ANTIBIOTICA IN MELK EN HONING: EEN UPDATE Dr. Wim Reybroeck VMT FOOD - Symposium Antibiotica en Resistentie in de Voedselketen Bunnik, NL, 18 februari 2016
INLEIDING Screeningstesten worden massaal ingezet bij de controle van melk op antibioticaresiduen, dit volgens een bepaalde strategie LC- MS/MS HPLC bevestiging (identificatie en kwantificatie) ELISA RECEPTOR TEST MICROBIOL. + ENZYM RECEPTOR TEST - ELISA MICROBIOLOGISCH groepsspecificatie screening Besluit vaak enkel gebaseerd op een screeningsresultaat
DETECTIE VAN ANTIBIOTICARESIDUEN IN MELK GEINTEGREERD DETECTIESYSTEEM HOEVE ZUIVEL- BEDRIJF VOEDSEL- AGENTSCHAP behandelde koeien autocontrole bv. artikel 14 EEG Richtlijn 92/46 respectering wachtperiode testen op remstoffen ex-farm melk verzekeren <MRL volgens Verordening No. 37/2010, 675/92 etc. voor antibiotica sulfonamiden Zero tolerantie voor chlooramphenicol, dapson resultaat: penalisatie bij een positief testresultaat doel: respectering MRLs testen op MRL (kwantitatief) resultaat: >MRL = recall / boete (HEESCHEN & SUHREN, 1996)
ANTIBIOTICATESTEN OP DE HOEVE Testen van individuele koemelk i.p.v. tankmelk - Na respectering van de wachtperiode Copan Milk Test, Charm Cowside II test, Delvotest SP-NT mini, Delvotest T mini, Eclipse Farm 3G + e-reader,... Microbiële inhibitortest met Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis als testorganisme - Mogelijkheden: - individuele vials - kleine incubator (/reader) - visuele aflezing of e-reader - breedspectrum - vooral gevoelig voor penicillines, cefalosporines, sulfonamiden Bepaalde melkveehouders experimenteren met sneltesten
TESTEN VAN HOEVEMELK (ex-farm melk) IN BELGIE In België wordt elke levering bemonsterd en gecontroleerd op remstoffen Screening met de Delvotest T (Geobacillus stearothermophilus) in microtiterplaten (sinds 01/09/2012) Reflectometrische aflezing + Delvoscan software (z-waarden) cut-off bij -3,0 Verder onderzoek met sneltesten en herhaling test alvorens toekenning van penalisatie (29,75 per 100 l melk)
Screening Postscreening Delvotest T no penalization, no post-screening Z-value <-3.0, neg Z-value -3.0, pos penalization -lactam ratio 0.20, pos eta-s.t.a.r. ratio >0.20, pos no penalization Combo low quantity of -lactam ratio (mean ratio blanks - 4 SD), pos ratio >(mean ratio blanks - 4 SD), neg Pro-reader Z-value -3.0, pos Delvotest T no penalization, repeatability of Delvotest T Z-value <-3.0, neg post-screening stopped Z-value -3.0, pos milk + β-lactamase Delvotest T no penalization, low quantity of -lactam, Z-value <-3.0, neg post-screening stopped penalization tetracyclines Trisensor 4-Aminosensor Tylosensor pos tetra channel neg neg neg pos -lactam pos sulfa channel pos pos channel penalization penalization aminoglycosides penalization tylosin Sulfonamides no penalization after verification at ILVO low quantity of Cut-off TriSensor, 4-Aminosensor, -lactam penalization quinolones Tylosensor and Quinosensor: 1.10; Quinosensor after verification at ILVO pos ratio 1.10, pos; >1.10, neg samples to ILVO neg no penalisation
TESTEN VAN HOEVEMELK (ex-farm melk) IN BELGIE Postscreening I Further post-screening Positive Delvotest T eta-s.t.a.r. Combo ratio 0.20, pos ratio >0.040, pos ratio (mean ratio blanks - 4 SD), pos ratio >(mean ratio blanks - 4 SD), neg penalization -lactam no penalization low quantity of -lactam βeta-s.t.a.r. Combo: verdunning melk + cut-off 0,20 (Accuscan PROreader) laat discriminatie toe tussen 3 en 4 µg/kg benzylpenicilline 3 µg/kg benzylpenicilline: steeds negatief resultaat 4 µg/kg benzylpenicilline: steeds positief resultaat (penalisatie) penalisatieniveau: tussen 3 en 4 µg/kg benzylpenicilline 2015: 1 156 276 hoevemelkstalen: 304 (0,026%) positief Merk op: resultaat pas gekend als de melk al verwerkt is
