Detectie en kwantificatie van schistocyten op de Cell-Dyn Sapphire

Detectie en kwantificatie van schistocyten op de Cell-Dyn Sapphire Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het diploma bachelor Medisch Laboratoriumtechnologie Silke Goovaerts Annelies Crabbe Lutgarde Smet Guy Van Moer Anneleen Schallier Departement Gezondheidszorg Academiejaar 2013-2014 Academiejaar Bachelor Medisch Laboratoriumtechnologie Erasmushogeschool Brussel Departement Gezondheidszorg en Landschapsarchitectuur Laarbeeklaan 121 B-1090 Jette t +32 (0)2 472 52 00 gl@ehb.be www.erasmushogeschool.be

Detectie en kwantificatie van schistocyten op de Cell-Dyn Sapphire Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het diploma bachelor Medisch Laboratoriumtechnologie Silke Goovaerts Annelies Crabbe Lutgarde Smet Guy Van Moer Anneleen Schallier Departement Gezondheidszorg Academiejaar 2013-2014 II

III

Voorwoord Een klein dankwoord eerst en vooral aan het diensthoofd Prof. Dr. Marc De Waele voor de toelating om mijn eindwerkstage hier te mogen uitvoeren. Ik wil ook Lutgarde Smet, Guy Van Moer en Anneleen Schallier bedanken om mee te werken aan hun onderzoek en ook voor hun uitleg, hulp en steun. De laboranten wil ik zeker ook bedanken voor hun uitleg en hulp. Ten slotte wil ik ook mijn ouders, familie en enkele vrienden bedanken voor hun hulp bij het nalezen van mijn eindwerk. IV

Dienst hematologie Diensthoofd 3 Biomedische laboratoriumtechnologie Organigram Sector hematologie Sectorverantwoordelijke Eenheid hematologie Klinische bioloog Sector hemostase Sectorverantwoordelijke Eenheid HLA en Moleculaire hematologie Klinisch bioloog Eenheid immunologie Klinisch bioloog Sector morfologie Sectorverantwoordelijke Sector Cellulaire immunologie Hoofdlaborant Sector humorale immunologie Hoofdlaborant Diensthoofd: Prof. Dr. Marc De Waele Klinisch bioloog eenheid hematologie: Prof. Dr. Kristin Jochmans Sectorverantwoordelijke hematologie: Guy Van Moer Sectorverantwoordelijke hemostase: Christelle Orlando Sectorverantwoordelijke morfologie: Lutgarde Smet Kwaliteitsfunctionaris: Serge Damiaens Laboranten: Bart, Ann, Hilde, Cynthia, Carine, Karine, Marleen, Gaby, Jenny, Anny, Eddy, Greta, en Sonja. V

Inhoudsopgave 1 Inleiding... 1 2 Literatuurstudie... 3 2.1 Pathologieën waarbij schistocyten aanwezig zijn... 3 2.2 Trombotische microangiopathie... 4 2.2.1 TTP & HUS... 4 3 Materiaal en toestellen... 8 3.1 Toestellen... 8 3.1.1 Cell-Dyn Sapphire... 8 3.1.1.1 Staalname... 8 3.1.1.2 Doel... 9 3.1.1.3 Principe en werkwijze... 9 3.1.1.4 Onderhoud... 19 3.1.1.5 Kwaliteitscontroles... 19 3.1.1.6 Referentiewaarden... 20 3.1.2 Cell-Dyn Slide Maker Stainer... 21 3.1.1.1 Doel... 21 3.1.1.2 Principe en werking... 21 3.2 Materialen... 23 3.2.1 Cell-Dyn Sapphire en Slide Maker Stainer... 23 3.2.2 Software: FCS Express... 23 3.2.3 Statistiek via analyse it en SPSS... 23 3.2.3.1 Analyse it... 23 3.2.3.2 Statistical Package for the Social Sciences SPSS... 23 4 Methodes... 24 4.1 Methode validatie... 24 4.1.1 Antiglycophorine methode... 24 4.1.2 Dilutie van een positief staal... 24 4.1.3 Autofluorescentie van de bloedplaatjes... 24 4.2 Vergelijkende studie: cut off bepaling... 25 4.2.1 Normaalwaarden... 25 4.2.2 Reproduceerbaarheid... 25 4.2.3 Intraclass correlation coëfficiënt'... 25 4.2.4 Microscopie versus Cell-Dyn Sapphire... 25 VI

