Voorbeeld. Preview NEN Bacteriologisch onderzoek van water NEDERLANDSE NORM

Transcriptie

1 UDC :543.39: Bacteriologisch onderzoek van water Onderzoek naar de aanwezigheid en het aantal kolonievormende eenheden (KVE) van /_eg/one//a-bacteriën Bacteriological examination of water Examination on the presence and the number of colony forming units (CFU) of Legionella bacteria NEDERLANDSE NORM NEN 6265 ledruk, juni 1991 Onderwerp Deze norm geeft een methode voor het aantonen en kwantificeren van Leg/one//a-bacteriën in water. Karakteristieke kolonies worden nader onderzocht door middel van reinkweken en uitvoeren van bevestigings- en eventueel typeringsreacties. Raadpleeg bij deze norm NPR Toepassingsgebied Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen. toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten. This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded. De norm is van toepassing bij het bacteriologisch onderzoek van - al dan niet verwarmd - water, zoals drinkwater, grondwater, bronwater, zwemwater, koelwater, regenwater, oppervlaktewater en afvalwater, tenzij de aard en/of het gehalte aan zwevende stof de bepaling verstoort. Begripsomschrijving Bacteriën uit de familie Legionellaceae zijn staafvormige (2-20 \irr\ lang en 0,3-0,9 (im dik), Gramnegatieve, niet-zuurvaste, beweeglijke bacteriën die sporen noch cysten vormen. De celwand bevat vertakte vetzuren. Het organisme groeit alleen in een zuurstofhoudend milieu en heeft onder andere het zwavelhoudende aminozuur L-cysteïne nodig. Beginsel Concentratie van het monster geschiedt door middel van een geschikt membraanfilter. Indien hoge concentraties /_eg/one//a-bacteriën verwacht worden, kan het monster ook direct uitgespateld worden. Het concentraat of het ongefiltreerde monster wordt geïncubeerd op een vaste, selectieve voedingsbodem met zodanige eigenschappen dat /_eg/one//a-bacteriën karakteristieke kolonies vormen. Ter bevestiging wordt nader onderzoek gedaan naar het onvermogen van deze kolonies te kunnen groeien op een medium zonder cysteine. Een voorafgaande behandeling van een deel van het geconcentreerde monster kan storende bijgroei voorkomen. Veiligheid /_eg/one//a-bacteriën zijn opportunistisch pathogène micro-organismen. Bij het werken met deze kiemen dienen dan ook de juiste veiligheidsmaatregelen te worden getroffen (FIN 1-condities [1]), vooral het voorkómen van de vorming van aerosolen. Monsterneming Bij monsterneming wordt de monsterkraan niet geflambeerd. Neem direct een monster van ten minste 500 ml en meet hierin de temperatuur met een van tevoren met alcohol 70 % (V/V) gedesinfecteerde thermometer. Daarna de kraan laten doorstromen tot de temperatuur niet meer verandert. Noteer de temperatuur. Bij monsterneming van andere watersoorten kan - indien van toepassing - direct een monster genomen worden volgens NEN Toestellen en glaswerk 7.1 Toestellen Autoclaven voor het steriliseren van glaswerk en voedingsbodems Droogstoof voor steriliseren van glaswerk Broedstoof, afgesteld op 37 C ± 1 C Waterbad, afgesteld op 50 C ± 1 C Waterbad, afgesteld op 100 C ± 1 C. NEN 6265

2 NEN 6265-Biz ph-meter Whirlmixer Opstelling voor membraanfiltratie met steriliseerbare trechters Ultrasoon trilwaterbad (uitsluitend voor methode ). 7.2 Glaswerk Het glaswerk dient van een zodanige kwaliteit te zijn, dat het bestand is tegen veelvuldig steriliseren. Borosilicaatglas voldoet aan deze eis. Het gebruik van steriele, verpakte kunststofmaterialen is toelaatbaar Maatcilinders, 500 ml Maatpipetten, inhoud 10 ml, verdeeld in 1 ml; inhoud 5 ml verdeeld in 0,5 ml en inhoud 1 ml, verdeeld in 0,1 ml Steriele reageerbuizen ca. 15 mm x 100 mm Glaspareltjes, middellijn 3 mm (Drigalski-)spatel om het monster op de voedingsbodems te verspreiden Petrischalen, kunststof met een middellijn van 9 cm Steriel potje met een middellijn iets groter dan het filter (7.4.4) (uitsluitend voor methode ). 7.3 Steriliseren van glaswerk Steriliseer het glaswerk volgens één van de onderstaande methoden: - natte sterilisatie bij 121 C ± 1 C gedurende ten minste 15 min; - droge sterilisatie bij 170 C C gedurende ten minste 1 h, exclusief de opwarmtijd. 7.4 Diversen Pincetten met afgeronde hoeken voor het opnemen van membraanfilters Entoog of entnaald van platina-iridium, chroom-nikkel, glas of kunststof Membraanfilters met een poriegrootte van ten hoogste 0,22 jim en vrij van groeiremmende eigenschappen Filters met een gladde oppervlakte, een poriegrootte van ten hoogste 0,22 (im en vrij van groeiremmende eigenschappen Scalpelhouder en scalpelmesje (uitsluitend voor methode ) Stereomicroscoop met opvallend licht en met een vergrotingsfactor van 6 tot Voedingsbodems, ingrediënten, reagentia en filters Bij de bereiding van voedingsbodems volgens de in deze norm gegeven recepten dient zoveel mogelijk gebruik te worden gemaakt van speciaal voor dit doel in de handel gebrachte ingrediënten. Gebruik alleen chemicaliën van analysekwaliteit en vers gedestilleerd of gedemineraliseerd water dat vrij is van toxische of groeiremmende bestanddelen. De media zijn, mits koel en in het donker bewaard en beschermd tegen uitdroging, gedurende een maand houdbaar. 8.1 Buffered Charcoal Yeast Extract Agar (BCYE) Samenstelling totaal medium gistextract tot 10,0 g actieve poederkool tot 2,0 g agar tot g 1 ) ACES 2 ) (C4H 10 N 2 O4S) tot 10,0 g kaliumhydroxide-oplossing c(koh) = 1 mpl/l tot 50,0 ml oplossing A oplossing В oplossing С oplossing D gedestilleerd water tot 1000 ml Oplossingen A t.m. D zijn niet houdbaar en moeten dus vers bereid worden. 1) Volg aanwijzigingen van fabrikant. 2) ACES = N-(2-acetamido)-2-aminoethaansulfonzuur.

