPmassaspectrometrie (zie 2.8) in de Atoom- en Massaspectrometrie onderzoeksgroep (A&MS) van Prof. dr. F. Vanhaecke. 4

13 2 Inductief Gekoppeld Plasma- Massaspectrometrie Inductief gekoppeld plasma-massaspectrometrie (ICP-MS) is een krachtige analytische techniek die sinds 1983 commercieel beschikbaar is. Aangezien het ICP resulteert in een goede ionisatie-efficiëntie voor de meeste elementen en vooral enkelvoudig geladen ionen levert, is het een uitstekende ionenbron voor element -en isotopenanalyse. Door dit ICP te koppelen aan een massaspectrometer ontstaat een krachtige en gevoelige multi-element analysetechniek: de voordelen van eenvoudige monsterintroductie in het ICP en de eenvoudig te interpreteren massaspectra worden gecombineerd. [1],[16],[17],[18],[19] Hoewel er verscheidene merken op de markt beschikbaar zijn (Agilent, Perkin Elmer, Thermo Scientific, ), bezit elk ICP-MS instrument dezelfde drie essentiële onderdelen: (i) de ionenbron, waarin de ionen worden geproduceerd; (ii) de massaspectrometer, waar de ionen met verschillende verhouding van massa tot lading van elkaar gescheiden worden en (iii) de detector (Figuur 2.1). Daarnaast is er een monsterintroductiesysteem aanwezig dat het monster naar de ionenbron transporteert. Door de massaspectrometer en het detectiesysteem onder een hoog vacuüm ( mbar) te plaatsen wordt de geproduceerde ionenbundel zo weinig mogelijk verstoord (botsing met luchtmoleculen worden vermeden). Figuur 2.1 Schematische voorstelling van de drie essentiële onderdelen waaruit een MS toestel is opgebouwd. [1],[18] 5

14 Maar aangezien het plasma opereert bij een atmosferische druk, vormt de interface een noodzakelijk onderdeel om de overgang van atmosferische druk naar een hoog vacuüm mogelijk te maken. Na de interface bevindt zich het lenzensysteem, dat de gevormde ionen introduceert in de massaspectrometer (MS). Figuur 2.2 toont alle fundamentele onderdelen van een ICP-MS toestel. Deze zullen verder besproken worden in de volgende paragrafen. Sommige onderdelen kunnen verschillen van deze in de figuur. Zo kan het type verstuiverkamer wijzigen (zie 2.1.2), de aanwezige massaspectrometer kan naast een quadrupool ook bijvoorbeeld een sector-veld massaspectrometer (2.4.2) zijn en als detector kan tevens een Faraday cup gebruikt worden (2.5.2). Detector Quadrupool Lenzensysteem Interface Toorts Inductiespoel Computer vacuümpompen Verstuiver + verstuiverkamer Peristaltische pomp Monsteroplossing Figuur 2.2 Vereenvoudigde voorstelling van een quadrupool-gebaseerd ICP-MS toestel. Alle fundamentele onderdelen worden weergegeven. [1],[18],[19] 6

15 2.1 Monsterintroductie ICP-MS wordt voornamelijk ook tijdens deze studie gebruikt voor de analyse van waterige oplossingen. Een pneumatische verstuiver (vervaardigd uit glas, kwarts of een waterstoffluoride-bestendig polymeer), in combinatie met een verstuiverkamer, zorgt voor efficiënte introductie van een representatief deel van het monster in het ICP (zie Figuur 2.2). Voor de directe studie van een vast materiaal wordt het monster bv. via laser ablatie (laser ablation, LA) omgezet in een droog aërosol en vervolgens in het ICP geïntroduceerd. [20],[21] Pneumatische Verstuiving Bij pneumatische verstuivers wordt de monsteroplossing omgezet tot een primair aerosol als gevolg van de interactie tussen een versnelde gasstroom (argon) en een vloeistof (oplossing). Twee types worden tijdens deze studie gebruikt (zie 2.8), namelijk de concentrische en de microconcentrische verstuiver. Bij een concentrische verstuiver (ca. 1 ml/min) wordt het monster via een capillair volledig omgeven door een ander capillair dat het gas (argon) bevat tot aan het uiteinde van de verstuiver gebracht. Zoals de naam al doet vermoeden, is deze gasstroom parallel aan het capillair (Figuur 2.3 a). Een vernauwing op het einde van de concentrische verstuiver versnelt de argongasstroom zodat er hier ten gevolge van het Venturi-effect een onderdruk ontstaat, wat zorgt voor een spontane aanzuiging van de monsteroplossing (Figuur 2.3). Ondanks de spontane aanzuiging, wordt er meestal toch gebruik gemaakt van een peristaltische pomp, waardoor de gebruiker het monsterdebiet naar eigen keuze kan instellen en de aanvoersnelheid niet afhankelijk is van de viscositeit van de oplossing (monster, standaard of blanco). [1],[19],[21] Een microconcentrische verstuiver (ca. 10 tot enkele honderd µl/min) is een miniatuurversie van de concentrische verstuiver die aangewend wordt als een laag monsterverbruik noodzakelijk is. Dit kan belangrijk zijn in toepassingen waarbij maar een kleine hoeveelheid monster beschikbaar is. Bovendien wordt de monster introductieefficiëntie verhoogd, daar de druppelgroottedistributie beter is. Dit resulteert in een signaalintensiteit die toch voldoende hoog ligt. [1],[18],[19],[21] 7

16 2.1.2 De Verstuiverkamer Het primair aerosol wordt verder naar de verstuiverkamer geleid, die ervoor zorgt dat enkel de kleinste druppeltjes het plasma bereiken zodat een snelle desolvatatie, atomisatie en ionisatie mogelijk is. [1],[19],[21] Het werkingsprincipe van de double-pass verstuiverkamer (Scott-type) (Figuur 2.3 a) is vrij eenvoudig. Bij de doorgang van de aerosoldruppeltjes botsen de grotere, zwaardere druppels tegen de wand ten gevolge van hun traagheid en worden door de zwaartekracht geleid naar een afvalcontainer. De voldoende kleine druppels (< 10 µm) kunnen de bocht in de verstuiverkamer wel volgen en worden naar het ICP getransporteerd. [18],[19] De cyclonische verstuiverkamer (Figuur 2.3 b) werkt op basis van een centrifugale kracht uitgeoefend door de argonstroom: de kleinere druppels gaan mee met de gasstroom richting het plasma, terwijl de grotere druppels tegen de wand botsen, naar beneden vallen en via een buisje naar de afvalcontainer geleid worden. [18],[19] Een derde type is de impact bead verstuiverkamer (Figuur 2.3 c), waarin zich een klein intern volume (ca. 1 cm in diameter) bevindt waartegen de gesolvateerde monsterdeeltjes botsen. De voordelen van dit volume zijn de snelle uitwas en de gereduceerde geheugeneffecten. [18],[19],[22],[23] Richting ICP Richting ICP Concentrische verstuiver Double pass verstuiverkamer (Scott-type) Monster+ matrix (b) Verstuivergas (Ar) (a) Afval Monster+ matrix Afval Monster+ matrix (c) Richting ICP Afval Figuur 2.3 Voorstelling van een concentrische verstuiver in combinatie met een double pass verstuiverkamer (Scott-type) (a), een cyclonische verstuiverkamer (b) en een impact bead verstuiverkamer (c). [18],[21],[22],[24] 8

17 2.2 Inductief Gekoppeld Plasma Zoals hoger vermeld, opereert het inductief gekoppeld plasma (inductively coupled plasma, ICP) als ionenbron bij atmosferische druk. Een plasma is per definitie een gasmengsel van atomen, ionen, elektronen en neutrale componenten bij een hoge temperatuur. Door de samenstelling van het plasma is deze elektrisch geleidend waardoor er energie kan toegevoegd worden via inductie, vandaar de naam inductief gekoppeld plasma. [1],[18],[19],[25] Het ICP wordt gegenereerd aan het uiteinde van een toorts (Figuur 2.4), meestal vervaardigd uit kwarts en bestaande uit drie concentrische buizen waardoor telkens argongas stroomt aan verschillende debieten (Figuur 2.5). Door de buitenste buis stroomt het zgn. plasmagas of koelgas (12-17 L/min), dat een dubbele functie heeft: (i) het plasma onderhouden en (ii) een thermische afscherming bieden tussen het plasma en de kwartsbuis, die verhindert dat de toorts smelt. Door de middelste buis stroomt het zgn. hulpgas (ca. 1 L/min) dat dient om de positie van het plasma in die toorts te regelen. Door de binnenste buis (voor zeer corrosieve materialen kan aluminium oxide, platina, gebruikt worden i.p.v. kwarts) stroomt het zgn. draaggas (ca. 1 L/min), dat samen met het monsteraerosol rechtstreeks uit de verstuiver en de verstuiverkamer in het plasma wordt geïnjecteerd. Hierdoor ontstaat een toroïdaal plasma (cfr. Donut-vorm). [1],[18],[19],[25] Voordat het plasma als ionisatiebron kan optreden, dient het opgestart te worden door middel van een Tesla-ontlading. Hierbij wordt het aanvankelijk neutraal Ar-gas geïoniseerd waarbij een fractie van de neutrale argon atomen omgezet wordt in argonionen en elektronen. Door een watergekoelde, spiraalvormige inductiespoel rond de toorts te plaatsen waar men een hoogfrequente wisselstroom (27,12 of 40,68 MHz) door stuurt ontstaat een wisselend magnetisch veld, dat de aanwezige ionen en elektronen doet versnellen en ze laat bewegen in cirkelvormige banen (Figuur 2.4). Door inelastische botsingen van elektronen met argonatomen, treedt er verdere ionisatie op en wordt het plasma in stand gehouden. Het monsteraerosol wordt via de binnenste concentrische buis in het plasma gebracht dat het monster vervolgens desolvateert, verdampt, atomiseert, exciteert en uiteindelijk ioniseert. De belangrijkste ionisatiemechanismen in het plasma zijn: (i) electron impact en (ii) Penning-ionisatie: 9