5 Resultaten en discussie... 27 5.1 Methode validatie... 27 5.1.1 Antiglycophorine methode... 27 5.1.2 Dilutie van een positief staal... 30 5.1.3 Autofluorescentie van de bloedplaatjes... 31 5.1.4 Werkwijze uit gaten van de gefragmenteerde rode bloedcellen... 32 5.1.5 Discussie methodevalidatie... 34 5.2 Vergelijkende studie... 35 5.2.1 Normaalwaarden... 35 5.2.2 Reproduceerbaarheid... 38 5.2.3 Intraclass correlation coëfficiënt... 38 5.2.4 Microscopie versus Cell-Dyn Sapphire... 39 5.2.5 Discussie vergelijkende studie... 40 5.3 Interferenties... 41 6 Conclusie... 45 7 Referenties... 46 8 Bijlagen... 47 8.1 Bijlage 1... 47 8.2 Bijlage 2... 47 8.2.1 Dilutie CBC + RETIC mode... 47 8.2.2 Dilutie antiglycophorine methode... 48 VII

Lijst van gebruikte afkortingen ADAMTS13: A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin-1 motifs 13th member of the family ALL: Axial Light Loss CBC: Complete Blood Count CD: Cluster of Differentiation CHCr: Mean Hemoglobin Concetration of reticulocytes CI: Confidence Interval DIC: Dissiminated Intravascular Coagulation DNA: Desoxyribonucleic acid EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid EHEC: Enterohaemorrhagic Escherichia coli EPO: Erytropoitin FCS: Flow Cytometry Standard FL: Fluorescence channel FRC: Fragmented Red Blood Cells HCT: Hematocrite HDW: Hemoglobine Distribution Width HELLP: Hemolysis Elevated Liver Enzymes and Low Platelets HGB: Hemoglobine HLA: Human Leukocyte Antigen HPO: Hypochromic RBC HPR: Hyperchromic RBC HUS: Hemolytic Uremic Syndrome IAS: Intermediate Angle Scatter IBM: International Business Machines Corporation ICC: Intraclass Correlation Coëfficiënt IRF: Immature reticulocyte fraction K: Kalium LDH: Lactate dehydrogenase LED: Light Emitting Diode MAC: Macrocytic Red Blood Cells MCH: Mean Cell Hemoglobine MCHC: Mean Cell Hemoglobine Concentration MCHr: Mean Reticulocyten Hemoglobine MCV: Mean Cell Volume MCVr: Mean Reticulocyten Volume MGG: May-Grünwald Giemsa MIC: Microcytic Red Blood Cells MPV: Mean Platelet Volume NPV: Negatieve Predictieve waarde NRBC: Nucleated RBC (gekernde RBC erythroblasten) PLT: Platelets PLTi: Plaatjes met de impedantiemethode gemeten PLTo: Plaatjes optisch gemeten PPV: Positive Predictive Value VIII

PSI: PSS: RBC: RDW: RETC: RNA: ROC: rp: SMS: SPSS: TMA: TTP: VC: vwf: WBC: WVF: Pound per Square Inch Polarized Side Scatter Red Blood Cells Relative Distribution Width of the erytrocytes Reticulocytes Ribonucleic acid Receiver Operating Characteristic Reticulated Platelets (jonge plaatjes) Slide Maker Stainer Statistical Package for the Social Sciences Trombotic Microangiopathy Trombotic Trombocytopenic Purpura Coefficient of Variation von Willebrandfactor White Blood Cells White blood cell viability (levensvatbaarheid van de witte bloedcellen) IX

Lijst van figuren Figuur 1: Figuur 2: Figuur 3: Figuur 4: Figuur 5: Figuur 6: Figuur 7: Figuur 8: Figuur 9: Figuur 10: Figuur 11: Figuur 12: Figuur 13: Figuur 14: Figuur 15: Figuur 16: Figuur 17: Figuur 18: Figuur 19: Figuur 20: Figuur 21: Figuur 22: Figuur 23: Figuur 24: Figuur 25: Figuur 26: Figuur 27: Figuur 28: Figuur 29: Productie van schistocyten: splitsen van een discocyt (2) door een fibrinedraad (2). De schistocyten (3) evolueren tot sfero-schistocyten waarbij hemolyse snel optreedt (4) Schistocyten (zwarte pijlen) Stollingsproces Cell-Dyn Sapphire Sarstedt EDTA/K + 2,6 ml Algemene weergave van de Cell-Dyn Sapphire Status van het toestel: indicatielampjes + toestel in open modus (blauwe kader) Verschillende dilutiecups Nozzle Assambly Volgorde injectie van verdunningen bij optische flowcelmeting Hoeken waaronder de lichtverstrooiing wordt gemeten Scattergram Cell-Dyn SMS FCS scatterplot nat meting in de CBC + RETIC mode ALL: axial light loss (0 ) PSS: polarized side scatter (90 ) (links) FRC: 0,06% (rechts) FCS scatterplot na meting met de antiglycophorine methode ALL (0 ) PSS (90 ) FCS scatterplot na meting in CBC + RETIC mode Correlatie FRC telling Dilutie positief staal in de CBC + RETIC mode Dilutie positief staal antiglycophorine methode Links: CD235a (rood) Rechts: CD235a (rood) en CD41 (groen) FL1: Fluorescence channel 1 IAS: Intermediate angle scatter (7 ) Uit gaten van de schistocyten met tabel waarin percentage schistocyten wordt weergegeven Uit gaten van de schistocyten met in de tabel het percentage schistocyten Scattergram van een gezond individu 1 via CBC + RETIC mode Scattergram van een gezond individu 1a via antiglycophorine methode Scattergram van een gezond individu 1b via antiglycophorine methode ROC plot Scattergram van een postbeenmergtransplant Scattergram van een staal met poikylocytose Scattergram van een staal met sikkelcelanemie X

