Acetonitril versus Methanol als eluens in een LC-APCI-MS/MS systeem

Rijkswaterstaat Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling (RIZA) Acetonitril versus Methanol als eluens in een LC-APCI-MS/MS systeem Werkdocument 98.081 X Afstudeerscriptie Jordan Tiesnitsch Noordelijke Hogeschool Leeuwarden HLO-Chemisch, algemene richting

Massaspectrometrie Vervangen van Acetonitril door Methanol als eluens in een LC-APCI-MS/MS systeem Naam Jordan Tiesnitsch Studierichting : HLO, Algemene chemie Onderwijsinstelling : Afstudeer-instelling : Noordelijke Hogeschool Leeuwarden Sector techniek Afdeling HLO-LPT Rijksinstituut voor Integraal Zoetwate Afvalwater behandeling (RIZA) Afdeling : Informatie en Meettechnologie, Lab( Organische analyse (IMLO) Locatie : Lelystad Begeleiding : Ing. Rene Geerdink Periode : augustus 1997-juni 1998 W.fi. De inhoud van dit werkdocument hoeft niet noodzakelijkerwiis in overeenstemming te zijn met de visie van het Ministerie van Verkeer en Waterstaat

Voorwoord Deze afstudeerscriptie is tot stand gekomen na een experimenteel onderzoek van acht maanden op de afdeling Informatie en Meettechnologie, Laboratorium voor Organische analyse (IMLO) bij het Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling (RIZA) in Lelystad. Dit instituut geeft advies over inrichting en beheer van de Nederlandse zoete wateren en verzamelt daartoe informatie over de toestand van het water en doet onderzoek. De afstudeerperiode ging uit van de Noordelijke Hogeschool Leeuwarden, sector techniek, afdeling HLO-LPT en werd van daaruit begeleid door Dhr. J. Veerman. Graag wil ik Paul Frintrop bedanken voor zijn bereidwilligheid dit werk kritisch door te nemen en van commentaar te voorzien. In het bijzonder wil ik Rene Geerdink bedanken voor zijn hulp, begeleiding en prettige samenwerking tijdens de afstudeerperiode. Verder bedank ik alle medewerkers van de afdeling IMLO voor hun ondersteuning en collegialiteit. Jordan Tiesnitsch Voorpagina: Bovenste figuur is een massaspectrometer met een TSQ Onderste figuur geeft een APCI-ionisatiebron.

I SAMENVATTING 1 II ABSTRACT 3 III AFKORTINGEN EN TERMEN 5 1 INLEIDING 6 1.1 R.I.Z.A 6 1.2 ALGEMEEN 6 1.3 PROBLEEMSTELLING 6 1.4 DOELSTELLING 7 2THEORIE 8 2.1 MASSASPECTROMETRIE 8 2.2 WERKING QUADRUPOOL 8 2.2.7 De quadrupool 8 2.2.2 Triple Stage Quadrupool 9 2.2.3 Scanmodes 10 2.2.4 RF-only Daughter mode 7 7 2.3 IONISATIE 12 2.3.1 Chemische Ionisatie 72 2.3.2 Atmospheric Pressure Chemical Ionization 72 3 EXPERIMENTEEL 14 3.1 APPARATUUR 14 3.2 MEETOMSTANDIGHEDEN VAN MS 14 3.3 ANALYSE MET ACN EN MEOH ALS MOBIELE FASE 14 3.4 KEUZE PREKOLOM 16 3.5 PRECONCENTRATIE MET PLRP-S EN MEOH 17 4 RESULTATEN EN DISCUSSIE 18 4.1 ANALYSE MET ACN EN MEOH ALS MOBIELE FASE 18 4.2 KEUZE PREKOLOM 19 4.3 PRECONCENTRATIE MET PLRP-S EN MEOH 21 4.3.7 Tweede pomp voor bijmengen water 27 4.3.2 Tweede pomp voor elutie van prekolom 22 4.4 AUTOMATISERING EN HERHAALBAARHEID METHODE 25 5 CONCLUSIES 27 6AANBEVELINGEN 28 7 REFERENTIES 29 8 BIJLAGEN 30 Afsludeeropdrachl Jordan Tiesnitsch

I Samenvatting Voor het analyseren van een groot aantal, zowel bekende als onbekende, polaire en semi-polaire componenten wordt bij het RIZA gebruik gemaakt van de combinatie vloeistofchromatografie (LC) en massaspectrometrie (MS). Hierbij wordt gebruik gemaakt van de RFD-mode (RadioFrequency only Daughter scan mode), terwijl de ionisatie plaatsvindt met APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization). Als mobiele fase wordt er gebruik gemaakt van acetonitril (ACN). Een groot nadeel van ACN is dat voor veel stoffen geldt dat de ionisatie wordt onderdrukt. Hierdoor kunnen een groot aantal stoffen niet geanalyseerd worden. Door nu ACN te vervangen door methanol (MeOH) als mobiele fase, kan dit probleem grotendeels verholpen worden. MeOH heeft echter het nadeel dat stoffen die zijn geconcentreerd op een polymere prekolom, slecht desorberen. Een ander nadeel is de koppeling van de polymeer-prekolom met de C-18 analytische kolom. Er vindt piekverbreding plaats, wat zeer nadelig is voor de bepaling. In dit onderzoek is getracht om het systeem zo te wijzigen dat MeOH wel kan worden toegepast als eluens. Eerst is de ACN en MeOH invloed op de ionisatie onderzocht. Uit het vervangen van de ACN-mobiele fase door MeOH in een LC- MS systeem blijkt dat voor zowel de positieve als de negatieve ionisatie geldt dat de signaal/ruis verhouding voor bijna alle stoffen in de standaarden beter wordt. Bij de positieve ionisatie waren er een aantal stoffen (Lenacil, Diuron en Monolinuron) die een verbetering opleverden met een factor van 50-80. Het gaat hierbij om metingen waar geen gebruik is gemaakt van een preconcentratie maar van een loopinjectie. Vervolgens is er onderzocht welke prekolom/analytische kolom combinatie met methanol gradient de bestaande methode met ACN en PLRP-S prekolom kan vervangen. Bij de detectie is hierbij gebruik gemaakt van een LC-UV. Bij het testen van verschillende prekolommen is gebleken dat op basis van piekhoogte, piekbreedte en piekoppervlak, de prekolom "C-18, 8pm, high carbon, 10*3mm" het beste resultaat geeft Met deze C-18 prekolom is vervolgens onderzoek gedaan naar het doorbraakvolume van enkele stoffen op deze prekolom. Uit dit onderzoek is gebleken dat voor chloridazon geldt dat deze al doorbreekt bij een volume van 25 ml. Hieruit blijkt dat er geen oplossing gevonden kan worden door een andere prekolom te gebruiken. Vervolgens is er gekeken of er een andere, technische, oplossing mogelijk is. Dit is gedaan door een tweede pomp in het systeem te plaatsen. Deze pomp kan op twee manieren in het systeem geplaatst worden. Als eerste door de tweede pomp te gebruiken voor het bijvoegen van water na het elueren van de PLRP-S prekolom. Dit had als doel de stoffen opnieuw te preconcentreren op de analytische kolom. Dit levert echter geen verbetering van de piekvorm op. Een andere oplossing is door de tweede pomp te gebruiken als desorptiepomp. Na het desorberen met 100% MeOH wordt dan vervolgens via een T-stuk het mobiele fase-gradient bijgevoegd. Op deze manier komen alle componenten goed van de Afstudeeropdrachl Jordan Tiesnilsch,