18 (i) (ii) Ion-elektron recombinatie zorgt voor de emissie van een continu spectrum. Het is de verdeling van de kinetische energie van de ionen die dit continu emissiespectrum verklaart. Het blauwachtig-wit licht ook waargenomen door de gebruiker wordt verklaart door het lijnenspectrum van Ar, bovenop het continu spectrum van ion-elektron combinatie. Het plasma wordt in stand gehouden zolang er een wisselstroom door de inductiespoel wordt gestuurd en zolang er Ar wordt toegevoerd (typisch L/min). [1],[18],[19],[25],[26] ICP Elektronen bewegen in een cirkelvormige baan Toorts Oscillerend magnetisch veld Plasmagas (Ar) Hulpgas (Ar) Koelgas Draaggas (Ar) + monsteraërosol Draaggas + monsteraërosol Figuur 2.4 De toorts waar het plasma wordt gecreëerd en in stand gehouden wordt, samen met de voornaamste onderdelen. [18] Figuur 2.5 De toorts bestaat uit drie concentrische buizen waar argon doorstroomt, telkens met een bepaald debiet. 10

19 2.3 De Interface De interface bevindt zich tussen het ICP en de massaspectrometer (Figuur 2.2) en heeft als doel het grote drukverschil tussen beide te overbruggen: het ICP werkt bij atmosferische druk, terwijl de massaspectrometer een hoog vacuüm vereist. De interface bestaat uit twee coaxiale kegels met een centrale kleine opening: de sampling cone ( mm) en de skimmer ( mm), meestal vervaardigd uit nikkel of platina (zie Figuur 2.6 ). [1],[18],[19],[27] Het mengsel van ionen, elektronen en neutrale componenten, afkomstig van het ICP, passeert eerst de sampling cone waarna het geheel supersonisch expandeert door het grote drukverschil. Het grootste deel van het geëxpandeerde gas wordt uit de expansiekamer (ruimte tussen de sampling cone en de skimmer) verwijderd door middel van een vacuümpomp. De centrale bundel echter wordt efficiënt geëxtraheerd door de opening van de skimmer. Vervolgens zorgen de extractielenzen er voor dat enkel positieve ionen richting de massaspectrometer gestuurd worden. [1],[18],[19] Het proces tot na de interface wordt schematisch voorgesteld in Figuur 2.7. Extractielenzen Expansie ionen bundel Mach disk Plasma Inductiespoel Skimmer Toorts Sampling cone Figuur 2.6 Skimmer (links) en Sampling cone (rechts). [1] Figuur 2.7 De analietionen worden geëxtraheerd uit het ICP d.m.v. de interface. Vervolgens worden ze via de ionenlenzen de massaspectrometer in geleid. [28] 11

20 2.4 De Massaspectrometer Meteen na de elektrostatische lenzen bevindt zich de massaspectrometer (Figuur 2.2). Het doel van dit onderdeel is de positief geladen ionen te scheiden volgens hun verhouding van massa tot lading (m/z). Er wordt onderscheidt gemaakt tussen vier types massaspectrometers: (i) een quadrupoolfilter; (ii) een dubbel focusserende sector veld massaspectrometer; (iii) een time of flight (TOF) massaspectrometer en (iv) een ioncyclotron resonantie (ICR) massaspectrometer. Enkel deze die relevant zijn in dit onderzoek worden toegelicht. [29] De Quadrupoolfilter Een quadrupoolfilter (Figuur 2.8) bestaat uit vier parallelle cilindrische of hyperbolische staven die bestaan uit, of op z n minst gecoat zijn met een geleidend materiaal. De diametraal tegenover elkaar staande staven vormen een elektrodepaar waarbij de aangelegde spanning bestaande uit een gelijkspannings- en een wisselspanningscomponent op beide elektrodeparen even groot is, maar tegengesteld van teken. Het opgewekte elektrisch veld laat enkel de positief geladen ionen met een welbepaalde m/z ± 1 u toe een stabiele baan te volgen, richting de detector. Alle andere ionen buiten dit nauw venster vertonen een onstabiele baan en worden aldus uit de bundel verwijderd (Figuur 2.8). Door de aangelegde spanning te variëren kan het volledige massabereik gescand worden (massascan). Men kan echter ook de spanning discontinu variëren zodat die overeenstemt met vooraf geselecteerde m/z waarden (peak hopping). [1],[18],[19],[30] Quadrupoolstaven Richting detector Ionenbundel Ingangsspleet Onstabiele baan Stabiele baan Uitgangsspleet Figuur 2.8 Het principe van de quadrupoolfilter. [18] 12

21 2.4.2 De Sector-veld Massaspectrometer In een sector-veld massaspectrometer wordt een magnetische sector als massaspectrometer gebruikt of de combinatie van een magnetische sector en een elektrostatische sector. In de magnetische sector (Figuur 2.9) worden de ionen gescheiden van elkaar op basis van hun verhouding van massa tot lading. Wanneer de ionen afkomstig uit de ionenbron versneld worden over een potentiaalverschil V en vervolgens in een magnetisch veld B gebracht worden, waarbij de richting van dit veld loodrecht op de bewegingsrichting staat, beschrijven ze een eenparig cirkelvormige beweging. De centripetale kracht (F cp ) die de ionen hiertoe dwingt wordt gelijk gesteld aan de Lorentzkracht (F L ), uitgeoefend door het magnetisch veld: (2.1) Waarbij: = kracht uitgeoefend op het ion = de lading van het ion (in ICP-MS bedraag q meestal +1) = snelheid van het ion = de grootte van het magnetisch veld = de massa van het ion = de straal van de cirkelvormige baan dat het ion beschrijft. Anderzijds kunnen we de kinetische energie van het ion beschrijven als: (2.2) Met V het aangelegde potentiaal. Omvormen van formules (2.1) en (2.2) levert: (2.3) Met andere woorden, bij een constante V en B is de straal van de cirkelvormige baan die het ion beschrijft in het magnetisch veld, enkel afhankelijk van zijn verhouding van massa tot lading. Dit geldt echter enkel wanneer alle ionen dezelfde kinetische energie bezitten, wat in de praktijk niet het geval is. [1],[18],[19],[31] 13

22 Aangezien het ICP ionen produceert met een bepaalde energiespreiding, worden de ionen met een verschillende kinetische energie, van elkaar gescheiden in de elektrostatische sector (Figuur 2.10). Dit wordt verwezenlijkt door gebruik te maken van twee gebogen platen waarop een gelijke, doch tegengestelde spanning wordt aangelegd. Hierbij draagt in het algemeen de buitenste plaat een positieve lading en de binnenste een negatieve lading. Door de kracht dat het elektrisch veld uitoefent op de positieve ionen beschrijven ze een cirkelvormige baan als ze tussen beide platen heen bewegen. De centripetale kracht (F cp ) die de ionen hiertoe dwingt wordt gelijk gesteld aan de elektrische veldkracht (F E ): (2.4) Waarbij E de elektrische veldsterkte voorstelt. De straal van de cirkelvormige baan dat een ion dus zal afleggen wordt gegeven door: (2.5) Ionenbron (+) elektrode Detectie S1 S2 Versnelling Magnetisch veld Ionenbron (-) elektrode Figuur 2.9 De magnetische sector: inkomende ionen worden versneld over een potentiaalverschil tussen opening S1 en S2, waarna ze in een magnetisch veld komen dat ervoor zorgt dat de ionen een cirkelvormige baan beschrijven en uiteindelijk gedetecteerd worden. [18],[19] Figuur 2.10 De elektrostatische sector: inkomende ionen met een verschillende kinetische energie (hier is E 2 >E 1 ) worden van elkaar gescheiden. Enkel de ionen met een kinetische energie binnen een klein energievenster worden door een nauwe spleet doorgelaten. [18],[19] Een hogere resolutie wordt verkregen door een nauwe spleet te plaatsen na de elektrostatische sector: deze treedt op als een energiefilter. Echter, dit leidt tot een lagere transmissie-efficiëntie aangezien een groot deel van de ionen verwijderd wordt. [1],[18],[19],[31] Een zogenaamde dubbelfocusserende massaspectrometer combineert een magnetische sector met een elektrostatische sector op zo n wijze dat de spreiding veroorzaakt door de ene sector gecompenseerd wordt door de andere: ionen met eenzelfde m/z maar met een 14

