Invloed van natuurlijke antibiotica op verschillende soorten bacteriën

Transcriptie

1 Invloed van natuurlijke antibiotica op verschillende soorten bacteriën Door: Roger Lamers profiel: Natuur en Techniek vakken: natuurkunde, scheikunde, biologie en wiskunde B & D klas: V6A school: Het Bisschoppelijk College Weert begeleiding school: M. Korten, R. Jeurissen begeleiding onderzoek: R. Lamers, W. van den Bijllaardt 31 januari

2 Inhoudsopgave 1. Inleiding Werkplan Resultaten De gevonden MIC-waarden uitslag Eventuele verbeterpunten uitslag De gevonden MIC/MBC 90-waarden van onderzoek 2 en Discussie en conclusie vergelijking van de resultaten met discussie conclusie Samenvatting Korte samenvatting Mijn visie op natuurlijke antibiotica na het onderzoek Dankwoord Literatuurlijst Bijlagen Logboek Plan van aanpak de bacterielijst verdunningsreeks

3 1. Inleiding Waarom dit onderzoek? Omdat mijn vader en broer altijd in alternatieve geneeskunde geïnteresseerd zijn geweest, hebben we thuis alternatieve middelen die worden ingezet bij infecties. Zo ook bijv. colloïdaal zilver en tea tree olie. Omdat het me leuk leek om dit te onderzoeken en mijn moeder op een bacteriologisch laboratorium werkt, werd het idee al snel duidelijk: Natuurlijke antibiotica testen op bacteriën. Door op internet te surfen kwamen we sites tegen waarop werd beschreven dat ook propolis antibacterieel zou moeten zijn. Deze 3 natuurlijke antibiotica (colloïdaal zilver, tea tree oil en propolis) heb ik gekozen, en ze leken me erg interessant om te testen naar hun werking op verschillende bacteriegroepen. Ik heb zowel gramnegatieve als grampositieve bacteriën getest aangezien er een verschil zit in de structuur van de celwand van deze twee groepen. De bacteriën die we gekozen hebben, 17 stuks, zijn pathogene (ziekteverwekkende) bacteriën. Stam 1, Bacillus subtilis, is hierop een uitzondering. Deze bacterie is niet pathogeen, maar wordt vaak meegenomen in onderzoeken. Daarnaast zijn er ook 3 zogenaamde ziekenhuisbacteriën meegenomen. Dit zijn bacteriën die erg resistent zijn, waarbij de patiënt in isolatie wordt verpleegd. Naast deze 3 ziekenhuisbacteriën (stam 5, 7 en 18) worden ook de gevoelige varianten meegenomen (stam 4, 12 en 17). Dit om een mogelijk verschil te constateren. Hiernaast nemen we ook een gist mee om te zien wat daarop de werking is. Mijn moeder heeft een stageplaats voor me geregeld via haar baas, Dr. Buiting. Hij was meteen enthousiast en stelde voor om Wouter van den Bijllaardt, arts-microbioloog in opleiding, erbij te betrekken voor ondersteuning. Mijn moeder zal me dan gaan begeleiden bij de uitvoering. In dit onderzoek worden MIC (minimale remmende concentratie)-waarden bepaald. De MIC-waarde is de laagste concentratie antibioticum waarbij de groei van de onderzochte bacterie nog net geremd wordt. Later blijkt dat propolis een troebele oplossing geeft, waardoor de MIC niet afgelezen kan worden. Daarom moeten de bacteriën bij verschillende concentraties propolis op bloed-agar voedingsbodems en chocolade-agar voedingsbodems gezet worden om te zien tot hoever ze groeien. Hieruit kan geconcludeerd worden waar de MBC 90 (minimale bactericide concentratie)- waarden liggen (zie 3.3 en 3.4 voor de resultaten). De MBC 90-waarde is de concentratie antibioticum waarbij de onderzochte bacterie niet meer groeit, of de groei tot hooguit 10% bedraagt ten opzichte van de GC (groeicontrole). Dit onderzoek wordt uitgevoerd buiten het lichaam ( in vitro ). De resultaten van dit onderzoek zeggen niets over de werking in het lichaam ( in vivo ). Daarnaast wordt er ook gekeken naar de literatuur over ieder antibioticum. Hieruit is er een bereik van MIC-waarden vastgesteld die in het onderzoek getest gaan worden. Ook wordt er globaal uitgezocht wat de werking is van ieder antibioticum op een micro-organisme (met nadruk op bacteriën). Hieronder een korte beschrijving per antibioticum: 3

4 Colloïdaal zilver (zilverwater): Een oplossing van colloïdaal zilver (Nano-zilverdeeltjes) is erg antibacterieel tegen Staphylococcus aureus, E. Coli en Pseudomonas aeruginosa, en zelfs tegen Candida albicans (schimmel). De Nano-deeltjes zorgen voor schade aan het membraan van de bacterie. Hierdoor treden de deeltjes de cel binnen (Mukha, 2013 / Brian Owens, 19 juni 2013) Zilverwater is een van de meest gebruikte lokale antibacteriële producten op dit moment (Universiteit Gent, ). Uit onderzoek komt naar voren dat een gewoon antibioticum een half dozijn verschillende ziekteverwekkers doodt, waar Zilver er zo n 650 vernietigt. Resistente ketens kunnen zich hierbij niet ontwikkelen (Sila, ). Tegenwoordig zijn er nieuwe technieken nodig om ziekten te bestrijden, één van deze technieken is door professor microbiologie Willy Verstraete voorgesteld op een bijeenkomst van de Society for Applied Microbiology in Londen. Wetenschappers hebben ontdekt dat door zilveren Nano deeltjes aan goedaardige bacteriën te hechten, virussen vernietigd kunnen worden. De techniek werd getest tegen het norovirus en kan volgens onderzoekers gebruikt worden om griep en verkoudheid te bestrijden (HLN, 2010). Pas op! Naast Crystal zijn er nog andere bedrijven die colloïdaal zilver produceren en verkrijgbaar stellen. Uit analyse van vele producten is gebleken dat het ionisch gehalte varieert tussen 75% en 99%. Colloïdaal betekent dat de deeltjes in een vloeistof groter zijn dan één atoom en kleiner dan nm. Zilver ionen zijn geen colloïdaal deeltjes! Het is een opgeloste vorm van zilver. Het gehalte van de Nano deeltjes verkocht onder het merk Crystal is ongewoon hoog vergeleken met de anderen (fabrikant Crystal 1). Vandaar de interesse om colloïdaal zilver van juist dit merk te testen. Er zijn een aantal publicaties gevonden waarin de MIC-waarden zijn vastgesteld van zilverwater. Iedere bacteriegroep, zoals de grampositieve en negatieve bacteriën, hebben hun eigen MICwaarden. Deze MIC-waarden verschillen van 5-15 µg/ml, oftewel 5-15 mg/l (Monteiro, 2012; Amato, 2011) Voor het onderzoek wordt er een oplossing van colloïdaal zilver van de firma Crystal gebruikt. De oplossing bedraagt 10 ppm colloïdaal-zilverdeeltjes. Door middel van een kleine berekening: Indien u een flesje colloïdaal zilver met een inhoud heeft van 200 ml dan is het gewicht van de inhoud ongeveer 200 gr. Indien u nu een zilver gehalte van 10 ppm heeft dan zit er in het flesje van 200 gr.: 2mgr (milligram) zilver (fabrikant Crystal 2). Concentratie in zilverwater = 2 mg/ 200 ml 10 mg/l, dit is bij een concentratie van 10 ppm (dit is dus massa ppm). Crystal heeft voor het tweede en derde onderzoek een oplossing van 27,3 ppm gemaakt. Dit is het hoogst haalbare oplossing op het gebied van colloïdaal zilver tot nu toe, volgens de fabrikant. Bij 27,3 ppm bevat de oplossing 27,3 mg/l zilverwaterdeeltjes. 4

