Micropartikels: een nieuwe schakel tussen kanker en trombose

Transcriptie

1 Micropartikels: een nieuwe schakel tussen kanker en trombose Auteurs Trefwoorden M.E.T. Tesselaar, R.M. Bertina en S. Osanto kanker, micropartikels, tissue factor, trombose Samenvatting Reeds in de 19 e eeuw bleek een verband te bestaan tussen veneuze trombose en kanker, maar het duurde nog ruim een eeuw voordat de eerste grote cohortstudies, die deze bevinding ondersteunden, in de literatuur verschenen. Trombose bij kankerpatiënten gaat gepaard met een slechtere prognose, hetgeen suggereert dat lokale dan wel systemische hypercoagulabiliteit de groei van tumorcellen bevordert. Micropartikels zijn kleine, subcellulaire fragmenten, die ontstaan na activering of apoptose en die afkomstig kunnen zijn van de verschillende bloedcellen in de circulatie, maar ook van endotheelcellen. Er is steeds meer bewijs dat micropartikels een pathofysiologische betekenis kunnen hebben. Flowcytometrie is wereldwijd de meest gebruikte methode om micropartikels te karakteriseren. De door verschillende auteurs gerapporteerde aantallen micropartikels bij gezonde mensen lopen sterk uiteen. Deze grote verschillen lijken te worden verklaard door de verschillende technieken die de diverse laboratoria gebruiken voor isolatie, detectie en karakterisering van micropartikels. De eerste artikelen over een mogelijke rol van micropartikels bij de ontwikkeling van trombose bij verschillende ziektebeelden dateren uit de jaren 80 van de vorige eeuw. Preklinisch onderzoek toonde aan dat micropartikels die afkomstig zijn van tumorcellijnen, stollingsactiviteit bezitten. Recentelijk werd voor het eerst een verband gevonden tussen micropartikels, kanker en trombose bij de mens. Verder onderzoek zal moeten aantonen in hoeverre micropartikels een oorzakelijke rol spelen bij kankergerelateerde trombose. (Ned Tijdschr Hematol 2007;4: ) Inleiding Kanker en veneuze trombose gaan hand in hand. Het voorkomen van veneuze trombose is geassocieerd met een grotere kans op kanker. 1 Vice versa ontwikkelen kankerpatiënten vaker trombose dan personen die geen kanker hebben. 2 Trombose bij kankerpatiënten gaat gepaard met een slechtere prognose, wat impliceert dat lokale dan wel systemische hypercoagulabiliteit de groei van tumorcellen bevordert. Het verband tussen trombose en kanker dateert uit 1865, toen Armand Trousseau voor het eerst de hoge incidentie van trombose beschreef bij patiënten met gastro-intestinale tumoren. 3 Het duurt echter nog ruim een eeuw voordat de eerste grote cohortstudies die deze bevinding ondersteunen, in de literatuur verschijnen. 4 Ondanks het feit dat veel kankerpatiënten (tot wel 80%) een abnormaal stollingsprofiel hebben (bijvoorbeeld verhoogde concentraties van stollingsfactoren als fibrinogeen, factoren V, VIII, IX en XI en trombocytose), ontwikkelen niet al deze kankerpatiënten trombose. Het mechanisme dat verantwoordelijk is voor kankergerelateerde trombose, is dan ook nog niet volledig opgehelderd. Micropartikels (MP), kleine subcellulaire fragmenten, worden in hogere mate aangetroffen in de circulatie van patiënten met syndromen die geassocieerd zijn met een grotere kans op het ontwikkelen van n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 4 n r