23 verschillende bewegingsrichting en kinetische energie worden uiteindelijk toch in hetzelfde punt gefocusseerd. Afhankelijk van de opstelling, wordt een Mattauch-Herzog, een Nier- Johnson of een omgekeerde Nier-Johnson geometrie bekomen (Figuur 2.11 en Figuur 2.12). Magnetische sector Elektrostatische sector Magnetische sector Ion versnelling Elektrostatische sector Ionenbron Detector Figuur 2.11 De voorstelling van een dubbel-focusserende opstelling met omgekeerde Nier-Johnson geometrie waarbij er gewerkt wordt met één detector. [18] Reeks Faraday detectoren Figuur 2.12 De voorstelling van een dubbel-focusserende opstelling met Nier-Johnson geometrie waarbij gewerkt wordt met negen detectoren die simultaan kunnen meten. [1] 2.5 De Detector Na de massaspectrometer bevindt zich de detector, waarvan er ook verschillende soorten op de markt beschikbaar zijn, elk met hun eigen voor- en nadelen. Hier worden de elektronenvermenigvuldiger en de Faraday cup besproken, daar enkel deze twee relevant zijn in deze studie De Elektronenvermenigvuldiger De elektronenvermenigvuldiger (Figuur 2.13) bestaat uit een aantal discrete dynodes (typisch Cu/Be legering) die op een steeds hogere potentiaal zijn gebracht. Wanneer een positief ion op de kathode (eerste dynode) invalt, wordt deze geneutraliseerd en zgn. secundaire elektronen worden losgeslagen. Deze versnellen naar de tweede dynode waarbij voor elk invallend elektron, meerdere elektronen worden losgeslagen die uiteindelijk worden versneld naar de derde dynode, enz. Deze elektronenvermenigvuldiging (tot elektronen) zorgt ervoor dat bij de laatste dynode een meetbaar signaal optreedt (pulse counting mode). [1],[18],[19],[32] 15

24 Omdat de detectie van een ion in de pulse counting mode enige tijd vergt (het proces van elektronen vermenigvuldigen en het verwerken van de puls door de elektronica), is een elektronenvermenigvuldiger onderhevig aan een bepaalde dode tijd τ. De dode tijd is afhankelijk van de gebruikte vermenigvuldiger en bedraagt 5 tot 100 ns. Uiteraard zal er bij een hogere ionenintensiteit een hogere fractie van de ionen niet gedetecteerd worden. [18],[19] Daarom is het aangewezen om bij hogere intensiteit te meten in analog mode. Hier wordt de stroom na versterking gemeten. Het meten van dergelijke intense ionenbundels heeft ook als nadeel dat de detector minder lang zal meegaan aangezien vooral de laatste dynodes veel elektronen verliezen. Om de levensduur (typisch 1 tot 2 jaar) van de detector te verhogen, kan men ook meten op een eerdere dynode. [18],[19] Men kan kiezen voor één van de twee modi, ofwel het toestel automatisch laten kiezen, op basis van de signaalintensiteit. [18],[20] De Faraday Cup De Faraday cup is een derde detectie-optie. Als de signaalintensiteit te hoog wordt om te meten via een elektronenvermenigvuldiger kan men kiezen om de invallende ionenbundel te detecteren via een Faraday cup. Dit is een metalen cup dat wordt geaard via een zeer hoge weerstand (typisch Ω). Het werkingsprincipe wordt voorgesteld in Figuur Als een kation tegen de metalen wand van de Faraday cup botst, wordt deze onmiddellijk geneutraliseerd door een elektron via de aarding. Dit levert een potentiaalverschil op over de weerstand, dat een maat is voor de signaalintensiteit. [1],[18] Het voordeel van een Faraday cup t.o.v. een elektronenvermenigvuldiger is de zeer lange levensduur en de afwezigheid van een dode tijd. Dit betekent dat deze detector ideaal is om een hoge intensiteit aan ionen te detecteren. Deze voordelen moeten in een experiment opwegen tegen de lagere gevoeligheid van een Faraday cup omdat voor elk kation slechts één elektron aangevoerd wordt. Dit resulteert in een detectielimiet dat 10 3 keer hoger ligt dan bij een elektronenvermenigvuldiger. [18],[29],[32] 16

25 Ion kathode d 2 d 4 d n Signaal Ionenbundel d 1 d 3 e - V Figuur 2.13 De elektronenvermenigvuldiger, bestaande uit n Figuur 2.14 Werkingsprincipe van de Faraday cup. [1] discrete dynodes. [1] 2.6 Massaresolutie De massaresolutie van een massaspectrometer geeft kwantitatieve informatie over de mate waarin twee aangrenzende pieken kunnen gescheiden worden. De massaresolutie kan op twee manieren gedefinieerd worden. Een eerste definitie is een mathematische uitdrukking, gebaseerd op de breedte van de piek op 5% van de hoogte ( ) (Figuur 2.15). De tweede definitie, de 10 % valley definitie, is geschikt om de minimaal vereiste resolutie nodig om twee pieken te scheiden te berekenen: twee pieken van gelijke hoogte worden als gescheiden beschouwd wanneer het dal (valley) tussen deze twee niet hoger is dan 10% van de piekintensiteit (Figuur 2.16). Een typische massaresolutie voor een quadrupoolfilter bedraagt R 300, voor een sector-veld instrument daarentegen kan R zijn. [18],[19],[30] Signaalintensiteit (a.e.) Figuur 2.15 Grafische voorstelling van de definitie van massaresolutie. [1],[18],[19] Figuur 2.16 Grafische voorstelling van de 10% valley definitie voor massaresolutie. [1],[18],[19] 17

26 2.7 Voor- en Nadelen van ICP-MS De voor- en nadelen in het gebruik van ICP-MS analyse worden weergegeven in Tabel 2.1. Afhankelijk van de toepassing, kunnen sommige nadelen verholpen of aanvaard worden. [19] Tabel 2.1 De voor- en nadelen van ICP-MS. Voordelen Lage detectielimieten (ppt of beter) Groot lineair dynamisch bereik Eenvoudige spectra Multi-elementanalyse (kwalitatief/kwantitatief) Hoge sample-throughput Hoge analysesnelheid Mogelijkheid tot informatie isotopische samenstelling Mogelijkheid om - gebruik te maken van een alternatief monsterintroductiesysteem - te koppelen aan chromatografische scheidingstechnieken Nadelen Interferenties (spectraal/niet-spectraal) Kostprijs bij aankoop toestel Kostprijs gebruik (Ar verbruik ca. 20 L/min) Beperkte robuustheid 2.8 De Gebruikte ICP-MS Toestellen Tijdens dit werk wordt er gebruik gemaakt van drie verschillende ICP-MS toestellen: (i) een quadrupool-gebaseerd toestel (Thermo Scientific XSeries II, Figuur 2.20); (ii) een singlecollector sector-veld instrument met omgekeerde Nier-Johnson geometrie (Thermo Scientific Element XR, Figuur 2.21) en (iii) een multi-collector sector-veld instrument met Nier-Johnson geometrie (Thermo Scientific Neptune, Figuur 2.22). Tabel 2.2 toont welk type verstuiver en verstuiverkamer er aangesloten is op elk toestel. Tabel 2.2 De combinatie van verstuiver en verstuiverkamer waarmee elk gebruikt instrument uitgerust is. ICP-MS toestel Verstuiver Verstuiverkamer Thermo Scientific XSeries II Concentrisch Impact bead Thermo Scientific Element XR Concentrisch Cyclonisch Thermo Scientific Neptune Microconcentrisch in PFA Combinatie van Double-pass + Cyclonisch De Thermo Scientific Element XR bezit twee verschillende detectoren: (i) een elektronenvermenigvuldiger en (ii) een Faraday cup. Er kan slechts bij één massa gemeten worden elk moment. Om in een ander gebied van het spectrum te meten dient de versnellingspotentiaal (V, E-scannen ) of het magnetisch veld (B, B-scannen ) gewijzigd te 18