5 Propolis: Propolis is een harsachtige stof, ook wel bijenkorfcement genoemd, die het bijenvolk of de bijenstaat beschermt tegen infecties. Naast stuifmeel, bestaat propolis waarschijnlijk ook uit verschillende boomsoorten. Vele soorten stoffen uit de afscheidingen van bomen en planten worden ook in propolis teruggevonden. Propolis uit het gematigde klimaat bevat zo n 30 verschillende fenolcomponenten, waarvan 90 tot 95% flavonoïden zijn. Deze flavonoïden zijn verantwoordelijk voor de brede werking tegen virussen, bacteriën en schimmels. Dit zijn gele pigmenten die functioneren als natuurlijk werkzame antibiotica (van de Leeuw (fabrikant)). Propolis is antimicrobieel werkzaam tegen bacteriën zoals o.a. Staphylococcus aureus en schimmels zoals o.a. Trichophyton rubrum. Propolis versterkt in grote mate het effect van antibiotica zoals penicilline en streptomycine. In combinatie met enkele antimycotica (antischimmel) is een synergistisch (samenwerkend) effect van propolis tegen Candida albicans vastgesteld (TNO Nederland, ). Er worden twee oplossingen propolis in het onderzoek gebruikt. Misschien kan er iets worden gezegd over het verschil in concentratie. De één beweert een concentratie van 45% propolis te hebben, terwijl de ander een concentratie van 22,5% voor het onderzoek heeft gemaakt. Ze hebben dus de aangegeven percentage puur propolis in een 96% alcohol opgelost. Pas op! De samenstelling van propolis kan heel erg verschillen. Dit hangt vooral af aan het jaargetijde waarin het bijenvolk leeft en de omgeving. Hierom mag propolis geen medicijn genoemd worden. Farmaceutische medicijnen worden streng gecontroleerd of ze altijd exact dezelfde samenstelling hebben (van de Leeuw (fabrikant 2)). De eerste oplossing: Golden Bee propolis tinctuur wordt gemaakt van nauwkeurig geselecteerde ruwe propolis, met een evenwichtig gehalte aan flavonoïden (de werkzame stof in propolis), waardoor een constante kwaliteit gegarandeerd wordt. Het heeft een concentratie van 45% zuivere propolis. (Golden Bee (fabrikant)). De propolis wordt voor het onderzoek propolis GB genoemd. 5

6 De tweede oplossing: Lokale propolis bevat net als lokale honing stoffen en pollen uit de eigen omgeving. Daarnaast is Nederlandse propolis van een zeer hoge kwaliteit. Kwaliteit vinden wij heel belangrijk. Daarom werken we met pure onverhitte propolis. Zonder onnodige toevoegingen en als wij het kunnen vinden, met grondstoffen van biologische oorsprong. Ten slotte beschermen wij alle propolis producten in hoogwaardige UV dichte verpakkingen om de kwaliteit en werkzaamheid te behouden (voorpagina van de Leeuw (fabrikant 2)). Omdat ik veel contact heb gehad met Ewout bij deze firma, wordt deze propolis voor het onderzoek propolis Ew genoemd. De MIC-waarden van propolis zijn ook in een aantal bronnen vastgesteld. Met een berekening kwam er een MIC van mg/l (Koru O, 2007 / Campana R, 2009 / Popova M, 2013). Sommige micro-organismen, zoals de Streptococcus sobrinus, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Candida albicans, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter aerogenes en Escherichia coli, hebben zelfs nog een lagere MIC-waarden dan hierboven aangegeven (dit ligt tussen 2 mg/l en 30 mg/l) (Uzel A, 2005) Helaas wordt er in ons onderzoek niet met mg/l gewerkt, namelijk percentages, dit vanwege het ontbreken van het soortelijk gewicht van propolis. Theeboomolie (of wel tea tree oil van de Melaleuca alternifolia): Aan TTO (tea tree oil) zijn een aantal therapeutische eigenschappen verbonden. Er is onderzocht dat TTO activiteiten vertoont tegen ontstekingen en er wordt interesse getoond in de anti-tumor eigenschappen van de olie. TTO staat echter meer bekend om zijn antimicrobiële eigenschappen tegen een groot aantal micro-organismen, zoals de Staphylococcus aureus (inclusief MRSA), orale bacteriën en verschillende virussen, inclusief Herpes en Influenza virus. TTO toont mogelijk ook activiteiten tegen schimmels, zoals sommige azoleresistente (vaakst gebruikte anti-gist middel) gisten. (Gordon Ramage, 2012) Voor het onderzoek wordt puur TTO gebruikt van de Melaleuca alternifolia, die alleen in Australië groeit (blogspot, 2008). Hoeveel mg werkzame stof per Liter in het flesje zit, is nog de vraag. De samenstelling blijft vrijwel gelijk. Dus hierbij situeren wij de MIC-waarden in procenten. Aangezien TTO schadelijk/giftig kan zijn bij een te grote inname (de kruidenkorf), zou TTO alleen buiten het lichaam, bijvoorbeeld huidinfecties, gebruikt mogen worden. Wel kan in een lage concentratie gespoeld worden, zodat mogelijk ook keelinfecties hiermee behandeld kunnen worden. De meest voorkomende huid- en keelinfectie veroorzakende bacteriën worden in ons in vitro onderzoek getest. 6

