Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation.

Transcriptie

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Stevanović, Sanja Title: Exploiting HLA-class II disparity for anti-tumor immunity by allogeneic cellular immunotherapy Issue Date:

2 CHAPTER 7 SYNOPSIS IN DUTCH NEDERLANDSE SAMENVATTING ACKNOWLEDGEMENTS DANKWOORD CURRICULUM VITAE LIST OF PUBLICATIONS

3

4 Synopsis in Dutch Nederlandse samenvatting SYNOPSIS IN DUTCH NEDERLANDSE SAMENVATTING HEMATOPOÏESE EN ACUTE LEUKEMIE In het beenmerg vindt de vorming van nieuwe bloedcellen plaats in een proces dat hematopoïese wordt genoemd. Hematopoïese verloopt via meerdere opeenvolgende stappen waarin uit hematopoïetische stamcellen door differentiatie verschillende rijpe bloedcellen worden gevormd, waaronder rode bloedcellen (nodig voor zuurstof transport), witte bloedcellen (functioneren als afweercellen) en bloedplaatjes (betrokken bij bloedstolling). De ontwikkeling van niet uitgerijpte bloedcellen tot rijpe bloedcellen gebeurt in twee verschillende takken van de hematopoïetische ontwikkeling. In de lymfatische tak worden de witte bloedcellen, T cellen, B cellen en NK cellen, gevormd, terwijl in de myeloïde tak vele andere soorten witte bloedcellen, zoals granulocyten, neutrofielen en monocyten, de rode bloedcellen en de bloedplaatjes gevormd worden. In verschillende stadia van de hematopoïese kunnen genetische mutaties optreden die de normale vorming van bloedcellen kunnen verstoren, wat kan leiden tot ongecontroleerde groei van getransformeerde, maligne bloedcellen in het beenmerg en perifeer bloed. Dit wordt leukemie genoemd. Acute leukemieën worden gekenmerkt door agressieve, ongecontroleerde groei en accumulatie van onrijpe bloedcellen in het beenmerg en perifeer bloed. Dit leidt tot verdringing van de normale hematopoïese en, als de ziekte niet behandeld wordt, binnen enkele weken tot de dood. Acute leukemieën worden onderverdeeld in twee typen, acute lymfatische leukemie (ALL) en acute myeloïde leukemie (AML). Daarnaast is de acute fase van chronische myeloïde leukemie (CML) een ziekte die klinisch vergelijkbaar is met een acute leukemie door de agressieve uitgroei van onrijpe maligne cellen van lymfatische of myeloïde origine. De zogenaamde blasten crisis CML (CML-BC) is de terminale fase van CML, een myeloproliferatieve ziekte die gekenmerkt wordt door de aanwezigheid van het Philadelphia chromosoom. Het Philadelphia chromosoom ontstaat als gevolg van een maligne transformatie in de hematopoïetische stamcel. Door additionele mutaties in de maligne cellen ontwikkelt CML zich van een chronische naar een acute fase. ALL komt het meeste voor bij kinderen en jong volwassenen (3 per ), maar treft ook volwassenen en ouderen (1 per ). AML is zeldzaam bij kinderen, maar komt het meeste voor bij volwassenen (3 per ) en neemt toe bij ouderen (16 per ). CML is ook zeldzaam bij kinderen, en komt het meeste voor bij volwassenen (1,5 per ) en ouderen (7 per ). In Nederland komen er jaarlijks 200 nieuwe ALL, 600 nieuwe AML en 500 nieuwe CML patiënten bij

5 Chapter 7 ALLOGENE STAMCELTRANSPLANTATIE De initiële behandeling van acute leukemie bestaat uit chemotherapie die gericht is op het uitroeien van de leukemie cellen. ALL en AML zijn heterogene ziektes die bestaan uit verschillende subtypen die verschillend reageren op deze behandeling. Afhankelijk van onder meer het subtype ALL en AML variëren de 5-jaar overlevingskansen met chemotherapie van 15 tot 50% in volwassen patiënten met ALL en 5 tot 70% in patiënten met AML. Patiënten met CML-BC responderen in ongeveer 40% van de gevallen op behandeling met chemotherapie, maar remissies zijn vaak van korte duur en vele patiënten krijgen een recidief van de leukemie. De meeste patiënten met acute leukemie kunnen niet genezen met alleen chemotherapie, en additionele behandelingswijzen zijn nodig. Een behandelwijze met potentieel curatief effect voor patiënten met hoog risico op een recidief van leukemie na chemotherapie is stamceltransplantatie (SCT). Aan de SCT gaat een pre-conditionerings behandeling vooraf bestaande uit intensieve chemotherapie en/of radiotherapie waardoor leukemiecellen maar ook gezonde hematopoïetische stamcellen van de patiënt vernietigd worden. Na de conditionering worden gezonde hematopoïetische stamcellen (graft) aan de patiënt toegediend, waaruit zich alle typen bloedcellen kunnen vormen en de normale hematopoïese van de patiënt weer kan herstellen. Deze stamcellen kunnen afkomstig zijn van de patiënt zelf (autoloog) of van een gezonde donor (allogeen). Bij een allogene SCT (allosct) wordt de hematopoïese van de patiënt geheel vervangen door het hematopoïetisch systeem van de donor (volledig donor chimerisme = het hematopoïetisch systeem van de patiënt is volledig afkomstig van de donor). Het voordeel van allosct is dat naast het herstellen van de hematopoïese ook een additioneel gunstig effect wordt bewerkstelligd door de aanwezigheid van donor afweercellen in het stamceltransplantaat, het zogenaamde Graft-versus- Leukemia (GvL) effect. Donor T cellen zijn afweercellen die een belangrijke rol spelen in het therapeutisch effect van allosct. Na de allosct, kunnen donor T cellen een sterke immuunreactie vormen tegen de eventueel na de pre-conditionerings behandeling overgebleven hematopoïetische cellen van de patiënt (mixed chimerisme = een deel van het hematopoïetisch systeem van de patiënt is afkomstig van de donor en een deel van de patiënt), waaronder ook leukemiecellen, doordat deze cellen als lichaamsvreemd worden herkend door donor T cellen. Deze gunstige afweerreactie van donor T cellen tegen residuele hematopoïetische cellen en leukemiecellen van de patiënt kan leiden tot genezing van de ziekte. Echter, donor T cellen kunnen ook een ongunstige afweerreactie vormen tegen de gezonde niet-hematopoïetische weefsels van de patiënt, die kan leiden tot Graftversus-Host Disease (GvHD). GvHD is een ernstige en potentieel levensbedreigende complicatie van allosct waarbij met name huid, darmen en/of lever van de patiënt door donor T cellen worden aangevallen. Om het optreden van GvHD te voorkomen, kunnen donor T cellen uit de allosct graft worden verwijderd voor de transplantatie (T cel gedepleteerde (TCD) allosct). Het hematopoïetisch systeem van de patiënt wordt dan vervangen door die van de donor, maar GvHD treedt niet op door afwezigheid van donor T cellen. TCD allosct leidt echter wel tot een verhoogd 124