Lijst van tabellen Tabel 1: Tabel 2: Tabel 3: Tabel 4: Tabel 5: Tabel 6: Tabel 7: Tabel 8: Tabel 9: Tabel 10: Tabel 11: Meest voorkomende pathologieën Parameters Cell-Dyn Sapphire Modes Sapphire Status Toestel Verdunning met het volume van het staal Celinformatie Referentiewaarden parameters Cell-Dyn Sapphire Schema kleuring Meetresultaten CBC + RETIC mode en de antiglycophorine methode Resultaten dilutie CBC + RETIC mode Resultaten dilutie antiglycophorine methode XI

Samenvatting Schistocyten zijn kleine fragmenten van rode bloedcellen. Deze ontstaan door een uitwendige beschadiging in de circulatie. Het is belangrijk om deze gefragmenteerde rode bloedcellen te identificeren, want de aanwezigheid hiervan kan diagnostisch zijn bij Trombotische Trombocytopenische Purpura, TTP, wat één van de pathologieën is van Trombotische Microangiopathie, TMA. Indien TTP niet behandeld wordt, is er 90% kans op sterfte. In deze studie probeert men na te gaan op welke manier de Cell-Dyn Sapphire van Abbott kan gebruikt worden om de schistocyten te detecteren en te kwantificeren. Eerst wordt er een methode validatie uitgevoerd. Deze omvat een aantal testen om na te gaan of de detectie en de kwantificatie kan gevalideerd worden. Een lage correlatie werd bekomen, maar er werd besloten om toch verder de stalen te analyseren. De reproduceerbaarheid van twee gezonde individuen en twee TMA patiënten wordt nagegaan door elk staal tien maal te meten via de Complete Blood Count + reticulocyten, CBC + RETIC, mode. De analyse gebeurt door één persoon zodat een variatiecoëfficiënt kan bepaald worden. De intraclass correlation coëfficiënt, ICC, wordt nagegaan door dertig ad random stalen te laten beoordelen door drie verschillende personen. De ICC wordt gebruikt om na te gaan of er een overeenkomst is tussen de resultaten van de drie examinators. Dertig stalen van gezonde personen worden enerzijds via de CBC + RETIC mode van de Sapphire gemeten en anderzijds via het protocol van antiglycophorine, dit is een merker voor de rode bloedcellen. Een vergelijkende studie wordt nadien uitgevoerd waarin geprobeerd wordt om een cut off waarde te bepalen. De gouden standaard of referentiemethode is de microscopische telling. Deze wordt vergeleken met de Cell-Dyn Sapphire. Er worden bij de vergelijking 139 stalen geanalyseerd. De sensitiviteit en specificiteit worden bepaald. Een hoge sensitiviteit werd bekomen, maar door het grote aantal vals positieve patiënten was de specificiteit laag. Dit bevestigde nog maar eens dat de Cell-Dyn Sapphire niet gebruikt kan worden als kwantificatie, maar wel als detectie. XII

Abstract Schistocytes are little fragments of red blood cells. They develop by an external damage in the circulation. It is important to identify these fragmented red cells, because their presence can be diagnostical for Trombotic Trombocytopenic Purpura, TTP, which is one of the pathologies of Trombotic Microangiopathy, TMA. There is a death rate of 90% if TTP is not treated. In this study we try to use the Cell-Dyn Sapphire of Abbott to detect and to quantify the schistocytes. First of all a validation of the method is performed. This consists in a number of tests in order to check whether the detection and quantification can be validated. We obtained a low correlation, but we decided to continue to analyse the samples. The reproducibility of two healthy individuals and two TMA patients is analysed by measuring each sample ten times in CBC + RETIC mode. This analysis is performed by one person in order to be able to determine a variation coefficient. The Intraclass Correlation Coefficient, ICC, is tested by examination of thirty ad random samples by three examinators. ICC is used to verify if there is a similarity between the results of the three persons. Thirty samples of healthy individuals are measured on one hand by the CBC + RETIC mode of the Sapphire and on the other hand by the antiglycophorine method, which is a marker for the RBC. Afterward a comparative study was performed to determine a cut off value. The golden standard, or so called reference method, is the microscopic countig. This is being compared with the Cell-Dyn Sapphire. Therefore 139 samples are being analysed and the sensitivity and specificity are examined. A high sensitivity was obtained, but due to the presence of a large number of false positive patients, the speficity was low. This confirms once more that the Cell-Dyn Sapphire can be used as screening but not for quantification. XIII