2 arteriële of veneuze trombose. 5-8 In dit overzichtsartikel wordt ingegaan op de eventuele rol van MP bij kankerpatiënten. Micropartikels Al in de jaren 40 van de vorige eeuw was bekend dat plaatjesrijk plasma sneller stolt dan plaatjesarm plasma. De stollingstijd van plaatjesvrij plasma bleek echter nog langer te zijn, hetgeen impliceert dat er een procoagulante subcellulaire factor in plaatjesarm plasma aanwezig moet zijn. Uiteindelijk werd deze factor in 1967 door Wolf voor het eerst aangetoond, en bleek afkomstig te zijn van bloedplaatjes, destijds ook wel platelet dust genoemd. 9 Niet veel later werd aangetoond dat bloedplaatjes tijdens activering, kleine deeltjes (thans MP genoemd) kunnen afscheiden, en dat deze MP in staat zijn tot procoagulante activiteit. Inmiddels is bekend dat alle circulerende bloedcellen, maar ook endotheelcellen, in staat zijn MP te vormen door activering van cellen of juist door apoptose. Deze MP variëren in grootte van 100 tot nanometer en worden gekenmerkt door de aanwezigheid van dezelfde antigenen op hun oppervlak als hun moedercel. Heel lang is gedacht dat MP tot het celdebris behoorden en geen belangrijke pathofysiologische rol zouden spelen. Er is echter steeds meer bewijs dat de MP zelf, alleen of samen met andere cellen, een belangrijke pathofysiologische betekenis hebben. Uit bloed van gezonde mensen kunnen MP worden geïsoleerd die voornamelijk afkomstig blijken te zijn van bloedplaatjes, maar ook van monocyten, lymfocyten, erytrocyten en endotheelcellen. 10 Bij patiënten met een aangeboren bloedziekte, die gekenmerkt wordt door een gestoorde membraanvesiculatie (Scottsyndroom), wordt in het bloed een veel lager aantal MP gevonden. Juist deze patiënten presenteren zich met een toegenomen bloedingsneiging. 11 Daartegenover staan ziektebeelden die geassocieerd zijn met vaatwandbeschadiging en hypercoagulabliteit, waarbij de aantallen MP duidelijk verschillen van die bij gezonde mensen. 5-8,10,12 Karakteriseren van micropartikels Flowcytometrie is wereldwijd de meest gebruikte methode om MP te karakteriseren. MP kunnen worden geïsoleerd uit plaatjesvrij plasma voordat ze worden geïncubeerd met specifieke antilichamen of annexine-v (dat specifiek bindt aan negatief geladen fosfolipiden in aanwezigheid van calciumionen), en waaraan een fluorochroom is bevestigd. Op deze manier kunnen antigenen, respectievelijk fosfatidylserines die zich op het micropartikeloppervlak bevinden, gekwantificeerd worden met behulp van de flowcytometer. Het merendeel van de MP die geïsoleerd zijn uit plaatjesvrij plasma, bij zowel gezonde als zieke mensen, bindt annexine-v en brengt CD61 of CD41 tot expressie. Om die redenen zijn zij afkomstig van bloedplaatjes. 10,12 De door de verschillende auteurs gerapporteerde aantallen MP bij gezonde mensen lopen sterk uiteen. Zo rapporteerden Shet el al. aantallen MP van 192 ± 70 x 10 3 /l in plaatjesvrij plasma, terwijl bijvoorbeeld Berckmans et al. 290 x 10 6 /l vonden. 10,13 Deze grote verschillen lijken te worden verklaard door de verschillende technieken die de diverse laboratoria gebruiken voor de isolatie (wel of niet gesedimenteerd, verschillende centrifugesnelheden), detectie en karakterisering van MP (keuze en gebruik van de verschillende celspecifieke antilichamen). Helaas is er tot op heden dan ook geen algemene richtlijn ten aanzien van de beste techniek om aantallen MP betrouwbaar te meten. Door deze verschillen in gebruikte methoden is onderling vergelijken van de resultaten van verschillende laboratoria niet mogelijk. Soms leidt dit tot inconsistente of zelfs tegenstrijdige resultaten. 14 Rol van tissue factor en micropartikels in trombusvorming Tot op heden is het niet duidelijk waar de tissue factor (TF) die wordt aangetroffen in trombi en in MP, precies vandaan komt. In 1999 toonden Giesen et al. aan dat ex vivo gevormde trombi niet alleen bloedplaatjes en fibrine bevatten, maar ook een aanzienlijke hoeveelheid TF. 15 Door middel van elektronenmicroscopie met goudgelabeld anti- TF-antilichaam konden zij grote clusters van TFantigeenpositieve membraanvesikels aantonen, die zich bevonden in de nabijheid van bloedplaatjes. Het bleef echter onduidelijk waar dit blood-borne TF vandaan kwam. De auteurs suggereerden toentertijd dat de TF wellicht afkomstig was van TFpositieve leukocyten en monocyten. Muller et al. toonden door middel van elektronenmicroscopisch onderzoek aan dat TF-antigeen aanwezig was in de alfagranulae van rustende bloedplaatjes, en dat - na stimulatie van bloedplaatjes - TF aanwezig was op het oppervlak van de plaatjes. 