Voorbeeld. Preview NEN 6261

Transcriptie

1 UDC : : Bacteriologisch onderzoek van water Onderzoek met behulp van membraanfiltratie naar de aanwezigheid en het aantal kolonievormende eenheden (KVE) van Escherichia coli Bacteriological examination of water Examination by means of membrane filtration on the presence and number of colony forming units (CFU) of Escherichia coli NEDERLANDSE NORM NEN e druk, juni 1990 Onderwerp Deze norm geeft een methode voor het aantonen en kwantificeren van Escherichia coli door het filtreren van een monster water door een membraanfilter, het resusciteren van afgefiltreerde kiemen op een vaste, niet-selectieve voedingsbodem en het kweken op een vaste selectieve voedingsbodem, waarna differentiatie van gevormde kolonies plaatsvindt door middel van onderzoek naar de aanwezigheid van indol. Raadpleeg bij deze norm NPR Toepassingsgebied Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen. toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten. This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded. Deze norm is van toepassing bij het bacteriologisch onderzoek van drinkwater, mineraal- en bronwater, zwemwater in circulatiebaden, oppervlaktewater, afvalwater en zeewater, tenzij de aard en/of het gehalte aan zwevende stof de bepaling verstoort. Begripsomschrijving Escherichia coli behoort tot de familie der Enterobacteriaceae. Dat zijn Gram-negatieve, oxydase-negatieve, katalase-positieve, niet sporenvormende staafvormige bacteriën die meestal beweeglijk zijn door het bezit van pentriche flagellen. Zij zijn facultatief anaëroob en zetten suikers zowel oxydatief als fermentatief om. Ten behoeve van deze norm geldt de volgende definitie voor Escherichia coli (E. coli): Galresistente bacteriën, welke in staat zijn in een medium met tryptofaan bij 44 ± 0,5 C in minder dan 24 h indol te vormen. Beginsel Filtratie van het monster door een geschikt membraanfilter. Incubatie van het filter bij 37 ± 1 C op een vast, tryptonhoudend medium gevolgd door incubatie bij 44 ± 0,5 C op een vast medium dat trypton en galzouten bevat en zodanige selectieve eigenschappen bezit dat E. coli duidelijk zichtbare kolonies zal vormen waarin uit het aangeboden tryptofaan indol is gevormd. De twee voedingsbodems kunnen eventueel worden gecombineerd in één dubbellaag. Nader onderzoek van de kolonies op de aanwezigheid van indol door het membraan over te leggen op een filtreerpapiertje doordrenkt met indol-reagens, waarna onder bestraling met ultraviolet licht een karakteristieke rode kleur ontstaat. Monsterneming Neem een monster water volgens NEN Toestellen en glaswerk 6.1 Toestellen Autoclaven voor het steriliseren van glaswerk en voedingsbodems Droogstoof voor het steriliseren van glaswerk Broedstoof ingesteld op 37 ± 1 C Broedstoof ingesteld op 44 ± 0,5 C. In plaats van de broedstoven en mag ook een programmeerbare broedstoof ingesteld op 37 ± 1 C en 44 ± 0,5 C worden gebruikt Opstelling voor membraanfiltratie met steriliseerbare trechters Ultravioletlamp, golflengte nm. NEN 6261

2 NEN Biz Glaswerk Het glaswerk dient van een zodanige kwaliteit te zijn dat het bestand is tegen veelvuldig steriliseren. Borosilicaatglas voldoet aan deze eis. Het gebruik van steriele, verpakte kunststofmaterialen is toelaatbaar Petrischalen Cultuurbuizen, mm x 160 mm Maatcilinders, 100 ml Maatpipetten, inhoud 10 ml verdeeld in 1 ml en inhoud 1 ml verdeeld in 0,1 ml. 6.3 Steriliseren van het glaswerk Steriliseer het glaswerk volgens een van de beide onderstaande methoden: - natte sterilisatie bij 121 ± 1 C gedurende ten minste 15 min; - droge sterilisatie bij C gedurende ten minste 1 h exclusief de opwarmtijd. 6.4 Diversen Pincetten met afgeronde hoeken voor het opnemen van membraanfilters Filtreerpapiertjes met een middellijn van ten minste 47 mm. 7 Voedingsbodems, ingrediënten, reagentia en filters 7.1 Voedingsbodems Gebruik bij voorkeur in droge toestand verkrijgbare voedingsbodems waarvan de samenstelling overeenkomt met de onder en gegeven samenstelling. Volg bij de bereiding daarvan de aanwijzingen van de fabrikant. Bij de bereiding van voedingsbodems volgens deze norm dient zoveel mogelijk gebruik te worden gemaakt van speciaal voor dit doel in de handel gebrachte ingrediënten. Gebruik alleen chemicaliën van analysekwaliteit en vers gedestilleerd of gedemineraliseerd water dat vrij is van toxische of groeiremmende bestanddelen. Tenzij anders aangegeven zijn de bereide media, mits koel (bij 0-4 C) en in het donker bewaard en beschermd tegen uitdroging, gedurende een maand houdbaar Trypton-soya-agar (TSA) Samenstelling Trypton 15,0 g Soya pepton 5,0 g Natriumchloride 5,0 g Agar 15,0 g Water tot 1000,0 ml Bereiding Los de bestanddelen op in water onder koken. Stel de ph zodanig in dat deze na sterilisatie een waarde van 7,2 ± 0,1 bij 25 C heeft bereikt. Verdeel het medium dan in porties van ten hoogste 250 ml over flessen of kolven en steriliseer gedurende 15 min bij 121 C. Het medium kan ten hoogste een maand bij 4 C worden bewaard. Laat (eventueel na smelten) het medium afkoelen tot 50 C en a. giet het direct uit tot een laagdikte van ten minste 4 mm (bijv. ten minste 10 ml in een petrischaal met een middellijn van 55 mm) of b. bereid dubbellaagsplaten volgens Trypton-gal-agar (TGA) Samenstelling Trypton 20,0 g Galzouten 1,5 g Agar 15,0 g Water tot 1000,0 ml Bereiding Bereid het trypton-gal-agar volgens Pepton-fysiologische zoutoplossing (PFZ) Samenstelling Pepton 1,0 g Natriumchloride 8,5 g Water tot 1000,0 ml