TESTEN VAN EX-FARM MILK IN NEDERLAND - Screening van elke levering: Delvotest T - Post-screening: herhaling Delvotest T na verhitting melk (neutralisatie bepaalde natuurlijke remstoffen) - Schijfjesmethode in plaat (calidolactis-test) diameter inhibitiezone > zone benzylpenicilline 0,0037 IE/ml (= 2,2 µg/kg): korting kortingsniveau: vanaf 2,2 µg/kg benzylpenicilline korting ook mogelijk omwille van remstoffen (niet-antibiotica) 2015: 2 255 500 hoevemelkstalen: 257 (0,010%) positief Sinds 1 april 2015: Onderzoek van kortingsgevallen tot op stofniveau met LC/MS-MS + oorzaakanalyse: > MRL: melding aan COKZ en NVWA
OORZAKEN VAN VALSPOSITIEVE RESULTATEN BIJ MICROBIOLOGISCHE INHIBITIETESTEN lactoferrine, lysozyme in colostrum- en mastitismelk hoge ph (> 7.0) - melk van koeien met chronische subklinische mastitis - residuen of alkalische desinfectieproducten of detergenten hoog somatisch celgetal hoge concentratie aan melkvet of melkeiwit; laag eiwit hoge concentratie aan capryl-, caprine-, laurine- of myristinezuur in melk door de activiteit van melkeigen lipase of bacteriële lipasen vitaminebindende eiwitten, mineralen of oligo-elementen kans op vernietiging van conforme melk Remedie: - verhitten, afromen of afromen & verhitten van de melk - gebruik van een test met een ander testprincipe 9
INHIBITIE DOOR VETZUREN (0,15% w/v in melk) Vetzuur Delvotest MCS CMT Delvotest SP Charm Blue- Yellow II Eclipse 3G BR-AS special boterzuur* (4:0) - + capronzuur* (6:0) + +/- + caprylzuur* (8:0) + + + + caprinezuur* (10:0) + + + + + + laurinezuur* (12:0) + + + + myristinezuur* (14:0) - +/- + palmitinezuur* (16:0) - + stearinezuur* (16:0) - + palmitoleïnezuur (16:1n-7) + + + oliezuur (18:1n-9) - + linolzuur (18:2n-6) - + + α-linoleenzuur (18:3n-3) + + elaïdinezuur (18:1trans-9) - vacceenzuur (18:1trans 11) - * verzadigd data ILVO 10
INHIBITIE DOOR BACTERIELE BACTERIOCINES Probleemstelling: Melk van hoeves met frequente positieve resultaten in het kader van de uitbetaling van de rauwe melk - positief op Delvotest, zelfs na een hittebehandeling - geen aanduiding van antibioticaresiduen Staalname van individuele koemelk en tankmelk; cut-off Delvotest=-3,0 Melk SCC (x10 3 ml -1 ) ph Delvotest (d+1) Delvotest (d+3) Vetoxidatie (d+3,5) (meq O 2 kg -1 vet) Vrije vetzuren (d+3,5) (% oliezuur 100 g -1 vet) koe 9 1407 6,76-7,56-2,67 0,13 0,1329 tank 168 6,64-3,32-0,10 1,24 0,1415 tank 179 6,65-3,47 0,21 1,24 0,1415 blanco milk 159 6,80-8,96-6,87 0,09 0,0665 d: dag staalname 11
INHIBITIE DOOR BACTERIELE BACTERIOCINES Isolatie van bacteriën: - psychrotroof (groei bij 7 C) - haemolytische en proteolytische activiteit - vetoxidatie rpob sequence analysis: meest verwant met Pseudomonas tolaasii Bacteriële toxines geïdentificeerd als cyclische lipodepsipeptiden van de viscosine-groep (Reybroeck et al., 2014, PLoS ONE) 12
INHIBITIE DOOR MELKSAMENSTELLING % Valspositieve resultaten Melkparameter Charm BY II Eclipse 3G Delvotest T n* % n* % n* % melk met normale samenstelling 1717 0,2 435 0,9 403 2,7 kiemgetal >10 8 per ml 20 0,0 nt nt nt nt SCC 5 10 5-10 6 per ml 232 6,5 198 15,7 68 19,1 SSC >10 6 per ml 145 33,8 117 32,5 69 47,8 vet <2 g per 100 ml 10 0,0 nt nt nt nt vet >6 g per 100 ml 82 12,2 72 29,2 46 8,7 eiwit <2,5 g per 100 ml 10 30,0 nt nt 9 0,0 eiwit >4 g per 100 ml 10 40,0 nt nt nt nt bacteriële bacteriocines ja ja ja ph >7,0 ja ja ja data ILVO n*: aantal geteste stalen nt: niet getest 13
INGANGSCONTROLE VAN RMO-MELK: BE Bij jaarlijkse aankoop > 2 000 000 liter rauwe melk Verplichting tot controle van de melk voor verwerking - op niveau opslagtank - of op niveau RMO-wagen Lijst van door FAVV erkende sneltesten; erkenning op basis van acceptatiecriteria (detectie β-lactam) - βeta-s.t.a.r. combo v1.0 (Neogen Corporation) - BetaXpress Milk MRL KIT044 (Unisensor s.a.) - Charm MRLBL (ROSA) (Charm Sciences Inc.) - Charm MRLBL1 (Charm Sciences Inc.) - Charm MRLBL3 (Charm Sciences Inc.) - SNAP ST (IDEXX Laboratories Inc.) - SNAPduo ST (IDEXX Laboratories Inc.) - TwinSensor KIT020 (Unisensor s.a.) - TriSensor KIT035 (Unisensor s.a.)
