Verzamelprotocol DNA barcoding Vaatplanten Doel Het verzamelde organisme wordt gebruikt om DNA uit te isoleren, aan de hand waarvan een DNA barcode bepaald kan worden. DNA extract en organisme (voucher) worden opgenomen in de collectie van NCB Naturalis. De DNA barcode wordt, tezamen met de bijbehorende foto en collectie gegevens, gedeponeerd in de publieke database van het internationale Barcoding of Life project (www.boldsystems.org). Als richtlijn voor Nederland houden we drie exemplaren per soort aan. V5.0
Protocol Stap 1: Selecteren geschikt materiaal Selecteer een jong blad zonder aantastingen. Zorg voor een scherpe foto van hetzelfde individu als waar het DNA uit bemonsterd wordt van een soortsonderscheidend kenmerk. Neem eventueel een habitusfoto. Stap 2: subsampling Knip circa 2 cm van de punt af, vermijd de hoofdnerf. Breng het subsample, 25-100 mg vers bladmateriaal, over naar een monsterbuisje met silicagel. Voorkom contaminatie tussen samples! Gebruik slechts (materiaal van) één exemplaar per buisje! Stap 3: voucher De bijbehorende voucherplant dient in zijn geheel (indien te groot, een representatief deel) in een stoof gedroogd te worden en vervolgens opgeplakt te worden op een herbariumvel. Stap 4: etiketteren Voorzie zowel het monsterbuisje (met subsample) als de voucher van een van de voorgedrukte etiketten met BRAHMS collectieregistratiecodes. Het etiket zonder barcode is bedoeld voor IN het monsterbuisje, het zelfklevend etiket met barcode is voor bij de voucher. Belangrijk: de etiketten koppelen het sample aan de voucher. Gebruik dus etiketten met identieke collectieregistratiecodes. Controleer! Stap 5: invullen samplesheet Geef in het bijgeleverde Excel-bestand SamplesheetBlank.xls aan welk sample in welk buisje zit, door de gebruikte collectieregistratiecodes in te vullen. Gebruik bij het opslaan van het bestand het nummer van het rekje als bestandsnaam. Stap 6: invoeren registratiegegevens Voer per sample de bijbehorende registratiegegevens in. Tenminste: collectieregistratiecode, taxon, determinator, verzamelaar, verzameldatum, land, plaats, gebied, coördinaten. Gebruik het bijgeleverde Excel-bestand SampleBrahmsBlank.xls Stap 7: overdracht Lever de volgende zaken altijd tezamen aan: Vol verzamelrekje (95 monsters), buisje H12 ontbreekt standaard (controle) Excel-bestand met positie-informatie (samplesheet) Electronisch bestand met registratiegegevens (Excel-bestand) Bijbehorende voucherplanten, opgeplakt op herbariumvellen Detailfoto s en eventuele habitusfoto s van levend materiaal in.tif of.jpg formaat
Toelichting op protocol DNA kan uit een grote verscheidenheid van weefsels geëxtraheerd worden. Echter, factoren als de versheid, conserveringsmethode en leeftijd van het sample hebben allemaal effect op het succes van het verkrijgen van een goede DNA barcode. Vers, ongeconserveerd weefsel is ideaal wanneer de omstandigheden het toestaan. Natte weefsels vergaan zodra de cellen sterven. Wanneer de cellen openbreken, lyseren, komen er enzymen vrij die DNA te lijf gaan. Over het algemeen geldt: hoe verser, hoe beter. Bij stap 1 Jong blad is veelal het meest geschikt, omdat daar nog weinig of geen secundaire metabolieten in aanwezig zijn die kunnen storen bij het DNA werk. Verder zijn in deze blaadjes de nerven nog niet erg stevig; harde nerven kunnen problemen opleveren bij het fijnmalen van het materiaal. Rottend blad en blad met schimmels of andere aantastingen dient vermeden te worden. Bij stap 2 Subsampling Om subsamples te nemen kan het meegeleverde weefselschaartje wordt gebruikt. Vermijd het nemen van veel materiaal (niet meer dan 150 mg natgewicht). De meegeleverde pincet kan gebruikt worden om de subsamples in de buisjes te stoppen. De silicagel zorgt er voor dat de samples zo snel mogelijk indrogen. Zorg er voor dat tijdens het werken het rekje in de juiste oriëntatie staat; met positie A1 linksboven. Om subsamples te nemen kan de meegeleverde weefselschaar worden gebruikt. Ontsmet de schaar regelmatig met een tissue en wat alcohol. Bleekwater (natriumhypochloriet-oplossing) kan ook gebruikt worden, maar zorg dat alle bleek grondig is weggespoeld om beschadiging van het DNA in de samples te voorkomen.