3 NEN Biz Bereiding Los de bestanddelen in het water op. Stel de ph zodanig in dat deze na sterilisatie een waarde heeft van 7,0 ± 0,1 bij 25 C. Verdeel de verdunningsvloeistof dan in porties van ten hoogste 250 ml over flessen of kolven en steriliseer gedurende 15 min bij 121 C. Breng porties van 7,5 ml in cultuurbuizen (6.2.2). 7.3 Indolreagens Samenstelling p-dimethylaminobenzaldehyde 0,5 g Zoutzuur, c(hci) = 1 mol/l 100,0 ml Bereiding Los de p-dimethylaminobenzaldehyde op in het zoutzuur. Bewaar het reagens in een niet-lichtdoorlatende fles bij 4-6 C gedurende ten hoogste 1 maand. Het reagens dient een lichtgele kleur te hebben en is onbruikbaar wanneer het een meer bruin-gele kleur heeft. In plaats van het hier beschreven reagens kan het James-reagens 1 ) worden gebruikt. 7.4 Membraanfilters van cellulosenitraat of cellulose-acetaat of een mengsel daarvan De filters dienen een poriëngrootte van 0,45 цш te hebben, een middellijn van ten minste 47 mm en vrij te zijn van groeiremmende of -bevorderende eigenschappen. Het verdient de voorkeur gebruik te maken van groene filters die door middel van elkaar snijdende lijnen in een aantal vierkanten zijn onderverdeeld. De hiervoor gebruikte drukinkt mag geen invloed op de groei van bacteriën hebben. Steriliseer de filters volgens een van de onderstaande methoden: - in een autoclaaf gedurende 15 min bij 121 ± 1 C; - koken in water gedurende 30 min. 8 Voorbereiding van het monster Begin het onderzoek bij voorkeur onmiddellijk na de monsterneming. Bij koeling van het monster op 0-4 C moet binnen 24 h na monsterneming met het onderzoek worden begonnen. 9 Uitvoering van het onderzoek 9.1 Bereiding van de verdunningen De hoeveelheid vloeistof die in 9.2 in bewerking wordt genomen dient ten minste 10 ml te bedragen. Indien het te verwachten aantal indol-positieve kolonies kleiner is dan 60 per 10 ml kan het monster rechtstreeks worden onderzocht. Indien het te verwachten aantal indol-positieve kolonies groter is dan 60 per 10 ml, onderzoek dan verdunningen van het monster zodanig dat één verdunning een aantal indol-positieve kolonies gelegen tussen 15 en 60 zal opleveren. Wanneer het te verwachten aantal indol-positieve kolonies niet bekend is, dienen er verschillende volumes en/of verdunningen van het monster te worden onderzocht. Door tussen de opeenvolgende verdunningen of volumes een verhouding te kiezen van 1 : 4, mag worden verwacht dat één verdunning een aantal indolpositieve kolonies gelegen tussen 15 en 60 zal opleveren. Verdunningen van 1 : 4 kunnen als volgt worden verkregen: Breng 2,5 ml van het oorspronkelijke monster met een steriele pipet in een cultuurbuis met 7,5 ml PFZ (7.2). Zorg voor een goede menging. Bereid op deze wijze voor elke verdunningsstap 3 cultuurbuizen. Bereid met één van deze cultuurbuizen op soortgelijke wijze een verdere verdunning tot 1:16, enz. Gebruik de resterende 2 cultuurbuizen voor het onderzoek. Van een monster van onbekende samenstelling kunnen bijv. de volgende volumes worden onderzocht: - 40 ml (onverdund); - 10 ml (onverdund); - 10 ml (1 : 4 verdund); - 10 ml (1 : 16 verdund); - 10 ml (1 : 64 verdund). 1) James-reagens is een handelsnaam van API BioMérieux B.V. 's-hertogenbosch