27 worden. Net voor de magnetische sector bevindt zich een ingangsspleet, met een instelbare opening van 250, 30 en 16 µm. Dit resulteert in een lage (zie Figuur 2.17) en twee hoge massaresolutie (zie Figuur 2.18) modi ( medium en hoge massaresolutie genaamd) en het is mogelijk om te veranderen van modus terwijl het plasma aanstaat. [1],[18],[19] De Thermo Scientific Neptune beschikt over negen Faraday cups vandaar de naam multi-collector inductief gekoppeld plasma-massaspectrometer (MC-ICP-MS) die de mogelijkheid bieden om simultaan ionen te detecteren met een verschillende verhouding van massa tot lading. Het grote voordeel hierbij is dat de verschillende isotopen van eenzelfde element simultaan gedetecteerd kunnen worden. Bijgevolg levert dit een automatische correctie voor signaalinstabiliteit en signaaldrift en resulteert dus is een hogere precisie (tot 0,002% RSD). De aanwezigheid van één centrale en acht verstelbare Faraday cups laat de gebruiker toe om deze volgens een geschikte configuratie in te stellen waardoor de doelnucliden in de cups invallen. Dit toestel beschikt tevens over een instelbare openingsspleet, maar deze bevindt zich uiteraard net voor de elektrostatische sector. De opening van de uitgangsspleet na de magnetische sector wordt zodanig ingesteld dat er bij lage resolutie trapeziumvormige pieken ontstaan (Figuur 2.17). Dit wordt verwezenlijkt door de opening van de uitgangsspleet groter te maken dan de breedte van de ionenbundel. Meten met trapeziumvormige pieken heeft als voordeel dat een kleine variatie op de m/z verhouding geen invloed zal hebben op het signaal, wat leidt tot een hoge precisie. [1],[33],[34] Het voordeel van de trapeziumvormige pieken (hoge precisie) is ook zijn grote nadeel: interfererende (moleculaire) ionen treden tevens de cup binnen, wat leidt tot een lage massaresolutie. Bij overgang van lage naar hoge massaresolutie (door aanpassing van de ingangs- en uitgangsspleet), gaan de trapeziumvormige pieken verloren en worden er driehoekvormige pieken verkregen. De oplossing bij de Neptune om interferentievrij te meten en tegelijk de trapeziumvormige pieken te behouden, is werken bij een zogenaamde pseudo-hoge massaresolutie, met een iets lagere precisie (tot 0,005% RSD), door enkel de ingangsspleet kleiner te maken. Dit leidt dan tot een signaalverloop zoals weergegeven in Figuur Uiteindelijk wordt de cup gepositioneerd op het deel van de piek waar enkel het analiet ion invalt (interferentie-vrij plateau). Bij de Neptune is het niet mogelijk om te meten bij een lage of hoge massaresolutie, maar enkel bij een pseudo-medium of pseudo-hoge massaresolutie. [1],[33],[34] 19

28 Signaalintensiteit Signaalintensiteit Signaalintensiteit Analietion + moleculair ion Analietion ion + moleculair ion Moleculair ion m/z (a.e.) Figuur 2.17 Trapeziumvormige pieken bekomen door een brede uitgangsspleet. Levert een hoge precisie, maar een lage massaresolutie. [2] m/z (a.e.) Figuur 2.18 Wanneer er gewerkt wordt bij een hoge massaresolutie, worden de analiet ionen en de moleculaire ionen volledig gescheiden. [2] Analietion + + Moleculair moleculair ion Analietion Moleculair ion m/z (a.e.) Figuur 2.19 Interferentievrije meting van het analiet ion bekomen door een smallere ingangsspleet, maar een even brede uitgangsspleet. Dit levert een iets lagere precisie, maar een hogere massaresolutie. [2] Figuur 2.20 Het gebruikte quadrupool toestel in de A&MS groep is een Thermo Scientific XSeries II apparaat. Figuur 2.21 Het gebruikte Thermo Scientific Element XR apparaat. Figuur 2.22 Het gebruikte Thermo Scientific Neptune apparaat. 20

29 3 Interferentie 3.1 Spectrale Interferentie Spectrale interferentie bij lage resolutie toestellen (quadrupool ICP-MS) treedt op als twee of meerdere ionen eenzelfde verhouding van massa tot lading hebben. Bij sector-veld toestellen daarentegen treedt er in hoge massaresolutie pas spectrale interferentie op als het verschil kleiner is dan een honderdste u. De grootste bron van dit type interferentie ligt bij het voorkomen van polyatomische ionen gevormd uit elementen in het plasmagas, solvent, matrix, lucht, met eenzelfde nominale massa als het analiet. Ook meervoudig geladen ionen kunnen samenvallen met enkelvoudig geladen analieten. [1],[19] In Tabel 3.1 worden enkele spectrale interferenties weergegeven die tijdens deze studie van belang zijn, vooral bij de precieze bepaling van isotopenratio s. Tabel 3.1 Spectrale interferenties die optreden tijdens deze studie (niet beperkende lijst). Type interferentie Analiet Interferentie Isobare nuclide 54 Fe + 54 Cr + Ar-gebaseerde interferentie Andere 58 Fe + 58 Ni + 66 Zn Ba Fe + 56 Fe + 57 Fe + 63 Cu + 67 Zn + 68 Zn + 40 Ar 14 N + 40 Ar 16 O + 40 Ar 16 OH + 40 Ar 23 Na + 35 Cl 16 + O 2 35 Cl 16 O 2 H + Er bestaan een aantal oplossingen om spectrale interferentie te vermijden, of toch op z n minst te reduceren. Zo zal een correcte monsterbehandeling, een goede scheiding van de analietelementen uit hun matrix (ionenuitwisselingschromatografie), uitdampen van de stalen, gebruik van een botsings/reactiecel en/of een alternatief monsterintroductiesysteem, leiden tot eliminatie of reductie van bepaalde gevallen van overlap. Ook een blancocorrectie (evt. met matrix-matching ) is mogelijk, maar enkel 21

30 succesvol wanneer de graad van overlap eerder beperkt is. Bij hoge-resolutie toestellen, zoals een sector-veld massaspectrometer kunnen de meeste spectrale interferenties geresolveerd worden. [1],[18],[19],[35],[36] De Botsings/Reactiecel De botsings/reactiecel in een quadrupool-gebaseerd toestel (Figuur 3.1) bevindt zich tussen de interface en de quadrupoolfilter en biedt een universele en elegante manier om met spectrale interferentie om te gaan. De cel bevat een multipooleenheid (quadrupool, hexapool of octopool) en kan gevuld worden met een geschikt gas. Naargelang de spectrale interferentie wordt een ander gas gekozen om de interferentie te elimineren. De verschillende processen die kunnen optreden tussen dit gekozen gas en de (moleculaire) ionen uit het ICP zijn: (i) dissociatie van moleculaire ionen door botsing, (ii) selectieve ladingsoverdracht en (iii) chemische reactie met atoomtransfer, vandaar de naam botsings/reactiecel. Het nadeel van zo n cel is dat ongewenste reacties aanleiding kunnen geven tot nieuwe polyatomische ionen. Als de cel uitgerust is met een quadrupooleenheid, kan die de ongewenste ionen destabiliseren en uit de ionenbundel verwijderen. Een cel met een hexapool- of octopooleenheid daarentegen kan dit niet. In dit geval is er een alternatieve manier om het verwijderen van deze ongewenste ionen: energiediscriminatie. De ionen die door reactie in de cel gevormd werden, bezitten een lagere kinetische energie dan de ionen afkomstig uit het ICP. Door het aanleggen van een potentiaal (energiebarrière) geraken de ongewenste ionen niet verder tot in de massaspectrometer, waardoor het doelnuclide minder tot geen concurrentie meer heeft van interfererende ionen. Een andere mogelijkheid om louter via energiediscriminatie interfererende ionen te verwijderen, is de botsing met inerte gasatomen (bijvoorbeeld helium, 7% H 2 in He, 1% NH 3 in He, ): door de botsing verliezen moleculaire ionen (rotatie en vibratiemogelijkheid) meer energie dan atomaire ionen. Het aanleggen van een potentiaal (energiebarrière) leidt opnieuw tot selectieve eliminatie van de interfererende moleculaire ionen (Figuur 3.2). [1],[19] In deze studie wordt gebruik gemaakt van de botsings/reactiecel in een Thermo Scientific XSeries II apparaat om de interferentie van 40 Ar 16 O + met 56 Fe + te verlagen. Dit toestel is uitgerust met een hexapooleenheid waardoor er dus gewerkt wordt met de energiediscriminatie zoals hierboven beschreven. Het gebruikte gas is een mengsel van 7% 22

31 Toenemende energie H 2 in He, waardoor onder meer de 40 Ar 16 O + ionen meer energie verliezen door botsing met He. Het H 2 reageert met Ar volgens (i) en (ii) maar dragen in dit specifiek voorbeeld niet bij tot het vermijden van de 40 Ar 16 O + interferentie: (i) (ii) Het optimale gasdebiet voor dit specifiek voorbeeld is terug te vinden in Hoofdstuk 6. Quadrupoolfilter Botsings/reactiecel Extractielenzen Figuur 3.1 Voorstelling van een quadrupool-gebaseerd ICP-MS toestel met een botsings/reactiecel. Als voorbeeld wordt de interferentie van 40 Ar 16 O + op de 56 Fe + bepaling getoond. [1] CCT ED Kinetische Energiediscriminatie Botsings/reactiecel Van plasma Naar quadrupool Energiebarrière Botsingsgas: atoom of molecule Analietion M + Moleculair ion bv. ArX + Figuur 3.2 Schematische voorstelling van de kinetische energiediscriminatie: moleculaire ionen die botsen met een inert gas verliezen meer energie dan atomaire ionen. Door het aanleggen van een potentiaal worden deze moleculaire ionen niet verder geleid tot in de massaspectrometer. CCT staat voor Collision Cell Technology. [1],[19] 23

