Central role of Rho-kinase in the pathophysiology of allergic asthma Schaafsma, Dedmer

Transcriptie

1 University of Groningen Central role of Rho-kinase in the pathophysiology of allergic asthma Schaafsma, Dedmer IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2007 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Schaafsma, D. (2007). Central role of Rho-kinase in the pathophysiology of allergic asthma s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Nederlandse samenvatting Allergisch astma is een chronisch inflammatoire luchtwegaandoening die ondermeer gekenmerkt wordt door overgevoeligheid van de luchtwegen voor diverse bronchusobstructieve prikkels, waaronder neurotransmitters en ontstekingsmediatoren die vrijkomen bij een allergische reactie. Deze luchtweghyperreactiviteit (LHR) wordt in belangrijke mate veroorzaakt door een verhoogde reactiviteit van het gladde spierweefsel voor contractiele stimuli en door irreversibele structurele veranderingen van de luchtwegen ( luchtwegremodeling ), waaronder toename van de gladde spiermassa. Contractie van de luchtweg gladde spier wordt vooral bepaald door de mate van fosforylering van de lichte keten van het contractiele eiwit myosine (myosin light chain; MLC). MLC fosforylering wordt geïnitieerd door een verhoging van de intracellulaire Ca 2+ -concentratie ([Ca 2+ ] i ) en de daarop volgende vorming van het Ca 2+ -calmoduline complex. Dit complex is in staat het myosin light chain kinase (MLCK) te activeren, wat resulteert in de fosforylering van MLC. Gefosforyleerd MLC gaat vervolgens een interactie aan met het contractiele eiwit actine wat uiteindelijk leidt tot gladde spiercontractie. Behalve deze Ca 2+ -afhankelijke MLC fosforylering, is ook aangetoond dat de gevoeligheid van het contractiele apparaat voor Ca 2+ kan worden verhoogd. Dit betekent dat [Ca 2+ ] i niet altijd rechtstreeks gecorreleerd is met de mate van MLC fosforylering en contractie. Dit komt omdat de fosforyleringsgraad van MLC wordt bepaald door de balans in activiteit tussen MLC-fosforylering (door MLCK) en - defosforylering (door myosin light chain phosphatase, MLCP). Deze balans kan worden beïnvloed door met name Rho-kinase, dat in staat is MLCP te fosforyleren en daarmee diens activiteit te remmen. Er ontstaat dan een situatie waarbij een toegenomen MLC fosforylering wordt geïnduceerd bij een constante [Ca 2+ ] i ; dit proces wordt gedefinieerd als Ca 2+ -sensitisatie. Agonist-geïnduceerde contractie van glad spierweefsel kan plaats vinden door stimulatie van G q -gekoppelde receptoren, zoals de histamine H 1 -receptor en de muscarine M 3 - receptor. Stimulatie van dergelijke receptoren leidt tot de vorming van inositol-1,4,5- trifosfaat (IP 3 ) dat in staat is Ca 2+ uit intracellulaire opslagplaatsen vrij te maken - en (indirect) extracellulair Ca 2+ te laten instromen - wat resulteert in een verhoging van [Ca 2+ ] i en in contractie. Er bestaat een sterke correlatie tussen de inositolfosfaat (IP) accumulatie en de mate van contractie die cholinerge M 3 -receptor agonisten kunnen oproepen. Daarbij is er voor volle agonisten, waaronder methacholine, een aanzienlijke reserve gevonden in IP productie, terwijl er geen reserve aanwezig is voor de partiële agonist McN-A-343. Daarnaast is aangetoond dat volle agonisten een veel groter Ca 2+ - mobiliserend vermogen hebben in vergelijking met partiële agonisten. Desalniettemin zijn partiële agonisten toch in staat om een (sub)maximale contractie van luchtweg glad spierweefsel te bewerkstelligen. De studies beschreven in Hoofdstuk 2 werden opgezet om de verschillen in signaaltransductie tussen volle en partiele cholinerge receptoragonisten nader te bestuderen. Er werd met name gekeken in hoeverre verschillende agonisten, die op dezelfde receptor aangrijpen, afhankelijk zijn van de 195