16 Zij suggereerden dat TF wellicht wordt geïnternaliseerd door bloedplaatjes, zoals dat ook 297 v o l. 4 n r n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

3 werd gevonden voor andere eiwitten, onder andere factor V. Voorts onderzochten zij direct uit bloed geïsoleerde MP en MP afkomstig van bloedplaatjes, verkregen door middel van in-vitrostimulatie van de bloedplaatjes met collageen en trombine. MP van bloedplaatjes bevatten functioneel inactief TF, maar als een zeer sterke stimulus aan de bloedplaatjes of de MP was toegediend, hadden de MP wel TF-procoagulante activiteit. Zij suggereerden dan ook dat dergelijke MP afkomstig van gestimuleerde bloedplaatjes in vivo voorkomen en TF kunnen vervoeren naar verschillende delen van het lichaam, waardoor zij de stolling zowel lokaal als op afstand kunnen initiëren. 16 Ook in andere studies is met behulp van onder andere de flowcytometer aangetoond dat MP die antigenen afkomstig van plaatjes tot expressie brengen, ook TF-antigeen bevatten. Het werd echter niet duidelijk of dit TF afkomstig was van de bloedplaatjes zelf, dan wel het gevolg is van interactie met MP afkomstig van bijvoorbeeld geactiveerde endotheelcellen of monocyten. Ook is niet duidelijk of dit TF in een procoagulante, actieve vorm dan wel encrypted, dat wil zeggen in een biologisch niet-actieve vorm, aanwezig is. Lange tijd heeft men gedacht dat bloedplaatjes zelf geen TF kunnen maken en dus ook geen TF tot expressie kunnen brengen. De experimenten van Muller et al. wezen in de richting van de aanwezigheid van TF in de alfagranulae van circulerende bloedplaatjes. 16 Onlangs toonden Schwertz et al. aan dat rustende bloedplaatjes onvolledig gesplitst TF-pre-mRNA bevatten en dat activering van bloedplaatjes met trombine de vorming van rijp TF-mRNA en functioneel TF-eiwit stimuleert. 17 Dit zou betekenen dat bloedplaatjes na activering TF-antigeen tot expressie kunnen brengen, en - indien TF in de actieve vorm aanwezig is - ook in staat zouden kunnen zijn stolling op gang te brengen. Voorts zou dit betekenen dat MP die afkomstig zijn van gestimuleerde bloedplaatjes, ook TF tot expressie kunnen brengen, en - mits TF in actieve vorm aanwezig is - een bijdrage kunnen leveren aan het op gang brengen van de stolling. Rauch et al. toonden aan dat monocytaire cellijnen die TF tot expressie kunnen brengen, dit TF kunnen overbrengen op geactiveerde bloedplaatjes via MP, en het mogelijk maken de trombusvorming te initiëren. 18 Bloedplaatjes, maar ook plaatjes-mp, kunnen fuseren met monocyten. Dit zou een belangrijk en efficiënt mechanisme kunnen zijn van de in-vivovorming van biologisch actief TF. Uit studies in de muis, waarbij een door laser geïnduceerde vaatwandbeschadiging werd aangebracht, bleek dat P-selectine een belangrijke rol speelt bij de rekrutering van TF naar de trombus en bij de extensie van de trombus. 19 De TF die aanwezig was in deze trombi, kwam niet alleen uit de vaatwand zelf, maar ook uit blood-borne TF, afkomstig van MP in de circulatie. De precieze bron van deze TF bevattende MP is tot op heden niet bekend. Micropartikels en kanker Ondanks het feit dat het verband tussen kanker en trombose reeds meer dan 150 jaar geleden werd gelegd, is het tot op heden niet duidelijk wat de exacte pathofysiologie van deze kankergerelateerde trombose is. Het is een complex proces, waarbij verschillende factoren een rol spelen. De overheersende gedachte is dat de tumorcel zelf een sleutelpositie inneemt. Het zogeheten Trousseausyndroom, gekenmerkt door een tromboflebitis migrans, wordt meestal geassocieerd met mucineproducerende tumoren. In recent werk van Wahrenbrock et al. werd voor het eerst in diermodellen een causaal verband tussen mucines en het ontstaan van microtrombi aangetoond. 