Brassica rapa is wereldwijd een van de meest belangrijke oliehoudende zaadgewassen met een grote ecologische impact. Naast het gebruik in de plantaardige olie-industrie, voorziet het de gemeenschap over de hele wereld in het dagelijks voedsel. Als gewas heeft Brassica meerdere pathogene schimmels die schadelijke effecten veroorzaken, niet alleen op de kwaliteit maar ook op de kwantiteit van het gewas. Een van deze pathogene schimmels is Leptosphaeria maculans wat blackleg of stengelkanker veroorzaakt. Deze pathogeen komt wereldwijd voor en veroorzaakt grote verliezen in de oogst van Brassica soorten in Australia, Canada, Europa en Afrika. De interactie tussen Brassica soorten en pathogene schimmels is hoofdzakelijk bestudeerd op het niveau van het glucosinolaatgehalte. Onder de Brassica soorten heeft B. rapa tot nu toe weinig aandacht gekregen wat betreft onderzoek naar de interactie met schimmels. Transcriptoom en proteoom-technieken geven veel informatie maar geen volledig overzicht van het metaboliet netwerk in een organisme, dat wil zeggen over het fenotype. De complexe stress respons van planten is nog lang niet volledig onderzocht en vooral op het metaboliet niveau is er nog steeds veel te onderzoeken. Het onderzoek dat in dit proefschrift beschreven staat richt zich op het niveau van de metabolieten in de plant in de interactie tussen B. rapa en schimmels. We onderzochten de interactie van vier verschillende cultivars van B. rapa (Raapstelen, Witte Mei, Herfstraap en Oleifera) met drie verschillende schimmels behorend tot verschillende schimmelklassen; Leptosphaeria maculans, Aspergillus niger (Ascomyceten) en Fusarium oxysporum (Deuteromyceten). In Hoofdstuk 2 is een overzicht gegeven over de functie van secundaire metabolieten in de interactie van Brassica soorten en diverse schimmels. De secundaire metabolieten (fenylpropanoïden, flavonoïden en glucosinolaten) hebben een rol in de resistentiemechanismen van planten en in het algemeen gaat het gehalte hiervan omhoog na biotische en abiotische stress. Fytoalexinen zijn metabolieten die na inductie door schimmelinfectie de novo worden gemaakt. Sommige planten zijn in staat om de fytotoxines die gemaakt zijn door de pathogene schimmels, zoals L. maculans, A. brassicae en B. cinerea te ontgiften. Aan de andere kant zijn er enkele pathogene schimmels die de fytoalexinen kunnen ontgiften die door de plant zijn gevormd zijn als reactie op de infectie. Om de interactie tussen B. rapa en schimmels 153
te kunnen bestuderen is het nodig om eerst de metabolieten van Brassica te identificeren en een database te maken van het Brassica metaboloom van diverse Brassica cultivars en ontwikkelingsstadia van B. rapa. De karakterisering van het metaboloom van B. rapa extract met behulp van NMR spectroscopie staat beschreven in Hoofdstuk 3 waarbij ook de differentiatie tussen vier cultivars (Raapstelen, Witte Mei, Herfstraap en Oleifera) en twee ontwikkelingsstadia (vier en zes weken oud) beschreven is. In de Brassica extracten konden verschillende primaire en secundaire metabolieten, worden geïdentificeerd, zijn behorend tot verschillendeg groepen zoals aminozuren, organische zuren, koolhydraten, fenylpropanoïden, flavonoïden en glucosinolaten, geïdentificeerd worden. Zes weken oude planten bevatten hogere gehaltes aan fenylpropanoïden en glucosinolaten terwijl vier weken oude planten hogere gehaltes hebben aan IAA en flavonoïden. Herfstraap vertoonde hogere gehaltes aan glucosinolaten en Oleifera vertoonde een lager gehalte wat bevestigd werd door het glucosinolaat profiel van verschillende cultivars van B. rapa, dat gemeten werd met behulp van HPLC. Op basis van de resultaten uit Hoofdstuk 3 werd de interactie tussen verschillende schimmelstammen en zes weken oude planten nader onderzocht. Hiervoor zijn drie verschillende schimmels, behorend tot verschillende klassen, gebruikt. Diverse Brassica soorten zijn wel een gastheer voor Leptosphaeria maculans maar geen gastheer voor Fusarium