1 Inleiding Schistocyten zijn gefragmenteerde rode bloedcellen. Ze zijn kleiner dan normale rode bloedcellen, namelijk fragmenten met verschillende grootte. Schistocyten kunnen scherpe en/of rechte rand hebben. Helmcellen, keratocyten en microsferocyten behoren ook tot de schistocyten. Ze zijn meestal donkerder gekleurd. De gouden standaard om de gefragmenteerde rode bloedcellen te identificeren is de microscopische analyse van perifeer bloed. De International Council of Standardization in Haematology heeft enkele aanbevelingen om de identificatie van schistocyten te standaardiseren beschreven: de uitstrijkmethode, de telmethode en de morfologische beschrijving gebaseerd op de criteria die hierboven beschreven staan zoals helmcellen, klein, verschillende grootte, enz. (Zini et al., 2011). In figuur 1 is de productie van schistocyten te zien in opeenvolgende stappen en op figuur 2 zijn de schistocyten te zien in een perifeer bloeduitstrijk. Figuur 1: Productie van schistocyten: dankzij splitsen van een discocyt (2) door een fibrine draad (2). De schistocyten (3) evolueren tot sfero-schistocyten waarbij hemolyse snel optreedt (4) 1

Figuur 2: Schistocyten (zwarte pijlen) De 'flow cytometry' mode, complete bloud count en reticulocyten mode, van de Cell- Dyn Sapphire van Abbott wordt gebruikt in dit onderzoek. In deze mode wordt een volledige telling van het bloed uitgevoerd, maar ook de reticulocyten worden gemeten. Een dilutie en antiglycophorine meetmethode worden ook toegepast in deze studie. Deze drie meetmethoden worden gebruikt om de gefragmenteerde rode bloedcellen te onderscheiden van de andere bloedcellen. Om die gefragmenteerde rode bloedcellen te differentiëren van de gehele populatie aan rode bloedcellen wordt hun populatie geanalyseerd via een 'flow cytometry' programma van de firma De Novo Software, namelijk FCS Express. Hierin wordt het scatterplot ganalyseerd en wordt de normale populatie RBC onderscheiden van de kleine RBC fragmenten. Het aantal aanvragen om schistocyten te identificeren stijgt. De manuele telling is arbeidsintensief, subjectief en semi-kwantitatief. Daarom poogt men in deze studie om de Sapphire te gebruiken voor detectie en kwantificatie van schistocyten. 2

2 Literatuurstudie 2.1 Pathologieën waarbij schistocyten aanwezig zijn In onderstaande tabel staan de meest voorkomende pathologieën waarbij de schistocyten kunnen voorkomen. Trombotische Trombocytopenische Purpura, TTP, en Hemolytisch Uremisch Syndroom, HUS, staan in het rood, omdat het onderzoek naar de identificatie van schistocyten bij beiden diagnostisch is (Huh et al., 2013). In deze pathologieën moeten schistocyten zeker gerapporteerd worden. Tabel 1: Meest voorkomende pathologieën waarbij schistocyten aanwezig kunnen zijn Hematologische maligniteit Megaloblastische anemie Microangiopatische hemolytische anemie - Dissiminated Intravascular Coagulation, DIC - Hemolysis Elevated Liver enzymes and Low Platelets, HELLP - TTP/HUS Metastatisch carcinoom Sepsis Acuut renaal falen Chronisch renaal falen Neonaat Levercirrose Congestief hartfalen Andere - mechanische hartklep - thalassemie 3

2.2 Trombotische microangiopathie Trombotische microangiopathie is een acuut en ernstig ziektebeeld. Meerdere orgaansystemen kunnen betrokken geraken waarbij neurologische en/of nefrologische stoornissen vooral op de voorgrond staan. Een kenmerkende eigenschap van het ziektebeeld is de combinatie van trombocytopenie (te weinig bloedplaatjes), hemolytische anemie (te snelle afbraak van de rode bloedcellen), koorts en in de bloedfilm karakteristieke kapotte erytrocyten, namelijk schistocyten (Kater et al., 2002). TMA is de groepsnaam voor verschillende pathologiën: - Dissiminated intravascular coagulation (DIC) - Hemolysis Elevated Liver enzymes and Low Platelets (HELLP syndroom) - Trombotische Trombocytopenische Purpura (TTP) - Hemolytische Uremische Syndroom (HUS) 2.2.1 TTP & HUS TTP en HUS zijn moeilijk te onderscheiden van elkaar omdat hun klinische symptomen grotendeels overlappen. TTP is een zeldzame en levensbedreigende aandoening, want aggregaten van trombocyten gaan de kleine bloedvaten afsluiten. Indien TTP niet behandeld wordt, is er 90% kans op sterfte (TTP, 2011). HUS wordt gekenmerkt door achteruitgaande nierfunctie, in combinatie met een tekort aan rode bloedcellen en bloedplaatjes (Schieving, 2013). Bij TTP is er idealiter een klinische pentade, maar soms zijn slechts drie tot vier kenmerken aanwezig: - trombocytopenie - hemolytische anemie - koorts - neurologische afwijkingen - nierdysfunctie 4