6 Synopsis in Dutch Nederlandse samenvatting risico op een recidief van de leukemie in vergelijking met niet-tcd allosct, hetgeen bevestigt dat donor T cellen een belangrijke rol spelen in het voorkomen van recidief van de leukemie. DONOR LYMFOCYTEN INFUSIE ALS IMMUUNTHERAPIE Indien na allosct de leukemie recidiveert, kunnen patiënten behandeld worden met T cellen van de donor, de zogenaamde donor lymfocyten infusies (DLI), om GvL effect te induceren. DLI kan sterke GvL effecten bewerkstelligen met name in patiënten met minder agressieve vormen van leukemie, zoals chronische fase CML waarin in ongeveer 75% van de patiënten langdurige remissies worden geïnduceerd. Patiënten met agressieve leukemieën zoals ALL, AML en CML- BC responderen echter minder goed op behandeling met DLI met 2-jaar overlevingskansen variërend tussen 5 en 30%. Er zijn meerdere mogelijke redenen voor het falen van DLI in deze groep patiënten. Het recidief in ALL, AML en CML-BC kent een agressief beloop en het is daarom mogelijk dat donor T cellen niet in staat zijn om snel genoeg te expanderen tot hoeveelheden die een GvL effect kunnen bewerkstelligen. Een andere reden zou kunnen zijn dat deze leukemieën een slechte capaciteit hebben om donor T cellen te stimuleren. Het is bekend dat voor het induceren van effectieve primaire T cel responsen (bestaande uit antigeen onervaren T cellen uit het naïeve T cel repertoire), T cellen geactiveerd moeten worden door zogenaamde professionele antigeen presenterende cellen (APC), zoals dendritische cellen, die adhesie en co-stimulatie moleculen op het oppervlak tot expressie brengen die een belangrijke rol spelen bij T cel herkenning. Op ALL, AML en CML-BC cellen ontbreekt de expressie van de meeste adhesie en co-stimulatie moleculen, waardoor mogelijk geen herkenning van deze leukemiecellen door donor T cellen kan plaatsvinden. Het toedienen van DLI vroeg (binnen zes maanden) na TCD allosct om een recidief van leukemie te voorkomen (profylactisch) of om volledig donor chimerisme te induceren (preëmptief) heeft geleid tot betere uitkomsten voor patiënten met acute leukemieën. Het vroeg toedienen van DLI na TCD allosct leidt echter vaak tot ernstige GvHD, waaraan patiënten kunnen overlijden. Een hoog risico op GvHD in non-tcd allosct of na vroeg toedienen van DLI na TCD allosct wordt veroorzaakt door de heersende klinische omstandigheden. Door de pre-conditionerings behandeling wordt veel weefselschade in de patiënt aangericht, waardoor lichaamscellen en afweercellen proinflammatoire factoren maken en residuele professionele APC van de patiënt geactiveerd worden. Onder deze inflammatoire omstandigheden kunnen donor T cellen sterk gestimuleerd worden door residuele professionele APC van de patiënt wat kan leiden tot ernstige GvHD. Het toedienen van DLI laat na allosct, wanneer weefselschade is hersteld, pro-inflammatoire omstandigheden opgelost en patiënt APC vervangen zijn door donor APC, is geassocieerd met een lager risico op GvHD. Omdat recidieven van acute leukemieën vaak vroeg na TCD allosct optreden, is het uitstellen van behandeling met DLI vaak niet mogelijk. Het verbeteren van deze immuuntherapie 7 125