DETECTIECAPACITEIT FAVV ERKENDE SNELTESTEN INGANGSCONTROLE MELK (deel 1) Marker residue MRL μg kg -1 Detectiecapaciteit (μg kg -1 ) βeta-s.t.a.r. BetaXpress Charm combo (v1.0) Milk KIT044 MRLBL Charm MRLBL1 ROSA benzylpenicilline 4 4 2 2 2 ampicilline 4 4 3 3 4 amoxicilline 4 4 3 3 4 cloxacilline 30 5 9 25 16 nafcilline 30 12 100 45 150 ceftiofur 100 90 10 6 16 desfuroylceftiofur 100 1000 60 8 90 cefquinome 20 8 20 14 20 cefazoline 50 40 12 10 20 cephapirine 60 9 4 5 30 desacetylcephapirine 60 3 20 7 60 cefoperazone 50 8 1 4 1 cefalexine 100 700 900 15 1750 cefalonium 20 5 2 3 9 Resultaten validatiestudies ILVO-T&V 15
DETECTIECAPACITEIT FAVV ERKENDE SNELTESTEN INGANGSCONTROLE MELK (deel 2) Detectiecapaciteit (μg kg -1 ) Marker MRL Charm SNAP SNAP Twin TriSenso residue μg kg -1 MRLBL3 ST duo ST Sensor r KIT035 Pearl EZ KIT020 * benzylpenicilline 4 3 3 3 2 3 3 ampicilline 4 4 4 4 4 4 4 amoxicilline 4 4 4 4 4 4 4 cloxacilline 30 25 25 5 5 8 9 nafcilline 30 175 175 4 4 80 70 ceftiofur 100 14 14 12 14 10 10 desfuroylceftiofur 100 100 100 70 70 100 100 cefquinome 20 20 20 16 18 16 20 cefazoline 50 25 30 30 40 12 18 cephapirine 60 9 10 25 35 4 5 desacetylcephapirin 60 60 60 60 70 70 60 e cefoperazone 50 2 2 40 35 4 3 cefalexine 100 1250 1250 >7500 >7500 1250 800 cefalonium Resultaten 20 validatiestudies 12 12 ILVO-T&V, 20 behalve 20 * (DQPA) 4 4 16
INGANGSCONTROLE VAN RMO-MELK: BE SECTOR PROTOCOL + + + SNELTEST (β-lactam) OP RMO-MELK - + HERHALING ZELFDE SNELTEST (intern lab) + MICROBIOLOGISCHE TEST + - - (2x) AFKEURING (VERNIETIGING) HUMANE CONSUMPTIE Beschikking 2006/694/EG: melk met een positief resultaat voor een screeningstest dient als onveilig te worden beschouwd
MONITORING IN HET KADER VAN MONIMILK EN DOOR FAVV Richtlijn 96/23/EG & Beschikking 97/747/EG: Nationaal residuplan Verplichting tot jaarlijkse controle van o.a. melk: 1 staal per 15 000 ton geproduceerde melk; minimum van 300 stalen - diverse matrices: melk(poeder), room, - ad random staalname - batterij aan testen + ook LC-MS/MS - monitoring van antibiotica, chemotherapeutica, antiparasitaire stoffen, niet-steroïdale ontstekingsremmers, pesticiden, melamine, aflatoxine M1, - steeds bepaling van de substantie en kwantificatie ter vergelijking met de norm (MRL of ML) (LC-MS/MS)
VALIDATIE VAN SCREENINGSTESTEN Beschikking van de Commissie 2002/657/EG Aantoonbaarheidsgrens CC Beslissingsgrens CCα Juistheid/ Terugvinding Precisie Selectiviteit / Specificiteit Toepasbaarheid/ Robuustheid/ Stabiliteit kwalitatieve methoden Kwantitatieve methoden S + - - - + + C + + - - + + S + - - + + + C + + + + + + S: screeningstesten; C: bevestigingsmethoden Guidelines for the validation of screening methods (CRLs, January 20, 2010) - primaire validatie - transfervalidatie