De kliniek van HUS is als volgt: - trombocytopenie - hemolytische anemie - nierdysfunctie - typische HUS: diarree (wordt uitgelokt door toxines, bv.: enterohemorragische Escherichia coli EHEC) / atypische HUS: geen diarree Detectie van TMA in de laboratoria van UZ Brussel: - hematologie: lage plaatjes, schistocyten, anemie - chemie: indirecte bilirubine, lactaatdehydrogenase (LDH), creatinine - humorale immunologie: haptoglobine Het verschil tussen beide pathologiën kan bepaald worden door ADAMTS13, A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin-1 motifs 13th member of the family, te analyseren. ADAMTS13 is een von Willebrand factor klievend protease. De activiteit van de ADAMTS13 zal sterk gedaald zijn of afwezig zijn bij TTP. Bij een HUS worden er Shiga-toxines (EHEC, Shigella) terug gevonden die verantwoordelijk zijn voor diarree. De prognose en de therapie van HUS en TTP zijn verschillend (Trombotische microangiopathie van de nieren, 2014). Direct therapeutisch handelen, namelijk via plasma exchange, kan levensreddend zijn bij TTP. Meer dan 1% aanwezige schistocyten moet diagnostisch beschouwd worden voor TTP en de klinische setting, zoals hierboven beschreven is, moet ook duidelijk aanwezig zijn. 5

Figuur 3: Stollingsproces In figuur 3 is het stollingsproces te zien op drie manieren: Afbeelding A: In deze afbeelding is te zien hoe er bij een normale persoon een stolsel wordt gevormd. Door een schuifspanning (door een slechte afname of beschadiging van de bloedvatwand) zullen de Von Willebrand-factor multimeren, vwf, zich gaan uitrollen en de plaatjes kunnen hierop binden. Zo gaan er zich plaatjes aggregaten gevormd worden, en wordt de bloeding gestopt. Afbeelding B: bij normale, gezonde personen worden vwf multimeren gekliefd door het ADAMTS13 enzyme. Kleine vwffragmenten gaan hierdoor circuleren in de bloedbaan. Afbeelding C: bij TTP patiënten worden de vwf multimeren niet gekliefd doordat ADAMTS13 activiteit afwezig is. Plaatjes zullen binden aan de trombogene multimeren en stolsels zullen ontstaan (Thrombotic Microangiopathy: ahus and TTP, 2014). 6

Plasmaferese als behandeling voor TTP heeft de sterfte al verlaagd van 90% tot 10 à 25%. Een aanwezige autoantistof wordt verwijderd en met vers plasma wordt functioneel protease aangeboden. Bij een goede respons wordt na een week de behandeling afgebouwd. Bij falen van de therapie kan splenectomie overwogen worden (Kater et al., 2002). HUS wordt meestal voorafgegaan door hemorragische gastro-enteritis die veroorzaakt wordt door Escherichia coli, meer bepaald de EHEC. Deze bacterie is verantwoordelijk voor diarree. In dit geval spreekt men dus van typische HUS. HUS komt voornamelijk voor bij kinderen en is een belangrijke oorzaak van acute nierinsufficiëntie bij kinderen (Kater et al., 2002). De consumptie van besmet voedsel is één van de belangrijkste oorzaken van besmetting bij de mens. HUS kan ook ontstaan na een urineweginfectie. Bij kinderen is de prognose meestal gunstig, maar bij volwassenen is het sterftecijfer hoog. Het gebruik van antibiotica lijkt HUS te induceren, waarschijnlijk door het vrijkomen van het verotoxine. Bij volwassenen lijkt de behandeling met plasmaferese wel nog zinvol te kunnen zijn (Kater et al., 2002). 7

3 Materiaal en toestellen 3.1 Toestellen 3.1.1 Cell-Dyn Sapphire Figuur 4: Cell-Dyn Sapphire 3.1.1.1 Staalname Voor celtellingen maakt men gebruik van volbloed afgenomen in Sarstedt tubes. Deze bevatten EDTA K + /2,6 ml. Figuur 5: Sarstedt EDTA/K + 2,6 ml 8

3.1.1.2 Doel De Sapphire heeft als doel verschillende hematologische parameters te meten in bloed. Figuur 6: Algemene weergave van de Cell-Dyn Sapphire 3.1.1.3 Principe en werkwijze Dertig hematologische parameters worden bepaald met de Sapphire zoals WBC, RBC, HGB, MCV, RDW, MPV, PLT, RETC, Neutrofielen, lymfocyten, monocyten, eosinofielen en basofielen. Andere parameters worden berekend a.d.h.v. de metingen of worden afgeleid uit de histogrammen of scattergrammen. Zie tabel 2 voor alle parameters. 9

