Citation for published version (APA): Bovenkamp, M. V. D. (2006). Liver fibrosis in vitro: Liver slices as a promising alternative s.n.

Transcriptie

1 University of Groningen Liver fibrosis in vitro Bovenkamp, Marja van den IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2006 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Bovenkamp, M. V. D. (2006). Liver fibrosis in vitro: Liver slices as a promising alternative s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Samenvatting ACHTERGROND Leverfibrose is een aandoening waarbij gezond leverweefsel langzaam wordt vervangen door littekenweefsel. Dit wordt veroorzaakt door chronische schade aan de lever, bijvoorbeeld door infectie met het hepatitis B of C virus, door alcoholmisbruik of door auto-immuun ziektes. Leverfibrose leidt uiteindelijk tot leverfalen en behoort tot de top tien van doodsoorzaken in de westerse wereld. Zoals beschreven in hoofdstuk 1 is het ontstaan van fibrose in de lever het resultaat van een proces waarbij verschillende celtypes een rol spelen. Kort samengevat produceren beschadigde levercellen stoffen die zorgen dat de stellaatcellen in de lever geactiveerd raken. Hierdoor veranderen deze cellen in myofibroblasten, die zich gaan vermenigvuldigen en overmatig littekenweefsel produceren. De activatie van stellaatcellen wordt gezien als de belangrijkste stap in de ontwikkeling van leverfibrose, maar waarschijnlijk spelen bij de littekenweefselvorming ook andere typen (myo)fibroblasten een rol. Daarnaast leidt leverschade tot een ontstekingsreactie, onder andere door de activatie van Kupffer-cellen in de lever, wat verder bijdraagt aan het fibroseproces. De mate van littekenweefselvorming en ontsteking die plaatsvindt, is afhankelijk van de aard en de duur van de schade aan de lever. Wanneer deze kort duurt, wordt het fibroseproces gevolgd door een herstelproces waarbij beschadigd leverweefsel wordt vervangen, het littekenweefsel wordt opgeruimd en de ontsteking stopt. Bij chronische schade is dit herstelproces echter niet voldoende en wordt het nog gezonde leverweefsel langzaam vervangen door littekenweefsel, waardoor essentiële leverfuncties worden aangetast en de patiënt uiteindelijk overlijdt. Omdat er tot nu toe geen goede behandeling voor leverfibrose is, wordt er veel onderzoek gedaan naar de mechanismen die leiden tot het ontstaan van leverfibrose en naar de ontwikkeling van nieuwe fibrose-remmende stoffen. Hiervoor kan gebruik gemaakt worden van verschillende in vivo en in vitro modellen, die beschreven worden in hoofdstuk 1. Voor het ontwikkelen van nieuwe medicijnen wordt vooral gebruik gemaakt van in vivo diermodellen. Dit zijn modellen waarin het fibroseproces wordt nagebootst in proefdieren. Het voordeel van deze modellen is dat alle aspecten die een rol spelen bij het ontstaan van leverfibrose in vivo, dat wil zeggen in een levend organisme, in het model aanwezig zijn. Hierbij moet echter wel rekening gehouden worden met de mogelijkheid dat de situatie in proefdieren niet altijd overeenkomt met de situatie in patiënten. Bovendien zou het gebruik van in vivo modellen zo veel mogelijk vermeden moeten worden vanwege het ongerief voor de proefdieren. Door gebruik te maken van in vitro modellen kan het gebruik van proefdieren aanzienlijk verminderd worden omdat verschillende experimenten gedaan kunnen worden met cellen of weefsel afkomstig van één proefdier, iets dat vaak niet mogelijk is met in vivo modellen. Ook kan door het gebruik van menselijk weefsel het probleem van mogelijke verschillen tussen mens en dier vermeden worden en de validiteit van diermodellen bepaald worden. Helaas is de beschikbaarheid van in vitro modellen voor leverfibrose nog steeds erg beperkt. De huidige in vitro modellen voor fibrose zijn vooral celkweekmodellen. Deze modellen hebben veel bijgedragen aan het onderzoek naar leverfibrose, maar hebben het nadeel dat de interacties tussen de verschillende 114