4 NEN Biz Isolatie en differentiatie Tweestapsmethode Filtreer in duplo de te onderzoeken hoeveelheid monster of een verdunning daarvan door een membraanfilter (7.4) en spoel de trechter na met PFZ (7.2). Zuig het filter net droog en breng het zo op de TSA-platen (7.1.1) dat er zich geen luchtbellen onder het membraanfilter bevinden. Incubeer de platen gedurende 4 tot 5 h bij 37 C. Breng na incubatie het membraanfilter over op de trypton-galagar (7.1.2) en incubeer aansluitend 19 tot 20 h bij44 C Eenstapsmethode Bereid min vóór de aanvang van de analyse dubbellaagsplaten door uitgieten van TSA (7.1.1) over een tot kamertemperatuur voorverwarmde plaat TGA (7.1.2). Neem een hoeveelheid TSA die een laagdikte oplevert van ca. 1 mm (bijv. 2,5 ml in een petrischaal met een middellijn van 55 mm). Laat stollen en droog zo nodig omgekeerd in een broedstoof van 37 C. Filtreer in duplo de te onderzoeken hoeveelheid monster of een verdunning daarvan door een membraanfilter (7.4) en spoel de trechter na met steriel water. Breng het membraanfilter over op de dubbellaagsplaat op een zodanige wijze dat er zich geen luchtbellen onder het membraanfilter bevinden. Breng het geheel over in een broedstoof (6.1.3) en incubeer 4 ± 1 h, gevolgd door incubatie in en broedstoof (6.1.4) gedurende 20 ± 1 h Indolreactie Breng na incubatie het membraanfilter over op een filtreerpapiertje verzadigd met indol-reagens (7.3) en bestraal het geheel met de ultravioletlamp (6.1.7) gedurende 10 tot 60 min afhankelijk van de kleurontwikkeling. Tel alle rode kolonies op het membraanfilter. Indien gebruik gemaakt wordt van het James-reagens, is bestraling met ultraviolet niet nodig. 10 Berekening en weergave van de resultaten Indien geen rode kolonies op het membraanfilter aanwezig zijn, geef dan het resultaat van het onderzoek als volgt weer: "géén Escherichia coli aangetoond in V"\ V is het volume van de grootste onderzochte hoeveelheid monster in ml. Indien wel rode kolonies aanwezig zijn, bereken dan het aantal E. coli met de formule: waarin: Л/ is het aantal kolonievormende eenheden van E. coli per volume monster, in ml -1, afgerond volgens NEN 1047, blad 2.1; m is het gemiddelde van het aantal kolonies aanwezig op de membraanfilters; V is het volume van de onder 9.2 in onderzoek genomen hoeveelheid monster of verdunning daarvan, in ml; f is de eventueel gebruikte verdunningsfactor. Geef het aantal kolonievormende eenheden van E. coli op als: a x 10 ь mol" 1 waarin: a is een getal met één decimaal, dat varieert tussen 1,0 en 9,9; b is een geheel getal. 11 Verslag Vermeld in het verslag: a. de gegevens die noodzakelijk zijn voor het identificeren van het monster; b. de toegepaste methode: volgens NEN 6261 (1990); с het gebruikte reagens; d. het gevonden aantal kolonievormende eenheden E. coli per ml onderzocht water; e. de eventuele bijzonderheden, tijdens de behandeling waargenomen; f. alle niet in de norm voorgeschreven handelingen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed.

5 Bestelformulier Stuur naar: NEN Standards Products & Services t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer WB Delft NEN Standards Products & Services Postbus GB Delft Vlinderweg AX Delft Ja, ik bestel ex. NEN 6261:1990 nl Bacteriologisch onderzoek van water - Onderzoek met behulp van membraanfiltratie naar de aanwezigheid en het aantal kolonievormende eenheden (KVE) van <em>escherichia coli</em> T (015) F (015) Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via Gratis nieuwsbrieven Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen, normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze nieuwsbrieven. Gegevens Bedrijf / Instelling T.a.v. O M O V Klantnummer NEN Uw ordernummer BTW nummer Postbus / Adres Postcode Plaats Telefoon Fax Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres) Postbus / Adres Postcode Plaats Datum Handtekening Retourneren Fax: klantenservice@nen.nl Post: NEN Standards Products & Services, t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214, 2600 WB Delft (geen postzegel nodig). Voorwaarden De prijzen zijn geldig tot 31 december 2018, tenzij anders aangegeven. Alle prijzen zijn excl. btw, verzend- en handelingskosten en onder voorbehoud bij o.m. ISO- en IEC-normen. Bestelt u via de normshop een pdf, dan betaalt u geen handeling en verzendkosten. Meer informatie: telefoon , dagelijks van 8.30 tot uur. Wijzigingen en typefouten in teksten en prijsinformatie voorbehouden. U kunt onze algemene voorwaarden terugvinden op: LEREN, WERKEN EN GROEIEN MET NEN preview