Tabel 2: Parameters Cell-Dyn Sapphire Optische parameters Witte bloedcellen of leukocytentelling WBC Procent neutrofielen %N Absolute neutrofielen NEU Procent lymfocyten %L Absolute lymfocyten LYM Procent Monocyten %M Absolute monocyten MONO Procent eosinofielen %E Absolute eosinofielen EOS Procent basofielen %B Absolute basofielen Fractie leefbare leukocyten Erythrocyten optisch Procent Hypochrome RBC Procent Hyperchrome RBC Hemoglobine distributie width Absolute erythroblasten Aantal erythroblasten per 100 WBC (%) BASO WVF RBCo %HPO %HPR HDW NRBC NR/W Immature reticulocytenfractie Absolute reticulocyten IRF RETC Procent reticulocyten R% Gemiddeld RETC colume Gemiddeld RETC hemoglobine MCVr MCHr Gemiddelde concentratie RETC hemoglobin CHCr 10

Procent reticulated PLT Bloedplaatjes optisch Bloedplaatjes immunologisch %rp PLTo CD61 Impedantie parameters Erytrhocyten met impedantie Gemiddeld volume van de RBC Hematocriet Erythrocyten distributie width Bloedplaatjes met impedantie Gemiddeld bloedplaatjesvolume Plaatjescriet of thrombocriet Plaatjes distributie width Procent microcyten Procent macrocyten RBCi MCV HCT RDW PLTi MPV PCT PDW %MIC %MAC Hemoglobine parameters Hemoglobineconcentratie Gemiddelde hoeveelheid hemoglobine in de RBC HGB MCH Gemiddelde concentratie HGB in de RBC MCHC 11

De Sapphire heeft verschillende modes om de cellen te tellen in het bloedstaal. In onderstaande tabel worden deze toegelicht. Tabel 3: Modes Sapphire Modus CBC CBC + RETC CBC Resistant RBC Betekenis Complete Blood Count, volledige telling van het bloed, alle cellen CBC en de reticulocyten worden gemeten Er zijn resistente rode bloedcellen aanwezig en deze heeft het toestel mee geteld. In resistant mode meten zodat deze rode bloedcellen worden gelyseerd. CBC-WBC extended count Te weinig WBC aanwezig. Om een goed resultaat te verkrijgen, langer tellen zodat een betere differentiatie wordt gegenereerd. CBC + RETC + resistant CBC Zie CBC + RETC en CBC resistant RBC Tabel 4: Status toestel Status Aspirating Busy Not Ready Locked Ready Betekenis Toestel is staal aan het aspireren Stalen verdelen over de dilutiecups met reagens + meten Toestel is niet klaar om stalen te analyseren Processor cover staat vastgeklikt Toestel staat klaar om in open of closed mode te werken 12

A.d.h.v. de indicatielampjes kan men zien wat het toestel exact aan het doen is, dit is verduidelijkt in tabel 4 en in figuur 7 zijn de indicatielampjes te zien. Er zijn twee manieren waarin het toestel kan meten, in de open en gesloten modus, zie figuur 7 blauwe kader. Figuur 7: Status van het toestel: indicatielampjes + toestel in open modus (blauwe kader) Reagentia: - Diluent sheath reagens Het diluent sheath reagens is voor de RBC/PLT en RETC metingen de belangrijkste verdunningsvloeistof. - Hemoglobine reagens Het hemoglobine reagens gaat ervoor zorgen dat de rode bloedcellen gelyseerd worden, zodat het hemoglobine kan binden met immidazole. - WBC reagens deel A en deel B Het WBC reagens bestaat uit twee delen (WBC reagens A en B). De reagentia worden gemengd, op een temperatuur van 40 C gebracht en geschud zodat de RBC gelyseerd worden. Het fluorochroom propidiumiodide gaat erytroblasten,oude en soms pathologische cellen laten fluoresceren. - Reticulocyten reagens Cyanine gaat het RNA in de reticulocyten laten fluoresceren. 13