prekolom af en worden ook goed gereconcentreerd op de analytische kolom. De piekvorm was na de elutie vergelijkbaar met de oude situatie met ACN. Het meten onder deze omstandigheden is geautomatiseerd door gebruik te maken van een PROSPEKT. Vervolgens zijn er een aantal meetseries uitgevoerd, om de herhaalbaarheid met beide soorten eluens te bepalen. Uit deze resultaten blijkt dat voor de positieve ionisatie de spreiding, met MeOH als eluens, voor bijna alle componenten veel lager is dan met ACN als eluens. Voor MeOH ligt de spreiding tussen 2-7 % en voor ACN is dit tussen 3-22 %. Hieruit kan opgemaakt worden dat voor de positieve ionisatie geldt dat de herhaalbaarheid met MeOH beter is dan met ACN als eluens. Ook is dit vergelijk gemaakt voor de negatieve ionisatie. Uit deze metingen blijkt dat ook hier de spreiding kleiner is bij de metingen met MeOH (2-18 %) dan met ACN (3-35 %). Er zijn echter ook vier stoffen die een veel grotere spreiding geven met MeOH als eluens (>50 %). Het gaat hier dan om een groep stoffen die bij de "fenolen" horen. Een oorzaak van deze afwijkende resultaten is niet gevonden. A/sludeeropdrachl Jordan Tiesnitsch

II Abstract The Radiofrequency only - Daughter scan mode (RFD-mode) of a triple quadrupole mass spectrometer is, in combination with liquid chromatography and APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) ionization (LC-APCI-MS/MS) a very useful mode to analyse a large number of known and unknown compounds. At RIZA the method is used to analyse polar and semi-polar compounds in surface water. By using a cut-off mass of m/z 70 and m/z 71 and alternating collision offset voltages of ±6 and ±20 V respectively, both molecular and fragment ions can be analysed in one analysis. Usually ACN is used as an eluent to analyse the compounds. A drawback of ACN is that the ionization will be suppressed for a lot of compounds. However, when MeOH is used instead of ACN as an eluent, most of the problem of the ionization is remediable. MeOH has a drawback that the pesticides which are concentrated on the solid-phase column, will not elute badly. This results in very broad peaks. To analyse polar and semi-polar compounds This means that another method with MeOH must be found. First, the effect of ACN and MeOH on the ionization is studied for the negative and the positive ionization mode. Using MeOH.the S/R ratio for all the compounds decreased. For some of the compounds (Lenacil, Diuron and Monolinuron) a gain in senitivity is reached of factor of 50 to 80. All these experiments are done with a loopinjection. Next another solid phase column was investigated which could replace the PLRP-S column. The solid phase column "C-18, 8pm, high carbon, 10*3mm" gave the best result. This column showed the best peak-height and peak-width. However the break through volume of this solid phase column, a volume of 25 ml was found for the compound chloridazon. This means that the replacement of the PLRP-S column is not a good solution for the problem. Another solution is to use a second pump in the system. De pump can be used in two ways. First the pump can be used to add water to the system after the desorption of the solid phase column. In this way the compounds should reconcentrate the compounds on the analytical column. However this did not happen. The second pump can also function as a desorption pump. After desorption of the solid phase column with 100% MeOH, the eluent has been added T-piece. In this way the compounds eluted very well from the solid phase column and are reconcentrated on the analytical column.

Automation is performed by using the PROSPEKT. A few series of standard solutions have been measured to calculate the standard deviation with both eluents. The standard deviation for the positive ionization for MeOH was 2-7% and for ACN 3-22%. For negative ionization and MeOH it was 2-18% en 3-35%. With negative ionization there were 4 compounds which gave a standard deviation >50% for MeOH. All these compounds were phenols. A reason for these deviating results is not found.

Ill Afkortingen en termen ACN amu APCI CID CI COFF DC EPA IMLO Marathon MeOH m/z octapole PROSPEKT Qn quan-massa's RFD-mode R.I.Z.A. SDU SRM SSP TSQ Acetonitril Atomaire massa eenheid Atmospheric Pressure Chemical Ionization Collision Induced Dissociation Chemische Ionisatie Collision OFFset Direct Current Environmental Protection Agency Afdeling Informatie en Meettechnologie Laboratorium voor Organische analyse Automatische injectiesysteem Methanol massa-lading verhouding Een achttal lenzen PRogrammable On-line Solid-Phase E(K)straction Quadrupool 1, 2 of 3 Quantificeringsmassa RadioFrequency only Daughter scan mode Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwater behandeling Solvent Delivery Unit Single Reaction Monitoring Sample Preparation Program Triple Stage Quadrupool

1 INLEIDING 1.1 R.I.Z.A. Het R.I.Z.A. (Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling) is opgericht in 1920. Het is onderdeel van Rijkswaterstaat en verantwoordelijk voor alle Rijkswateren; het Usselmeer en de grote rivieren. Om goed onderbouwde adviezen te geven verzamelt het informatie over de toestand van het water en er wordt onderzoek gedaan. De belangrijkste doelstelling van het RIZA luidt als volgt: "Het bevorderen van een maatschappelijk gewenste duurzame waterhuishouding van de binnenwateren, welke de zorg omvat van het op of in de bodem vrij aanwezige water, met het oog op de belangen die daarbij in het geding zijn". 1.2 Algemeen De hoofdafdeling Informatie en Meettechnologie (IM) heeft de verantwoording over het inwinnen en opslaan van gegevens over de grote Nederlandse binnenwateren, en het verwerken van deze gegevens tot relevante informatie, Ook wordt er voortdurend gewerkt aan de ontwikkeling van nieuwe meet- en bemonsteringsmethoden. De parameters, meetpunten en meetfrequenties moeten op een zodanige manier gekozen worden dat het een algemeen beeld geeft over de Nederlandse binnenwateren. Een onderdeel van de afdeling IM is de afdeling Informatie en Meettechnologie Laboratorium voor Organische analyse (IMLO). Op deze afdeling wordt o.a. gebruik gemaakt van Massaspectrometrie, dit voor zowel de koppeling met gaschromatografie (GC-MS) als met vloeistofchromatografie (LC-MS). Met GC-MS worden voornamelijk vluchtige en semi-vluchtige componenten geanalyseerd. Met LC-MS worden polaire en semi-polaire componenten geanalyseerd. De gemeten monsters worden bij deze methoden niet alleen vergeleken met de componenten die in de standaarden zitten, maar ook wordt er gekeken of de identiteit van onbekenden opgehelderd kan worden. Deze stoffen kunnen dan ook weer aan de standaarden toegevoegd worden. 1.3 Probleemstelling Bij de koppeling van LC met MS worden er polaire en semi-polaire stoffen geanalyseerd. Het gaat hier dan voornamelijk om pesticiden. De detectie van deze stoffen vindt plaats met de RF-only daughter scan mode (APCI-MS-MS). Als mobiele fase wordt er gebruik gemaakt van acetonitril (ACN). Het nadeel van ACN is dat voor veel stoffen geldt dat de ionisatie wordt onderdrukt. Hierdoor kunnen een groot aantal stoffen, waronder Diuron, niet geanalyseerd worden. Door nu ACN te vervangen door methanol (MeOH) als mobiele fase, kan dit probleem verholpen worden. Een nadeel met MeOH is de on-line koppeling van de polymeer-prekolom met de C-18 analytische kolom. De stoffen worden goed geconcentreerd op de prekolom, maar het desorberen hiervan levert een probleem op met MeOH. Hierdoor vindt er piekverbreding plaats, wat zeer nadelig is voor de bepaling. s

1.4 Doelstelling Onderzoeken of ACN door MeOH als mobiele fase kan worden ven/angen in een LC- APCI-MS-MS systeem. Dit is gedaan door op de volgende manier te werk te gaan: Vaststellen of de methode met methanol gradient voor een betere S/R verhouding zorgt. Op deze manier moet er bevestigd worden of MeOH als mobiele fase voor betere ionisatie zorgt dan ACN. Onderzoeken welke prekolom/analytische kolom combinatie met methanol gradient de bestaande methode kan vervangen. Bij de detectie is hierbij gebruik gemaakt van een LC-UV methode. Onderzoeken of een technische aanpassing zou kunnen leiden tot een methode met een methanol gradient. Vaststellen wat de betrouwbaarheid is van de nieuwe methode.