3 bovenbeschreven Rho-kinase afhankelijke Ca 2+ -sensitisatie. In runder tracheaal glad spierweefsel werden hiertoe de effecten van de specifieke Rho-kinase remmer Y op contractie, Ca 2+ -mobilisatie en Ca 2+ -influx, geïnduceerd door methacholine (volle agonist), pilocarpine en McN-A-343 (partiële agonisten) bestudeerd. In aanwezigheid van Y-27632, werd de gevoeligheid om contractie te induceren voor alle agonisten geremd. Echter, de maximale contractie was uitsluitend verminderd voor de partiële agonisten en niet voor methacholine. Dit geeft aan dat de volle agonist alleen in de lagere concentraties afhankelijk is van Rho-kinase voor contractie, maar niet afhankelijk is van dit enzym voor het bewerkstelligen van zijn maximale contractiele effect. Van de bestudeerde agonisten was methacholine in staat om de grootste (IP 3 -afhankelijke) Ca 2+ - mobilisatie en -influx te induceren, wat volledig in overeenstemming is met zijn aanzienlijke IP-productie reserve. Deze substantiële Ca 2+ -responsen volstaan dus om de maximale contractie te bereiken, zonder dat Rho-kinase daar functioneel aan hoeft bij te dragen. In tegenstelling tot methacholine, werden met pilocarpine en McN-A-343 zeer lage Ca 2+ -responsen gemeten, wat overeenkomt met de afwezigheid van transductiereserve voor deze agonisten, waardoor Rho-kinase activatie wel een significante bijdrage kan leveren aan het maximale contractiele effect. Volledig in overeenstemming met deze interpretatie bleek dat de maximale methacholinegeïnduceerde contractie wel Rho-kinase afhankelijk werd als de receptorreserve werd verminderd door behandeling van de spierpreparaten met de irreversibele muscarine receptor-antagonist N-propylbenzilylcholine mosterd. Er kan derhalve geconcludeerd worden dat de functionele bijdrage van Rho-kinase aan de muscarine receptoragonistgeïnduceerde contractie toeneemt naarmate de primaire transductiereserve afneemt. Dit wordt ondersteund door de inverse correlatie die gevonden werd tussen de bijdrage van Rho-kinase aan de contractie en de Ca 2+ -mobilisatie en de Ca 2+ -influx. Er werden geen directe effecten van Y gevonden op de Ca 2+ -responsen van de drie agonisten, wat bevestigt dat de effecten van de Rho-kinase remmer op de cholinerge contractie berusten op een verminderde Ca 2+ -sensitisatie. Activatie van de Rho/Rho-kinase route kan plaatsvinden door verschillende receptoren, waaronder G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) en receptor tyrosine kinases (RTKs). Naast een agonist-afhankelijke rol voor Rho-kinase, zoals hierboven beschreven, blijkt er ook een receptorafhankelijke bijdrage te bestaan in de regulatie van luchtweg gladde spiercontractie. Zoals beschreven in Hoofdstuk 8, zijn van de gladde spier van de caviatrachea zowel de maximale contractie als de gevoeligheid voor PGF 2 - een prostaglandine dat zijn effect uitoefent via G q -gekoppelde FP-receptoren - gedeeltelijk afhankelijk van Rho-kinase, terwijl bij histamine-geïnduceerde contractie - die plaatsvindt door stimulatie van G q -gekoppelde H 1 -receptoren - deze parameters onafhankelijk zijn van Rho-kinase. Volledig in overeenstemming met deze bevindingen is ook de differentiële bijdrage van Rho-kinase aan de PGF 2 - en histamine-geïnduceerde luchtwegobstructie in vivo (Hoofdstuk 10). In runder tracheaal glad spierweefsel kon worden aangetoond dat contracties geïnduceerd door methacholine (receptorafhankelijk) en door KCl (via membraandepolarisatie, receptoronafhankelijk) beide deels afhankelijk zijn van Rho-kinase. Remming van Rho-kinase verminderde deze contracties in 196