7 Chapter 7 is derhalve van belang om de uitkomst voor patiënten met acute leukemie te verbeteren door een optimale balans te vinden tussen GvL effect en GvHD. BIOLOGIE VAN IMMUUNREACTIES NA ALLOSCT EN DLI AlloSCT gaat gepaard met gunstige en ongunstige klinische effecten die veroorzaakt worden door allo-reactiviteit (herkenning als lichaamsvreemd) tussen patiënt en donor cellen. Patiënt afkomstige T cellen kunnen afstoting van de allosct graft veroorzaken doordat zij deze als lichaamsvreemd herkennen. Transplantaat afstoting wordt voorkomen door immuunsuppressieve middelen toe te dienen aan de patiënt voor en na allosct. Daarentegen kunnen donor afkomstige T cellen gunstige (GvL) en ongunstige (GvHD) effecten veroorzaken na allosct en DLI door herkenning van patiënt cellen (gezonde en maligne cellen) als lichaamsvreemd. T cellen kunnen lichaamsvreemde cellen (zoals pathogeen geïnfecteerde cellen) herkennen met behulp van een T cel receptor die zich op het celoppervlak van de T cel bevindt en deze cellen vervolgens elimineren. Elke T cel receptor is in principe specifiek voor een bepaald antigeen. Doordat men een groot aantal T cellen heeft met verschillende specificiteiten, kan er bescherming worden geboden tegen een groot aantal verschillende pathogenen. Via de T cel receptor worden kleine fragmenten van eiwitten (peptiden of antigenen genoemd) herkend die in de context van humane leukocyten antigenen (HLA) worden gepresenteerd. HLA moleculen zijn eiwitten die op het celoppervlak van alle lichaamscellen (behalve rode bloedcellen) tot expressie worden gebracht en intra- en extracellulaire antigenen aan T cellen kunnen presenteren. HLA moleculen die een rol spelen in immuunreacties worden verdeeld in HLA-klasse I (HLA-A, -B en -C) en HLA-klasse II (HLA-DR, -DQ en -DP) moleculen. HLA-klasse I moleculen komen constitutief tot expressie op alle kernhoudende cellen, terwijl HLA-klasse II moleculen met name op cellen van het hematopoïetisch systeem tot expressie worden gebracht. Echter, de expressie van HLA-klasse II moleculen op niet-hematopoïetische cellen kan worden geïnduceerd door proinflammatoire cytokines. Het T cel compartiment wordt onderverdeeld in T cellen die de CD4 coreceptor tot expressie brengen (CD4+ T cellen) en T cellen die de CD8 co-receptor tot expressie brengen (CD8+ T cellen). CD4+ T cellen herkennen antigenen in de context van HLA-klasse II moleculen en worden met name gezien als helper T cellen. Helper CD4+ T cellen produceren diverse cytokines en bevorderen de effector functies van CD8+ T cellen en verschillende functies van andere afweercellen. CD8+ T cellen herkennen antigenen in de context van HLA-klasse I moleculen en worden met name gezien als effector T cellen doordat zij vreemde cellen direct kunnen lyseren (cytotoxische activiteit). In het geval van allosct worden patiënten en donoren preferentieel gematcht voor HLA moleculen, omdat bekend is dat HLA verschillen tot sterke allo-reactiviteit en dus ernstige GvHD kunnen leiden. Complete HLA match houdt in dat alle HLA-klasse I en HLA-klasse II moleculen (12/12 HLA allelen match) tussen patiënt en donor overeenkomen. Dit wordt HLA- 126

8 Synopsis in Dutch Nederlandse samenvatting identieke (familie donor) of volledig HLA-gematchte (ongerelateerde donor) allosct genoemd (HLA-matched allosct). In ongeveer 30% van alle allosct kan een dergelijke donor worden gevonden. Overige patiënten kunnen worden getransplanteerd met donoren die niet volledig gematcht zijn voor alle HLA moleculen (HLA-mismatched allosct). Ongerelateerde allosct worden preferentieel gedaan met donoren die gematcht zijn voor alle HLA-klasse I moleculen en voor de HLA-klasse II moleculen HLA-DR en -DQ, omdat is aangetoond dat een mismatch tussen patiënt en donor voor één van deze HLA moleculen een negatief effect heeft op de uitkomst van de patiënt. Matching voor het HLA-klasse II molecuul HLA-DP wordt niet standaard uitgevoerd. Tijdens de ontwikkelingsfase van T cellen in de thymus worden T cellen die lichaamseigen antigenen in de context van eigen HLA moleculen herkennen verwijderd om autoreactiviteit te voorkomen. Het T cel compartiment van mensen bestaat derhalve uit T cellen die lichaamsvreemde antigenen (o.a. pathogeen afkomstige antigenen) in de context van eigen HLA moleculen kunnen herkennen. Bij HLA-matched allosct vindt GvL effect en GvHD plaats doordat allo-reactieve donor T cellen lichaamsvreemde antigenen afkomstig van de patiënt herkennen in de context van eigen HLA moleculen (zelf-hla, gemeenschappelijk HLA molecuul tussen patiënt en donor). Deze allo-antigenen worden minor histocompatibiliteits antigenen (MiHA) genoemd en zijn afkomstig van eiwitten met aminozuur verschillen (polymorfe eiwitten) tussen patiënt en donor door genetische polymorfismen (variaties in het DNA). Als MiHA tot expressie worden gebracht op lichaamscellen van de patiënt, kunnen donor T cellen na allosct en DLI de cellen van de patiënt als lichaamsvreemd herkennen en deze elimineren. MiHA kunnen breed tot expressie worden gebracht op alle lichaamscellen van de patiënt, zowel op normale en maligne hematopoïetische cellen als op niet-hematopoïetische cellen. Donor CD8+ en CD4+ T cellen die deze MiHA herkennen in de context van respectievelijk zelf-hla-klasse I en zelf-hla-klasse II moleculen, kunnen naast GvL effect ook GvHD induceren. Andere MiHA komen selectief tot expressie op normale en maligne hematopoïetische cellen, maar niet op niet-hematopoïetische weefsels. Donor CD4+ en CD8+ T cellen die deze hematopoïese-specifieke MiHA herkennen kunnen mogelijk GvL effect geven zonder of met weinig GvHD. Bij HLA-mismatched allosct vindt GvL effect en GvHD plaats doordat allo-reactieve donor T cellen antigenen in de context van een vreemd HLA molecuul (allo-hla, verschillend HLA molecuul tussen patiënt en donor) herkennen. Deze allo-reactiviteit wordt veroorzaakt door donor T cellen die oorspronkelijk ontwikkeld zijn met als doel een lichaamsvreemd antigeen in de context van het eigen HLA te herkennen, maar die kruis-reactiviteit vertonen met een vreemd HLA molecuul dat een antigeen presenteert. De frequentie van allo-reactieve T cellen die allo- HLA moleculen herkennen is keer hoger dan de frequentie van allo-reactieve T cellen die MiHA in de context van zelf-hla moleculen herkennen. Hierdoor is de sterkte van een immuunrespons over een HLA barrière meestal hoger dan bij HLA-identieke allosct. Echter, mismatching voor HLA-klasse I moleculen wordt preferentieel vermeden omdat deze moleculen op alle lichaamscellen tot expressie komen en allo-reactieve donor CD8+ T cellen die allo-hla-klasse 7 127