DETECTIECAPACITEIT DELVOTEST T Familie Merkerresidu MRL (µg kg -1 ) ccβ (µg kg -1 ) cefalosporinen cefquinome 20 60 tetracyclines 4 epimeer van chloortetracycline 100 1000 aminoglycosiden dihydrostreptomycine 200 1500 kanamycine A 150 1500 quinolonen enrofloxacine 100 1500 polymyxines colistine 50 400 penicillines benzylpenicilline 4 1 cloxacilline 30 8 cefalosporinen cefazoline 50 4 (desacetyl)cephapirine 60 (2)2 sulfonamiden sulfadimethoxine 100 16 aminoglycosiden neomycine B 1500 150 Detectiecapaciteit niet in lijn met resp. MRLs. Lijst niet beperkt. 20
DETECTIECAPACITEIT SNAP ST benzylpenicillin (4) cefalonium (20) ampicillin (4) cef alexin (100) amoxicillin (4) cef operazone (50) oxacillin (30) cef acetrile (125) cloxacillin (30) desacetylcephapirin (60) dicloxacillin (30) cephapirin (60) cef azolin (50) cef quinome (20) naf cillin (30) ceftiofur (100) desf uroylcef tiofur (100) Binnencirkel = 2 MRL; cirkel 2 = MRL; cirkel 3 = 0,5 MRL; cirkel 4 = 0,25 MRL. MRL in µg/kg, vermeld tussen haakjes.
ratio ILVO TESTROBUUSTHEID Betachannel (blank - pen - pen 3 ppb) 34SENSOR ppb) MILK MELKINVLOEDEN OP β-lactamkanaal 6,0 5,5 5,0 5,0 4,5 4,5 4,0 4,0 3,5 3,5 3,0 3,0 2,5 2,5 2,0 2,0 1,5 1,5 1,0 1,0 0,5 0,5 0,0 0,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min blank max min blank mean max blank min mean pen blank 3 ppb max min pen pen 3 ppb ppb mean max pen 3 ppb ppb cut-off mean pen 3 ppb cut-off milk quality/composition milk quality/composition blanco melk benzylpenicilline 3 µg/kg 1. normal raw milk = reference 2. somatic cells, >10 6 ml -1 3. TBC > 5 10 5 ml -1 4. low fat, <2 g 100 ml -1 5. high fat, >6 g 100 ml -1 6. low protein, <3 g 100 ml -1 7. high protein, >4 g 100 ml -1 8. ph 6.0 9. ph 7.5 valsnegatieve resultaten valspositieve resultaten
TESTROBUUSTHEID CHARM MRL1 TEST MRLBL1 Milk type-benzylpenicillin 3 µg/kg MELKINVLOEDEN OP β-lactamkanaal reader value 2000 1000 benzylpenicilline 3 µg/kg 0-1000 -2000 valsnegatieve resultaten 1 2 3 4 5 6 milk type Maximum reading ( ), Average reading ( ), Minimum reading ( ), Con Minimum Maximum positive 1. referentie from Meannegative = normale ( rauwe ), melk Legend: 4. gereconstitueerde 1=reference: normal melkpoeder raw milk, 2=U Cut-off reconstituted 2. UHT melk powder, 5= goats milk, 5. 6= mares geitenmelk milk. 3. gesteriliseerde melk 6. paardenmelk
ANTIBIOTICARESIDUEN IN HONING Antibiotica en sulfonamiden worden soms door de imker ingezet tegen bacteriële broedziekten (Amerikaans en Europees vuilbroed) en Nosemose. Andere besmettingsbronnen: - behandeling van fruitbomen met streptomycine tegen bacterievuur - gecontamineerd drinkwater - medicatie van andere diersoorten (reisduiven, ) - vanuit mest - metabolisatie tot sulfanilamide vanuit herbicide asulam - door bijmenging of voedering van gecontamineerde importhoning Geen MRLs gefixeerd voor antibiotica in honing (actielimieten in BE) Geen metabolisatie, lange verblijftijden in de honing in de bijenkast Richtlijn 96/23/EG & Beschikking 97/747/EG: Nationaal residuplan Verplichting tot jaarlijkse controle van honing: 10 stalen per 300 ton (eerste 3000 ton productie), nadien 1 staal per 300 ton