20 Zij toonden aan dat mucines die afgescheiden zijn door tumorcellen, binden aan P-selectines op bloedplaatjes en L-selectines op leukocyten, waarna de bloedplaatjes en de leukocyten aggregeren en microtrombi kunnen vormen. De eerste artikelen over een mogelijke rol van MP bij de ontwikkeling van trombose bij kanker, dateren uit de jaren 80 van de vorige eeuw. Dvorak toonde aan dat MP die afkomstig waren van tumorcellijnen, stollingsactiviteit bezitten. Het lukte hem echter niet een pathofysiologische relatie aan te tonen tussen de procoagulante activiteit van de MP en het ontwikkelen van trombose. 23 Na een stilte van enkele tientallen jaren verschenen in het begin van de 21 e eeuw de eerste artikelen over MP in relatie tot kanker. In 2004 toonden Yu et al. TFactiviteit aan in MP die afgesnoerd waren van 2 tumorcellijnen (HCT116 en A432). 24 Zij toonden met hun experimenten geen directe relatie tussen kanker, trombose en MP bij de mens aan. Tot op heden zijn slechts enkele (kleinere) studies gedaan bij kankerpatiënten. In 2003 toonden Kim et al. aan dat de hoeveelheid circulerende MP in het bloed bij kankerpatiënten toeneemt, wanneer deze patiënten zich in een gevorderd stadium van de ziekte bevinden. 25 Verder rapporteerde de groep n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 4 n r

4 Aanwijzingen voor de praktijk 1. Het mechanisme achter het ontwikkelen van kankergerelateerde trombose is tot op heden niet volledig opgehelderd. 2. Circulerende bloedcellen, maar ook endotheelcellen en wellicht tumorcellen, zijn in staat micropartikels te produceren met een procoagulante activiteit, door activering of apoptose. 3. Voor de isolatie, detectie en karakterisering van micropartikels worden in de diverse laboratoria verschillende technieken gebruikt, waardoor onderlinge vergelijking op dit moment niet goed mogelijk is. 4. Een toegenomen aantal micropartikels wordt gevonden in de bloedcirculatie van patiënten met ziektebeelden die geassocieerd zijn met een toegenomen stollingsneiging. 5. Bij kankerpatiënten in een gevorderd stadium van de ziekte worden grotere aantallen micropartikels geïsoleerd uit bloed dan bij kankerpatiënten in een vroeg stadium van de ziekte. 6. Bij kankerpatiënten met een adenocarcinoom en trombose wordt een verhoogde micropartikelgeassocieerde tissuefactoractiviteit gevonden en lijkt er een associatie te zijn met de aanwezigheid van mucine bevattende micropartikels in het bloed. van Hron dat er een correlatie is tussen het aantal TF-antigeen bevattende MP in het bloed en de D-dimeerspiegels bij patiënten met colorectaal kanker. In beide artikelen wordt niet ingegaan op de eventuele pathofysiologische rol van deze MP. Zwicker et al. lieten zien dat uit het bloed van patiënten met een pancreascarcinoom significant meer TF-antigeen bevattende MP kunnen worden geïsoleerd dan uit het bloed van gezonde mensen. Ook zij konden echter (nog) geen relatie leggen met het ontstaan van trombose. 27 In een recent verschenen artikel van Tesselaar et al. wordt voor het eerst een verband gevonden tussen MP-geassocieerde TF-activiteit en mucine bevattende MP, en tussen MP-geassocieerde TF-activiteit en het ontwikkelen van trombose (n=5) bij patiënten met een vergevorderd stadium van een pancreascarcinoom (n=23). 