4 verschillende mate, met het grootste effect voor KCl. Dit was verrassend, aangezien tot dusver alleen receptorafhankelijke activatie van Rho-kinase was beschreven (Hoofdstuk 6). In de Hoofdstukken 3 en 4 werden de contractiele eigenschappen van groeifactoren onderzocht. Groeifactor-geïnduceerde proliferatie en differentiatie van gladde spiercellen van ondermeer bloedvaten en luchtwegen zijn uitgebreid onderzocht en beschreven. Door het initiëren van hyperplasie (toegenomen celaantal) en hypertrofie (toegenomen celgrootte) dragen groeifactoren bij aan remodeling van de gladde spierlaag, wat kenmerkend is voor ernstig astma. Recent is gebleken dat G q -gekoppelde receptoragonisten, waaronder acetylcholine, bradykinine en trombine, de proliferatieve capaciteit van groeifactoren kunnen versterken. Daarentegen is er zeer weinig bekend over groeifactoren met betrekking tot hun eigen contractiele eigenschappen in luchtweg glad spierweefsel. In vasculair glad spierweefsel was al gebleken dat sommige groeifactoren in staat zijn contractie te induceren. In Hoofdstukken 3 en 4 staat beschreven dat groeifactoren contractie kunnen induceren van zowel humaan bronchiaal (Hoofdstuk 3) als cavia tracheaal (Hoofdstuk 4) glad spierweefsel op een volledig Rhokinase afhankelijke manier. Het bleek dat deze contracties gemedieerd worden door de productie van contractiele prostaglandines - afkomstig uit de gladde spierlaag en niet uit het epitheel -, die op hun beurt een Rho-kinase afhankelijke contractie induceren (Hoofdstuk 4). Verscheidene groeifactoren, waaronder IGF-1, EGF en PDGF, kunnen worden gegenereerd door ontstekingscellen zoals macrofagen en eosinofielen. Daarnaast kunnen ze afkomstig zijn uit geëxtravaseerd plasma, epitheelcellen en de luchtweg gladde spier zelf. In overeenstemming hiermee, is in astmatische luchtwegen een verhoogde expressie gevonden zowel van groeifactoren als van hun receptoren. Aangezien groeifactoren betrokken zijn bij herstelprocessen, zou een groeifactor geïnduceerde contractie kunnen bijdragen aan de bescherming van beschadigde gebieden in de luchtwegen. Astma wordt ondermeer gekenmerkt door een diffuse luchtwegontsteking, en het is goed voor te stellen is dat groeifactoren onder dergelijke pathofysiologische omstandigheden zouden kunnen bijdragen aan luchtwegobstructie. Inhibitie van zulke contracties door middel van Rho-kinase remmers kan daarom therapeutisch relevant zijn. Luchtweg gladde spiercellen hebben het vermogen om van fenotype te veranderen (fenotypische plasticiteit). Modulatie van het fenotype kan geschieden onder invloed van groeifactoren, neurotransmitters en inflammatoire mediatoren. In vitro is aangetoond dat luchtweg gladde spiercellen en intacte spierpreparaten overgaan naar een minder contractiel, proliferatief fenotype na langdurige blootstelling aan groeifactoren, zoals PDGF, of foetaal runderserum. Een dergelijke verandering in fenotype gaat gepaard met een verminderde contractiele capaciteit en een afname in contractiele eiwit-expressie. De inductie van een (hyper)contractiel fenotype wordt daarentegen gekenmerkt door een toename in de expressie van contractiele eiwitten, zoals sm-mhc, calponine en sm-actine. Aangezien er recent een belangrijke rol voor Rho-kinase in de regulatie van de gentranscriptie van gladde spier-specifieke eiwitten aan het licht is gekomen, waren we geïnteresseerd in hoeverre Rho-kinase remming het functionele fenotype van intact 197