2 Theorie 2.1 Massaspectrometrie Massaspectrometrie is een techniek waarbij ionen gescheiden worden op grond van hun massa/lading verhouding. Voor 1970 bestonden massaspectrometers enkel uit een elektrische en/of magnetische sector. Door middel van electrische velden werden de ionen versneld en vervolgens werden ze ook weer afgebogen door een electrisch en/of een magnetisch veld. Doordat een ion met een grotere massa meer afgebogen wordt dan een ion met een kleinere massa, kan er op deze manier scheiding plaatsvinden. Op deze manier kunnen bijvoorbeeld isotopen van elkaar gescheiden worden op basis van hun massa/lading verhouding. Om de ionen te verkrijgen zijn er verschillende manieren om te ioniseren. Een aantal van deze methoden zijn: Elektron Impact (El), Veldionisatie (Fl), Velddesorptie (FD), Vonkionisatie (Spark source) en Chemische Ionisatie (CI). 2.2 Werking Quadrupool 2.2.1 De quadrupool Een quadrupool is opgebouwd uit vier hyperbolische staven die in een vierkant staan opgesteld. De staven die nu tegenover elkaar liggen zijn met elkaar verbonden d.m.v. een geleider. Het ene paar is positief geladen en het andere negatief. Het gaat hier in beide gevallen om een gelijkspanning. Ook wordt er over deze staven een wisselspanning aangelegd. Deze wisselspanning heeft een constante frequentie (1MHz) en een variabele amplitude (van 0 tot 6000 V). Omdat deze wisselspanning in het radiofrequentiebereik ligt wordt deze de RF-spanning genoemd. De gelijkspanning die over de staven staat varieert tussen de 0 en 500 V. De uiterste waarden van deze spanningen gelden voor een massabereik tot 2000 amu. Om nu vervolgens massascheiding te krijgen worden de spanningen voortdurend gevarieerd, terwijl de DC/RF spanningsverhouding constant blijft. Deze verhouding blijft altijd 0.168. Als nu de spanning RF wordt verhoogd, wordt de breuk kleiner en wordt het gebied waarin de ionen een stabiele baan binnen de quadrupool afleggen te groot. Hierdoor kunnen ionen met verschillende m/z-waarde tegelijkertijd gedetecteerd worden. Dit betekent dat de resolutie nu slechter is geworden. Als deze verhouding gelijk is aan nul, dus als DC nul is, worden alle ionen doorgelaten op de lichte na. In dit geval heeft de quadrupool de functie van een transmissiecel. In het geval dat de RF wordt verlaagd, en de breuk groter wordt, is er geen sprake meer van een stabiliteitsgebied en zullen de ionen zich voortijdig ontladen bij een van de staven van de quadrupool. De ionen die te licht zijn, ondervinden meer invloed van de wisselspanning en hebben hierdoor de neiging om voortijdig bij de positieve pool ontladen te worden. De te zware ionen zullen meer de baan van de gelijkspanning volgen en worden dus ontladen aan de negatieve quadrupool. De deeltjes die nu inmiddels neutraal zijn geworden, worden vervolgens afgezogen. De ionen die wel in de goede baan blijven, kunnen vervolgens gedetecteerd worden. o

Over de gehele quadrupool staat ook nog een bepaalde spanning (offset) t.o.v. de bron die ervoor zorgt dat de ionen de juiste kinetische energie meekrijgen om lang genoeg in de quadrupool aanwezig te zijn om op hun m/z verhouding te kunnen worden gefilterd. 2.2.2 Triple Stage Quadrupool De TSQ is een massaspectrometer met drie quadrupolen in serie geschakeld. Voor elke quadrupool geldt wat in paragraaf 2.2.1 is vermeld. Tussen de quadrupolen onderling zijn ook enkele verbanden aanwezig. In figuur 2.1 is een opstelling weergegeven van een LC in combinatie met de TSQ. LC-APCI-MS/MS-opstelling Preconcentratie via PROSPEKT IIPLC/Analytische kolom UV-metcr lonisatichron Scheiding 250 nm APCI Triple Stage Quadrupool i A_JL il MS IS Figuur 2.1: LC in combinatie met APCI en TSQ Zowel de eerste als de derde quadrupool kan dienen als massafilter of als transmissiecel. Indien de quadrupool als massafilter wordt gebruikt, wordt de RFspanning en de gelijkspanning (DC) op een bepaalde waarde ingesteld. Op deze manier worden ionen met een bepaalde m/z waarde doorgelaten. Als nu beide spanningen verhoogd worden dan worden er weer ionen doorgelaten met een andere m/z verhouding. Dit gaat op deze manier door tot aan het einde van de scan. Hierna worden de RF en DC spanningen tot nul teruggebracht en het proces weer opnieuw gestart. Indien er alleen een RF-spanning wordt aangelegd (RF-only), worden alle ionen boven een bepaalde massa (cutoff massa) gefocusseerd en doorgelaten. Van deze situatie wordt gebruik gemaakt bij de tweede quadrupool die bij de TSQ fungeert als botsingskamer. Door in deze tweede quadrupool een inert gas (Argon) toe te laten, kunnen de ionen door een of meerdere botsingen fragmenteren. Dit wordt ook wel Collision Induced Dissociation (CID) genoemd. Het aantal botsingen dat een ion zal maken is afhankelijk van de druk van het gas. Als er meerdere botsingen plaatsvinden, zullen er ook meer en dus ook kleinere fragmenten ontstaan. Een te hoge druk zal echter de ontstane fragmenten teveel afremmen, zodat deze de derde quadrupool niet zullen bereiken. De mate van

fragmenteren is afhankelijk van de hoeveelheid kinetische energie die de primair gevormde ionen hebben. Deze kinetische energie van het ion wordt bepaald door het spanningsverschil (COFF: Collision OFFset) over de tweede quadrupool. De mate van fragmentatie kan dus op deze manier ook bepaald worden door een geschikte keuze van het spanningsverschil. De focusserende werking van de RF-only quadrupool is zodanig, dat bij goede instellingen maar weinig ionen verloren zullen gaan. Door nu een gelijkspanning aan de RF-wisselspanning toe te voegen, worden alleen de ionen van een m/z doorgelaten. De overige ionen botsen tegen een van de vier staven van de quadrupool en worden ontladen en vervolgens afgezogen. De quadrupool werk nu als een massafilter. 2.2.3 Scanmodes De meest gangbare scanmodes bij de TSQ en de RFD-mode, zijn in figuur 2.2 weergegeven. Bij deze scanmodes wordt onderscheid gemaakt tussen een of twee scannende quadrupolen. lien massa filter Q3/MS Ql Q2 Q3 RFD-mode Twee massa filters DAI -mode * -^s. SRM-mode ^S Figuur 2.2: Scanmodes bij de TSQ In Q3/MS worden alle ionen doorgelaten in de quadrupolen Q1 en Q2. Q3 heeft als functie dat het de scannende quadrupool is. De RFD-mode is ook een full scan-mode en werkt vrijwel op de zelfde wijze als Q3/MS. Het belangrijkste verschil is dat in Q2 een botsingsgas aanwezig is waarbij de ionen bij verschillende botsingsenergieen kunnen fragmenteren. 10