oxysporum. Aspergillus niger is een humaan pathogeen dat ook in staat is enkele groenten- en fruitsoorten te infecteren. De gastheer en niet-gastheer interacties werden onderzocht met NMR spectroscopie gecombineerd met multivariate data analyse (Hoofdstuk 4). De infectie door de pathogenen induceerde de accumulatie van verschillende klassen van metabolieten. Fenylpropanoïden (sinapoyl- en feruloyl malaat) flavonoïden (kaempferol glucosiden), alifatische glucosinolaten (progoïtrine) en fumaarzuur waren sterk verhoogd na infectie met deze schimmels. Het niet gastheer pathogeen F. oxysporum veroorzaakte accumulatie van sinapoyl-, feruloyl- en 5-hydroxyferuoyl malaat, kaempferol, quercitin, progoïtrine en fumaarzuur in hogere gehaltes dan de infectie met de twee andere schimmelsoorten. Statistische analyse toonde aan dat er bij de alifatische glucosinolaten verschillen waren tussen het vierde (lokale) en zesde (systemische) blad. Het vierde blad bevatte hogere gehaltes aan alifatische glucosinolaten dan het zesde blad. Naast de variatie veroorzaakt door de schimmelsoort, bepaald vooral de cultivar de metabole veranderingen. 154
Twee glucosinolaten (een alifatische en een indool glucosinolaat) zijn met behulp van NMR spectroscopie geïdentificeerd. Ondanks dat de verschillende klassen van glucosinolaten kunnen worden gekwantificeerd met behulp van NMR, kan het geringe aantal van individuele glucosinolaten die geïdentificeerd zijn met behulp van NMR een inkompleet overzicht geven over de glucosinolaten als een belangrijke groep van verbindingen in Brassica. NMR analyse van de onderzochte cultivars Herfstraap en Oleifera toonde hogere gehaltes van glucosinolaten aan na schimmelinfectie, terwijl Raapstelen hogere gehaltes aan fenylpropanoïden, flavonoïden en IAA vertoonde. Er is van HPLC gebruik gemaakt om het individuele glucosinolaat gehalte na infectie van Herfstraap en Oleifera met twee pathogene schimmels (L. maculans en F. oxysporum) in kaart te brengen (Hoofdstuk 5). Analyse van het glucosinolaat gehalte van deze twee cultivars toont aan dat vóór infectie (controle planten) Herfstraap een hoger gehalte heeft aan glucosinolaten vergeleken met het gehalte in Oleifera. De respons na schimmelinfectie is afhankelijk van de cultivar en het infecterende micro-organisme. Door een infectie accumuleren de alifatische glucosinolaten (gluconapine, progoïtrine, glucobrassicanapine en gluconapoleiferine) en de indool glucosinolaat (4-hydroxy-glucobrassicine) in Herfstraap. en twee indool glucosinolaten (glucobrassicine en 4-hydroxyglucobrassicine) in Oleifera, zeven dagen na infectie. Vergeleken met L. maculans induceerd het pathogeen F. oxysporum een hogere accumulatie van individuele alifatische glucosinolaten en 4-hydroxy-glucobrassicine in Herfstraap en hogere gehaltes aan glucobrassicine en 4-hydroxy-glucobrassicine in Oleifera. De toename in glucosinolaat hoeveelheden lijkt te zijn gerelateerd aan de resistentie van de bestudeerde cultivars in dit onderzoek. De hogere gehaltes aan alifatische en indool glucosinolaten in controle planten van Herfstraap vergeleken met de controle planten van Oleifera en daarnaast de toegenomen gehaltes van individuele alifatische glucosinolaten en 4-hydroxy-glucobrassicine in Herfstraap na schimmelinfectie en alleen glucobrassicine en 4-hydroxy-glucobrassicine in geïnfecteerde Oleifera, hangt waarschijnlijk samen met de het feit dat Herfstraap meer resistent is dan Oleifera. Omdat Raapstelen een hoger gehalte aan fenylpropanoïden, flavonoïden en IAA vertoonden na schimmelinfectie (Hoofdstuk 4), is deze studie vervolgd door de infectie van B. rapa cultivar rapa (Raapstelen) met L. maculans op verschillende tijdstippen te volgen met behulp van NMR spectroscopie gecombineerd met multivariate data analyse. Er werden ook analyses uitgevoerd met behulp van HPLC 155