32 3.2 Niet-Spectrale Interferentie Niet-spectrale interferentie wordt verkregen door de matrix die een signaalonderdrukking of -verhoging induceert, waardoor het signaal van alle analietelementen wordt beïnvloed. Dit type interferentie wordt veroorzaakt door een aantal effecten: [1] Fysische effecten: bv. verschil in viscositeit tussen monster en standaard; Verschuiving van het ionisatie-evenwicht: bij de aanwezigheid van een grote hoeveelheid van een eenvoudig ioniseerbaar matrix-element; Ambipolaire diffusie in het ICP: radiale diffusie van elektronen en ionen van het centrum van het ICP naar buiten toe. Elektronen diffunderen sneller waardoor een elektrisch veld ontstaat zodat kationen ook elektromigratie vertonen. Dit effect heeft meer invloed op de lichtere ionen; Verschuiving van de maximale M + zone: tussen de inductiespoel en de sampling cone in functie van de temperatuur in het ICP; Specifieke effecten: door introductie van een bepaald matrix-element; Space-charge effect en Nozzle-separation: worden verder besproken in Hoofdstuk 4. 24

33 4 Massadiscriminatie en Correctie Massadiscriminatie is een onvermijdelijk fenomeen bij ICP-MS dat onder andere veroorzaakt wordt door: (i) het space-charge effect en (ii) het nozzle-separation effect. Beide effecten resulteren in een efficiënter transport van de zwaardere ionen t.o.v. de lichtere in de richting van de massaspectrometer, waardoor er een continu verlaagd signaal voor een lichter isotoop t.o.v. elk zwaarder isotoop verkregen wordt (Figuur 4.1 rechts). [1],[18] Het is duidelijk dat hiervoor dient gecorrigeerd te worden om accurate isotopenverhoudingen te krijgen. Een aantal correctiemethoden worden verder in dit hoofdstuk besproken. 4.1 Space-Charge Effect De bundel die de expansiekamer verlaat via de skimmer bestaat uit elektronen, kationen, anionen en neutrale componenten. De extractielens die zich na de interface bevindt, is negatief geladen en zorgt ervoor dat enkel de kationen uit de bundel worden geëxtraheerd zodat de neutrale en negatief geladen afgestoten deeltjes verwijderd worden via een vacuümpomp. De geëxtraheerde bundel bevat nu dus enkel nog positieve ladingen, die elkaar onderling afstoten (wet van Coulomb). De maat van afstoting is afhankelijk van de kinetische energie van deze kationen. Argon is het meest abundante atoom dat zich in de bundel bevindt en laat alle deeltjes bewegen met een zelfde snelheid, waardoor de kinetische energie van elk deeltje afhankelijk is van zijn massa. Zwaardere deeltjes (hogere kinetische energie) worden hierdoor efficiënter getransporteerd naar de massaspectrometer, terwijl de lichtere meer repulsie ondervinden. Dit leidt dus tot defocussering en wijziging van de bundelsamenstelling en wordt het space-charge effect genoemd. [1],[18],[19],[35] 25

34 4.2 Nozzle-Separation Effect Dit effect treedt op in de expansiekamer. Omwille van hun lagere massa zullen de lichtere ionen ook hier meer van het centrum van de bundel verwijderd worden en dus de kleine opening van de skimmer niet bereiken. De nozzle-separation leidt dus tot massadiscriminatie in dezelfde richting als het space-charge effect waardoor de bijdrage van deze twee effecten zeer moeilijk experimenteel kan onderscheiden worden. [18] 4.3 Massadiscriminatie versus Massafractionatie De twee bovenstaande effecten resulteren in een continue aanrijking van de ionenbundel in de zwaardere isotopen, m.a.w. zwaardere ionen worden efficiënter getransporteerd dan de lichtere waardoor ICP-MS minder gevoelig is voor deze laatste. Dit fenomeen blijft ongeveer constant in de tijd en wordt aangeduid met de term massadiscriminatie (mass discrimination). Er dient hiervoor duidelijk gecorrigeerd te worden. [1],[2],[18] Er moet toch even bij stilgestaan worden dat tijdsafhankelijke massafractionatie, zoals aanwezig in thermische ionisatie massaspectrometrie (TIMS), een volledig ander proces is dan de statische massadiscriminatie, waargenomen bij ICP-MS. Het verschil tussen beide wordt geïllustreerd aan de hand van Figuur 4.1. Bij TIMS worden de lichtere isotopen iets efficiënter geïoniseerd dan de zwaardere. Na verloop van tijd zijn er relatief meer van de lichtere isotopen uit het monster verdampt en blijft een steeds groter wordende fractie van de zwaardere isotopen over. Als een gevolg hiervan wordt de geproduceerde ionenbundel dus rijker aan de zwaardere isotoop in functie van de tijd. [1],[18] TIMS ICP-MS Tijd (a.e.) Tijd (a.e.) Figuur 4.1 Vergelijking tussen massafractionatie in TIMS (links) en massadiscriminatie bij ICP-MS (rechts). [2] 26

35 4.4 Correctiemethoden In de correctiemethodes zullen de volgende vergelijkingen toegepast worden: (4.1) Waarbij de werkelijke verhouding (van het aantal mol of het aantal deeltjes) voorstelt van twee isotopen, met de zwaarste isotoop in de teller en de lichtste in de noemer en: (4.2) Waarbij de gemeten verhouding is van beide isotopen. Door het effect van massadiscriminatie is. Zo kunnen,, en gedefinieerd worden waarbij std staat voor standaard. Daar het verschil in isotopische samenstelling tussen de monsters zeer klein is, worden de verhouding van de intensiteiten omgezet in een meer werkbare eenheid: de deltawaarde, uitgedrukt in promille: - (4.3) Deze deltawaarde geeft het relatieve verschil weer in isotopische samenstelling van het monster t.o.v. een referentiemateriaal. [1] Externe Standaardisatie Bij externe standaardisatie is de kalibratie meestal sequentieel (standaard-monsterstandaard-monster- -standaard; sample-standard bracketing, SSB). Bij deze correctiemethode wordt aangenomen dat de massadiscriminatie lineair fluctueert (neemt lineair toe of af in functie van de tijd). Hierdoor zal de gemeten waarde van een standaard ook variëren in tijd. De afwijking van de werkelijke verhouding t.o.v. de waargenomen verhouding van het monster is bij dit model louter het gemiddelde van de afwijkingen van de waargenomen verhoudingen t.o.v. de werkelijke verhoudingen van de standaarden, gemeten net voor en net na het beschouwde monster: 27

36 R (a.e.) (4.4) Of (4.5) Als wordt de waarde gebruikt die het institute for reference materials and measurements (IRMM) of het national institue for standards and technology (NIST) meedelen op hun referentiemateriaal. Dit correctiemodel wordt aan de hand van een voorbeeld voorgesteld in Figuur Figuur 4.2 Grafische voorstelling van de bracketing methode Interne Standaardisatie Tijd (a.e.) Bij dit soort correcties wordt er een element met gelijkaardige massa als het doelelement aan de monsteroplossing en standaarden toegevoegd. Er wordt verondersteld dat de massadiscriminatie voor deze inwendige standaard gelijkaardig is als deze voor de doelisotopen in het monster. Voor Fe kan bijvoorbeeld Ni gebruikt worden, voor Zn kan men Cu toevoegen en omgekeerd. De afwijking op de isotopenverhoudingen van deze inwendige standaarden kan dan gebruikt worden om de massadiscriminatie per massa-eenheid (ε) te bepalen. Afhankelijk van de veronderstelling of de massadiscriminatie varieert volgens een lineaire -, machts - of exponentiële functie met het verschil in massa ( ) tussen de twee isotopen, worden er verschillende modellen gehanteerd: [1],[2],[18],[37],[38] (4.6) (4.7) 28

37 (4.8) In de Russell vergelijking daarentegen, wordt de verhouding van beide isotopenmassa s beschouwd als de bepalende factor in massadiscriminatie: (4.9) Hieronder volgen drie methodes die gebaseerd zijn op het gebruik van een inwendige standaard en de Russell vergelijking. [1],[2],[18],[37],[38] Methode 1 Deze methode is gebaseerd op de Russell vergelijking en de beschrijving van Malinovsky et. al [39] en Meija et. al [38] en wordt in wat volgt de inter-element methode genoemd:, en zijn gekend en wordt gemeten, zowel in de standaard als in het monster. Hieruit kan berekend worden. Aangezien de massa van de doelisotopen gelijkaardig is aan die van de inwendige standaard, wordt er verondersteld dat. Zo kan de werkelijke isotopenverhouding van het monster (en van de standaard) bepaald worden: (4.10) Methode 2 Deze methode gebaseerd op wat Woodhead et. al [40] publiceerden hanteert ook de Russell vergelijking om de massadiscriminatiefactoren te berekenen. Maar er wordt gebruik gemaakt van lineaire regressie om de correlatie tussen en in de standaardoplossing (gekende isotopensamenstelling) te documenteren. Via de vergelijking van de bekomen rechte kan voor de monsters berekend worden uit. Vervolgens wordt bekomen op dezelfde wijze als bij de inter-element correctie. In wat volgt wordt deze methode kortweg de Woodhead methode genoemd. Methode 3 Deze methode beschreven door Mason et. al [41] is een combinatie van de SSB-methode en de inter-element methode. De deltawaarde van het analiet in het monster wordt berekend ten opzichte van de standaard en vervolgens verminderd met de deltawaarde 29