5 luchtweg glad spierweefsel zou beïnvloeden. De studies beschreven in Hoofdstuk 6 laten zien dat langdurige voorbehandeling (8 dagen) met de Rho-kinase remmer Y resulteert in een reductie van zowel receptorafhankelijke (methacholine) als receptoronafhankelijke (KCl) contractie van runder tracheale spierpreparaten. Dit suggereert dat Rho-kinase activiteit in belangrijke mate betrokken is bij het behouden van de contractiliteit. Aangezien in vasculair glad spierweefsel een regulerende rol van Rho-kinase was gevonden in de PDGF-geïnduceerde proliferatie, is een rol voor Rhokinase in de fenotypische modulatie door groeifactoren ook voorstelbaar. Zoals beschreven in Hoofdstuk 6, zijn de PDGF-geïnitieerde proliferatie en de reductie in contractiliteit die optreedt na langdurige blootstelling aan deze groeifactor ongevoelig voor Y Hieruit kan geconcludeerd worden dat remming van Rho-kinase een hypocontractiel fenotype induceert, net als groeifactoren dat doen, echter, zonder dat daarbij proliferatieve effecten (luchtwegremodeling) naar voren komen. De acute bijdrage van Rho-kinase aan de contractie bleek onafhankelijk te zijn van het fenotype waarin de spierpreparaten verkeerden (Hoofdstuk 6). Desalniettemin is Rho-kinase activiteit noodzakelijk voor de inductie van een hypercontractiel fenotype, wat optreedt na langdurige incubatie met insuline, zoals later wordt beschreven (Hoofdstuk 7). Gebruikmakend van runder tracheale gladde spiercellen, is in ons laboratorium eerder aangetoond dat acuut toegediend insuline een zwak proliferatief effect heeft en dat het proliferatieve gedrag van andere groeifactoren versterkt. De studies in Hoofdstuk 5 werden opgezet om te onderzoeken of insuline ook contractie zou kunnen induceren. In gladde spierpreparaten van de caviatrachea induceerde insuline een stabiele contractie die afhankelijk was van p42/44 MAPK en Rho-kinase. Het bleek dat deze contractie gemedieerd werd door contractiele prostaglandines, aangezien zowel remming van COX, als EP 1 - en FP-receptor blokkade, de effecten van insuline op de myogene tonus sterk verlaagden. Deze bevindingen zijn volledig in overeenstemming met het in Hoofdstukken 3 en 4 beschreven mechanisme van groeifactor-geïnduceerde contractie. Naast acute proliferatieve en contractiele effecten, is insuline ook in staat een hypercontractiel fenotype te induceren. Langdurige behandeling van runder tracheale gladde spierpreparaten met insuline verhoogt de contractiele respons van KCl en methacholine en verlaagt de proliferatieve effecten van andere groeifactoren. De moleculaire mechanismen die hieraan ten grondslag liggen worden beschreven in Hoofdstuk 7. Langdurige incubatie met insuline bleek zowel de mrna- als de eiwitexpressie van specifieke contractiele eiwitten significant te verhogen. Daarnaast werd de vorming van grote langgerekte gladde spiercellen, waarvan het bekend is dat ze (hyper)contractiel zijn, bevorderd. Zowel Rho-kinase als PI-3-kinase spelen een rol in de accumulatie van contractiele eiwitten en de vorming van langgerekte cellen, waarschijnlijk door regulatie van gentranscriptie (Rho-kinase) en -translatie (PI-3- kinase). In tegenstelling tot Rho-kinase, bleek PI-3-kinase ook betrokken te zijn bij de (geringe) toename in contractiele eiwitexpressie die optreedt na langdurige serumdeprivatie in afwezigheid van insuline. 198