28 Het betreft een kleine studie en de schrijvers van het artikel kunnen niet met zekerheid zeggen waar de TF-activiteit bevattende MP precies vandaan komen. Zij laten echter wel duidelijk zien dat de groep kankerpatiënten met een adenocarcinoom van de pancreas en trombose grote aantallen in bloed circulerende MP hebben met een sterk toegenomen TF-activiteit. Een dergelijke, sterk toegenomen, MP-geassocieerde TF-activiteit werd niet gevonden in het bloed van gezonde mensen, van trombosepatiënten zonder kanker en ook niet in bloed van kankerpatiënten zonder trombose. Bij alle kankerpatiënten met trombose worden mucine bevattende MP in het bloed gevonden. Voorts blijken kankerpatiënten met een hoge MP-TF-activiteit en met mucinepositieve MP een veel kortere overleving te hebben dan kankerpatiënten die dit niet hebben (mediane overleving respectievelijk 1,6 en 6 maanden). Hoewel dit een kleine stap voorwaarts is, zal de toekomst moeten uitwijzen in hoeverre de MP daadwerkelijk een sleutelrol spelen bij het ontstaan van kankergerelateerde trombose. Conclusie MP worden gevonden in het bloed van gezonde mensen, maar de aantallen MP zijn duidelijk hoger bij verschillende ziekten met een grotere neiging tot trombose. Steeds meer artikelen verschijnen over MP en kanker en hun mogelijke rol bij het ontstaan van kankergerelateerde trombose. Zowel de studie van Zwicker et al. als de studie van Tesselaar et al. tonen aan dat in een cohort van patiënten met een adenocarcinoom van de pancreas, TF bevattende MP kunnen worden geïsoleerd uit het bloed van de 299 v o l. 4 n r n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

5 patiënt. In de studie van Tesselaar werd tevens een relatie gevonden tussen MP-TF-activiteit, mucine bevattende MP en het hebben van trombose. Hoewel de aantallen patiënten in beide studies nog beperkt zijn, lijken MP een rol te spelen bij kankergerelateerde trombose. Verder onderzoek naar de herkomst en precieze rol van deze TF bevattende MP is nodig om een antwoord op deze vraag te krijgen. Referenties 1. Blom JW, Doggen CJ, Osanto S, Rosendaal FR. Malignancies, prothrombotic mutations, and the risk of venous thrombosis. JAMA 2005;293: Blom JW, Vanderschoot JP, Oostindier MJ, Osanto S, Van der Meer FJ, Rosendaal FR. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. J Thromb Haemost 2006;4: Trousseau A. In Clinique medicale de l Hotel-dieu de Paris. Phlegmasia alba dolens. Paris: JB Balliere et Fils. 1865: Baron JA, Gridley G, Weiderpass E, Nyren O, Linet M. Venous thromboembolism and cancer. Lancet 1998;351: Boulanger CM, Scoazec A, Ebrahimian T, Henry P, Mathieu E, Tedgui A, et al. Circulating microparticles from patients with myocardial infarction cause endothelial dysfunction. Circulation 2001;104: Sabatier F, Darmon P, Hugel B, Combes V, Sanmarco M, Velut JG, et al. Type 1 and type 2 diabetic patients display different patterns of cellular microparticles. Diabetes 2002;51: Dignat-George F, Camoin-Jau L, Sabatier F, Arnoux D, Anfosso F, Bardin N, et al. Endothelial microparticles: a potential contribution to the thrombotic complications of the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost 2004;91: Pereira J, Alfaro G, Goycoolea M, Quiroga T, Ocqueteau M, Massardo L, et al Circulating platelet-derived microparticles in systemic lupus erythematosus. Association with increased thrombin generation and procoagulant state. Thromb Haemost 2006;95: Wolf P. Nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol 1967;13: Berckmans RJ, Nieuwland R, Boing AN, Romijn FP, Hack CE, Sturk A. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost 2001;85: Scott syndrome: an inherited defect of the procoagulant activity of platelets. Platelets 1997;8: Jimenez JJ, Jy W, Mauro LM, Horstman LL, Ahn YS. Elevated endothelial microparticles in thrombotic thrombocytopenic purpura: findings from brain and renal microvascular cell culture and patients with active disease. Br J Haematol 2001;112: Shet AS, Aras O, Gupta K, Hass MJ, Rausch DJ, Saba N, et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood 2003;102: Jy W, Horstman LL, Jimenez JJ, Ahn YS, Biro E, Nieuwland R, et al. Measuring circulating cell-derived microparticles. J Thromb Haemost 2004;2: Giesen PL, Rauch U, Bohrmann B, Kling D, Roque M, Fallon JT, et al. Blood-borne tissue factor: another view of thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96: Muller I, Klocke A, Alex M, Kotzsch M, Luther T, Morgenstern E, et al. Intravascular tissue factor initiates coagulation via circulating microvesicles and platelets. FASEB J 2003;17: Schwertz H, Tolley ND, Foulks JM, Denis MM, Risenmay BW, Buerke M, et al. Signal-dependent splicing of tissue factor pre-mrna modulates the thrombogenicity of human platelets. J Exp Med 2006;203: Rauch U, Bonderman D, Bohrmann B, Badimon JJ, Himber J, Riederer MA, et al. Transfer of tissue factor from leukocytes to platelets is mediated by CD15 and tissue factor. Blood 2000;96: Chou J, Mackman N, Merrill-Skoloff G, Pedersen B, Furie BC, Furie B. Hematopoietic cell-derived microparticle tissue factor contributes to fibrin formation during thrombus propagation. Blood 2004;104: Wahrenbrock M, Borsig L, Le D, Varki N, Varki A. Selectin-mucin interactions as a probable molecular explanation for the association of Trousseau syndrome with mucinous adenocarcinomas. J Clin Invest 2003;112: Dvorak HF, Quay SC, Orenstein NS, Dvorak AM, Hahn P, Bitzer AM, et al. Tumor shedding and coagulation. Science 1981;212: Dvorak HF, Van DeWater L, Bitzer AM, Dvorak AM, Anderson D, Harvey VS, et al. Procoagulant activity associated with plasma membrane vesicles shed by cultured tumor cells. Cancer Res 1983;43: Carr JM, Dvorak AM, Dvorak HF. Circulating membrane vesicles in leukemic blood. Cancer Res 1985;45: Yu JL, Rak JW. Shedding of tissue factor (TF)-containing microparticles rather than alternatively spliced TF is the main source of TF activity released from human cancer cells. J Thromb Haemost 2004;2: Kim HK, Song KS, Park YS, Kang YH, Lee YJ, Lee KR, et al. Elevated levels of circulating platelet microparticles, VEGF, IL-6 and RANTES in patients with gastric cancer: possible role of a metastasis predictor. Eur J Cancer 2003;39: Hron G, Kollars M, Weber H, Sagaster V, Quehenberger P, Eichinger S, et al. Tissue factor-positive microparticles: cellular origin and association with coagulation activation in patients with colorectal cancer. Thromb Haemost 2007;97: Zwicker JE, Furie BC, Kos CA, LaRocca T, Bauer KA, n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 4 n r

6 Furie B. Trousseau s Syndrome revisited: tissue factor-bearing microparticles in pancreatic cancer. Blood 2005;106: Tesselaar ME, Romijn FP, Van der Linden IK, Prins FA, Bertina RM, Osanto S. Microparticle-associated tissue factor activity: a link between cancer and thrombosis? J Thromb Haemost 2007;5: Ontvangen 18 april 2007, geaccepteerd 30 augustus C o r r e s p o n d e n t i e a d r e s Mw. drs. M.E.T. Tesselaar, internist-oncoloog Mw. dr. S. Osanto, internist-oncoloog Leids Universitair Medisch Centrum Afdeling Klinische Oncologie Postbus RC Leiden Tel.: adres: m.e.t.tesselaar@lumc.nl Prof. dr. R.M. Bertina, biochemicus Einthoven Laboratorium voor Experimentele Vasculaire Geneeskunde Afdeling Trombose en Hemostase Correspondentie graag richten aan de eerste auteur. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. 301 v o l. 4 n r n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e