Tevens wordt er een cutoff-massa ingesteld waaronder geen ionen worden doorgelaten. In Q3 worden de ionen en/of fragmenten gescand. Met de DAU-mode kan veel selectiever worden gemeten omdat gebruik wordt gemaakt van twee massafilters. In Q1 wordt een ion geselecteerd. Na fragmentatie van dit ion in Q2 worden alle fragment-ionen gescand in Q3. Bij de hiervan afgeleide SRM-scanmode worden slechts een beperkt aantal ionen in Q3 geselecteerd. Per tijdseenheid kan er langer "gekeken" worden naar een ion, zodat deze methode relatief gevoeliger is. Met de LC-MS/MS methode streeft men er naar alle componenten die van de LCkolom komen te meten. Met de DAU- of SRM-methode is dit niet mogelijk. Deze methoden zijn alleen geschikt voor Target-Compound analyses waar gericht naar een beperkt aantal verbindingen onderzoek wordt gedaan. Alle componenten die buiten dit venster vallen, dus ook onbekende stoffen, worden niet gemeten. Om een zo volledig mogelijk beeld te krijgen van het monster zijn de Q3MS- en de RF-only Daughter mode (RFD) wel geschikt. De Q3MS-mode is echter weinig specifiek. Er bevindt zich geen gas in de botsingscel wat in feite hetzelfde resultaat oplevert als een enkelvoudige MS-systeem met alleen informatie over het molecuulgewicht. 2.2.4 RF-only Daughter mode Door het toelaten van argongas in de botsingscel en met Q3 als massafilter, is de RFD (RF-only Daughter mode) geschikt om tegelijkertijd de oorspronkelijke (parent-ionen) en de gevormde ionen (produktionen) te meten. In figuur 2.3 is een schematisch weergave gegeven van de RFD-scanmode. Selectie ionen boven massa Botsingscel Massafilter Quadrupool 1 Quadrupool 2 Quadrupool 3 Cutoff massa m/z 70 m/z 71 Collision offset + 20 V ' + 6 V Figuur 2.3: Schematische weergave van de RF-only Daughter scanmode Scan range m/z 20-700 scan time 1 s Clusterionen met het eluens (bv acetonitril+nh 4 * = m/z 59) kunnen voor interferenties zorgen tijdens de analyse. Om te voorkomen dat deze clusterionen het systeem II

binnen gaan, wordt een cutoff-massa ingesteld. Dit is een RF-spanning met een bepaalde amplitude, waarbij theoretisch alle ionen met een m/z gelijk of groter aan de ingestelde cutoff-massa (hier m/z 70 en 71) door de RF-quadrupool worden getransporteerd. Om tot een voldoende zekere identificatie te komen moeten minstens vijf karakteristieke ionen aanwezig zijn waaronder het moleculair ion (volgens de US Environmental Protection Agency (EPA)). Bij de RFD-mode wordt daarom over de botsingscel, waar argon aanwezig is, alternerend een spanning van ±6 V en ±20 V aangelegd. Bij een spanning van ±6 V treedt er een zachte botsing op waardoor het betreffende molecuul weinig of niet fragmenteert en het moleculair ion behouden blijft. Bij een botsingsspanning van ±20 V is er sprake van een harde botsing, waarbij het molecuul uiteen valt in fragmenten. In de derde quadrupool worden nu de molecuulionen en fragmenten afkomstig uit de botsingscel gescand over een massabereik van 20 tot 700 met een scantijd van een seconde. 2.3 Ionisatie 2.3.1 Chemische Ionisatie Bij de massaspectrometrische analyse heeft men vaak te maken met het verschijnsel dat van bepaalde organische verbindingen het moleculair-ion weinig intensiteit heeft of zelfs helemaal afwezig is. Dit wordt veroorzaakt doordat er zeer veel kinetische energie aanwezig is, het ion valt hierdoor direct uiteen. Door het toepassen van chemische ionisatie is het vaak wel mogelijk om ionen te verkrijgen die representatief zijn voor het gehele molecuul. Het is namelijk een zachte ionisatie-techniek. Bij chemische ionisatie worden de ionen gevormd doordat de moleculen van een stof reageren met de ionen die afkomstig zijn van een reactiegas. Veel gebruikte reactiegassen zijn: methaan, isobutaan, ammoniak of stikstof. Dit reactiegas wordt ingelaten in de reactiekamer onder een bepaalde druk. Bij de TSQ is dit ongeveer 2-8 mtorr. Wanneer er nu een elektronenstroom door de ionisatiekamer wordt gestuurd zullen er in eerste instantie alleen ionen van het reactiegas worden gevormd. Deze ionen reageren vervolgens opnieuw met de primaire moleculen van het reactiegas. De ionen die hierbij worden gevormd kunnen op hun beurt weer reageren met molekulen van het monster, waarbij een proton wordt overgedragen. Karakteristiek voor CI is de [M+H]*-piek die ontstaat. Behalve de [M+H]*-piek zijn er bij de CI vaak ook nog adduct-ionen te zien. Deze ionen zijn afkomstig van andere deeltjes die bij de ion-molekuul reactie in de bron gevormd zijn. Zo ontstaat bijvoorbeeld bij de toepassing van ammoniak het adduct-ion [M+NHJ*. Deze adduct-ionen kunnen eveneens worden gebruikt om de moleculaire massa van een verbinding te bepalen. 2.3.2 Atmospheric Pressure Chemical Ionization APCI is een zachte ionisatietechniek die plaats vindt onder atmosferische druk (figuur 2.4). Als reactiegas wordt er gebruik gemaakt van stikstof. Dit gas wordt de, -y

ionisatiekamer binnengebracht. Doordat er over de Corona naald een hoge potentiaal heeft, gaat het stikstof door ontlading ionen vormen. Deze ontlading vindt in twee stappen plaats. Primaire Ion formatie N 2 + e" => N 2 * + 2e Secundaire Ion formatie N 2 + + N 2 => N 4 * H 2 0 + H 2 0 => H 3 0* + OH Vervolgens komt het monster het interface binnen en wordt meteen verneveld en verdampt. De molekulen die nu over zijn gebleven reageren vervolgens met de ionen die uit het reactiegas zijn ontstaan waardoor er protonoverdracht plaatsvindt. Ook kunnen hierbij enkele adduct ionen ontstaan. Dit is hieronder weergegeven. Adduct ion formatie H 3 0+ + M => [M+H]* + H 2 0 H 3 0 + + M => [M+H 3 Or De ionen die nu zijn ontstaan worden getransporteerd door een verwarmd capillair en komen bij de skimmer. Deze vangt een deel van het overtollige reactiegas weg. De tube lens zorgt ervoor dat de geladen ionen gefocusseerd worden, en zo door de skimmer kunnen gaan. Shcat Gas Tube lens Skimmer \ulnhfsferisch naar MS htnig vutuum Monster (Auxiliary gas) (wordt niet gebruikt) corona needle Capillary Octapolc Figuur 2.4: De APCI-bron Vervolgens worden de ionen door een octapole opnieuw gefocusseerd en gaan daarna de massaspectrometer (TSQ) binnen. 13