toegespitst op het glucosinolaat profiel (Hoofdstuk 6). NMR spectroscopie en multivariate data analyse (PCA en PLS-DA) toonde aan dat twee en zeven dagen na infectie in de geïnfecteerde planten aminozuren, fenylpropanoïden en flavonoïden significant toenamen, met een duidelijke toename na zeven dagen. HPLC analyse toonde aan dat 7 dagen na infectie alleen 4-methoxy glucobrassicine samen met het aromatische glucosinolaat sinalbine significant toenam. Een significante afname van de dominante indool glucosinolaten (glucobrassicine en neoglucobrassicine) 7 dagen na infectie en een significante toename van alle gedetecteerde fenylpropanoïden, flavonoïden en IAA duiden op een verandering in de channeling van de precursors. Chorismaat wordt gebruikt als een substraat door chorismaat mutase (CM) wat vervolgens leidt tot fenylalanine en tyrosine, de precursors van fenylpropanoïden, flavonoïden en benzoyl glucosinolaten. Dit kan ten koste gaan van de beschikbaarheid van het substraat voor anthranilaat synthase wat leidt tot tryptofaan, de precursor van de indool glucosinolaten. Veranderingen van fluxen op het niveau van chorismaat kan een rol spelen bij de resistentie van de plant (Hoofdstuk 6). Het Brassica metaboloom wordt niet alleen beïnvloed door infectie met schimmels maar ook behandeling met andere biotische factoren kunnen het metaboloom van B. rapa veranderen. Bij de resistentie van planten na schimmelinfectie zijn de signaalstoffen jasmonate (JA) en salicylate (SA) betrokken bij de signaaltransductieroute. Brassica rapa cultivar rapa (Raapstelen) planten werden behandeld met JA en SA en geanalyseerd met behulp van NMR spectroscopie en multivariate data analyse en daarnaast met behulp van HPLC voor de analyse van het glucosinolaat profiel (Hoofdstuk 7). NMR en PCA data toonden aan dat door de aanwezigheid van een grote groep metabolieten het mogelijk is om planten behandeld met JA of SA te onderscheiden van de controle planten. Vetzuren, aminozuren (alanine, threonine, valine en GABA), organische zuren (succine en fumaarzuur), adenine, steroïden, fenylpropanoïden (sinapoyl-, coumaroyl-, en 5-hydroxyferuloyl malaat), flavonoïden (kaempferol en quercetine), alifatische glucosinolaten (gluconapin, progoïtrine en glucobrassicine), benzoyl glucosinolaten (gluconastutiïne en sinalbine) en IAA waren significant toegenomen in planten behandeld met JA. Salicylzuur behandelde planten konden worden gekarakteriseerd door hoge concentraties van vetzuren, aminozuren (alanine, threonine, en GABA), adenine, steroïden, flavonoïden (kaempferol), alifatische glucosinolaten (gluconapine en glucobrassicanapine), indool glucosinolaten (neoglucobrassicine) en benzoyl 156
glucosinolaten (gluconastutiïne en sinalbine). Terwijl JA behandelde planten een significante afname vertoonden in het sucrose, choline en malaat gehalte, vertoonden SA behandelde planten daarnaast ook nog een significante afname in feruloyl- en caffeoyl malaat. Eerdere onderzoeken aan B. napus toonden aan dat die plant op JA en SA reageert door het accumuleren van indool en benzoyl glucosinolaten. Onze resultaten met B. rapa toonden aan dat JA en SA een accumulatie veroorzaken van alle klassen van glucosinolaten (alifatische, indool en benzoyl glucosinolaten). De reactie op schimmels is verschillend voor de verschillende cultivars zoals beschreven in Hoofdstuk 4 en 6. Het is duidelijk dat de respons van Brassica soorten na schimmelinfectie of behandeling met signaalstoffen verschillen van soort tot soort en zelfs van cultivar tot cultivar. Zowel infectie met schimmel als de behandeling met signaalstoffen verhoogde de accumulatie van fenylpropanoïden, flavonoïden en enkele organische zuren en aminozuren, maar signaalstoffen hebben duidelijk een sterker effect op het glucosinolaatgehalte dan een infectie met schimmels. Ondanks dat zowel een infectie met schimmels als een behandeling met signaalstoffen de accumulatie van fenylpropanoïden tot gevolg hebben, resulteerde de infectie met schimmels tot veel hogere gehaltes. Discussie en conclusies van de resultaten van geïnfecteerde en met signaalstoffen behandelde planten zijn beschreven in Hoofdstuk 8. Om