3.1.1.3.1 Detectiemethodes Via valven en pompen worden de te meten verdunningen van de reactiekamers naar de meetkamers getransfereerd en gemeten volgens onderstaande principes: - Impedantie transducermeting Impedantie staat voor elektrische weerstand. Het principe van deze methode berust dus op het feit dat de bloedcellen elektrische stroom minder goed gaan geleiden dan de elektrolytoplossing waarin de cellen gesuspendeerd zijn. Er wordt een voltage aangelegd tussen twee elektroden om een constante stroom door een kleine opening, apertuur, te sturen. Het staal wordt verdund en gemengd in diluent sheath in een mengcup, nl.de RBC dilutiecup. Het diluent sheath is een oplossing met een bepaalde conductiviteit. Het verdunde en gemengde staal wordt in de impedantie transducer in het centrum van een diluent sheath geïnjecteerd via tubings en valven. Dit is het principe van hydrodynamische focussering. De cellen passeren één voor één door de apertuur. Indien een cel door de kleine opening gaat, wordt de elektrische stroom gewijzigd. Het voltage moet stijgen om de constante stroom te behouden en het voltage dat binnen een bepaalde hardware treshold valt, indiceert een bloedcel. Een reeks pulsen wordt geteld en geanalyseerd. De grootte, het volume, van een bloedcel wordt bepaald door het meten van de hoogte van de overeenstemmende puls. - Hemoglobine flowcelmeting In de hemoglobine dilutiecup wordt het bloed verdund met het hemoglobine reagens. Zo worden de RBC gelyseerd, maar de witte bloedcellen en andere cellulaire fragmenten vernietigd. HGB reagens bezit imidazole als actief bestanddeel. Het reagens zet de ferroheemgroep van HGB om tot een ferriheemgroep dat met imidazole een stabiel imidazole ferriheem complex vormt. Dit complex wordt via absorptiespectrofotometrie, een colorimetrische methode, bepaald. Colorimetrie is een eenvoudige concentratiebepaling m.b.v. licht. Door een 540 nm LED, light emitting diode lamp wordt de hemoglobine flowcel belicht. Het verschil in gemeten licht tussen het monster en de blanco (hemoglobine reagens) wordt veroorzaakt door de lichtabsorptie van het HGB complex en wordt gebruikt om de concentratie hemoglobine in het staal te berekenen. - Optische flowcelmeting Lightscatter In de dilutiecups wordt het bloed verdund en gemend. In figuur 8 worden deze weergegeven en in tabel 5 wordt de verdunning met het nodige volume weergegeven. 14

Tabel 5: Verdunning met het volume van het staal Figuur 8: Verschillende dilutiecups Verdunning Volume van het staal Hemoglobine kamer (fig.8 nr.5) 18,75 µl Witte bloedcelkamer (CBC, CBC+RETC, CBC-WBC extended count) (fig.8 nr. 2) 37,5 µl Witte bloedcelkamer (CBC+RETC, Resistant RBC) 37,5 µl Rode bloedcelkamer (RBC & PLT) (fig. 8 nr. 8) 36,25 µl RETC (fig. 8 nr. 7) 225 µl van aliquot rode bloedcelkamer De meetkamer is de optische flowcel. Via een snelbewegende diluent sheath stroom wordt de verdunning in de flowcel geïnjecteerd. Het principe van hydrodynamische focussering wordt toegepast. In een constante stroom van diluent sheath met een druk van 8 PSI wordt het reactiemengsel geïnjecteerd met een druk van 4 PSI. Door dit drukverschil gaan de cellen één per één passeren door de flow cel, waar de laserbundel op gecentreerd wordt. 15

Figuur 9: Nozzle Assembly De Nozzle Assembly bestaat uit 3 concentrische injectienaalden, zodat de injectie van de WBC-,RBC/PLT-,en RETIC diluties onafhankelijk van elkaar kunnen gebeuren. Figuur 10: Volgorde injectie van verdunningen bij optische flowcelmeting De cellen gaan het laserlicht verstrooien onder verschillende hoeken afhankelijk van hun volume en hun interne structuur. Detectoren detecteren het gescatterde, verstrooide, licht dat omgezet wordt in elektronische pulsen die worden doorgestuurd naar het data station voor opslag en analyse. 16

De hoeveelheid licht die gemeten wordt onder elke hoek zegt iets over de cellen en wordt weergegeven in tabel 6. Tabel 6: Celinformatie Hoeken Celinformatie 0 (laten licht door) Grootte 7 Complexiteit 90 Lobulariteit (kernvorm) 90 gedepolariseerd Granulariteit In figuur 11 worden de hoeken waaronder de lichtverstrooiing wordt gemeten, weergegeven. Figuur 11: Hoeken waaronder de lichtverstrooiing wordt gemeten 17

- Fluorimetrie Fluorescentie wordt ook toegepast door de Sapphire. Fluorochromen kleuren de cellen en het laserlicht gaat deze fluorochromen doen fluoresceren. Filters laten een bepaalde golflengte door en blokkeren de andere golflengtes. Een fotomultiplier gaat de intensiteit van de golflengte detecteren. FL1, een filter, detecteert een groene fluorescentie op een golflengte van 530 nm. Cyanine is het fluorochroom, een fluorescente merker, die bindt met RNA. Dit complex fluoresceert in het groen en wordt gedetecteerd door de FL1 filter. FL3, een andere filter, detecteert een rode fluorescentie die het toestel detecteert op 630 nm. Het fluorochroom dat zich op het DNA bevindt is propidium jodide. Van de niet leefbare, oude en maligne WBC staan de poriën meer open waardoor propidium jodide gaat binden met het DNA in de cel. Dit complex geeft een rode fluorescentie. - Data analyse en weergave op het data station Van alle elektronische signalen die binnen bepaalde hardware tresholds vallen in een list mode, gaat de Sapphire de data analyseren en weergeven d.m.v. scatterplots, histogrammen en contour plots. De verschillende hoeken waaronder fluorescentie of scattering wordt gemeten, worden tegen over elkaar op de grafiek uitgezet. Zo is het mogelijk om de verschillende celpopulaties te scheiden en de abnormale populaties kunnen gedetecteerd worden. Figuur 12: Scattergram 18