3 Experimented 3.1 Apparatuur Triple Stage Quadrupool APCI-interface Computerbesturing TSQ Marathon injectie-systeem 500ul Gradientpomp (bij loopinjectie's) Gradientpomp (UV-metingen) Gradientpomp (bij PROSPEKT) Desorptiepomp (afspoelen prekolom) Uitwerkstation (UV-metingen) UV-meter PROSPEKT, SDU Filtratie-unit Degasser Analytische kolom : Finnigan MAT, TSQ 700 : Finnigan MAT : DECstation 5000/33 : Spark Holland : Waters 600 E : Separations Model 480 : Milton Roy CM4000 : LKB-Bromma2150 : Millenium Waters versie 2.12 : UV/VIS detector Philips PU4110 : Spark Holland :MiliporeXF16.047.05 : Separations GT-104 : 250 mm *4,6 mm ID Supelco LC-18-DB 3.2 Meetomstandigheden van MS De instellingen voor zowel de positieve als de negatieve ionisatie zijn weergegeven in bijlage 1. Veel van deze parameters worden via een analyseprocedure automatisch ingesteld. Alleen de druk van het SHEAT-gas moet voor de wisseling van positief naar negatief handmatig veranderd worden. (pos. 70 psi, neg. 40 psi). 3.3 Analyse met ACN en MeOH als mobiele fase Er gebruik gemaakt van 3 verschillende standaard-oplossingen. Dit betreft een oplossing voor de negatieve en 2 oplossingen voor de positieve ionisatie. Deze drie standaarden zijn gemeten met behulp van de analyse opstelling die schematisch weergegeven is in figuur 3.1. Loopinjectie via Marathon HPLC/Analytische kolom UV-meter Ionisatiebron Tripple Stage Scheiding 250 nm APCI Quadrupool < Figuur 3.1: Opstelling voor vergelijk ACN en MeOH als mobiele fase 14

De stoffen in deze 3 standaarden zijn weergegeven in tabel 3.1. Negatief Positief 1 Positief 2 Chloridazon faed Desisopropylatrazine Bromacil Desethylatrazine Carbetamide Fluroxypyr Benzothiazole Simazine Bentazon Metribuzin Triethylcitraat 2,4-D D3 Lenacil 2 - (butoxyethoxy)ethy lacetaat 2,4-D Malaoxon Atrazine D5 MCPA Metabenzthiazuron Atrazine DNOC Chloortoluron Isoproturon 2,4-DP Atrazine D5 Monolinuron MCPP DEET Propachloor 2,4,5-T Diuron Metazachloor Warfarin Tnadirnenol Propazine 2,4-DB Triadimefon Metolachloor MCPB Diazinon 2,4,5-TP Dinoseb Dinoterp Pentachloorfenol Tabel 3.T: Standaardoplossingen negatieve en positieve ionisatie De standaard is ge'i'njecteerd met een automatisch injectiesysteem (Marathon), met een loop van 500 pi bevat. Om de juiste concentratie te krijgen (t.o.v. 100 pi loop) zijn de 3 standaarden (1 mg/l) vooraf 5 maal verdund (0.2 mg/l). De analytische kolom die in dit onderzoek gebruikt is, is de Supelco-sil (25 cm, 4,6 mm, I.D. 5 pm, LC-18-DB). De detectie vindt plaats met de RF-only daughter scan mode (APCI-MS-MS). Voor het elueren is gebruik gemaakt van de gradient die is weergegeven in tabel 3.2. Tijd (min.) % Eluens A % Eluens B % Eluens C Flow (ml/min.) 0 100 0 0 0.9 55 5 95 0 0.9 60 5 0 95 0.9 65 5 0 95 0.9 67 100 0 0 0.9 77 100 0 0 0.9 100 100 0 0 0.4 101 100 0 0 0.05 Tabel 3.2: Gradient voor vergelijk ACN en MeOH als mobiele fase 15

De verschillende mobiele fase samenstellingen zijn weergegeven in tabel 3.3. Soort meting Mobiele fase A Mobiele fase B Mobiele fase C Neg. ACN 5 % ACN 3 ml/1 Azijnzuur Pos. ACN 5 % ACN 3 ml/1 Mierezuur Neg. MeOH 5 % MeOH 3 ml/i Azijnzuur Pos. MeOH 5 % MeOH 3 ml/i Mierezuur Tabel 3.3: Samenstelling eluentia 100 % ACN 3 ml/l Azijnzuur 100 % ACN 3 ml/l Mierezuur 100 % MeOH 3 ml/l Azijnzuur 100 % MeOH 3 ml/l Mierezuur 100 % ACN 3 ml/l Azijnzuur 100 % ACN 3 ml/l Mierezuur 100 % ACN 3 ml/l Azijnzuur 100 % ACN 3 ml/l Mierezuur Eluens C geldt voor een extra spoelstap bij de metingen met MeOH. Om het vergelijk zo goed mogelijk te maken, is er bij de metingen met ACN ook gebruik gemaakt van dit eluens. Hier is eluens B echter hetzelfde als eluens C. Elke standaard is in duplo geanalyseerd. 3.4 Keuze prekolom Er is gebruik gemaakt van een standaard-oplossing welke 4 componenten bevat. De componenten zijn representatief voor een grote groep componenten die routinematig met LC worden geanalyseerd. Deze 4 stoffen zijn: - Chloridazon - Simazine - Isoproturon - Dinoterb Er zijn metingen verricht door een loopinjectie van 75 pi van een 1 mg/l -oplossing te injecteren. Bij deze metingen is er geen gebruik gemaakt van een prekolom. Daarentegen zijn er ook metingen gedaan door 25 ml van een 3 pg/l -oplossing te preconcentreren over een aantal verschillende prekolommen. De prekolommen die in dit onderzoek zijn gebruikt zijn weergegeven in tabel 3.4. Prekolom Omschrijving 1 PLRP-S, 15-25 pm (10*2 mm) 2 C-18, 8 pm, High Carbon, (10 * 2mm) 3 C-18, 8 um, High Carbon, (10 * 3mm) 4 Hysphere 2, C-18, 8 pm, (10 * 2mm) 5 Hysphere 2, C-18, 8 pm, (10 * 3mm) Tabel 3.4: Ceteste prekolommen 16