7 2. Werkplan Om dit onderzoek goed te laten verlopen moeten er 4 stappen verricht worden: 1. Bacteriestammen worden op voedingsbodems geënt. Deze voedingsbodems worden uur in een broedstoof geïncubeerd, zodat er verse kolonies groeien om het onderzoek mee uit te voeren. In totaal worden 17 verschillende bacteriestammen en 1 gist (zie lijst weergegeven in 8.3) onderzocht. 2. In microtiterplaatsjes worden verdunningsreeksen gemaakt van de te onderzoeken alternatieve antibiotica (in 8.4 weergegeven). Daarbij wordt ook een groeicontrole meegenomen (hierin zit geen antibioticum). Er wordt 50 l bouillon in iedere stap van het microplaatje gedaan, behalve in rij B van colloïdaal zilver en TTO (Mcr.pl A), want daarin wordt puur de oplossing van het antibioticum gepipetteerd. De bouillons worden in trogbakjes gegoten en van daaruit worden ze met de 12-kanaalspipet gepipetteerd in de verdunningsreeksen. Als dit gedaan is, moet er 50 l van rij B naar rij C gepipetteerd worden, dan even mengen. Vervolgens 50 l van rij C naar rij D, weer even mengen, etc. totdat je bij de laatste rij bent. De 50 l uit de laatste rij wordt weggegooid. Hierdoor wordt een verdunningsreeks verkregen met per stap een 2 maal kleinere concentratie van het antibioticum. 3. Met behulp van steriele wattenstokken worden suspensies gemaakt met een gestandaardiseerde hoeveelheid bacteriën (0,5-0,6 McFarland) in buisjes met steriel fysiologisch zout. Vanuit deze suspensies wordt 200 µl gepipetteerd in 11 ml bouillon (er zijn 3 soorten bouillons; voor uitleg zie 8.2 benodigdheden ). Uit deze oplossing (bouillon met bacteriesuspensie) wordt steeds 50 µl gepipetteerd in elke kolom van de microplaatjes. Zo wordt de hoeveelheid bacteriën gelijk gehouden. Alleen de concentratie van het antibioticum is nog de enige variabele uur na het inzetten van de microtiterplaatjes in de broedstoof op 37 graden (al dan niet met CO2) worden de resultaten afgelezen. Waarom na zoveel uur? Dit omdat de bacteriegroei dan maximaal is. Hieruit worden de MIC-waarden van elk antibioticum bij elke bacteriesoort afgelezen, dit wordt met het blote oog en met behulp van een spiegel bepaald en in een tabel verwerkt. Dit stappenplan wordt in totaal minstens 2 maal uitgevoerd. De verkregen resultaten zullen dan ook met elkaar vergeleken worden. Wanneer de resultaten veel van elkaar verschillen, dan wordt dit voor een 3 maal uitgevoerd. Na een eerste bepaling kunnen eventueel verbeteringen worden bedacht voor een volgende bepaling. De benodigdheden en omstandigheden voor dit onderzoek staan vermeld in het plan van aanpak (weergegeven in 8.2). 7

8 Antibioticaverdunningen maken in MH-bouillon Door verdunnen van de antibiotica met 12-kanaalspipet Toevoegen van de bacteriën aan de antibiotica-concentraties. Het maken van suspensies van bacteriën (en gist) van 0,5-0,6 McFarland. Na uur zijn de bacteriën al dan niet gegroeid bij verschillende antibioticaconcentraties en sowieso bij de groeicontrole. 8

9 3. Resultaten 3.1 De gevonden MIC-waarden uitslag 1 Nr bacterie MIC Zilver (mg/l) MIC prop.gb (mg/l) (op het oog) MIC prop. Ew (mg/l) (op het oog) MIC TTO (%) 1 Bacillus subtilus 5 >1270 >635 Geen groei bij GC 2 Candida albicans 5 >1270 >635 Geen groei bij GC 3 Enterococcus faecalis 5 >1270 >635 12,5 4 Escherichia coli (Extended spectrum β- lactamase (ESBL) negatief) 5 Escherichia coli (ESBL+) 2.5 >1270 >635 Geen groei bij GC 5 >1270 >635 Geen groei bij GC 6 Klepsiëlla pneumoniae 5 >1270 >635 Geen groei 7 Methicilline resistente Staphylococcus aureus (MRSA) 5 Remming bij 1270 Remming bij 635 bij GC Geen groei bij GC 8 Neisseria meningitidis Geen groei Geen groei Geen groei Geen groei 9 Proteus mirabilis 5 >1270 >635 Geen groei bij GC 10 Pseudomonas 2.5 >1270 >635 12,5 aeruginosa 11 Salmonella typhimurium 5 >1270 >635 Geen groei bij GC 12 Methicilline gevoelige 5 Remming bij Remming bij 3,13 Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae 5 >1270 >635 R (groei bij 50%) 14 Streptococcus pneumoniae 2.5 >1270 Remming bij 317 R (groei bij 50%) 15 Streptococcus pyogenes 5 >1270 >635 R (groei bij 50%) 16 Haemophilus influenzae 2.5 Niet afleesbaar 159 Geen groei bij GC 17 Enterococcus faecium (Vancomycine gevoelig) 18 Enterococcus faecium (Vancomycine resistent =VRE) 2.5 >1270 >635 (wel remming zichtbaar) 2.5 >1270 >635 (wel remming zichtbaar) 6,25 3,13 9