3 types levercellen zoals die normaal in de lever aanwezig zijn, verloren gaan. Omdat fibrose een proces is waarbij verschillende celtypes in de lever een rol spelen en hun onderlinge samenspel hierbij erg belangrijk is, zou het beter zijn om een model te hebben waarin interacties tussen de verschillende leverceltypes wel in stand blijven. DOEL VAN HET ONDERZOEK Recentelijk kwamen leverslices in de belangstelling als mogelijk nieuw in vitro model voor fibrose. Leverslices zijn kleine ronde plakjes lever met een diameter van 8 mm en een dikte van ongeveer 0.2 mm. De voor en nadelen van leverslices als model voor de lever en de manieren waarop stellaatcel activatie en fibrose in de slices gemeten kan worden, zijn beschreven in hoofdstuk 6. Het grote voordeel van leverslices ten opzichte van celkweekmodellen is dat in slices alle verschillende leverceltypes aanwezig zijn en de interactie tussen de cellen behouden blijft. Leverslices worden al veelvuldig gebruikt voor verschillende soorten onderzoek, maar er zijn weinig studies die het gebruik van leverslices voor fibrose onderzoek beschrijven. Het doel van het onderzoek dat in dit proefschrift beschreven is, was dan ook bepalen of leverslices ook gebruikt kunnen worden als in vitro model voor het bestuderen van fibrose en voor het testen van fibrose-remmende stoffen. RESULATEN Het onderzoek beschreven in dit proefschrift heeft uiteindelijk geleid tot de ontwikkeling van drie veelbelovende in vitro modellen voor leverfibrose. Ten eerste, zoals beschreven in hoofdstuk 2 en 3, hebben we een techniek ontwikkeld om vroege stellaatcel activatie te veroorzaken in slices van rat en menselijk leverweefsel. Dit werd gedaan door de leverslices te kweken in aanwezigheid van tetra (tetrachloorkoolstof) waarvan bekend is dat het in proefdieren leverfibrose veroorzaakt. Dit gebeurt via een multicellulair proces, wat betekent dat de activatering van stellaatcellen en de ontwikkeling van fibrose het gevolg is van de reactie van een aantal verschillende celtypes in de lever op tetra. In leverslices konden we aan de hand van markers voor stellaatcel activatie en fibrose zien dat het kweken in aanwezigheid van tetra vroege stellaatcel activatie veroorzaakte. Gezien het hierboven beschreven mechanisme van fibrose ontwikkeling door tetra in proefdieren, is het effect op stellaatcellen in de leverslices waarschijnlijk een indirect effect dat alleen plaats kan vinden omdat ook de andere leverceltypes in dit model aanwezig zijn en de interacties tussen de cellen behouden zijn gebleven. Dit in vitro model zou dus gebruikt kunnen worden om multicellulaire mechanismen leidend tot vroege stellaatcel activatie verder te onderzoeken, niet alleen voor tetra maar mogelijk ook voor andere stoffen. In hoofdstuk 4 hebben we onderzocht of de stellaatcel activatie die door tetra wordt veroorzaakt in leverslices ook gebruikt kan worden om effecten van fibrose-remmende stoffen te testen. Hiertoe werden slices van menselijke lever gekweekt in aanwezigheid van zowel tetra als pentoxifylline. Van de laatste stof is bekend dat het stellaatcel activatering kan remmen. Deze eigenschap van pentoxifylline wordt over het algemeen toegeschreven aan de remming van de werking van de groeifactor PDGF (plateletderived growth factor). In de leverslices remde pentoxifylline de vroege stellaatcel activatie die was veroorzaakt door tetra niet, terwijl er wel remmende effecten werden 115