RASFF NOTIFICATIES OMWILLE VAN ANTIBIOTICARESIDUEN IN HONING: 2002-2010 Familie Substantie aminoglycosiden streptomycine dihydrostreptomycine amphenicolen chlooramphenicol sulfonamiden sulfadiazine sulfathiazole sulfamethazine sulfamerazine sulfadimethoxine sulfamethoxazole sulfamethoxine tetracyclines tetracycline oxytetracycline doxycycline macroliden tylosine erythromycine lincosamiden lincomycine nitrofuranen AOZ AMOZ SEM fluoroquinolonen ciprofloxacine enrofloxacine diaminopyrimidine derivaten nitroimidazolen trimethoprim metronidazole
TRENDS IN ANTIBIOTICARESIDUEN IN EUROPESE COMMERCIELE TAFELHONING Land n 2002 2005 2009 2012 n Pos % Pos * n n Pos % Pos % Pos * n n Pos % Pos % Pos * België 20 13 65 21 4 19 14 21 2 10 5 40 0 Italië 20 3 15 19 6 32 11 15 2 13 7 --- --- Portugal 20 10 50 20 7 35 35 20 4 20 20 --- --- Spanje 20 7 35 20 0 0 0 15 3 20 7 --- --- Zwitserland --- --- --- --- --- --- --- 15 1 7 7 --- --- UK --- --- --- 20 3 15 0 --- --- --- --- --- --- 2002 *: controle op streptomycine, tetracyclines, sulfonamiden en CAP 2005: uitgebreid met macroliden/lincosamiden 2009: uitgebreid met macroliden/lincosamiden, quinolonen en nitrofuranen n data ILVO n Pos
ANTIBIOTICARESIDUEN IN LOKAAL GEPRODUCEERDE VLAAMSE HONING Substantie Positieve honingstalen / aantal geteste honingstalen 2000-2001 2002 2003 2004 2005 2006 en 2007 2008 2009 en 2010 2011 2012 en 2013 2014 streptomycine 4/248 0/90 --- 0/10 0/20 0/15 0/25 0/20 0/20 0/20 1/10 tetracyclines 2/72 0/90 --- 0/10 0/20 0/15 0/25 0/20 0/20 0/20 0/10 sulfonamiden 3/72 3/91 12/203 0/20 0/20 0/15 0/35 0/30 1/30 0/30 0/10 chlooramphenicol 0/93 0/226 --- 0/10 0/20 0/15 0/25 0/20 0/20 0/20 0/10 -lactams 0/50 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- macroliden/ lincosamiden --- --- --- --- --- 0/15 0/25 0/20 0/20 0/20 0/10 fluoroquinolonen --- --- --- --- --- 0/15 0/25 0/20 0/20 0/20 0/10 Sulfonamiden tot 13194 µg/kg (2003) en 5200 µg/kg (2011); streptomycine: 3 µg/kg (2014) data ILVO
SCREENING VAN ANTIBIOTICARESIDUEN IN HONING Geen MRLs: lage concentraties moeten kunnen worden aangetoond Microbiologische inhibitortest: Premitest: actielimieten vaak niet gehaald Receptortesten: - dipsticks: TetraSensor Honey (tetracyclines) SulfaSensor honey (sulfonamiden) Bee4sensor (tylosine, quinolones, sulfonamiden en CAP) - Charm II testen ( families) ELISA: families Biochip Array Technology (Randox): 22 componenten, families Screening met LC-MS/MS
CONCLUSIES De zuivelsector heeft een lange traditie in het systematisch testen van antibioticaresiduen Screeningstesten spelen daarbij een belangrijke rol Problematiek van antibioticaresiduen in honing is teruggedrongen o.a. door controleprogramma s Validatie van screeningstesten is belangrijk en een must om een juiste keuze van test toe te laten
Dank U Wim.Reybroeck@ilvo.vlaanderen.be Instituut voor Landbouw- en VisserijOnderzoek Brusselsesteenweg 370 9090 Melle België T + 32 (0)9 272 30 11 F +32 (0)9 272 30 01 t&vbu@ilvo.vlaanderen.be www.ilvo.vlaanderen.be