38 berekend voor de inwendige standaard in het monster, relatief t.o.v. de inwendige standaard in de standaard. Hierbij wordt er ook gecorrigeerd voor een niet-lineaire shift in de massadiscriminatie, wat niet gebeurd bij de lineaire benadering van de SSB-methode. 4.5 Vergelijking van de Verschillende Methodes Massadiscriminatie wordt in feite opgedeeld in twee componenten: (i) instrumentele massadiscriminatie effecten en (ii) matrix-afhankelijke massadiscriminatie, veroorzaakt door een verschil in monstersamenstelling. [41] Wat de instrumentele massadiscriminatie betreft houdt de standard-sample bracketing (SSB) methode geen rekening met niet-lineaire fluctuaties tussen twee standaarden. Dit maakt deze methode minder robuust t.o.v. interne standaardisatiemethoden, waar een inwendige standaard continu gemeten wordt en aldus informatie verschaft over de eigenlijke variatie in massadiscriminatie. Bijgevolg werkt de externe correctiemethode het best bij een stabiele massadiscriminatie. Dit laatste is meestal het geval bij de Neptune, zodat externe en interne standaardisatiemethoden algemeen zeer gelijkwaardige resultaten geven. [41] Opdat een accurate correctie voor matrix-afhankelijke massadiscriminatie mogelijk zou zijn dienen in de eerste plaats zoveel mogelijk matrixcomponenten verwijderd te worden om matrix-gerelateerde massadiscriminatie in het monster te minimaliseren. Een standaard bevat (praktisch) geen matrixcomponenten, wat dus een verkeerde correctie zou geven indien het monster niet zuiver genoeg zou zijn (bij de SSB-methode). [41] Interne standaardisatiemethoden zijn robuuster tegenover variaties in matrix tussen de standaarden en de stalen, maar toch maar in beperkte mate. De matrix-afhankelijke component van de massadiscriminatie verklaart ook de noodzaak om bij het meten van isotopenverhoudingen met een MC-ICP-MS de concentraties van het analietelement zo goed mogelijk overeen te laten komen tussen stalen en standaarden (maximum 20 % verschil). Tussen de interne standaardisatiemethoden blijkt de Woodhead methode het meest betrouwbare resultaten te geven. Daarom werden meestal de door deze methode bekomen resultaten gebruikt om verder mee te werken. 30

39 5 Monstername en -voorbereiding Een correcte monstervoorbereiding is een belangrijke stap om betrouwbare resultaten te verkrijgen in alle domeinen van de analytische chemie en zeker bij isotopenanalyse. Allerlei maatregelen worden genomen om een bloedmonster niet te contamineren vanaf de bloedafname tot bij het meten van het monster. In dit hoofdstuk wordt een beschrijving gegeven van de bloedafname en het clean lab waarin de volledige monstervoorbereiding werd uitgevoerd, bestaande uit twee grote stappen: (i) digestie van het bloed en (ii) isolatie van de analietelementen via ionenuitwisselingschromatografie. [11] 5.1 Bloedafname Na het spoelen van de naald met 10 ml bloed (gecollecteerd in urinebuisjes die verder geen functie hebben), wordt er 6 ml afgenomen in buisjes bestemd voor spoorelementanalyse (BD Vacutainer). De spoeling van de naald is belangrijk om contaminatie te vermijden. De bloedmonsters werden op het UZ Gent afgenomen. Tot de monstervoorbereiding van start gaat, worden de buisjes bewaard bij -20 C. 5.2 Het Clean Lab Om contaminatie van de stalen te vermijden, vindt de gehele monstervoorbereiding plaats in een PicoTrace clean lab klasse 10 (volgens de US FED-STD-209E standaard). Andere maatregelen om contaminatie te vermijden zijn het gebruik van Teflon PFA Savillex bekers (die een specifieke reinigingsprocedure ondergaan hebben, zie Bijlage 4) van verschillende groottes, verdere in-house opzuivering van de aangekochte zuren (HNO3, 14 M en HCl, 12 31

40 M; pro analysi, Chem-Lab, Zedelgem) met behulp van een sub kookpuntsdestillatie (subboiled, sb.) in Teflon apparatuur voor HNO 3 en in kwarts apparatuur voor HCl. Er werd ook gebruik gemaakt van ultra-zuiver water (Milli-Q, resistiviteit 18.2 MΩ.cm bij 25 C). [11],[42],[43],[44] 5.3 Digestie van het Bloed Omdat het ontdooide bloed vrij viskeus is wat kan leiden tot een verkeerd opgenomen volume via normaal pipetteren wordt er 3 ml in een 60 ml Teflon Savillex beker gebracht via omgekeerd pipetteren. Hierbij wordt de pipet tot de tweede stop ingedrukt, de pipetpunt wordt in het bloed gebracht en een bepaald volume (iets meer dan 3 ml) wordt opgezogen. Vervolgens wordt het pipetpunt geleegd tot de eerste stop, waardoor er exact drie milliliter in de beker terecht komt. Het bloed dat achter blijft in de pipetpunt wordt verwijderd. Aan het bloed in de Savillex beker wordt vervolgens 7 ml 14 M HNO 3 toegevoegd om Cu, Fe en Zn, die normaal gebonden zijn aan biomoleculen in het bloed, vrij te stellen. Na een uurtje wachten (en eventuele ontgassing), worden de gesloten bekers op een verwarmplaat geplaatst, waar ze gedurende 14 uur bij 110 C worden verwarmd. [11],[45] De verkregen oplossing wordt vervolgens bij 95 C drooggedampt. Het droge residu wordt hierna heropgelost in 5 ml 8 M HCl die ook 0.001% H 2 O 2 bevat om alle Fe- en Cuionen in hun hoogste oxidatietoestand te krijgen. Dit laatste is nodig om Cu en Fe elk als één fractie op het juiste moment te laten elueren tijdens de ionenuitwisselingschromatografie ( 5.4). Om het residu volledig te heroplossen, dienen de bekers (uiteraard gesloten) op een verwarmplaat (110 C) gezet te worden voor een aantal uur. Eventueel kan er, na het heroplossen, wat extra H 2 O 2 (bv. 50 µl) toegevoegd worden om er zeker van te zijn dat de koper- en ijzerionen in hun hoogste oxidatietoestand blijven, aangezien verwarming het waterstofperoxide uit de oplossing doet verdwijnen. [11] Na de vorige stap is er enige precipitatie aanwezig, waardoor de monsters gecentrifugeerd moeten worden, vooraleer ze in het tweede deel van de monstervoorbereiding op het hars worden geladen. Eerdere studie heeft aangetoond dat dit geen invloed heeft op de resultaten van de isotopenanalyse. [11] 32

41 5.4 Ionenuitwisselingschromatografie Deze stap in de monstervoorbereiding is van groot belang: er wordt een strategie gevolgd om achtereenvolgens de Cu-, Fe- en Zn-ionen te isoleren van alle andere componenten die aanwezig zijn in het monster. Als chromatografiekolom wordt er gebruik gemaakt van een Bio-Rad Poly-Prep kolom, gevuld met 2 ml van het sterke anion uitwisselingshars AG MP-1 (korrelgroottediameter 75 tot 150 µm). Deze bestaat uit quaternaire ammoniumgroepen die aan een styreen divinylbenzeen copolymeer met hoge porositeit (droog: effectief oppervlak van ± 23 m²/g) gebonden zijn en waarvan het tegenion in normale condities Cl - is. Aangezien in de laatste stap van het digestieproces HCl toegevoegd wordt aan de monsteroplossing, worden er metaalchloride complexen gevormd die resulteren in een beter ligand voor de ammoniumgroep, dan het Cl - anion. De complexen relevant voor dit werk zijn en, met Cu(II) of Zn(II) en. Boven het hars wordt er een zogenaamde stopper geplaatst om te voorkomen dat het hars opwervelt wanneer er oplossing wordt opgebracht. [11],[46],[47],[48] Het hars wordt gereinigd met 3 ml 7 M HNO 3, ca. 5 ml 8 M HCl en ca. 5 ml 0.7 M HNO 3, telkens met ca. 5 ml H 2 O tussen elke stap. Het hars wordt driemaal gebruikt en er dient opgemerkt te worden dat na het toevoegen van de 8 M HCl de eluerende oplossing geel kan kleuren. De exacte reden hiervoor is niet gekend maar hoogstwaarschijnlijk komt dit door de aanwezigheid van matrixelementen van een vorige scheiding. Spoelen met extra 8 M HCl tot de gele kleur verdwijnt is in dit geval noodzakelijk. Conditioneren gebeurt door 10 ml 8 M HCl % H 2 O 2 op het hars te brengen. Vervolgens wordt de monsteroplossing geladen, waarna 8 ml 8 M HCl % H 2 O 2 wordt gebruikt om de matrix te verwijderen. [11] Na de matrix, elueren achtereenvolgens het Cu, Fe en Zn door respectievelijk 12 ml 5 M HCl % H 2 O 2, 10 ml 0.6 M HCl en 10 ml 0.7 M HNO 3 op de kolom te brengen. Deze opgezuiverde analietelementfracties worden na elkaar opgevangen in Teflon Savillex bekers. Om chloor te verwijderen, worden de fracties uitgedampt op een verwarmplaat bij 95 C, heropgelost in 10 ml 0.7 M HNO 3 en nogmaals uitgedampt (enkel voor Cu en Zn). Uiteindelijk worden de residuen heropgelost in 5 ml 0.7 M HNO 3 voor Zn en 800 µl 0.7 M HNO 3 voor Cu. Indien deze tweede uitdampingsstap niet uitgevoerd wordt, zullen de signalen van 35 Cl 16 + O 2 en 35 Cl 16 O 1 2 H + interfereren met deze van respectievelijk 67 Zn + en 68 Zn +. 33