Let op! Nooit meer dan (materiaal van) één exemplaar per buisje! De exemplaren waarvan de subsamples afkomstig zijn vormen de vouchers. De vouchers dienen altijd te worden aangeleverd als ze nog niet in BRAHMS geregistreerd en/of gefotografeerd zijn. Let op! De buisjes dienen ingeleverd te worden op de correcte positie in het verzamelrekje. Verzamelrekje Het bijgeleverde verzamelrekje bevat 96 buisjes van 1,4 ml gevuld met silicagel. De silicagel is een mix van grove oranje indicatorkorrels en fijn wit zand. Als de silicagel verzadigd is verkleuren de oranje korrels naar transparant. Aan de onderzijde van elk buisje bevindt zich een alfanumerieke codering, waarmee de positie in het doosje wordt aangegeven (A1 [rij A, kolom 1] tot en met H12 [rij H, kolom 12]). Het doosje zelf heeft een uniek nummer, op de voorzijde weergegeven in cijfers en als barcode. Het laatste buisje (H12) ontbreekt, hetgeen dient als negatieve controle.
Bij stap 3 De gehele voucherplant dient op stoof gedroogd te worden, of op alcohol te worden gezet. De gedroogde plant dient gemonteerd te worden op een herbariumvel. De vouchers dienen altijd tegelijkertijd met de samples te worden aangeleverd. Deze vouchers worden opgenomen in de collectie van NCB Naturalis Nationaal Herbarium Nederland en digitaal geregistreerd in BRAHMS. Bij stap 4 Etiketten met BRAHMS registratiecodes zijn in tweevoud meegeleverd: als zelfklevend etiket met barcode en op katoenpapier. Het etiket op katoenpapier dient te worden losgeknipt om bij het subsample in het monsterbuisje te worden gevoegd.
Het zelfklevend etiket met barcode is voor de voucher op het herbariumvel, of voor op de alcoholcollectiepot. Bij stap 5 Gebruik voor elke batch van 95 samples (een vol verzamelrekje) een nieuw Excel-bestand. Het doel is te registreren welk sample zich in welk buisje bevindt. Vul in de samplesheet het nummer van het verzamelrekje, buisje en bij behorende BRAHMS collectieregistratiecode in. Voor gedetailleerde uitleg voor het invullen van de samplesheet is een apart tabblad bijgevoegd in het bestand. Gebruik bij het opslaan van het bestand het nummer van het rekje als bestandsnaam; bijvoorbeeld BCP1234-001.xls. Bij stap 6 De registratiegegevens zullen uiteindelijk door de Barcoding Faciliteit in het botanisch collectieregistratiesysteem BRAHMS worden opgenomen, je hoeft de gegevens dus niet ook nog elders in te leveren. Volg bij het invullen van het Excel-bestand zorgvuldig de uitleg op het bij het bestand gevoegde aparte tabblad. Bij stap 7 Probeer de tijd tussen verzamelen en aanleveren zo kort mogelijk te houden (liefst binnen 24 uur). Vers afgeknipt weefsel degradeert snel; hoe sneller het DNA in een -80 C vriezer terechtkomt, hoe beter. Zorg dat alle foto s (in.jpg of.tif) bij de Barcoding Faciliteit terecht komen, voordat alle data compleet is zal er niet gesequenced worden!
Inhoud verzamelpakket verzamelrekje met 95 1,4 ml buisjes, gevuld met silicagel, afgesloten met een transparant-blauw schroefdopje met o-ring. sleutel voor schroefdopjes rol met zelfklevende etiketten met BRAHMS collectieregistratiecodes stroken etiketten met collectieregistratiecodes (katoenpapier) weefselschaar papierschaar stomp pincet potlood doos met tissues flesje ethanol 70% USB stick met data bestanden +.pdf van de handleiding A4-tjes met uitleg voor opdringerig publiek tijdens veldwerk
Barcoding of life BOL is een internationaal initiatief (www.barcodeoflife.org), de Nederlandse bijdrage wordt mogelijk gemaakt door de FES-middelen. Zo veel mogelijk Nederlanse soorten worden opnieuw verzameld in samenwerking met PGO s, verenigingen en terreinbeherende instanties. Exemplaren worden gedetermineerd, gefotografeerd, gecatalogiseerd, en aan NCB collectie toegevoegd. DNA materiaal wordt geëxtraheerd en bewaard (-80 C). Barcodes worden gegenereerd, en aan de publieke database (BOLD) toegevoegd. Indien foto s van de vouchers aangeleverd worden, worden de namen van de fotografen op de BOLD website vermeld. Contact dnabarcoding@ncbnaturalis.nl Sylviusweg 72, 2333 BE Leiden www.science.naturalis.nl/dnabarcoding