10 3.2 Eventuele verbeterpunten uitslag 1 Enkele discussiepunten / verbeterpunten voor volgend onderzoek (kerstvakantie) - Is de concentratie zilver te laag voor het onderzoek? Bij concentratie B microplaatje 1 (5 mg/l) trad nergens groei op. Waarom? Misschien te weinig bouillon bij concentratie B (5 mg/l) voor goede groei van de bacteriën? - Bij propolis is microtiterplaatje 1 niet afleesbaar omdat propolis op zich al troebel is bij de hogere concentraties. Misschien de volgende keer de verdunning op een andere manier maken, want de pipetpunten waren (en bleven) vrij donker gekleurd van de propolis en is daardoor de verdunningsreeks minder betrouwbaar. En bij een hogere verdunning beginnen (bijv. 1:16). 1 ml propolis + 7 ml MH - Bij TTO waren veel GC (groeicontroles) niet gegroeid. Wat zou hiervan de oorzaak zijn? Dampen? Om de resultaten te kunnen vergelijken moeten de omstandigheden, hoeveelheden (concentraties) en tijdsduur hetzelfde zijn. Daarom wordt dit onderzoek nog twee maal herhaald. Het eerste onderzoek is meestal even wat uitproberen en kijken of alles goed volgens plan verloopt. Als dit niet zo is, moeten er verbeteringen komen. Omdat er toch wel wat veranderingen plaats gaan vinden, moet het onderzoek nog tweemaal herhaald worden. Dit voor de reproduceerbaarheid. De volgende veranderingen zullen toegepast worden in de volgende twee onderzoeken: - De fabrikant van zilver (Crystal) heeft een hogere concentratie voor het onderzoek gemaakt (27,3 mg/l; dit is het maximum). Hierdoor is het mogelijk om de concentratie in de verdunningsreeks hoger te beginnen. Om de MIC-waarden te verfijnen wordt er ook een concentratie gemaakt van 20 mg/l die door verdund kan worden. (zie tabel in bijlage 8.4 : Microtiterplaatje 1 2 de en 3 de keer (zilver)) - Er worden bouillons met een dubbele concentratie gemaakt voor de verdunningsreeksen van zowel zilver als TTO. Hierdoor bereiken we een goede eindconcentratie aan bouillon bij de hoogste verdunningsstap. Hierdoor is het mogelijk voor de bacteriën om ook hier goed te kunnen groeien. - Een andere manier van verdunnen van de propolis in de bouillons is mogelijk, maar de troebeling blijft. Hierdoor wordt het probleem van de pipetpunten wel verminderd. Op deze manier is het alleen nog mogelijk om een MBC 90-bepaling van de verschillende bacteriën te doen i.p.v. een MIC-bepaling. MBC 90 staat voor minimale bactericide (bacteriedodende) concentratie. Hierbij wordt gekeken naar de hoogste verdunning waarbij hooguit 10% groei optreedt ten opzichte van de GC (groeicontrole) en dus 90% van de initiële hoeveelheid bacteriën gedood is. Om de MBC 90 te kunnen bepalen moet na incubatie van het microtiterplaatje van elke verdunning een monster op een voedingsbodem gezet worden. Dit gebeurt met een 1 l öse. - Om te voorkomen dat er dampen verspreid worden, wordt er een folie geplakt over het microtiterplaatje i.p.v. een loszittende deksel. - De groeicontroles worden helemaal onderin geplaatst, bij de hoogste verdunning. 10

11 3.3 De gevonden MIC/MBC 90-waarden onderzoek 2 en 3. Nr bacterie MIC Zilver (mg/l) MBC 90 prop.gb (%) MBC 90 prop.ew (%) MIC TTO (%) Onderzoek Bacillus subtilus Candida albicans Enterococcus faecalis 5 5 > > Escherichia coli (ESBL-) > > > > Escherichia coli (ESBL+) > > > > Klepsiëlla pneumoniae 5 5 > > > > Methicilline resistente Staphylococcus aureus Neisseria meningitidis Proteus mirabilis 5 5 > > > > Pseudomonas aeruginosa > > > > Salmonella typhimurium > > > > Staphylococcus aureus (MRSA-) Streptococcus agalactiae > > > Streptococcus pneumoniae Gc niet Gc niet 0.78 gegroeid gegroeid 15 Streptococcus pyogenes > Haemophilus influenzae Enterococcus faecium > > (Vancomycine gevoelig) 18 Enterococcus faecium (Vancomycine resistent) > > * afenten op bloed-agar voedingsbodem * afenten op chocolade-agar voedingsbodem 11

12 4. Discussie en conclusie 4.1 Vergelijking van de resultaten met discussie Omdat onderzoek 1 een test is geweest en er wat verbeteringen zijn doorgevoerd, worden alleen onderzoek 2 en 3 met elkaar vergeleken. Ook mede omdat propolis niet goed afgelezen kan worden in de microtiterplaatjes en omdat bij tea tree olie de groeicontroles hoofdzakelijk niet gegroeid waren (zie ook de verbeterpunten onder 3.2). Resultaten Colloïdaal zilver Bij Colloïdaal zilver komen de MIC waarden goed overeen. Het maximale verschil is 1 verdunningsstap. In de microbiologie is het gebruikelijk om 1 verdunningsstap verschil te accepteren. Daarnaast zijn stammen 13, 14 en 15 afgeënt op voedingsbodems omdat de microtiterplaatjes niet afleesbaar waren met de MH-F bouillon vanwege de donkere kleur. Dit zijn daarom eigenlijk MBC 90- waarden i.p.v. MIC-waarden. Het microtiterplaatje van colloïdaal zilver, onderzoek 2, stam 1 t/m 12. De GC staat onderin. De GC s van alle stammen zijn goed gegroeid en de resultaten zijn goed af te lezen. Twee voorbeelden van hoe af te lezen (gebruik hierbij tabel in 8.4). Stam 4 heeft een MIC-waarde dat past bij de verdunning van D, omdat dit de kleinste concentratie is waarbij geen groei zichtbaar is (zie rode cirkels). In tabel 8.4 is te zien dat D correspondeert met een concentratie van 5 mg/l. Op deze manier heeft stam 11 dus een MIC-waarde van 3.41 mg/l (zie groene cirkels). 12

13 Resultaten Propolis GB en Ew Bij propolis is het niet mogelijk om de MIC-waarden te bepalen, vanwege de troebelheid van propolis zelf in de microtiterplaatjes. Daarom is het noodzakelijk om van iedere verdunning van iedere bacteriestam voedingsbodems te enten om de MBC 90-waarden te bepalen. Om niet te veel voedingsbodems te verbruiken is besloten om 4 verdunningen op 1 voedingsbodem te enten. Hierbij zou het aantal gegroeide kolonies geteld moeten worden bij zowel de GC als bij de verdunningen. Wanneer de groei minder dan 10% bedraagt vergeleken met de GC is dat de MBC 90-waarde. Omdat de kolonies van de GC zo dicht op elkaar zijn gegroeid, kan er niet geteld worden. Eigenlijk was er per verdunning 1 voedingsbodem nodig geweest om een betrouwbaarder MBC 90-waarde vast te stellen. Daarom vond er af en toe een schatting van de grenswaarde plaats. Enkele voorbeelden: Dit is een voorbeeld van een makkelijk af te lezen MBC 90-waarde. De omslag gaat van veel groei naar geen groei. De MBC 90-waarde is hier dan ook 0,0879 %. Hier is nog een beetje groei zichtbaar bij de concentratie van 0,176 %, maar dit is duidelijk minder dan 10 % vergeleken met de GC. De MBC 90-waarde is dus 0,176 %. Hier moet wel een beetje gegokt worden, omdat de kolonies bij de GC niet kunnen worden geteld. Hierbij is als MBC 90-waarde 0,703 % genomen, maar het zou ook 0,352 % kunnen zijn. Hier is geen GC afgeënt. Maar de MBC 90- waarde kan toch worden afgelezen, omdat hier een omslag is van veel groei naar geen groei. Dit is overigens een chocolade-agar voedingsbodem. Die is gebruikt voor stam 16 omdat deze niet groeit op een Bloed-agar voedingsbodem. De MBC 90-waarde is hier 0,352 %. 13