42 Voor 63 Cu + zouden de signalen van 14 N 12 C 37 Cl + en 35 Cl 16 O 12 C + kunnen overlappen en voor 65 Cu + kan er interferentie optreden met 37 Cl 16 O 12 C +. [11],[47] Het Elutieprofiel Een elutieprofiel toont aan in welke mate bepaalde componenten gescheiden werden van de matrixcomponenten en van elkaar tijdens een scheidingsmethode en hoeveel eluens hiervoor nodig is. Hieruit kan er dan geconcludeerd worden of de gebruikte methode al dan niet geschikt is. In deze studie werden de voornaamste elementen in menselijk volbloed bepaald, gebaseerd op de gegevens die beschikbaar zijn in menselijk referentiebloed (Seronorm Trace Elements Whole Blood L-1). [49] Het elutieprofiel wordt bekomen door als eerste een staal te laden (sample load) en de eerste fractie die van de kolom komt als één fractie op te vangen. Vervolgens wordt het zuur dat dient om de matrixelementen te elueren (matrix) op de kolom gebracht en per milliliter opgevangen. De Cu, Fe en Zn fracties worden op een analoge manier gecollecteerd als de matrixfracties. Het opvangen van elke milliliter gebeurt door middel van een microcentrifugebuis (aangekocht bij Carl Roth, Duitsland) en dit wordt onder de ionenuitwisselingschromatografiekolom gehouden. Om het elutieprofiel op te stellen werd gebruik gemaakt van een gewoon bloedstaal dat dezelfde monstervoorbereiding en scheidingsmethode onderging als elk ander staal. Er werd een kleine hoeveelheid monster apart gemeten (verdunde oplossing die geen scheiding onderging) voor concentratiebepaling om de hoeveelheid dat van elk analietelement op de kolom werd gebracht te kunnen bepalen. Eenmaal elke fractie geanalyseerd op de elementaire samenstelling, kan het percentage aan elk element berekend worden dat terug te vinden is in iedere fractie. Figuur 5.1 toont het verkregen elutieprofiel en er is duidelijk te zien dat een groot aantal matrixelementen reeds verwijderd wordt in de eerste fracties. Cu, Fe en Zn zijn zuiver teruggewonnen in hun eigen fracties (Figuur 5.2). 34

43 Cu 1 Cu 2 Cu 3 Cu 4 Cu 5 Cu 6 Cu 7 Cu 8 Cu 9 Cu 10 Cu 11 Cu 12 Fe 1 Fe 2 Fe 3 Fe 4 Fe 5 Fe 6 Fe 7 Fe 8 Fe 9 Fe 10 Zn 1 Zn 2 Zn 3 Zn 4 Zn 5 Zn 6 Zn 7 Zn 8 Zn 9 Zn 10 Opbrengst (%) B 140 Na Rb 120 Ba Mg 100 Si P 80 S Ca 60 Fe Cu sl m 1 m 2 m 3 m 4 m 5 m 6 m 7 m 8 Cu Fe Zn B Cu ZnSe Fe Ca S P Si Mg Ba Rb Na K Br Zn Se K Br Figuur 5.1 Het elutieprofiel bewijst dat de aangewende scheidingsmethode goed werkt om Cu, Fe en Zn van elkaar en de matrixelementen te scheiden Cu 10 0 Fe Zn Figuur 5.2 Wanneer enkel de Cu, Fe en Zn fracties bekeken worden, ziet men dat Cu teruggewonnen wordt in 1-mL fracties Cu 4 tot Cu 10, Fe in fractie Fe 2 & Fe 3 en Zn in fractie Zn 4 & Zn 5. 35

44 6 Metingen Om de concentraties van Fe, Cu en Zn in de opgevangen fracties te bepalen, werd gebruik gemaakt van een Thermo Scientific XSeries II quadrupool ICP-MS apparaat. Concentratiebepaling is steeds noodzakelijk omdat voor betrouwbare meting van de isotopenverhoudingen met het Thermo Scientific Neptune MC-ICP-MS apparaat zowel de standaarden als de stalen in eenzelfde concentratie (± 20%) aanwezig moeten zijn om de matrix-afhankelijke component van massadiscriminatie te minimaliseren (zie ook 4.5). Om het elutieprofiel (zie 5.4.1) en de detectielimieten (limit of detection, LOD) te bepalen, werd het Thermo Scientific Element XR sector-veld ICP-MS apparaat gekozen omdat er in de matrixfracties een groot aantal geïnterfereerde elementen zitten en deze interferenties niet allemaal te verhelpen zijn met de XSeries II. Door te meten bij een hogere (medium of hoge) massaresolutie konden met dit instrument de aanwezige spectrale interferenties worden vermeden. Bij elke monster-, standaard- en blanco-oplossing wordt er een gekende hoeveelheid inwendige standaard toegevoegd. Deze heeft een massa gelijkaardig aan het analietelement, waardoor beide op eenzelfde (of toch zeer gelijkaardige) manier reageren op de beïnvloeding van het signaal door instrumentinstabiliteit en matrixeffecten. Door de verdere berekeningen uit te voeren met de verhouding van beide signalen wordt er gecorrigeerd voor signaalinstabiliteit en signaaldrift. 6.1 Elementbepaling met de Thermo Scientific XSeries II Tabel 6.1 geeft weer wat typische concentratiewaarden zijn die voor Fe, Cu en Zn in menselijk volbloed in de literatuur terug te vinden zijn samen met de overeenkomstige gemiddelde experimentele waarden van dit werk. De experimentele waarden wijken lichtjes 36

45 af van de referentiewaarden uit de literatuur. Dit kan mogelijk verklaard worden door de neerslagvorming tijdens de monstervoorbereiding. Dit concentratieverschil heeft echter geen invloed op de isotopische samenstelling van elk monster, zoals eerder onderzoek [11] heeft bevestigd. Aangezien Fe, Cu en Zn in een hoge concentratie aanwezig zijn, worden deze voor hun bepaling verdund. Als inwendige standaard wordt 10 µg/l Co gebruikt voor Fe en 10 µg/l Ga voor Cu en Zn: de twee meest abundante isotopen ( 59 Co en 69 Ga) worden gemeten. Met behulp van een uitwendige standaardreeks wordt de concentratie van Fe, Cu en Zn in elk monster bekomen. De gebruikte instrumentinstellingen en meetparameters voor de Thermo Scientific XSeries II zijn weergegeven in Tabel 6.1. Deze instellingen variëren echter licht tussen elke meetdag: tijdens de tuning worden de instrumentinstellingen geoptimaliseerd om tegelijkertijd een voldoende hoge signaalintensiteit te verkrijgen, terwijl het niveau van oxide-ionen en dubbel geladen ionen voldoende laag wordt gehouden. Om de best mogelijke detectielimiet te verkrijgen en geen kostbare tijd verloren te laten gaan, wordt er gekozen om in peak-hopping modus te meten. [11],[50],[51] Om de interferentie van 40 Ar 16 O + met de meest abundante isotoop van ijzer ( 56 Fe) te reduceren werd de Collision Cell Technology op de XSeries II gebruikt (zie 3.1.1) en werd het optimaal gasdebiet (H 2 /He mengsel) bepaald door het maximum te bepalen van de verhouding van signaal (voor een 10 µg/l ijzer-oplossing in 2% HNO 3 (sb.)) tot achtergrond (2% HNO 3 (sb.)-oplossing) in functie van het gasdebiet. Uit Figuur 6.1 en Figuur 6.2 valt af te leiden dat het maximum ligt bij ongeveer 4.6 L/min van het botsings-/reactiegas, een mengsel van 7 % H 2 in He. Tabel 6.1 Het concentratie-interval voor Fe, Cu en Zn gevonden in menselijk volbloed: vergelijking tussen experimenteel bekomen waarden en deze gevonden in de literatuur. Element Fe Cu Zn Experimenteel (ppm) Concentraties Literatuur [51] (ppm)