6 De bevindingen die beschreven zijn in Hoofdstukken 5 en 7 kunnen van belang zijn voor de lopende discussie over het gebruik van inhalatie-formuleringen van insuline voor de behandeling van diabetes mellitus type 1 en 2. Vervolgstudies zijn echter noodzakelijk om de acute en chronische effecten van insuline op humaan luchtweg glad spierweefsel te identificeren en om de effecten van insuline-inhalatie op functie en fenotype van de luchtweg gladde spier onder pathofysiologische condities als astma en COPD, vast te stellen. Recent is gevonden dat Rho-kinase activiteit betrokken is bij (de ontwikkeling van) hypertensie. Een dergelijke pathofysiologische rol voor de Rho/Rho-kinase transductieroute zou ook relevant kunnen zijn voor luchtwegaandoeningen. In de literatuur zijn een verhoogde eiwitexpressie van RhoA, G 12 en G 13 en een toegenomen membraantranslocatie van RhoA waargenomen in luchtweg gladde spierpreparaten van herhaaldelijk allergeen-geprovoceerde ratten; ook was er in dit model een toegenomen bijdrage van Rho-kinase aan de contractie waargenomen. In Hoofdstuk 8 wordt beschreven dat actieve allergische sensitisatie, zonder daaropvolgende allergeenprovocatie, reeds in staat is om de bijdrage van Rho-kinase aan cavia-luchtweg gladde spiercontractie ex vivo en contractiele luchtwegreactiviteit in vivo te doen toenemen. Daarnaast werd er in longhomogenaten van actief gesensitiseerde cavia s een toegenomen RhoA-eiwitexpressie gevonden, wat (mede) de toegenomen functionele bijdrage van Rho-kinase kan verklaren. Omdat de verhoogde responsiviteit ex vivo van preparaten van actief gesensitiseerde dieren, die zowel met PGF 2 als met histamine werd waargenomen, genormaliseerd werd met Y-27632, kan worden geconcludeerd dat allergische sensitisatie op zich al bijdraagt aan de ontwikkeling van LHR. Naast actieve sensitisatie, is passieve sensitisatie van luchtweg gladde spierpreparaten met atopisch serum eerder gebruikt om potentiële mechanismen van allergeengeïnduceerde LHR te bestuderen. Gebruik makend van deze techniek was aannemelijk gemaakt dat niet IgE maar andere factoren aanwezig in het atopisch serum waarschijnlijk verantwoordelijk zijn voor de inductie van non-specifieke hyperreactiviteit van de gladde spier. In Hoofdstuk 9 wordt beschreven dat in passief gesensitiseerde gladde spierpreparaten van de caviatrachea zowel de IgE-gemedieerde contractie als de verhoogde contractiliteit voor histamine en methacholine afhankelijk zijn van Rhokinase. De non-specifieke LHR werd zelfs volledig genormaliseerd door Y-27632, wat aangeeft dat Rho-kinase een sleutelrol speelt in dit proces. De bevindingen beschreven in Hoofdstukken 8 en 9 impliceren dat er één of meerdere systemische factoren (aanwezig in het atopische serum) de bijdrage van Rho-kinase aan agonist-geïnduceerde luchtweg gladde spiercontractie verhogen. In Hoofdstuk 10 en 11 werd de in vivo bijdrage van Rho-kinase aan de allergeengeïnduceerde ontwikkeling van LHR na de vroege en late astmatische reactie bestudeerd, door gebruik te maken van ons caviamodel voor allergisch astma. Onder basale omstandigheden, dat wil zeggen vóór allergeenprovocatie, had inhalatie van Y een duidelijk bronchoprotectief effect voor histamine en PGF 2 (Hoofdstuk 10). 199

7 Daarnaast was er sprake van een toegenomen bijdrage van Rho-kinase aan de LHR na de vroege en de late reactie, die acuut en effectief kon worden opgeheven door middel van Y inhalatie. Wanneer Y min vóór en 8 uur na de allergeenprovocatie werd geïnhaleerd, werd wel de acute allergeen-geïnduceerde bronchusconstrictie sterk geremd; maar werd er geen significant effect op de totale vroege en late reactie waargenomen (Hoofdstuk 11). Daarnaast voorkwam Y inhalatie in belangrijke mate de LHR na de vroege reactie; de LHR na de late reactie werd zelfs genormaliseerd. Deze effecten zouden mede verklaard kunnen worden door het effect van Y op de