14 Ook is er vastgesteld dat bij propolis Ew neerslag ontstaat, zo gauw het met een bouillon wordt vermengd (zie foto). Mogelijk heeft dit invloed op de resultaten. Toch geeft propolis Ew iets betere resultaten dan propolis GB. Het aantal werkzame antibacteriële stoffen is, ondanks de neerslag, toch wat groter. Verdunningsreeks van Propolis GB in MHbouillon. Lost redelijk goed op, maar de oplossing blijft troebel. 1:8 van Propolis Ew in de 3 verschillende bouillons. Bij alle 3 ontstaat neerslag. Wanneer gekeken wordt naar het verschil tussen de ziekenhuisbacteriën en hun gevoelige varianten, wordt geen verschil geconstateerd. Hiervan zijn foto s gemaakt van één van die bacteriesoorten: Dit is de ziekenhuisbacterie MRSA (Methicilline resistente Staphylococcus aureus). Hier neemt de groei van de bacterie geleidelijk af en is de MBC 90-waarde gesteld op 1,406 %. Dit is ook de MRSA-bacterie. Hier neemt de groei eveneens geleidelijk af. Hier is de MBC 90- waarde gesteld op 0,176 %. 14

15 Dit is de gevoelige Staphylococcus aureus. Ook hier neemt de groei geleidelijk af en is de MBC 90-waarde gesteld op 1,406 %. Dit is identiek aan de MBC 90-waarde van de MRSA-bacterie. Dit is ook de gevoelige Staphylococcus aureus. Ook hier neemt de groei weer geleidelijk af en is de MBC 90-waarde gesteld op 0,176%. Dit is ook identiek aan de MBC 90-waarde van de MRSAbacterie. Resultaten theeboomolie (tea tree oil) Bij tea tree oil (TTO) is een verschil te zien tussen onderzoek 2 en 3. De MIC-waarden verschillen over het algemeen 2-3 verdunningsstappen (zie onderstaande foto s). Tijdens onderzoek 3 is opgemerkt dat TTO in het trogbakje het plastic aanvreet (zie foto hiernaast), waardoor de concentratie TTO mogelijk niet meer gelijk is aan de uitgangsconcentratie. De stammen zijn bij onderzoek 3 waarschijnlijk gevoeliger omdat de TTO eerder is verwerkt in de microtiterplaatjes en daardoor minder met het plastic in contact is geweest. Bij onderzoek 2 (en ook bij onderzoek 1, dat vergelijkbaar is met onderzoek 2) is hier meer tijd overheen gegaan. Dat zou kunnen verklaren dat de MIC-waarden bij onderzoek 3 hoger liggen dan bij onderzoek 2. Het microtiterplaatje TTO, onderzoek 2, stam 1 t/m 12. De GC s onderin zijn goed gegroeid en de resultaten zijn goed af te lezen. Het microtiterplaatje TTO, onderzoek 3, stam 1 t/m 12. De GC s onderin zijn goed gegroeid en de resultaten zijn goed af te lezen. 15

16 Daarnaast zijn stammen 13, 14 en 15 afgeënt op voedingsbodems omdat de microtiterplaatjes niet afleesbaar waren met de MH-F bouillon vanwege de donkere kleur. Dit zijn daarom eigenlijk MBC 90- waarden i.p.v. MIC-waarden. Helaas is bij onderzoek 2 de groeicontrole van stam 14 niet gegroeid. Dit kwam omdat pas bij onderzoek 3 het vermoeden bestond niet goed te kunnen aflezen van de MIC-waarden. De microtiterplaatjes van onderzoek 2 hadden inmiddels 1 dag in de koelkast gestaan. Dit heeft de bacterie helaas niet overleefd. Bij onderzoek 3 is de stam wel gegroeid en is hem dus wel een MBC 90-waarde toegekend. 4.2 Conclusie Mijn hypothese luidt als volgt: Natuurlijke antibiotica werken goed buiten het lichaam als bacteriedodend middel. Naar mijn mening klopt deze hypothese. Alle 3 de antibiotica zijn antibacterieel. Colloïdaal zilver en TTO zijn goed voor elke bacterie en gist (zeker voor de gist bij colloïdaal zilver) in de gebruikte bacterielijst. Er wordt bij colloïdaal zilver en TTO geen verschil gezien tussen bacteriën die erg resistent zijn tegen reguliere antibiotica en hun gevoelige varianten. Bij propolis daarentegen kan niet worden gezegd dat het voor alle geteste bacteriën antibacterieel is. Van de Gramnegatieve staven zijn de MBC 90-waarden in de gebruikte concentraties niet te bepalen. Deze bacteriën zijn minder gevoelig voor propolis dan de overige bacteriën en gist. Voor een MBC 90-waarde van deze bacteriën zijn hogere concentraties nodig om dit te testen. Er wordt geen verschil gezien tussen de MRSA (Methicilline-resistente Staphylococcus aureus) en de gevoelige Staphylococcus aureus. Zie ook de foto s bij 4.1. Aangezien het aannemelijk is dat de benodigde concentraties van de 3 natuurlijke antibiotica niet in het lichaam haalbaar zijn, hebben deze natuurlijke antibiotica waarschijnlijk alleen potentie om buiten het lichaam gebruikt te worden. Hiervoor zou nog verder onderzoek gedaan moeten worden. Het ziet er wel veelbelovend uit voor colloïdaal zilver en TTO voor nagenoeg alle bacteriën en mogelijk ook gisten. Voor propolis mogelijk ook bij lagere verdunningen. 16