9 Chapter 7 I moleculen herkennen derhalve ernstig GvHD kunnen induceren. In tegenstelling tot HLA-klasse I moleculen, komen HLA-klasse II moleculen met name tot expressie op normale hematopoïetische cellen en op de meeste B cel en myeloïde leukemieën. Donor CD4+ T cellen gericht tegen allo- HLA-klasse II moleculen kunnen daarom mogelijk GvL effect induceren zonder ernstige GvHD. Doordat de expressie van HLA-klasse II moleculen op niet-hematopoïetische cellen geïnduceerd kan worden onder inflammatoire omstandigheden, kunnen donor CD4+ T cellen gericht tegen allo- HLA-klasse II moleculen mogelijk ook GvHD induceren onder bepaalde voorwaarden. DOEL VAN STUDIES IN DIT PROEFSCHRIFT Recidief van leukemieën na allosct kan behandeld worden met DLI gebaseerde immuuntherapie, maar de gunstige GvL effecten zijn vaak geassocieerd met ongunstige en levensbedreigende GvHD. Lage dosis van DLI kan worden toegepast om ernstige GvHD te voorkomen, maar lage doses induceren waarschijnlijk geen effectieve GvL respons tegen agressieve acute leukemieën. Vroegtijdige interventies met DLI na TCD allosct kunnen wellicht recidieven van leukemie voorkomen, maar het optreden van GvHD blijft een ernstige complicatie van deze behandeling. Nieuwe T cel gebaseerde immuuntherapieën met hoge effectiviteit tegen acute leukemieën maar beperkte toxiciteit door GvHD zijn daarom gewenst om de uitkomst voor patiënten met agressieve leukemieën te verbeteren. Op basis van differentiële weefseldistributie van HLA-klasse II moleculen op hematopoïetische en niet-hematopoïetische cellen onder niet-inflammatoire omstandigheden, zijn (vreemde) HLA-klasse II moleculen als doelwit voor CD4+ T cel immuuntherapieën na TCD allosct een mogelijke strategie om selectief GvL effect te bewerkstelligen tegen HLA-klasse II positieve leukemieën zonder inductie van ernstige GvHD. Klinische studies hebben aangetoond dat behandelingen na TCD allosct met DLI waaruit CD8+ T cellen zijn verwijderd kunnen leiden tot sterke GvL effecten en conversie naar volledig donor hematopoïese, terwijl het optreden van GvHD beperkt blijft. Echter, diverse relevante vragen omtrent de werkzaamheid en optimale omstandigheden voor toediening en ontwerp van CD4+ T cel gebaseerde immuuntherapieën kunnen in een gecompliceerde klinische setting niet adequaat worden bestudeerd. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift was erop gericht een aantal klinisch relevante vragen betreffende CD4+ T cel gebaseerde DLI te beantwoorden in een pre-klinisch muizenmodel voor humane acute leukemie én de effectiviteit en toxiciteit van CD4+ T cel gebaseerde DLI te onderzoeken in de klinische setting. 128

10 Synopsis in Dutch Nederlandse samenvatting DIT PROEFSCHRIFT In de eerste drie studies van dit proefschrift is gebruik gemaakt van een NOD/scid muizenmodel van humane (B cel afkomstige) ALL en CML-BC om de werkzaamheid van DLI tegen deze acute leukemieën te onderzoeken. NOD/scid muizen zijn immunodeficiënt op basis van afwezigheid van de meeste afweercellen (geen T en B cellen, verlaagde NK cel aantallen) in hun immuunsysteem. Daardoor kunnen deze muizen humane leukemiecellen niet afstoten. Humane ALL en CML-BC cellen, in tegenstelling tot AML cellen, kunnen reproduceerbaar uitgroeien in hematopoïetische organen van NOD/scid muizen. Daarom zijn de studies in dit proefschrift uitgevoerd met NOD/scid muizen getransplanteerd met humane ALL of CML-BC leukemieën. Na intraveneuze inoculatie kan de progressie en uitgroei van humane leukemie in perifeer bloed van de muizen kwantitatief worden gevolgd door het wekelijks afnemen van bloedmonsters. De gevestigde leukemie kan worden behandeld met humane T cel gebaseerde immuuntherapieën en het GvL effect van deze therapieën kan eveneens kwantitatief worden gevolgd door aantallen leukemiecellen en T cellen te meten in het perifere bloed van muizen. Zowel de agressieve aard van ALL en CML-BC alsmede de lage of afwezige expressie van adhesie- en costimulatoire moleculen op deze leukemieën waardoor zij geringe capaciteit hebben om donor T cellen te stimuleren (lage immunogeniciteit) zijn mogelijke redenen voor lage effectiviteit van DLI tegen recidieven van ALL en CML-BC. In het bijzonder kan worden verwacht dat de effectiviteit van HLA-matched DLI tegen ALL en CML-BC beperkt is omdat alloreactiviteit wordt veroorzaakt door laag frequente T cellen die gericht zijn tegen MiHA en zich bevinden in het naïeve donor repertoire. Het is bekend dat naïeve T cellen die nog nooit eerder met vreemde antigenen in aanraking zijn geweest, geactiveerd moeten worden door professionele APC die diverse adhesie- en costimulatoire moleculen hoog tot expressie brengen om daarna te kunnen differentiëren tot antigeen-specifieke effector T cellen. Allo-HLA reactiviteit na HLA-mismatched DLI kan door naïeve T cellen, maar ook door memory T cellen worden veroorzaakt die reeds eerder met vreemd antigeen in aanraking zijn geweest. In tegenstelling tot naïeve T cellen, kunnen memory T cellen snel en efficiënt worden geactiveerd door niet-professionele APC omdat ze minder adhesie en co-stimulatoire moleculen vereisen. In hoofdstuk 2 is het GvL effect van HLAmatched (12/12 alleles) en HLA-klasse II mismatched DLI tegen gevestigde humane HLA-klasse II positieve ALL en CML-BC onderzocht en vergeleken in NOD/scid muizen. Behandeling van muizen met gevestigde ALL en CML-BC met HLA-matched DLI veroorzaakte slechts vertraagde uitgroei van de leukemiecellen in perifeer bloed in vergelijking met niet-behandelde muizen, terwijl de leukemiecellen in muizen behandeld met HLA-klasse II mismatched DLI snel en effectief werden geëlimineerd. In vivo geëxpandeerde CD4+ en CD8+ T cellen na behandeling met DLI werden uit muizen organen individueel geïsoleerd en opgegroeid tot T cel klonen. Geen van de geïsoleerde CD4+ en CD8+ T cel klonen uit muizen behandeld met HLA-matched DLI waren in staat de leukemiecellen van de patiënt te herkennen. De meeste CD4+ T cel klonen uit muizen 7 129