3 NEN 6265-Biz Oplossing A Samenstelling L-cysteïne-HCI CH 2 (SH) CH(COOH) NH 2 HCl 0,6 g Bereiding Los het L-cysteïne-HCI op in het gedestilleerde water en steriliseer door middel van filtratie door een membraanfilter (7.4.3) Oplossing В Samenstelling ijzer(lll)pyrofosfaat (Fe 4 (P ) 3 ) 0,37 g Bereiding Los het ijzer(lll)pyrofosfaat op in het gedestilleerde water en steriliseer door middel van filtratie door Oplossing С Samenstelling 2-oxoglutaarzuur (C 5 H ) 1,5 g Bereiding Los het oxoglutaarzuur op in het gedestilleerde water en steriliseer door middel van filtratie door een membraanfilter (7.4.3) Oplossing D Samenstelling pimaricine 0,1 g Bereiding Suspendeer het pimaricine in het gedestilleerde water en plaats de suspensie gedurende 15 min bij 100 C Bereiding totaal medium Los de ACES op in 450 ml gedestilleerd water onder verwarming tot ten hoogste 50 C. Meng het gistextract, de poederkool, de agar en de kaliumhydroxide-oplossing met 400 ml gedestilleerd water. Voeg beide oplossingen samen en autoclaveer gedurende 15 min bij 120 C. Koel af tot 50 C. Voeg oplossingen A t.m. D aseptisch toe. Vul nu aan met steriel gedestilleerd water tot 1000 ml. Stel de ph op 6,90 ± 0,05. Giet 20 ml medium in Petrischalen. 8.2 Buffered Charcoal Yeast Extract Agar met antibiotica (BCYE + ab) Samenstelling en bereiding als 8.1 maar na het toevoegen van de oplossingen A t.m. D worden van verse oplossingen E en F respectievelijk 10,0 ml en 8,0 ml aseptisch toegevoegd Oplossing E Samenstelling polymixine-b-sulfaat IE Bereiding Los het polymixine-b-sulfaat op in het gedestilleerde water en steriliseer door middel van filtratie door Oplossing F Samenstelling natriumcefazoline 0,011 g gedestilleerd water 10 ml Bereiding Los het natriumcefazoline op in het gedestilleerde water en steriliseer door middel van filtratie door 8.3 Buffered Charcoal Yeast Extract Agar zonder cysteine (BCYE - cys) Samenstelling en bereiding als 8.1. Voeg echter niet oplossing A toe. 8.4 Steriel leidingwater met een koperconcentratie kleiner dan 2,5 mg/l 8.5 Alcohol, 70 % (V/V)