17 5. Samenvatting 5.1 Korte samenvatting Voor dit onderzoek zijn 3 natuurlijke antibiotica uitgekozen om te testen op een groot aantal bacteriestammen, te weten colloïdaal zilver, propolis en tea tree olie (TTO). Volgens de literatuurgegevens zouden al deze 3 antibacterieel moeten zijn tegen bepaalde bacteriegroepen. Het onderzoek is bedoeld om dit al dan niet aan te tonen. In de literatuur stonden ook de MICwaarden per antibioticum per bacteriegroep beschreven. Voor een klein deel staat dit beschreven in de inleiding. De resultaten van dit onderzoek laten inderdaad zien dat ze alle 3 antibacterieel zijn. Wat de MIC-waarden betreft kunnen alleen die van colloïdaal zilver worden vergeleken, omdat propolis en TTO in dit onderzoek in percentages bekend zijn en niet in mg/l. De MIC-waarden van colloïdaal zilver komen in dit onderzoek overeen met de in de literatuur benoemde MIC-waarden. Ook zijn deze MIC-waarden reproduceerbaar. Bij propolis zijn de resultaten ook reproduceerbaar, maar ze kunnen niet vergeleken worden met de in de literatuur bekende MIC-waarden. TTO is in dit onderzoek niet goed reproduceerbaar vanwege het feit dat de TTO het plastic oplost van de gebruikte trogbakjes. Dit heeft waarschijnlijk de concentratie van TTO beïnvloed. 5.2 Mijn visie op natuurlijke antibiotica na het onderzoek Voor het onderzoek had ik niet zoveel vertrouwen in natuurlijke antibiotica. Nu het onderzoek voorbij is weet ik dat natuurlijke antibiotica effectief kunnen zijn tegen huidwonden. Voor inname (colloïdaal zilver en propolis) zal verder onderzoek nodig zijn, maar nu de goede resultaten van dit onderzoek bekend zijn, is er goede hoop op een doorbraak van deze natuurlijke antibiotica. Daarnaast is het prettig om te zien dat de verkregen resultaten van m.n. colloïdaal zilver goed overeenkomen met de resultaten die in de literatuur zijn gevonden. Daar zijn MIC-waarden gevonden van 5-15 mg/l, terwijl in dit onderzoek de MIC-waarden 2,5-5 mg/l zijn. Dit is een verschil van ten hoogste 1 verdunningsstap, wat in de medische microbiologie als aanvaardbaar wordt gezien. 17

18 6. Dankwoord Hier wil ik even in het kort alle personen bedanken die dit onderzoek mogelijk hebben gemaakt en me hebben gestimuleerd. Vooral Rinie Lamers en Wouter van den Bijlaardt, ze hebben me geholpen met het experiment en het opzoeken van de literatuurgegevens. Zonder hen zou het onderzoek niet op het LMMI van het st. Elisabeth ziekenhuis plaats hebben kunnen vinden. Heel erg bedankt voor jullie begeleiding! Ook Dr. A. Buiting wil ik hartelijk danken voor zijn toestemming hiervoor! Daarnaast wil ik ook de firma Crystal bedanken voor het maken van een hogere concentratie colloïdaal zilver. Zo konden de MIC-waarden makkelijker bepaald worden. Bedankt voor de steun! Ook wil ik de firma van de Leeuw bedanken, vooral Ewout, voor zijn oplossingen die hij verstuurd heeft en de daarbij horende uitleg. Hierdoor kon ik makkelijker de propolis van GB en Ew met elkaar vergelijken. Super bedankt hiervoor! Niet te vergeten wil ik ook R. Jeurissen en M. Korten bedanken! Voor het beantwoorden van al mijn vragen en onduidelijkheden. 18

19 7. Literatuurlijst Colloïdaal zilver Brian Owens juni 2013 Fabrikant Crystal 1 Mukha Sila Monteiro Amato Fabrikant Crystal 2 HLN Universiteit Gent /2010 Propolis Van de Leeuw (fabrikant 2) Voorpagina van de Leeuw (fabrikant 2) TNO Nederland Golden Bee (fabrikant) Uzal A Koru O Campana R Popova M Theeboomolie (Tea trea oil) Blogspot De Kruidenkorf welkomblog&itemid=15 Gordon Ramage Antifungal, cytotoxic, and immunomodulatory properties of tea tree oil and its derivative components: potential role in management of oral candidosis in cancer patients 18 juni

20 8. Bijlagen 8.1 Logboek Datum Tijd Plaats Verrichte werkzaamheden Resultaat 19/08/13 3 uur Op school Onderwerp zoeken Natuurlijke Antibiotica 20/08/13 3 uur Op school Onderzoeksvraag opstellen + deelvragen erbij. Dit opstellen in een plan van aanpak. Gedeelte plan van aanpak af. 24/08/13 3 uur Thuis Plan van aanpak afronden volgens de Plan van aanpak is klaar. profielwerkstuk Leidraad (gele boekje) 02/09/13 tot 29/09/13 11/10/13 tot 14/10/13 8 uur Thuis Natuurlijke antibiotica bestellen die voor het onderzoek nodig zijn. Vragen stellen aan Firma s over de concentratie van ieder product. Plaats regelen waar het onderzoek zich kan plaatsvinden. Dagen afspreken wanneer het onderzoek gaat plaatsvinden. Bacterielijst opstellen met Rinie + de tot dan toe vastgestelde verdunningsreeks. 4 uur Thuis Literatuur per product vinden en bij elkaar voegen voor de inleiding van het verslag. 15/10/13 3 uur Kantoor van Wouter van den Bijllaardt 16/10/13 3 uur LMMI op St. Elisabeth ziekenhuis 17/10/13 7 uur LMMI op St. Elisabeth ziekenhuis 18/10/13 5 uur LMMI op St. Elisabeth ziekenhuis Overleggen over het onderzoek en mogelijke veranderingen in het stappenplan maken. Ook de MIC-waarden vinden van alle antibiotica in eerdere onderzoeken. Bacteriën enten op voedingsbodems en in de broedstoof plaatsen. Verdunningsreeksen in microtiterplaatsjes + de bacteriesuspensies zijn gemaakt. De bacteriesuspensies zijn toegevoegd aan de verdunningsreeksen. De microtiterplaatjes moeten in de broedstoof geplaatst worden. Resultaten aflezen en verwerken in een tabel. Producten zijn binnen. De concentraties zijn bekend. En het onderzoek zal zich op het sint Elisabeth ziekenhuis in Tilburg plaatsvinden onder begeleiding van Rinie Lamers en Wouter van den Bijllaardt. Bacterielijst + verdunningsreeks zijn opgesteld. Literatuur gegevens gevonden en een bronnenlijst gemaakt. Het stappenplan van het onderzoek staat vast en is op grond van de mogelijkheden en de literatuurgegevens veranderd (zoals de verdunningsreeks + bacterielijst). De verdunningsreeks is gemaakt op grond van de gevonden MIC-waarden op de wetenschappelijke sites van ieder antibioticum. Gedaan Gedaan Gedaan 21/10/13 4 uur school Beginnen aan het verslag Voorpagina, inhoudsopgave en inleiding geschreven. 25/10/13 4 uur school Beginnen aan het verslag Werkplan + bijlagen gemaakt. 20