11 Chapter 7 behandeld met HLA-klasse II mismatched DLI waren allo-reactief en herkenden gemismatchte HLA-klasse II moleculen op de leukemiecellen en hematopoïetische cellen van de patiënt. CD8+ T cel klonen uit deze muizen waren niet allo-reactief. De resultaten van dit onderzoek laten zien dat HLA-matched DLI niet in staat was een effectieve GvL respons te induceren tegen ALL en CML-BC, terwijl deze leukemieën wel in staat waren effectieve T cel responsen te induceren over een HLA-klasse II barrière. De data illustreren de relevantie van HLA-klasse II mismatching voor effectieve behandeling van agressieve en laag immunogene HLA-klasse II positieve leukemieën. T cellen worden oorspronkelijk in de thymus geselecteerd met als doel vreemde antigenen in zelf-hla te herkennen, terwijl geen selectie plaatsvindt op basis van allo-hla moleculen. Allo- HLA reactiviteit wordt veroorzaakt door T cellen die kruis-reactiviteit vertonen tegen antigenen gepresenteerd in allo-hla moleculen. Het is mogelijk dat allo-hla reactieve T cellen breed kruisreactief zijn en meerdere allo-hla moleculen kunnen herkennen. Dit kan nadelige gevolgen hebben voor de patiënt die getransplanteerd is met meerdere HLA-mismatched allosct, omdat immuuntherapie met allo-hla reactieve T cellen met potentieel gunstige reactiviteit mogelijk nadelig GvHD kunnen induceren door off-target reactiviteit tegen andere allo-hla moleculen. In hoofdstuk 3 is het potentiële risico op off-target reactiviteit onderzocht in een allo-hlaklasse II gerichte T cel immuunrespons geïnduceerd in NOD/scid muizen met gevestigde HLAklasse II positieve CML-BC na behandeling met HLA-klasse II mismatched DLI. Omdat GvL effecten in muizen na DLI kunnen optreden met en zonder xeno-reactiviteit (= xenogene GvHD, muizen kunnen ziek worden na inspuiten van humane T cellen), is onderzocht of xeno-reactiviteit veroorzaakt wordt door off-target kruis-reactiviteit van allo-hla-klasse II reactieve T cellen met GvL effect of dat xeno-reactiviteit en GvL effecten door verschillende T cellen worden geïnduceerd. Klonale analyse van CD4+ en CD8+ T cellen geïsoleerd uit muizen ten tijde van GvL effecten en xenogene GvHD heeft laten zien dat de T cel respons geïnduceerd na HLA-klasse II mismatched DLI bestond uit een mix van allo-hla-klasse II leukemie-reactieve CD4+ T cellen en andere CD4+ en CD8+ T cellen die antigenen herkenden in muizen histocompatibiliteits moleculen (H-2- klasse I of H-2-klasse II). De resultaten van dit onderzoek laten zien dat GvL effecten en xenogene GvHD worden veroorzaakt door T cellen met verschillende specificiteiten, en dat allo-hlaklasse II leukemie-reactieve T cellen geïnduceerd in vivo geen brede kruis-reactiviteit vertonen tegen vreemde histocompatibiliteits moleculen. De data illustreren eveneens dat het NOD/scid muizenmodel voor humane leukemie geschikt is om in vivo GvL effectiviteit van T cel gebaseerde immuuntherapieën te bestuderen waarbij tevens hun potentieel tot brede kruis-reactieve off-target herkenning kan worden onderzocht. DLI gebaseerd op CD4+ T cellen in vergelijking met ongeselecteerde DLI leidt mogelijk tot een beperkt risico op ernstige GvHD door enerzijds de afwezigheid van CD8+ T cellen die alloantigenen in de context van breed tot expressie voorkomende HLA-klasse I moleculen herkennen en anderzijds door de beperkte expressie van HLA-klasse II moleculen op normale en maligne hematopoïetische cellen, maar niet op niet-hematopoïetische weefsels, onder niet-inflammatoire 130