De verschillende analytische kolommen die in dit onderzoek zijn gebruikt zijn weergegeven in tabel 3.5. Analytische Eigenschappen kolom Supelco-sil 25,0 cm 4,6 mm 5pm Inert-sil ODS-3 25,0 cm 4,6 mm 5pm 15% C Tabel 3.5: Ceteste analytische kolommen Er is gemeten met de volgende mobiele fase-gradient (tabel 3.6): Tijd (min.) Eluens A % Eluens B % Flow (ml/min.) 0 100 0 1.0 55 5 95 1.0 60 5 0 1.0 65 5 0 1.0 67 100 0 1.0 77 100 0 1.0 100 100 0 0 4 101 100 0 0.05 Tabel 3.6: Mobiele fase-gradient De metingen zijn verricht met een UV-detector, bij een golflengte van 250 nm. Vervolgens als het juiste pre-kolommetje gevonden is aan de hand van piekhoogte en piekbreedte, wordt hiervan het doorbraakvolume bepaald voor de 4 componenten die in de standaard aanwezig zijn. Dit wordt gedaan door 25, 50, 100, 200 en 400 ml standaard te preconcentreren er vervolgens te meten met de LC-UV methode. 3.5 Preconcentratie met PLRP-S en MeOH Om te beoordelen af de scheiding/piekvorm van de componenten beter/slechter wordt, wordt van een drietal componenten een aantal parameters bijgehouden. De componenten die hiervoor gebruikt zijn, zijn weergegeven in tabel 3.7. In deze tabel zijn de quan-massa's voor twee verschillende cutoff massa's weergegeven. Positieve ionisatie Stof Cutoff massa Cutoff massa 71 70 Desethylatrazine 188 146 Atrazine D5 221 179 Triadimenol 296 70 Tabel 3.7: Quan-massa's 3 componenten positieve ionisatie Eerst zijn er metingen uitgevoerd waar met een loop werd gemjecteerd en vervolgens zijn de metingen geautomatiseerd m.b.v. de Marathon. 17

4 Resultaten en discussie 4.1 Analyse met ACN en MeOH als mobiele fase Om de beide mobiele fasen met elkaar te vergelijken zijn voor zowel de zachte als de harde botsing de piekhoogtes en de daarbij horende ruis van 3 standaard oplossingen in duplo bepaald. Dit zijn de oplossingen die ook bij de routinematige analyses worden gebruikt. Dit geldt voor zowel de metingen met ACN als met MeOH als mobiele fase. In bijlage 2a is een vergelijk gemaakt tussen de signaal/ruis-verhouding van de componenten met MeOH en ACN als mobiele fase voor de negatieve standaard. Uit de S/R-verhouding met MeOH uitgerekend t.o.v. ACN blijkt dat voor bijna alle componenten geldt dat MeOH als eluens een betere S/R-verhouding geeft dan met ACN. Dit geldt zowel voor de zachte als de harde botsing. Het gaat hierbij dan om een verbetering van een factor IV2-2. Echter, 4 van de 18 componenten geven een lagere verhouding, maar deze verhouding is voor al deze 4 stoffen >0.8. Voor drie van de vier stoffen geldt dit voor de harde botsing (cutoff massa 70). Deze vier stoffen hebben nog een goede S/R-verhouding (>1000). Dit betekent dat deze 4 componenten nog zeer nauwkeurig te meten zijn met MeOH als eluens. De meting wordt pas onnauwkeurig, wanneer de S/R-verhouding lager wordt dan 100 Voor de beide positieve standaarden zijn de S/R-waarden weergegeven in bijlage 2b en c. Ook hier is de S/R-verhouding met MeOH uitgerekend t.o.v. ACN. Uit de positieve standaarden blijkt dat een bepaalde groep stoffen, "Triazines", een beter resultaat geven met ACN als eluens dan met MeOH. Deze stoffen zijn een factor 2 a 3 beter, als wordt gekeken naar de S/R-verhouding. Wat opvalt is dat deze stoffen allemaal een zeer goede S/R-verhouding hebben en dus zeer gevoelig geanalyseerd kunnen worden. Met MeOH als eluens zal de gevoeligheid enigszins af nemen maar t.o.v. de andere componenten nog steeds vergelijkbaar tot beter zijn. Ook de stof N,N Diethyl-3-methyl benzamide (DEET) geeft met ACN een beter resultaat. Deze is een factor IV2 a 2 beter. Een aantal stoffen geeft een aanzienlijke verbetering met MeOH als eluens. Deze stoffen zijn: -» Benzothiazole (factor 20) * Lenacil (factor 60) -»Diuron (factor 50) * Carbetamide (factor 5) * 2-(butoxyethoxy)ethylacetaat (factor 10) -»Monolinuron (factor 80) Overige stoffen geven een kleine verbetering met MeOH als eluens (een factor 2 a 4). Verder zijn er ook nog een aantal stoffen die een verbetering geven met de ene botsing en slechter worden met de andere botsingsenergie. De tabel waarin deze factoren vermeld staan is terug te vinden in bijlage 2b en c. In de kolom "gemiddelde S/R-verhouding ACN" valt op dat er een groot aantal stoffen zijn die een geringe S/R-verhouding hebben, d.w.z. <100. In de kolom van "MeOH" zijn deze waarden fors toegenomen. Het netto resultaat is dat nu alle stoffen betrouwbaar zijn te meten.. g

ACN (Lenacil) 100 - /z:l$) > da of 69.S0> 70.SO. E-05 1.3M 60 - toao - SO A /~-- ^. 0 A ««- ' -* MeOH (Lenacil) 100 - a.(x;151 > da or 69.50, 70.50 19-.06 1.01O 80 - / \ 60 - / \ 40 / \ 30 j 0 v Figuur 4.1: Piekhoogte verschil ACN en MEOH bij Lenacil In figuur 4.1 zijn 2 chromatogrammen van Lenacil weergegeven waarin te zien is dat er met ACN veel meer ruis aanwezig is dan met MeOH als eluens. 4.2 Keuze prekolom Uit de vorige experimenten is gebleken dat het vervangen van ACN door MeOH als mobiele fase een duidelijk voordeel oplevert wat betreft de S/R-verhouding. Het gaat hierbij echter wel om een systeem waar geen prekolom in is opgenomen. Vervolgens zijn 5 prekolommen (zie 3.4) onderzocht in een combinatie met een analytische kolom en met MeOH of ACN als gradient. In figuur 4.2 is schematisch weergegeven op welke wijze er allemaal gemeten is. h-l-k<4.hll IVfcfanol Supdco Lry^cKt.ar tafcmatii Figuur 4.2 Verschillende metingen I9