46 Signaal/Achtergrond Signaal/Achtergrond Tabel 6.2 Instrumentinstellingen en meetparameters voor de Thermo Scientific XSeries II. Cu en Zn Fe (CCT-modus) Instrumentinstellingen Monster opnamesnelheid (µl/min) 500 Plasmagasdebiet (L/min) 13.0 Hulpgasdebiet (L/min) Draaggasdebiet (L/min) RF vermogen (W) CCT-gas (L/min) Hexapool bias (V) Pole bias (V) Focus (V) D2 (V) Sampling cone Ni; 1.1 mm openingsdiameter Skimmer Ni; 0.75 mm openingsdiameter Meetparameters Meetmodus peak-hopping Runs 3 Sweeps Acquisitietijd (s) 5 Dwell time (ms) De spanning op de hexapool en de 2 quadrupool, 3 De spanning op de elektrostatische lenzen, 4 Het aantal keer elke massa geanalyseerd wordt tijdens een run, 5 De duur van één enkele run, 6 De duur dat één bepaalde massa geanalyseerd wordt Gasdebiet (L/min) Figuur 6.1 Gasdebiet He/H 2 (7%) versus de signaal/achtergrond verhouding. Een maximum wordt gevonden tussen 4 en 5 L/min ,9 4,4 4,9 Gasdebiet (L/min) Figuur 6.2 Gasdebiet He/H2(7%) versus de signaal/achtergrond verhouding, tussen 4 en 5 L/min. Het optimum wordt gevonden op 4.6 L/min. 6.2 Elementbepaling met de Thermo Scientific Element XR De Element XR werd gebruikt om het elutieprofiel op te stellen en de detectielimieten te bepalen van dit toestel voor de voor dit onderzoeksproject belangrijkste elementen in menselijk bloed. Tabel 6.3 geeft de gebruikte instrumentinstellingen en meetparameters weer. Standaard wordt er gekozen om te meten in E-scan modus: dit is sneller dan B-scan modus. In Tabel 6.4 zijn de detectielimieten terug te vinden. Hiervoor werden 10 blanco s (2% HNO 3 (sb.)) gemeten om de standaardafwijking op de blanco te meten en tweemaal een 2 38

47 µg/l multi-elementstandaard gemeten om de gevoeligheid van het element na te gaan. Vervolgens wordt voor elk geanalyseerd element de detectielimiet (Limit of Detection, LOD) berekend volgens volgende vergelijking: [52],[53] De Element XR laat op basis van mogelijke interferenties verschillende resolutiemodi waarin elk element gemeten wordt toe: lage (LR), medium (MR) of hoge (HR) resolutie. Dit komt respectievelijk overeen met R 400, 4000 en Zo kunnen bijvoorbeeld argonbevattende polyatomische ionen ( 40 Ar 14 N +, 40 Ar 16 O +, 40 Ar 16 OH +, ) gemakkelijk gescheiden worden van de signalen van 54 Fe, 56 Fe en 57 Fe door te werken bij medium resolutie. Tabel 6.3 Instrumentinstellingen en meetparameters voor de Thermo Scientific Element XR. Instrumentinstellingen Monster opnamesnelheid (µl/min) 200 Plasmagasdebiet (L/min) 15 Hulpgasdebiet (L/min) Draaggasdebiet (L/min) RF vermogen (W) Sampling cone Ni; 1.1 mm openingsdiameter Skimmer Ni; 0.8 mm openingsdiameter Meetparameters Scan-type E-scan Runs 3 Passes 1 4 Segmentduur (s) Monstertijd (ms) Dit zijn het aantal spectra nodig om met de ingestelde analysetijd elke berekende run te vullen, 2 Is de duur van een scan per isotoop, 3 De tijd waarin het instrument integreert voor elk massapunt (meettijd/punt). [53] Tabel 6.4 Bekomen detectielimieten van enkele elementen, op de Thermo Scientific Element XR. LOD (µg/l) 11 B (LR) Na (LR) 1 85 Rb (LR) Ba (LR) Mg (MR) Si (MR) P (MR) S (MR) Ca (MR) 1 56 Fe (MR) Cu (MR) Zn (MR) Se (MR) K (HR) Br (HR)

48 6.3 Isotopenanalyse met de Thermo Scientific Neptune De Neptune werd gebruikt om isotopenverhoudingen met hoge precisie te meten. In Tabel 6.5 zijn de instrumentinstellingen en meetparameters weergegeven die gebruikt werden voor de isotopenanalyse van Fe, Cu en Zn. Zoals hoger vermeld, wordt er bij de Cu-monsters 1 mg/l Ni (in-house) toegevoegd dat dient voor de correctie voor massadiscriminatie, bij de Cu- en Zn-monsters is dit respectievelijk 1 mg/l Zn (in-house standaard) en 1 mg/l Cu (inhouse standaard). Deze in-house standaarden werden bereid uit commercieel beschikbare oplossingen van 1 g/l (Inorganic Ventures, Nederland; lot C2-CU02116 voor Cu in-house, lot D2-FE03110 voor Fe in-house en lot D2-ZN02061 voor Zn in-house) om het verbruik van dure isotopische referentiematerialen te reduceren. Vooraleer de meting van start kan gaan, moet het toestel getuned worden en dienen de Faraday cups correct geplaatst te worden. Als eerste handeling wordt de ionenbundel van 58 Fe gecentreerd in de middelste (center) Faraday cup. Hierbij wordt een E-scan uitgevoerd om het midden van de trapeziumvormige spectrale piek te localiseren. De E-scanning wordt éénmaal van lage naar hoge massa uitgevoerd en éénmaal andersom. Het centrum van de spectrale piek en het meetpunt (voor statische datacollectie) worden vastgelegd. Vervolgens wordt er een peakscan uitgevoerd voor 56 Fe, waarvoor het signaal onderhevig is aan interferentie vanwege 40 Ar 16 O +. Dit wordt verwezenlijkt door een E-scan rond deze massa. In Figuur 6.4 is het duidelijk te zien dat het signaal voor de blanco-oplossing (lichtgroen) op een hogere massa start dan deze voor een 56 Fe-standaaroplossing (donkergroen). Voor dit isotoop moet op het linker plateau gemeten worden op zo n manier dat het blancosignaal minder dan 0.1% bijdraagt tot de totale signaalintensiteit. Ook voor de overige isotopen van ijzer moet er op het interferentie-vrij plateau gemeten worden (Figuur 6.5). Deze plateaus zijn echter breder dan het plateau van 56 Fe, waardoor de positie bepaald via de 56 Fe piek ook voor de andere isotopen zal voldoen indien de pieken goed uitgelijnd worden t.o.v. elkaar (zie Figuur 6.5). Voor Cu en Zn geldt een analoge procedure. [54] 40

49 Tabel 6.5 Instrumentinstellingen en meetparameters voor de Thermo Scientific Neptune. [54] Cu en Zn (MR) Fe en Ni (MR) Instrumentinstellingen Monster opnamesnelheid (µl/min) 100 Plasmagasdebiet (L/min) Hulpgasdebiet (L/min) Draaggasdebiet (L/min) RF vermogen (W) Sampling cone Ni; 1.1 mm openingsdiameter Skimmer Ni; 0.8 mm openingsdiameter Meetparameters Scan-type Statisch; multi-collectie Aantal blokken 1 9 Aantal cycli/blok 2 5 Integratietijd (s) 3 4 Magneet insteltijd (s) 0 Cupconfiguratie L3: 63 Cu L2: 64 Zn L1: 65 Cu C: 66 Zn H1: 67 Zn H2: 68 Zn L4: 54 Fe L2: 56 Fe L1: 57 Fe C: 58 Fe H1: 60 Ni H2: 62 Ni 1 Een blok is een set van cycli en kan gepauzeerd/gestopt worden. Bij hervatten worden de eerder gemeten cycli van dit blok gewoon opnieuw gemeten. 2 Een cyclus is de simultane detectie op de zes Faraday cups gedurende een bepaalde integratietijd. 3 De tijd waarin één cyclus gemeten wordt. Een meting bestaat dus uit het aantal blokken, vermenigvuldigd met het aantal cycli/blok. [54] Figuur 6.3 Spectrale piek voor 58 Fe gemeten in de center cup bij lage massaresolutie. 41

50 56 Fe + 56 Fe Ar 16 O + 40 Ar 16 O + Figuur 6.4 Spectrale piek van 56 Fe bij hogere massaresolutie. De geschikte massa waarop 56 Fe kan gemeten worden via statische datacollectie is deze waarbij het blanco signaal minder dan 0.1% bijdraagt tot de totale signaalintensiteit. L4 L2 L1 C H1 H3 = 54 Fe = 56 Fe = 57 Fe = 58 Fe = 60 Ni = 62 Ni Figuur 6.5 Genormaliseerde spectrale signalen voor alle ijzer- en nikkelisotopen (hogere massaresolutie). 42