12 Synopsis in Dutch Nederlandse samenvatting omstandigheden. Klinische studies hebben aangetoond dat behandeling van patiënten met CD8+ T cel gedepleteerde DLI na TCD allosct kan leiden tot GvL effecten en conversie naar volledig donor hematopoïese zonder optreden van ernstige GvHD. In deze studies is het echter onduidelijk of de klinische responsen (GvL effect en GvHD) door de CD4+ T cellen zijn veroorzaakt of door residuele donor CD8+ T cellen uit de allosct graft of contaminerende CD8+ T cellen in de DLI. In hoofdstuk 4 is daarom onderzocht of CD4+ T cellen, in absolute afwezigheid van CD8+ T cellen, als effector T cellen konden functioneren tegen HLA-klasse II gemismatchte ALL en CML-BC. CD4+ DLI induceerde effectieve GvL responsen tegen ALL en CML-BC in NOD/ scid muizen en activeerde leukemiecellen om adhesie en co-stimulatie moleculen tot expressie te brengen (leukemisch APC fenotype) vergelijkbaar met ongeselecteerde DLI. Klonale analyse van CD4+ T cellen uit CD4+ DLI behandelde muizen toonde aan dat allo-reactieve CD4+ T cel klonen specifiek waren voor verschillende allo-hla-klasse II moleculen van de patiënt. Deze CD4+ T cel klonen konden als effector T cellen functioneren met directe cytotoxische activiteit tegen leukemiecellen van de patiënt, maar ook als helper T cellen door pro-inflammatoire cytokines te produceren die leukemiecellen activeren om een leukemisch APC fenotype te verkrijgen. De resultaten van dit onderzoek laten zien dat CD4+ T cellen gericht tegen allo-hla-klasse II moleculen als potente effector T cellen kunnen dienen. De data tonen de relevantie aan van CD4+ T cel gebaseerde immuuntherapieën voor effectieve behandeling van HLA-klasse II positieve agressieve leukemieën na allosct. Om het klinisch effect van CD4+ DLI in patiënten te onderzoeken is gestart met een klinische studie waarin patiënten met hematologische maligniteiten 3 maanden na TCD allosct profylactisch (geen recidief) worden behandeld met hoog gezuiverde CD4+ DLI. In hoofdstuk 5 is het klinisch effect van CD4+ DLI na HLA-klasse II mismatched TCD allosct onderzocht en gekarakteriseerd in twee patiënten met AML na transplantatie met een HLA-DP gemismatchte (10/10 match) ongerelateerde donor. Beide patiënten converteerden na CD4+ DLI naar volledig donor chimerisme, maar ontwikkelden ook ernstige darm GvHD. In beide patiënten werd het klinisch beloop en de specificiteit van T cel immuunresponsen in detail onderzocht om het immuunmechanisme voor het ontstaan van klinische responsen te onderzoeken en om inzicht te verkrijgen in de klinische omstandigheden die ten grondslag kunnen liggen aan het ontstaan van GvHD. Klonale analyse en karakterisatie van de reactiviteit van CD4+ en CD8+ T cellen geïsoleerd uit patiënten tijdens GvHD hebben laten zien dat alleen CD4+ T cellen allo-reactief waren tegen de gemismatchte HLA-DP moleculen van de patiënt. Deze allo-reactieve CD4+ T cel klonen herkenden zowel HLA-DP positieve hematopoïetische cellen als niet-hematopoïetische huidfibroblasten van de patiënt indien gekweekt onder pro-inflammatoire omstandigheden om de expressie van HLA-DP op huidfibroblasten te induceren. Analyse van het klinisch beloop van de patiënten suggereerde dat deze inflammatoire omstandigheden waren veroorzaakt door reactivaties van het cytomegalovirus (CMV) die de patiënten hadden ondergaan voor en na CD4+ DLI en de anti-cmv T cel immuunresponsen die daarop volgden. Wij hebben kunnen aantonen dat CMV 7 131

13 Chapter 7 infectie van niet-hematopoïetische huidfibroblasten in vitro niet tot inductie van HLA-klasse II expressie leidt, maar dat CMV infectie in de darm in vivo wel HLA-klasse II expressie kan induceren op het darmepitheel, waarschijnlijk door pro-inflammatoire cytokines geproduceerd door verschillende afweercellen. Het is daarom aannemelijk dat anti-cmv specifieke T cellen een lokale immuunrespons hebben geïnduceerd tegen CMV geïnfecteerd darmepitheel in beide patiënten, waardoor pro-inflammatoire cytokines zijn geproduceerd die HLA-klasse II expressie op niet-hematopoïetisch darmepitheel hebben geïnduceerd. Daardoor is het darmepitheel doelwit geworden voor donor HLA-DP specifieke CD4+ T cellen in GvHD. De resultaten van dit onderzoek laten zien dat GvHD na HLA-DP mismatched CD4+ DLI door allo-hla-klasse II reactieve CD4+ T cellen kan worden geïnduceerd. De data geven bovendien relevant inzicht in klinische omstandigheden, zoals het optreden van virale immuunresponsen in patiënten ten tijde van toediening van DLI, die GvHD kunnen ontlokken na immuuntherapie met CD4+ DLI. SAMENVATTEND De beperkte expressie van HLA-klasse II moleculen op de cellen van hematopoïetische afkomst onder niet-inflammatoire omstandigheden is de fundamentele basis voor het selectief aanvallen van HLA-klasse II positieve hematologische maligniteiten door CD4+ T cellen met een laag risico op GvHD. In dit proefschrift hebben wij aangetoond dat allo-hla-klasse II gerichte CD4+ T cellen na behandeling met CD4+ HLA-klasse II mismatched DLI effectief GvL effect kunnen induceren tegen agressieve acute leukemieën in een pre-klinisch in vivo muizenmodel. Daarnaast hebben wij in patiënten na behandeling met CD4+ HLA-klasse II mismatched DLI aangetoond dat allo- HLA-klasse II gerichte CD4+ T cellen ook ernstige GvHD kunnen veroorzaken ten gevolge van geïnduceerde expressie van HLA-klasse II moleculen op niet-hematopoïetische weefsels onder inflammatoire omstandigheden. Het verkregen inzicht in de klinische omstandigheden die GvHD kunnen ontlokken na CD4+ DLI is van groot belang om in de toekomst HLA-klasse II gerichte CD4+ T cel responsen te sturen richting selectieve GvL reactiviteit zonder inductie van GvHD. Een mogelijkheid is de dosis van CD4+ DLI te verlagen om de magnitude van de immuunrespons te beperken. Andere mogelijkheden zijn het tijdstip van toediening van CD4+ DLI te baseren op de heersende klinische omstandigheden of CD4+ T cellen toe te dienen die antigenen herkennen die ook onder inflammatoire omstandigheden selectief op hematopoïetische cellen tot expressie komen. Al deze strategieën exploiteren het therapeutisch potentieel van CD4+ T cellen om selectief HLA-klasse II positieve hematologische maligniteiten aan te vallen en zo een optimale balans tussen gunstige GvL effecten en ongunstige GvHD te bewerkstelligen. 132