Hierbij zijn de volgende resultaten gevonden. Met methanol als eluens hebben alle 4 de stoffen, die representatief zijn voor een grote groep componenten die routinematig met LC worden geanalyseerd, een veel grotere retentie gekregen. Dit is een verschuiving van ongeveer 10 min. Deze verschuiving is te verklaren doordat ACN een grotere elutiesterkte heeft dan MeOH. Hierdoor worden de pieken zowel lager als breder met MeOH als mobiele fase. Het oppervlak van de pieken blijft bij beide mobiele fasen echter wel gelijk. Er is weinig verschil te constateren tussen de resultaten met een ODS-3 analytische kolom en de Supelco. De retentie van de componenten met de Supelco is wel iets korter (3 min.). De piekhoogte en de piekbreedte zijn voor beide analytische kolommen vergelijkbaar. Als methanol als mobiele fase gebruikt wordt dan is er een duidelijk verschil te zien tussen prekolom 1 (PLRP-S) en de rest van de prekolommen. Bij prekolom 1 worden de pieken veel breder en lager. Dit wordt veroorzaakt doordat deze prekolom bestaat uit een polymeer. Dit polymeer houdt de componenten veel beter vast dan het C-18 materiaal dat zich in de andere prekolommen bevindt. Doordat de MeOH de componenten er slechter afspoelt dan ACN worden de pieken "uitgesmeerd". Het verschil in piekvorm tussen een PLRP-S en een C-18 prekolom is weergegeven in bijlage 3. Uit de resultaten van piekhoogte en piekbreedte bij de verschillende prekolommen (bijlage 4a en b), blijkt dat prekolom 3 het beste resultaat geeft. Dit is de "C-18, 8pm, high carbon, 10*3mm". Met deze prekolom en de ODS-3 analytische kolom en methanol als mobiele fase is vervolgens het doorbraakvolume bepaald voor alle 4 de componenten in de standaard. Deze metingen zijn in een grafiek uitgezet en het lineair verband is hiervan bepaald. Dit is gedaan door het volume uit te zetten tegen de piekhoogte. Het punt waar de piekhoogte af begint te vlakken komt overeen met het doorbraakvolume (zie bijlage 5). De resultaten voor het doorbraakvolume zijn weergegeven in tabel 4.1. Pieknummer Stof Doorbraakvolume (ml) 1 Chloridazon <25 2 Simazine 100 3 Isoproturon >400 4 Dinoterb 100 Tabel 4.1: Bepalen doorbraakvolume Er zijn ook nog metingen gedaan door een loopinjectie te koppelen met een prekolom. Op deze manier komt al het monster in het systeem terecht. Op deze manier wordt er voorkomen dat er monster verloren gaat door het preconcentreren via de PROSPEKT. Uit deze experimenten bleek dat de gebruikte loop (75 pi) niet het juiste volume aangaf. Dit was te zien doordat deze metingen geen 100% opbrengst gaven terwijl dit wel het geval moest zijn. Toen de loop vervangen werd door een loop van 100 pi, kwamen de percentages van een gewone preconcentratie t.o.v. een pre-concentratie met loop-injectie wel dicht bij de 100% uit. Deze afwijking van de loop heeft verder geen consequenties gehad voor de keuze van prekolom en analytische kolom. 20

Bij het onderzoeken welke prekolom/analytische kolom combinatie met methanol gradient bestaande methode met ACN kan vervangen is gebleken dat de prekolom (C-78, 8pm, high carbon, 10*3mm), de beste resultaten opleverde met MeOH als mobiele fase. De beide verschillende analytische kolommen leverde geen verschil op. Bij het bepalen van het doorbraakvolume van deze prekolom bleek dat de stof "chloridazon" al doorbrak bij een volume lager dan 25 ml. Dit maakt ook deze prekolom ongeschikt voor deze bepaling. Om deze reden is er toch gekozen voor de PLRP-S voorkolom en zal worden onderzocht of er hiermee een "technische" oplossing mogelijk is. 4.3 Preconcentratie met PLRP-S en MeOH Uit voorgaand onderzoek is gebleken dat methanol als eluens en PRLP-s als prekolom gebruikt moet worden. Er is tevens vastgesteld dat piekverbreding gaat optreden. Een technische oplossing zou dit kunnen verhelpen. Dit is gedaan door een tweede pomp in het systeem te plaatsen. 4.3.1 Tweede pomp voor bijmengen water Om het probleem met de piekverbreding te voorkomen is er gebruik gemaakt van een tweede pomp in het systeem. Er kan nu op verschillende manieren gemeten worden. De eerste opstelling waarop gemeten is, is hieronder schematisch weergegeven in figuur 4.3. waltr Flow e prekolom PRLP-S T-stuk Analytische kolom Massa spectrometer Figuur 4.3: Bijmengen water na desrptie prekolom met gradient Er is met behulp van een injectiespuit 100 pi standaardoplossing gemjecteerd op een PLRP-S prekolom. Vervolgens is via een kraan de prekolom in het systeem geschakeld. De eerste pomp (gradientpomp) spoelt met een methanol-gradient de stoffen van de prekolom af. Hierna wordt via een T-stuk een constante flow HPLCwater toegevoegd. Er zijn op deze manier een aantal metingen verricht waarbij de flow van het bijgevoegde HPLC-water gevarieerd wordt en er wordt na de elutie wel/geen menging met glasparels uitgevoerd. De tweede pomp die in het systeem is geplaatst, welke ervoor zorgt dat na het afspoelen van de prekolom door het gradient er vervolgens HPLC-water bij-gemengd wordt, levert een zeer slechte piekvorm op. Om te beoordelen af de scheiding /piekvorm van de componenten beter/slechter wordt, wordt van een drietal componenten een aantal parameters bijgehouden. Het chromatogram dat hierbij verkregen is, is weergegeven in figuur 4.4. 2\

De pieken worden heel erg uitgesmeerd. Ook het varieren van de flow van het HPLCwater en wanneer er menging plaats vindt door een kolom met glasparels levert geen betere resultaten op. CHRO: aaatplom 18-rra-M Elapaa: 17:50 /I:70 > da ol 69.50> 70.SL 100 A. 50 ' 0 100 - M - i iimfif-iriiin Vrnlnirni /1:U6 a> da Ot 4950> 70,50 10.6 Mill r C-05 0:41 1996 1.005,. ««05 I.6J2 10C M 1/1:179.. da ol 69.50> 70.50 1160 41.lt l}414 1/1:1.8 a> da or 70.50> 71.50 069 11:49,1009 ^M&Pir»o 51:05 n 1.05 1.246 E.05 1.409 B/l:221 -> da ol 70.50> 71.50 Figuur 4.4: Chromatogram bi/mengen water Ook is er een meting gedaan om te kijken hoe het plaatje eruit ziet als er geen prekolom aanwezig is en als er geen bijmenging van water plaatsvindt. (bijlage 6). Uit deze eerste serie metingen blijkt dat het op deze manier schakelen van een tweede pomp in het systeem niet tot een goede oplossing zal leiden voor deze methode. 4.3.2 Tweede pomp voor elutie van prekolom De andere opstelling waarmee gemeten is, is weergegeven in figuur 4.5. Bij deze opstelling wordt de prekolom met een constante flow van 100% methanol in een korte tijd afgespoeld. Gelijktijdig wordt via een T-stuk het mobiele fase-gradient van methanol toegevoegd. Om deze metingen te automatiseren is er vervolgens gebruik gemaakt van de PROSPEKT, hierdoor kan de belading van de prekolommen automatisch gedaan worden. Om te beoordelen af de scheiding/piekvorm van de componenten beter/slechter wordt, wordt van een drietal componenten een aantal parameters bijgehouden. 22

PRWS prekitlom Menging m. h. v\ Analytische kolom glaspareh \Ui.\\a speclmmeteri Belttdinf: via pntsjh'kl l-yplilmux Figuur 4.5: Na elutie prekolom met MeOH, bijvoegen MeOH gradient Vervolgens zijn er metingen gedaan waar de prekolom geelueerd wordt met 100% methanol met een lage flow (0.05/0.1 ml/min). Hierna wordt het MeOH-gradient bij gevoegd via een T-stuk. Het varieren van de flow en het gradient leverde ook hier geen beter resultaat op. Om een beter resultaat te verkrijgen is er ook geprobeerd om een andere manier de vloeistoffen met elkaar te laten mengen, door er een ander T-stuk tussen te plaatsen, maar ook hier bleven de pieken zeer breed en er ontstonden dubbele pieken. Door vervolgens de aanvoer van de beide vloeistoffen naar het T-stuk te verwisselen ontstaat er al een beter resultaat. Dit is schematisch weergegeven in figuur 4.6. Dit betere resultaat komt doordat de beide vloeistofstromen zich op deze manier bij het samenkomen veel beter mengen. Dit wordt veroorzaakt omdat nu het gradient, met een "hoge" flow, bijgemengd wordt bij de 100% MeOH flow van de desorptiepomp, welke een "lage" flow heeft. Bij deze omstandigheden is alleen de eerste piek, desethylatrazine, nog aan de brede kant. EERST NV Gradient ^ MF.OIlJ T-stuk Massa spectrometer T-stuk Massa spectrometer Figuur 4.6: Verwisselen aanvoer naar T-stuk Dit probleem is opgelost door de elutietijd van de prekolom in te korten van 5 naar 1 min. Hierdoor worden de componenten die vrij vroeg elueren beter door de analytische kolom gereconcentreerd. Ook is de leiding vanaf de desorptiepomp naar het T-stuk zo kort mogelijk gemaakt, waardoor er geen onnodig veel 100 % organisch oplosmiddel (MeOH) in de vloeistofstroom komt. Het plaatje dat bij deze situatie ontstaat is weergegeven in bijlage 7. 23