4 gezien op volledig geactiveerde stellaatcellen of andere (myo)fibroblasten in de leverslice. Een mogelijke verklaring hiervoor ligt in de observatie dat stellaatcellen pas gevoelig zijn voor PDGF als ze volledig geactiveerd zijn. Wanneer pentoxifylline inderdaad alleen via remming van PDGF effecten werkt, zou dit verklaren waarom het geen remmend effect heeft in de vroege stadia van stellaatcel activatie. Uit deze resultaten concludeerden we dat, hoewel dit model gebruikt zou kunnen worden voor het testen van fibrose-remmende stoffen op vroege stellaatcel activatie, remmers getest moeten worden die stellaatcel activatie op een andere manier remmen. Ten tweede, hebben we de genexpressie van verschillende markers voor stellaatcel activatie en littekenweefselvorming onderzocht tijdens het kweken van slices van rat en humaan leverweefsel (hoofdstuk 4 en 5). Aan de hand van de expressie van deze markers concludeerden we dat tijdens het kweken van de leverslices spontaan een fibrotisch proces plaatsvindt. Bij dit proces leken zowel geactiveerde stellaatcellen als andere (myo)fibroblasten betrokken te zijn, wat overeenkomt met de situatie in proefdieren en patiënten. Ook werd littekenweefsel gevormd in de slices tijdens het kweken. Dat dit proces spontaan plaatsvindt in slices van gezond leverweefsel, geeft aan dat het waarschijnlijk veroorzaakt wordt door het maken en/of het kweken van de slices. Enkele factoren die mogelijk kunnen leiden tot activatie van stellaatcellen in de slices zijn de hoge zuurstofconcentratie die tijdens het kweken aanwezig is of ophoping van (afval)stoffen in de slice. Wanneer de fibrose-remmende stof pentoxifylline werd toegevoegd tijdens het kweken van de slices, leidde dit tot een remming van het fibrotisch proces. Dit model vormt dus een simpel systeem om littekenweefselvorming in de lever te onderzoeken en om fibrose-remmende stoffen te testen in een in vitro systeem waar alle leverceltypes aanwezig zijn en hun cel-cel contacten in stand blijven. De mechanismen die leiden tot het ontstaan van dit spontane fibrotische proces in de leverslices zullen nader onderzocht moeten worden om dit model verder te karakteriseren. Tenslotte is het gebruik van leverslices gemaakt van fibrotisch ratleverweefsel onderzocht als model voor fibrose en voor het testen van fibrose-remmende stoffen (hoofdstuk 5). Deze fibrotische leverslices werden gemaakt van levers van ratten drie weken nadat de galgang van de ratten was afgebonden. Dit afbinden van de galgang leidt tot ophoping van gal in de lever, wat al snel fibrose veroorzaakt. De fibrotische leverslices en de verschillende leverceltypes in de slices bleven vitaal in kweek gedurende 48 uur, met behoud van cel-cel interacties. Het kweken van de fibrotische slices veroorzaakte net als in slices van leverweefsel van gezonde ratten een fibrotisch proces in de slices. Dit proces kon geremd worden door drie verschillende fibroseremmende stoffen, wat aangeeft dat ook dit model gebruikt kan worden om de effecten van nieuwe fibrose remmende stoffen te testen. Wanneer de resultaten vergeleken werden met de effecten van deze remmers zoals ze eerder beschreven waren in andere modellen voor fibrose, bleek echter dat het moeilijk zal blijven om te voorspellen wat het effect van de remmers in patiënten zal zijn. Desondanks geeft het gebruik van fibrotische leverslices de unieke kans om de effecten van fibrose-remmende stoffen in vitro te testen in een multi-cellulair systeem en in een fibrotische omgeving, iets wat niet mogelijk is met andere in vitro modellen. 116

5 CONCLUSIE Zoals in meer detail besproken wordt in hoofdstuk 6, kunnen leverslices dienen als een multi-cellulair in vitro model voor de lever waarin interacties tussen de verschillende leverceltypes behouden blijven. Deze interacties spelen een belangrijke rol in het ontstaan van fibrose in vivo, maar zijn niet afdoende aanwezig in de huidige in vitro modellen voor fibrose. De resultaten van ons onderzoek geven aan dat leverslices een veelbelovend alternatief zijn voor het in vitro onderzoek naar leverfibrose. De ontwikkeling van de modellen zoals in dit proefschrift beschreven kan een bijdrage leveren aan het verminderen van het gebruik van proefdieren. Daarnaast kan door het gebruik van menselijk leverweefsel in deze in vitro modellen de voorspellende waarde verbeterd worden. 117