14 Acknowledgements Dankwoord ACKNOWLEDGEMENTS DANKWOORD When things don t go right, just turn left is een simpel maar treffend advies geweest welke ik ter harte heb proberen te nemen gedurende mijn promotietraject. Het heeft zijn vruchten afgeworpen getuige het resultaat, mijn proefschrift is een feit! Graag wil ik mijn dank uitspreken aan allen die hebben bijgedragen aan de totstandkoming van dit proefschrift. Verder wil ik graag eenieder die betrokkenheid heeft getoond, op welke wijze dan ook, laten weten dat dit nooit onopgemerkt voorbij is gegaan en dat het altijd werd gewaardeerd. In het bijzonder wil ik mensen bedanken met wie ik direct heb samengewerkt. Marianke: jij hebt met veel inspanning gewerkt aan experimenten met muizen die terug te vinden zijn in mijn proefschrift. Jouw inzet heb ik altijd gewaardeerd, bedankt! Kees en Simone: met een flinke dosis enthousiasme, schwung, toewijding én eigenwijsheid hebben jullie in een recordtijd een berg werk verzet. Bedankt! Kees, ik kijk uit naar jouw proefschrift, veel succes met de afronding! Simone, dank ook voor je interesse en geregelde schouderklopjes! Boris: dank voor het creëren van indrukwekkende immunohistochemie data! Jouw boekje is nu ook in zicht! Veel succes met je opleiding! Jessica: dank voor je inzichtelijke chimerisme data! Onze (niet-) wetenschappelijke gesprekken zullen mij altijd bijblijven. Veel succes in Oslo! Stijn: dank voor het verschaffen van de klinische CD4 DLI studie data. Inge: dank voor het meedenken en organiseren van (hopelijk) de laatste experimenten voor hs 5! Buiten het EXHE lab ben ik enkele mensen ook dankbaar voor hun bijdrage aan dit proefschrift. Daniela en Saskia: dank voor de pathohistologische analyses van muizen! Daniela, veel succes met de studie-uurtjes op zondag voor je examen! Saskia, samen hebben we ontdekt dat vele cruciale stapjes in de immunohistochemie protocollen compleet overbodig zijn! Katja: dank voor het creëren van de X/Y FISH data. Onze korte samenwerking was verfrissend mede door jouw flexibele en onbaatzuchtige houding. Veel succes met je duo-baan! De studente Iris Nijman wil ik bedanken voor haar inzet tijdens haar stage op de afdeling. Veel succes in het vervolg van je studie en je verdere carrière! Bijzonder waardevol zijn de vrijdagochtend AIO werkbesprekingen met Anita, Judith en Margot geweest tijdens mijn promotietraject. Onze discussies hebben mij onder andere veel kritischer leren nadenken over andermans, maar ook eigen, onderzoeksdata. Dank voor jullie input! Het werken op het EXHE lab met alle behulpzame collega s was bovendien plezierig. Alle stafleden en AIO s ben ik dankbaar voor de wetenschappelijke inbreng. Alle analisten ben ik dankbaar voor het zo ontzettend goed laten functioneren van het lab. De secretaresses ben ik dankbaar voor alle administratieve afhandelingen. Speciaal woord wil ik echter richten tot enkelen. Edith: dank voor je behulp- en zorgzaamheid! Volgende skitrip gaan we off-piste! Hetty: 7 133

15 Chapter 7 je optimisme en goed humeur zorgden altijd voor een leuke sfeer! Veel succes in je vervolgcarrière! Pleun: onze therapeutische sessies - stoom afblazen hebben mij in onze schrijfperiode goed gedaan! Jij bent een kanjer, veel succes met je post-doc baan! Matthijs: onze inspirerende gesprekken onder het genot van drankjes waren in de spannende schrijfperiode zeer prettig! Bedankt! Nu nog een sprintje tot 1 april en veel succes erna in R dam! Anita en Roos: wij hebben echt het lief en leed gedeeld en een bijzondere vriendschapsband ontwikkeld. Jullie stonden altijd voor mij klaar, ontzettend dank! Anita: wederzijds verbindend was onze drive voor het onderzoek, maar ook de verwondering voor Nederlandse gebruiken en uitdrukkingen! Roos: jouw veerkracht en volharding zijn menigmaal mijn inspiratiebron geweest! Veel succes in jullie carrières na jullie promotie! Mijn paranimfen, Henriette en Alwine, ontzettend fijn dat jullie bij de verdediging naast mij willen staan! Jullie stonden altijd klaar met een luisterend oor of een helpende hand op het lab. Bedankt! Bart wil ik graag bedanken voor zijn wetenschappelijke begeleiding in de eerste stappen van mijn promotietraject en zijn correcte en goedhartige houding tijdens onze samenwerking. Mijn co-promotor wil ik graag bedanken voor haar dagelijkse wetenschappelijke begeleiding, creatieve input, zinvolle wetenschappelijke discussies en haar aanstekelijke enthousiasme. Mijn promotor wil ik graag bedanken voor zijn onuitputtelijke geduld, reflectieve wetenschappelijke begeleiding en vertrouwen in de afgelopen jaren. Mijn vrienden die mij ontzettend dierbaar zijn, wil ik vanzelfsprekend bedanken voor hun belangstelling in mijn onderzoek, luisterend oor en direct opvang in allerlei crisismomenten én vele broodnodige afleidingen! Tot slot mijn familie die ik ontzettend liefheb. Ik had dit nooit kunnen doen zonder hun onophoudelijke steun, begrip, aanmoediging en liefde. Hvala vam do neba za podrške, razumijevanje i ljubav! Sanja 134