4 NEN Biz. 4 9 Voorbereiding van het monster Begin het onderzoek bij voorkeur direct na de monsterneming. Bij koeling kan het monster bij ca. 4 C gedurende 24 h bewaard worden. Raadpleeg voor de monsterneming NEN 6559 en NPR Uitvoering van het onderzoek 10.1 Isolatie Legionella wordt op een van de onderstaande manieren geïsoleerd Handel bij onderzoek van water waarin veel Z-eg/one//a-bacteriën verwacht worden als volgt: spatel per plaat 0,1 ml van het water uit over 2 BCYE-, 2 (BCYE + ab)-platen en 1 (BCYE - cys)-plaat Filtreer het monster door een filter (7.4.4) Zuig het filter net droog en breng het aseptisch met een steriele pincet (7.4.1) over in een lege petrischaal (7.2.6). Snij het filter met het scalpelmesje (7.4.5) in kleine stukjes van ongeveer 0,5 cm bij 0,5 cm en breng deze met een pincet (7.4.1) over in een reageerbuisje met glaspareltjes en 2,5 ml monster of filtraat ervan. Schud gedurende 15 s op de whirlmixer (rotatiefrequentie ca min -1 ) (7.7). Verdeel het monster in 2 delen en plaats één ervan gedurende 30 min in het waterbad van 50 C. Verdun beide deelmonsters 1:10 in steriel leidingwater (8.4). Spatel per plaat 0,1 ml van de deelmonsters en de verdunningen daarvan uit op 2 platen BCYE, 2 platen (BCYE + ab) en 1 plaat (BCYE-cys). Incubeer gedurende 7 dagen bij 37 C. Zorg dat de platen niet uitdrogen. Verpak ze hiervoor eventueel in plastic zakken. Z_eg/one//a-kolonies zullen pas na enige dagen incubatie verschijnen Filtreer het monster door een filter (7.4.4). Zuig het filter net droog en breng het aseptisch met een steriele pincet (7.4.1) over (met de bovenkant van het filter naar beneden) in een flesje met ca. 10 g glasparels (7.2.7) en 5 ml van het monster of het filtraat ervan. Tril het potje gedurende 2 min ultrasoon (7.1.9). Verdeel het monster in 2 delen en plaats één ervan gedurende 30 min in het waterbad van 50 C. Verdun beide deelmonsters 1:10 in steriel leidingwater. Spatel per plaat 0,1 ml van de deelmonsters en de verdunningen daarvan uit op 2 platen BCYE, 2 platen (BCYE + ab) en 1 plaat (BCYEcys) Het aflezen van de platen. Bekijk de platen door een stereomicroscoop (7.4.6). /_eg/one//a-kolonies hebben een karakteristieke morfologie. Deze is moeilijk exact te omschrijven, doch de kolonies zijn herkenbaar aan hun "matglazen" uiterlijk en een korrelige kernstructuur. De platen met cysteine worden vergeleken met de platen zonder cysteine, zodat al direct een indruk kan worden verkregen over het voorkomen van /_eg/one//a-bacteriën. Deze zullen nl. niet groeien op de platen zonder cysteine Bij voorkeur dienen de kolonies op platen waarin geen antibiotica verwerkt is en/of waarop monster geënt is dat een temperatuursbehandeling heeft ondergaan, te worden geteld. De opbrengst op deze platen zal nl. meestal hoger zijn dan op de andere platen Bevestiging Ten minste 5 verdachte kolonies per monster moeten worden overgeënt op een BCYE-plaat en een (BCYE - cys)-plaat en worden bebroed bij 37 C tot er op een van beide platen groei optreedt. Er moet ten hoogste 5 dagen worden bebroed. /_eg/one//a-bacteriën groeien niet op een (BCYE - cys)-plaat. 11 Berekening Indien geen Z_eg/one//a-kolonies aanwezig zijn, geef dan het resultaat van het onderzoek als volgt weer: "Geen /_eg/one//a-bacteriën aangetoond in... I monster". Indien er wel /.eg/one//a-kolonies aanwezig zijn, bereken dan het aantal /-eg/one//a-bacteriën met de formule: V D waarin: N is het aantal KVE /-eg/one//a-bacteriën per liter; M is het gemiddelde van het aantal kolonies aanwezig op de duploplaten; P is de fractie van het aantal volgens 10.3 onderzochte kolonies welke /_egf/one//a-bacteriën bleken te zijn; V is het volume van het in onderzoek genomen monster, in liters; D is de onderzochte fractie van het concentraat of ongefiltreerde monster dat per plaat geënt is.

5 Bestelformulier Stuur naar: NEN Standards Products & Services t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer WB Delft NEN Standards Products & Services Postbus GB Delft Vlinderweg AX Delft Ja, ik bestel ex. NEN 6265:1991 nl Bacteriologisch onderzoek van water - Onderzoek naar de aanwezigheid en het aantal kolonievormende eenheden (KVE) van <em>legionella</em>-bacteriën T (015) F (015) Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via Gratis nieuwsbrieven Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen, normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze nieuwsbrieven. Gegevens Bedrijf / Instelling T.a.v. O M O V Klantnummer NEN Uw ordernummer BTW nummer Postbus / Adres Postcode Plaats Telefoon Fax Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres) Postbus / Adres Postcode Plaats Datum Handtekening Retourneren Fax: klantenservice@nen.nl Post: NEN Standards Products & Services, t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214, 2600 WB Delft (geen postzegel nodig). Voorwaarden De prijzen zijn geldig tot 31 december 2018, tenzij anders aangegeven. Alle prijzen zijn excl. btw, verzend- en handelingskosten en onder voorbehoud bij o.m. ISO- en IEC-normen. Bestelt u via de normshop een pdf, dan betaalt u geen handeling en verzendkosten. Meer informatie: telefoon , dagelijks van 8.30 tot uur. Wijzigingen en typefouten in teksten en prijsinformatie voorbehouden. U kunt onze algemene voorwaarden terugvinden op: LEREN, WERKEN EN GROEIEN MET NEN preview