21 01/11/13 3 uur Thuis Verder werken aan het verslag Gedaan 04/12/13 5 uur School Literatuurlijst + discussie maken en Gedaan afronden. Inleiding compleet maken. 04/12/13 1 uur Thuis Opzoeken voor welke infecties iedere Gedaan bacterie in de bacterielijst zorgen. 07/12/13 1 uur Thuis Verder werken aan het verslag Gedaan 23/12/13 5 uur LMMI op St. Elisabeth ziekenhuis Aankweken van bacteriestammen en gist voor onderzoek 2. Van alles klaarzetten voor morgen in te zetten. Gedaan 24/12/13 7,5 uur LMMI op St. Elisabeth ziekenhuis 25/12/13 7 uur LMMI op St. Elisabeth ziekenhuis 26/12/13 5,5 uur LMMI op St. Elisabeth ziekenhuis 27/12/13 4 uur LMMI op St. Elisabeth ziekenhuis Verdunningen van de natuurlijke antibiotica maken. Suspensies van de bacteriestammen maken en door verdunnen in de bouillons. Suspensies van bacteriestammen toevoegen aan de verdunnings-reeksen (onderzoek 2). Opnieuw aankweken van bacteriestammen en gist voor onderzoek 3. Aflezen onderzoek 2 en evt. voedingsbodems enten van stammen die niet goed zijn af te lezen (propolis: alle stammen, colloïdaal zilver: stam 13, 14 en 15). Fotograferen van de microtiterplaatjes. Verdunningen van de natuurlijke antibiotica maken. Suspensies van de bacteriestammen maken en door verdunnen in de bouillons. Suspensies van bacteriestammen toevoegen aan de verdunnings-reeksen (onderzoek 3). Aflezen onderzoek 3 en evt. voedingsbodems enten van stammen die niet goed zijn af te lezen (propolis: alle stammen, colloïdaal zilver en TTO(voor zowel onderzoek 2 als 3): stam 13, 14 en 15). Fotograferen van de microtiterplaatjes. Aflezen voedingsbodems onderzoek 2. Fotograferen van voedingsbodems voor later met Wouter te bespreken. Aflezen voedingsbodems onderzoek 3. Fotograferen van voedingsbodems voor later met Wouter te bespreken. Gedaan Gedaan Gedaan Gedaan 28/ uur Thuis Foto s op computer gezet. Gedaan Resultaten verwerkt in tabellen. 31/12/13 2 uur Thuis Aan het verslag gewerkt. Wat verbeteringen Gedaan aangebracht. 02/01/14 2 uur Thuis Aan het verslag gewerkt (discussie en Gedaan conclusie). 03/01/14 3 uur Kantoor van De resultaten besproken en de discutabele Gedaan Wouter van den Bijllaardt platen besproken en afgelezen. Ook het verslag globaal bekeken en doorgenomen. Later thuis nog aan gewerkt. 03/01/14 2 uur Thuis Resultaten bijgewerkt en aan het verslag Gedaan gewerkt. 11/01/14 2 uur Thuis Aan het verslag gewerkt. Gedaan 16/01/14 2 uur School Bezig met afronden verslag Gedaan 18/01/14 2 uur Thuis Afronden verslag Klaar 21

22 8.2 Plan van aanpak Onderzoeksvraag Wat is de invloed van natuurlijke antibiotica op allerlei soorten bacteriën en hoe gaat dat in zijn werking? Deelvragen 1. Wat zijn natuurlijke antibiotica en welke functie hebben ze? 2. Welke natuurlijke antibiotica worden er gebruikt voor ons onderzoek? 3. Wat is de invloed van deze natuurlijke antibiotica op sommige bacteriën? 4. Wat zijn de gevolgen van het gebruik van natuurlijke antibiotica op je gezondheid? 5. Wat is mijn visie op natuurlijke antibiotica na het onderzoek? Hypothese Natuurlijke antibiotica werken goed buiten het lichaam als bacteriedodend middel. Omstandigheden waarin het onderzoek bevindt. Het onderzoek wordt uitgevoerd op het laboratorium LMMI in het St. Elisabeth Ziekenhuis te Tilburg. Het onderzoek wordt ingezet bij kamertemperatuur en de incubatie van de bacteriën vindt plaats bij een temperatuur van 37 C. Informatiebronnen, benodigdheden en plaats voor het onderzoek. De informatie wordt grotendeels van internet gehaald. Er wordt ook navraag gedaan bij fabrikanten waar de producten vandaan komen. Benodigdheden en plaats: Een laboratorium waarin het onderzoek uitgevoerd kan worden. Bacteriestammen. Voedingsbodems voor het aankweken van de bacteriestammen. 50 en 100 µl pipet. 12-kanaalspipet met bijbehorende steriele pipetpunten. Wattenstokken. 22

23 Microtiterplaatjes. Trog-bakjes. Bouillons Broedstoof van 37 C. MH bouillon (voor de makkelijke groeiers). MH-F bouillon (voor de bacteriën die wat meer voedingsstoffen nodig hebben om te groeien). HTM-bouillon (voor stam 16 (Haemophilus influenzae). Deze bacterie heeft speciale groeistoffen (X en V-factor) nodig). Broedstoof van 37 C met CO₂ (voor stam 16 (Haemophilus influenzae)). Densitometer. Vortex (mengapparaat) Steriel fysiologisch zout. Personen die bij het onderzoek betrokken zijn Er is toestemming van de bacterioloog van het Elisabeth Ziekenhuis nodig. Door Rinie Lamers en Wouter van den Bijllaardt wordt het onderzoek begeleidt. Eisen instrumenten onderzoek De 12-kanaalspipet en de densitometer moeten goed geijkt zijn. De temperatuur van de broedstoof moet een alarmsysteem bevatten in het geval van een afwijking van de temperatuur. Beschrijving onderzoek Bacteriestammen worden op voedingsbodems geënt. Deze voedingsbodems worden uur in een broedstoof geïncubeerd zodat we verse kolonies hebben om het onderzoek mee uit te voeren. Met behulp van steriele wattenstokken worden bacterie-suspensies van een 0,5/0,6 McFarland in buisjes met steriel fysiologisch zout gemaakt. Vanuit deze suspensies wordt 200 µl gepipetteerd in een 11 ml. bouillon. In microtiterplaatjes worden verdunningsreeksen gemaakt van de te onderzoeken alternatieve antibiotica. Daarbij wordt ook een groeicontrole meegenomen. De bouillons worden in trog-bakjes gegoten en van daaruit worden ze met de 12-kanaalspipet gepipetteerd in de verdunningsreeksen. Deze microtiterplaatjes worden gedurende uur geïncubeerd in de broedstoof. Daarna kan worden gekeken waar groei optreedt en waar niet en tot welke verdunning. Dit wordt met het blote oog en met behulp van een spiegel bepaald. 23