16 Curriculum Vitae CURRICULUM VITAE Sanja Stevanović werd geboren op 11 november 1982 te Travnik, Bosnië en Herzegovina, voormalig Joegoslavië. Daar heeft zij het eerste deel van haar jeugd doorgebracht waarna zij in 1993 naar Nederland is verhuisd. In 1995 werd er gestart met de V.W.O. opleiding aan het Wolfert van Borselen Scholengemeenschap te Rotterdam, welke in 2000 is afgerond. In datzelfde jaar is zij begonnen met de vijfjarige studie Bio-Farmaceutische Wetenschappen aan de Universiteit Leiden. De Masterstages werden uitgevoerd op de afdeling van Experimentele Chirurgische Oncologie van het Erasmus Medisch Centrum (begeleiding Ing. A.L.B. Seynhaeve, Dr. T.L.M. ten Hagen en Prof. Dr. A.M.M. Eggermont) en op de afdeling van Farmacologie van het Leiden/ Amsterdam Center for Drug Research (begeleiding Drs. C.C. Visser, Dr. A.G. de Boer en Prof. Dr. M. Danhof). In 2005 werd de Master titel behaald in de Bio-Farmaceutische Wetenschappen. In datzelfde jaar werd begonnen met de tweede Master studie, een versnelde éénjarige Master opleiding in de Forensische Wetenschappen aan de Universiteit van Amsterdam. De Masterstage werd uitgevoerd op de afdeling van niet-humaan DNA onderzoek in het Nederlands Forensisch Instituut (begeleiding Drs. M. Wesselink en Dr. I. Kuiper). In 2006 werd de Master titel behaald in de Forensische Wetenschappen. Van november 2006 tot en met december 2011 is het in dit proefschrift beschreven promotieonderzoek uitgevoerd op het Laboratorium voor Experimentele Hematologie in het Leids Universitair Medisch Centrum onder leiding van Dr. B.A. Nijmeijer ( ), Dr. M. Griffioen (2008-) en Prof. Dr. J.H.F. Falkenburg. Vanaf 1 april 2013 zal zij werkzaam zijn als post-doc onderzoeker in de sectie Tumor Immunology Surgery Branch in the National Cancer Institute, dat een onderdeel is van the National Institutes of Health (Bethesda, Maryland, Verenigde Staten), onder leiding van Dr. C.S. Hinrichs en Prof. Dr. S.A. Rosenberg. Hier zal zij gaan werken aan het optimaliseren van T cel immuuntherapie voor patiënten met humaan papillomavirus geïnduceerde maligniteiten

17 Chapter 7 CURRICULUM VITAE NAME: Sanja Stevanović DATE OF BIRTH: November, 11, 1982 PLACE OF BIRTH: Travnik, Bosnia and Herzegovina, former Yugoslavia EDUCATION: Pre-University Education Wolfert van Borselen, Rotterdam, The Netherlands MSc. Bio-Pharmaceurical Sciences Leiden University, Leiden, The Netherlands MSc. Forensic Science University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands PhD student Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands Department of Hematology, Laboratory for Experimental Hematology Promotor: Prof. Dr. J.H.F. Falkenburg Co-promotor: M. Griffioen Post-doctoral fellow National Cancer Institute at the National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, United States Surgery Branch Supervision: Dr. C.S. Hinrichs, Prof. Dr. S.A. Rosenberg 136

18 List of Publications LIST OF PUBLICATIONS Accepted publications S Stevanović, MLJ van Schie, M Griffioen and JHF Falkenburg. HLA-class II disparity is necessary for effective T cell mediated Graft-versus-Leukemia effects in NOD/scid mice engrafted with human acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2012 Sept; In press: doi: / leu S Stevanović, M Griffioen, BA Nijmeijer, MLJ van Schie, AN Stumpf, CE Rutten, R Willemze and JHF Falkenburg. Human allo-reactive CD4+ T cells as strong mediators of anti-tumor immunity in NOD/scid mice engrafted with human acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2012 Feb; 26 (2): Submitted publications S Stevanović, BA Nijmeijer, MLJ van Schie, DCF Salvatori, S Maas, M Griffioen and JHF Falkenburg. Distinct human allo-mhc reactive T cells mediate anti-tumor immunity and xenoreactivity in NOD/scid mice engrafted with human acute leukemia. Submitted S Stevanović, CAM van Bergen, SAP van Luxemburg-Heijs, B van der Zouwen, ES Jordanova, AB Kruisselbrink, M van de Meent, JC Harskamp, FHJ Claas, EWA Marijt, JJ Zwaginga, CJM Halkes, I Jedema, M Griffioen and JHF Falkenburg. HLA-class II upregulation during an ongoing viral infection can lead to HLA-DP directed Graft-versus-Host Disease after CD4+ donor lymphocyte infusion. Submitted Publications not in the manuscript CC Visser, S Stevanović, LH Voorwinden, L Van Bloois, PJ Gaillard, M Danhof, DJA Crommelin and AG de Boer. Targeting liposomes with protein drugs to the blood-brain barrier in vitro. European Journal of Pharmaceutical Science 2005 Jun; 25 (2-3): CC Visser, S Stevanović, LH Voorwinden, PJ Gaillard, DJA Crommelin, M Danhof and AG de Boer. Validation of the transferrin receptor for drug targeting to brain capillary endothelial cells in vitro. Journal of Drug Targeting 2004 Apr; 12 (3):

19