het uiteindelijke doel, het vinden van een oplossing voor de zeer schadelijke effecten van pathogene schimmels op B. rapa gewassen, te bereiken, zijn een groot aantal data, welke gerelateerd zijn aan de interactie tussen verschillende cultivars of variëteiten met verschillende schimmels, nodig. Het onderwerpen van deze data aan multivariate data analyse zou een meer holistisch overzicht van de interactie moeten geven wat zou kunnen leiden tot een beter inzicht van alle resistentie gerelateerde factoren. In Hoofdstuk 9 worden de toekomst perspectieven beschreven van studies naar de interactie tussen B. rapa en schimmels. Samenvattend, in dit promotieonderzoek is aangetoond dat het in kaart brengen van het metaboloom van de plant een veelbelovende methode is voor het bestuderen van de interactie tussen B. rapa en pathogene schimmels. Het geeft een overzicht van de metabolieten in de plant tijdens de interactie. Dit overzicht geeft nieuwe inzichten hoe precursors worden gekanaliseerd naar verschillende biosynthese routes tijdens de interactie. Maar, zoals eerder beschreven, erzijn er verschillen in de interactie van pathogene schimmels en verschillende cultivars en variëteiten van de plant. Brassica rapa heeft veel afweer gerelateerde verbindingen zoals glucosinolaten, 157
IAA, fenylpropanoïden en flavonoïden en zelfs enkele primaire metabolieten zoals aminozuren en organische zuren die mogelijk een rol spelen bij de resistentie tegen pathogenen. De metabole routes ondergaan tijdens de infectie een rerouting waardoor de precursors benodigd voor de afweerstoffen gevormd kunnen worden. De verandering van de fluxen op het niveau van chorismaat lijkt een rol te spelen in de resistentie van B. rapa tegen pathogene schimmels. Een synergistisch antimicrobeël effect van fenylpropanoïden, flavonoïden, glucosinolaten en IAA en zelfs primaire metabolieten zoals aminozuren en organische zuren zou een rol kunnen spelen en dienen nader onderzocht te worden. De onderzochte cultivars vertoonden na schimmelinfectie een verschillend metaboloom profiel. Sommige hebben een hoog gehalte aan glucosinolaten en een laag gehalte aan fenylpropanoïden en flavonoïden terwijl anderen een hoog gehalte hebben aan fenylpropanoïden en een laag gehalte aan glucosinolaten. Resistentie is klaarblijkelijk zeer complex. Om resistentie te kunnen begrijpen is onderzoek nodig tussen verschillende combinaties van cultivars en micro-organismen. Door een systeem biologische aanpak met het meten op het niveau van transcriptoom, proteoom en metaboloom te meten, kunnen de grote sets van data over interacties tussen cultivars en verschillende schimmels, in combinatie met gegevens over de mate van resistentie van de cultivars, een beter inzicht geven in de afweer reactie van de plant. Het doel van het hier beschreven onderzoek was om de interactie tussen B. rapa en pathogene schimmels op metaboloom niveau te onderzoeken om hiermee mogelijkheden te vinden om het zeer schadelijke effect van pathogene schimmels op Brassica gewassen te voorkomen. Bij dit onderzoek hebben we van verschillende cultivars gebruik gemaakt (zoals beschreven is in de Hoofdstukken 4, 5, 6, en 7) hierbij induceerde zowel de schimmelinfectie als de behandeling met signaalstoffen de productie van metabolieten die afkomstig zijn van de chorismaat biosyntheseroute zoals de fenylpropanoïden, flavonoïden, IAA en de indool glucosinolaten. Zelfs bij het gebruik van verschillende cultivars van B. rapa, vertoonden alle cultivars een verhoogde accumulatie van secundaire metabolieten afkomstig van de chorismaat biosyntheseroute. Fenylpropanoïden, benzoyl glucosinolaten, flavonoïden en indool glucosinolaten zouden dus de verbindingen zijn men zich met behulp van genetische modificatie op zouden kunnen richten. 158
Bij de veredeling van Brassica zou men met behulp van genetische modificatie technieken nieuwe cultivars kunnen maken welke gekarakteriseerd kunnen worden door hogere gehaltes van deze secundaire metabolieten. 159
160