24 Planning voor het verrichten onderzoek De bedoeling is dat er 3 dagen achtereenvolgend onderzoek wordt gedaan. Daarom is dit alleen in de schoolvakanties (herfst- en/of kerstvakantie) mogelijk. Ook omdat de begeleiding dan beschikbaar is. Naar schatting zal het onderzoek ongeveer uur in beslag nemen (inclusief reistijd en of er een duplobepaling wordt gedaan). 24

25 8.3 De bacterielijst Nr Naam bacterie Grampositief /negatief Soort bouillon Infecties 1 Bacillus subtilis Grampos. staaf MH Grondbacterie, niet ziekteverwekkend 2 Candida albicans Dit is een gist. Grampos. gist (schimmel) MH Mondinfectie, vaginale infectie, darminfectie. 3 Enterococcus faecalis Grampos. coc in ketens MH Urineweginfectie, wondinfectie, hersenvliesontst. 4 Escherichia coli (Extended Gramneg. staaf MH Urineweginfectie, spectrum β-lactamase (ESBL) buikvliesontsteking, wondinfectie. negatief) 5 Escherichia coli (ESBL +) Gramneg. staaf MH Ziekenhuisbacterie 6 Klebsiëlla pneumoniae Gramneg. staaf MH Urineweginfectie, longontsteking, wondinfectie. 7 Methicilline resistent Staphylococcus aureus (MRSA +) Grampos. coc in groepjes MH Ziekenhuisbacterie 8 Neisseria meningitidis Gramneg. duplococ MH Hersenvliesontst. 9 Proteus mirabilis Gramneg. staaf MH Urineweginfectie, wondinfectie. 10 Pseudomonas aeruginosa Gramneg. staaf MH Oorinfectie, longontsteking, wondinfectie van brandwonden, ziekenhuisbacterie. 11 Salmonella typhimurium Gramneg. staaf MH Maagdarminfectie 12 Methicilline gevoelige Staphylococcus aureus Grampos. coc in groepjes MH Wondinfecties na operatie, urineweginfectie, longontsteking. 13 Streptococcus agalactiae (groep B) Grampos. coc in ketens MH+F Vaginale infectie (ook pasgeborenen), urineweginfectie, kraamvrouwenkoorts. 14 Streptococcus pneumoniae Grampos. duplococ MH+F Luchtweginfectie, ooronsteking, bijholteontsteking, artritis, sepsis, buikvliesontsteking, hersenvliesontsteking. 15 Streptococcus pyogenes (groep A) Grampos. coc in ketens MH+F Keelinfectie, krentenbaard, wondinfectie. 16 Haemophilus influenzae Gramneg. fijn staafje HTM Luchtweginfectie, middenoorontsteking, bijholteontsteking, gewrichtsontsteking, hersenvliesontsteking. 17 Enterococcus faecium Grampos. coc in ketens MH Urineweginfectie, wondinfectie. (Vancomycine gevoelig) 18 Enterococcus faecium (Vancomycine resistent =VRE) Grampos. coc in ketens MH Ziekenhuisbacterie. 25

26 8.4 Verdunningsreeksen Microplaatje 1 1 ste keer zilver Prop. GB Ew TTO Verd. Conc. Verd. Conc. (%) Conc. Verd. Conc. (%) (mg/l) (%) A GC GC GC B 1:2 5 1: :2 50% C 1:4 2,5 1: :4 25% D 1:8 1,25 1: :8 12.5% E 1:16 0,625 1: :16 6,25% F 1:32 0,313 1: :32 3,13% G 1:64 0,156 1: :64 1,56% H 1:128 0,078 1: :128 0,78% GC: groeicontrole (hierin zit geen antibioticum) Microplaatje 2 1 ste keer zilver Verd. propolis Verd. Conc. (mg/l) Conc. (%) Conc. (%) A 1:250 0,039 1: B 1:500 0,020 1: C 1:1000 0,010 1: D 1:2000 0,005 1: E 1:4000 0,0024 1: F 1:8000 0,0012 1: G 1: ,0006 1: H 1: ,0003 1:

27 Microtiterplaatje 1 2 de en 3 de keer (zilver) zilver Verd. Conc. (mg/l) A 1:2 (beginoplossing: 27,3 mg/l) 13,65 B 1:2 (beginoplossing: 20,0 mg/l) 10 C 1:4 (beginoplossing: 27,3 mg/l) 6,83 D 1:4 (beginoplossing: 20,0 mg/l) 5 E 1:8 (beginoplossing: 27,3 mg/l) 3,41 F 1:8 (beginoplossing: 20,0 mg/l) 2,5 G 1:16 (beginoplossing: 27,3 mg/l) 1,71 H GC (groeicontrole) De concentratie van 27,3 mg/l is afkomstig van de fabrikant. Hieruit wordt een concentratie van 20 mg/l gemaakt om nauwkeuriger een MIC-waarden vast te stellen. Deze wordt verkregen door 735 µl van de zilveroplossing en 270 µl zuiver steriel water aan elkaar toe te voegen. Ook de GC (groeicontrole) wordt onderin geplaatst. De propolis-verdunningen blijven gelijk. Alleen de 1 ste en 2 de verdunningen komen te vervallen. Dit omdat eerst een verdunning gemaakt wordt in bouillon van 1:8, zodat de hoogste eindverdunning 1:16 zal worden (zie Microplaatje 1 1 ste keer) en de GC (groeicontrole) wordt onderin geplaatst. De TTO-verdunningen blijven onveranderd. Alleen de GC (groeicontrole) wordt onderin geplaatst. 27