infiltratie van inflammatoire cellen in de luchtwegen. Analyse van de bronchoalveolaire lavage (verkregen 25 uur na de allergeenprovocatie), liet zien dat inhalatie van de Rhokinase- remmer het totaal aantal inflammatoire cellen en de aantallen eosinofielen, neutrofielen en macrofagen verminderde. Naast de effectiviteit van Y om de agonist-geïnduceerde luchtwegobstructie na de vroege en de late reactie op te heffen (Hoofdstuk 10), laten deze resultaten zien dat inhalatie van Y ook beschermt tegen acute allergeen-geïnduceerde bronchusconstrictie, tegen de ontwikkeling van LHR na de vroege en na de late reactie en tegen infiltratie van ontstekingscellen. Het antiinflammatoire effect van Y zou een belangrijke rol kunnen spelen bij de bescherming tegen de ontwikkeling van LHR.. Belangrijkste conclusies van dit proefschrift: Volle en partiële muscarine agonisten zijn differentieel afhankelijk van Rhokinase voor hun contractiele effecten, waarbij er een inverse relatie bestaat tussen Rho-kinase afhankelijkheid voor contractie en de mate van Ca 2+ - mobilisatie en -influx (Hoofdstuk 2). Naast een agonist-afhankelijke rol, bestaat er ook een receptor-afhankelijke rol voor Rho-kinase in de regulatie van luchtweg gladde spiercontractie (Hoofdstukken 3 en 8). Groeifactoren zijn in staat om acuut contractie te induceren van luchtweg glad spierweefsel van mens (Hoofdstuk 3) en dier (Hoofdstuk 4). Stimulatie met groeifactoren resulteert in de productie van contractiele prostaglandines - afkomstig uit de gladde spierlaag - die verantwoordelijk zijn voor deze contractie en die afhankelijk zijn van Rho-kinase voor hun contractiele effecten (Hoofdstuk 4). De acute functionele bijdrage van Rho-kinase aan contractie is onafhankelijk van het fenotype van intact luchtweg glad spierweefsel. Daarnaast is Rho-kinase niet betrokken bij de modulatie naar het hypocontractiele/proliferatieve fenotype door de groeifactor PDGF. Wel is Rho-kinase een belangrijke regulator van basale contractiliteit (Hoofdstuk 6). Insuline is, net als andere groeifactoren, in staat luchtweg gladde spiercontractie te induceren (Hoofdstuk 5). Tevens leidt langdurige blootstelling van luchtweg gladde spiercellen aan insuline tot een verhoogde expressie van contractiele fenotypische markers, waarvoor zowel Rho-kinase als PI-3-kinase essentieel zijn (Hoofdstuk 7). 200

8 Actieve allergische sensitisatie verhoogt de bijdrage van Rho-kinase aan de contractiele responsiviteit (zowel ex vivo als in vivo), waarschijnlijk als gevolg van een verhoogde RhoA-expressie (Hoofdstuk 8). Rho-kinase is in belangrijke mate verantwoordelijk voor de non-specifieke hyperreactiviteit en de specifieke allergeenresponsiviteit in passief gesensitiseerde luchtweg gladde spierpreparaten (Hoofdstuk 9). Inhalatie van de Rho-kinase remmer Y heeft een sterk bronchoprotectief effect onder basale omstandigheden, die mede afhankelijk is van de contractiele agonist. Tevens is er een verhoogde bijdrage van Rho-kinase aan de LHR na de vroege en late astmatische reactie, die acuut kan worden opgeheven door Y inhalatie (Hoofdstuk 10). Inhalatie van Y werkt profylactisch tegen acute allergeen-geïnduceerde bronchusconstrictie, tegen ontwikkeling van LHR na de vroege en de late reactie en tegen luchtweg ontsteking. Het anti-inflammatoire effect van Y zou een belangrijke rol kunnen spelen in het beschermend effect tegen de ontwikkeling van LHR (Hoofdstuk 11). Aangezien Rho-kinase betrokken is bij verscheidene processen die ten grondslag liggen aan LHR, kan dit enzym beschouwd worden als een interessant farmacotherapeutisch target in allergisch astma. 201

9 202