De omstandigheden die het beste resultaat geven zijn: 100 pi injecteren op prekolom. Injectie door kraan over te halen en tegelijk desorptiepomp en gradientpomp starten. Desorptiepomp: 1 min, 1 ml/min, 100% Me H Gradientpomp: Tijd (min.) Eluens A % Eluens B % Eluens C % Flow (ml/min.) 0 100 0 0 0.90 5 100 0 0 0.90 55 0 100 0 0.90 60 5 0 95 0.90 65 5 0 95 0.90 67 10 0 0 0.90 77 100 0 0 0.90 100 100 0 0 0.40 101 100 0 0 0.05 Eluens A Eluens B Eluens C 100% HPLC-water 100% MeOH 100% ACN Positief Negatief : Er wordt 3 ml/l Mierezuur aan het eluens toegevoegd. : Er wordt 3 ml/l Azijnzuur aan het eluens toegevoegd. ciuto: aaa.rpi09i 100 -j 50-100 50-100 - JI 100 - H J 100 '0 100 M - a/t:70 a> da of 69.50> 70..0 1/1:146 a> da ot 69.50> 70.50 10:25 a/i:179.> da of 69.50> 70.50 a/l:19l.> da of 70.50> 71.50 10:21 l/j:221 -> da of 70.50> 71.50 /I:!H -> da Of 70.50> 71.5' mc 19 5,7 10:21 15:21 " : 2 A 01-MJUI-99 tlapaa: 40:01 45:21 0 'i i i i i r i i i i r 25:00 29:10 13:20 17:10 41:40 45:50 50:00 Figuur 4.7: Chromatogram PLRP-S en MeOH r E.06 2.101 E.04 2.207 _ 1.06 1.917 _ 1.06 5.400 _ E.04 4.264 _ E.M 1.748 07 1.5B5 In het gradient is een periode van 5 min. ingevoegd waar er alleen HPLC-water wordt gepompt. Deze periode is toegevoegd om ervoor te zorgen dat de 100% MeOH die van de desorptiepomp komt zodanig wordt verdund dat de componenten zich opnieuw preconcentreren v66r op de analytische kolom. Het chromatogram dat hierbij ontstaat is weergegeven in figuur 4.7. Onder deze omstandigheden zijn voor zowel standaard P1, P2 en N1 een duplo-meting uitgevoerd. Deze resultaten zijn vergeleken met de metingen waar alleen een loop-injectie gedaan is, zonder dat er een PLRP-S prekolom in het systeem aanwezig was. Als de S/R-verhouding van deze metingen nu met elkaar wordt vergeleken dan blijkt dat onder de nieuwe omstandigheden met 24

PLRP-S prekolom voor zowel de positieve als de negatieve standaarden geldt dat deze verhouding een factor 0.5 a 0.8 is (bijlage 8a,b,c). Dit lag ook wel in de verwachting, doordat de stoffen zich gaan hechten aan de prekolom. Hierdoor worden de pieken iets uitgesmeerd, waardoor het signaal van de componenten omlaag gaat. Door een tweede pomp in het systeem aan te brengen, die dienst doet om alleen de prekolom te elueren, kan MeOH in combinatie met een PLRP-S prekolom gebruikt worden. Nu zijn alle metingen nog verricht door 100 pi geconcentreerde standaard te injecteren op een prekolom. Dit kan echter ook geautomatiseerd worden door gebruik te maken van de PROSPEKT. 4.4 Automatisering en herhaalbaarheid methode Om het meten te automatiseren, is gebruik gemaakt van de PROSPEKT. Om dit mogelijk te maken moesten er wel enkele dingen veranderd worden aan de oorspronkelijke opstelling. De aansluitingen op de drie kranen van de PROSPEKT zijn veranderd, zodat de stap van het afspoelen van de prekolom ook via de PROSPEKT gaat. Hierdoor hoeft de desorptiepomp niet meer handmatig gestart te worden. Een schematische tekening van de drie kranen op de PROSPEKT is weergegeven in figuur 4.8. Het SPP-programma (Sample Preparation Program) dat gebruikt is voor het beladen/afspoelen van de prekolom, is weergegeven in bijlage 9. In dit SPP-programma staat dat de elutie-pomp 2 min. elueert met een flow van 1 ml/min. Elutie pomp WASH sur WASTE KHA IN / A/M.4V.' Figuur 4.8: Schakelschema kranen van PROSPEKT Dit komt niet overeen met de vorige metingen, maar dit gaf onder deze omstandigheden betere resultaten. Dit komt waarschijnlijk doordat de leidingen een iets andere lengte of diameter hadden dan bij de vorige opstelling. Op deze wijze is het injecteren van het monster op de prekolom geautomatiseerd, en kan er een serie metingen achter elkaar door gemeten worden. 25

Vervolgens is voor zowel de positieve als voor de negatieve ionisatie een serie van 7 metingen verricht met de PROSPEKT aan dezelfde standaard. De RSD van deze meetserie is een maat voor de herhaalbaarheid van de bepaling. Deze 7-voudige metingen zijn verricht met zowel ACN als met MeOH als eluens. Van deze series is voor ieder apart een respons-file gemaakt. Aan de hand van deze respons-file kan het gemiddelde en de standaardafwijking van deze 7 metingen bepaald worden. De resultaten van deze metingen zijn weergegeven in bijlage 10. Uit deze resultaten blijkt dat voor de positieve ionisatie de spreiding, met MeOH als eluens, voor bijna alle componenten veel lager is dan met ACN als eluens. Voor MeOH ligt de spreiding tussen 2-7 % en voor ACN is dit tussen 3-22 %. Hieruit kan opgemaakt worden dat voor de positieve ionisatie geldt dat de herhaalbaarheid met MeOH beter is dan met ACN als eluens. Ook is dit vergelijk gemaakt voor de negatieve ionisatie. Uit deze metingen blijkt dat ook hier de spreiding kleiner is bij de metingen met MeOH (2-18 %) dan met ACN (3-35 %). Er zijn echter ook een viertal stoffen die een veel grotere spreiding geven met MeOH als eluens (>50 %). Het gaat hier dan om een groep stoffen die bij de "fenolen" horen. Deze vier stoffen zijn: * DiNitroOrthoCresol (DNOC) -» Dinoseb -» Dinoterp -* Pentachloorfenol Bij de experimenten met een loopinjectie direct op de prekolom gaven deze componenten wel een goed resultaat. Dus moet er iets fout zijn gegaan bij het beladen of bij het elueren van de prekolom bij de PROSPEKT (zie aanbevelingen). Een oorzaak van deze afwijkende resultaten is niet gevonden. yt.