3.1.1.4 Onderhoud Er is een dagelijks, wekelijks en maandelijks onderhoud. Het dagelijks onderhoud wordt uitgevoerd door de laborant die aan de Sapphire staat. Het dagelijks onderhoud omvat het toestel te wassen met 10% javeloplossing en nadien te primen. Hierna wordt de patiëntencontrole uitgevoerd. Het wekelijks onderhoud wordt uitgevoerd door drie verantwoordelijken van het labo hematologie UZ Brussel, G. Van Moer, E. Segers of S. Damiaens. Het maandelijks onderhoud wordt ook uitgevoerd door de bovengenoemde personen. De firma Abbott komt drie keer per jaar om een preventief onderhoud uit te voeren. 3.1.1.5 Kwaliteitscontroles 3.1.1.5.1 Commerciële controles Om 8 uur voert men op Sapphire 1 en 2 de commerciële controles uit. Dit zijn drie controles van het bedrijf Abbott: Q01 low, Q02 normal en Q03 high. De waarden van deze controles komen in QC Today terecht, dit is een kwaliteitsprogramma. QC Today gaat aangeven of de waarden binnen de grenzen vallen, indien dit zo is, mogen de stalen opgezet worden. s Avonds rond 16 uur worden deze nog eens uitgevoerd om de stalen te waarborgen dat de waarden die doorgegeven zijn tussen deze periode correct zijn. Hiermee wordt de precisie van elk toestel nagegaan. 3.1.1.5.2 Dag en nacht controles Drie stalen van s nachts worden opnieuw uitgevoerd op Sapphire 1 en 2. Voor Sapphire 1 worden de resultaten van s nachts in een Excel file getypt en ernaast komen de resultaten van overdag. Staat alles in het groen, dan mogen de stalen gedraaid worden op Sapphire 2. voor Sapphire 2 worden de dagwaarden van de drie stalen op Sapphire 1 overgenomen en dan vergeleken met de waarden die Sapphire 2 geeft. Staat ook hier alles in het groen, dan mogen de stalen opgezet worden. 3.1.1.5.3 Interne controle Een patiëntencontrole wordt uitgekozen en deze wordt elke twee uur herdraait. De resultaten hiervan komen in een Excel file. Deze controle zorgt voor een regelmatige controle van het toestel. (Van Moer, 2013) 19

3.1.1.6 Referentiewaarden Tabel 7: Referentiewaarden parameters Cell-Dyn Sapphire Pasgeborenen < 2 jaar 2 10 jaar Volswassenen WBC (x10 3 /mm 3 ) 6,7-19,4 3,5-17,3 3,5-12,0 3,6-9,6 %N 35-47 12-60 18-70 41-74 NEU (x10 3 /mm 3 ) 1,9-6,5 1,7-8,7 1,8-6,8 1,4-6,7 %L 14-52 28-76 20-70 19-44 LYM (x10 3 /mm 3 ) 1,4-9,9 2,7-8,7 1,5-5,5 1,2-3,5 %M 1-14 1-13 1-13 3-13 MONO (x10 3 /mm 3 ) 0,2-2,4 0,3-1,8 0,3-1,3 0,1-1,0 %E 0-6 0-6 0-8 0-6 EOS (x10 3 /mm 3 ) 0,0-0,6 0,0-0,4 0,0-0,3 0,0-0,3 %B 0-2 0-2 0-2 0-2 BASO (x10 3 /mm 3 ) 0,0-0,1 0,0-0,1 0,0-0,1 0,0-0,1 WvF (%) > 90 > 90 > 90 > 90 RBCo (x10 3 /mm 3 ) 3,8-5,3 3,9-5,2 4,1-5,3 Man: 4,2-5,7 Vrouw: 3,9-5,0 IRF (x10 3 /mm 3 ) / 0,1-0,2 0,1-0,2 0,1-0,2 RETC (x10 3 /mm 3 ) 60,0-252,0 30,0-100,0 30,0-100,0 30,0-100,0 %R 2,0-5,0 0,6-2,0 0,6-2,0 0,6-2,0 PLTo (x10 3 /mm 3 ) 158-394 158-470 158-433 158-450 RBCi (x10 3 /mm 3 ) 3,8-5,3 3,9-5,2 4,1-5,3 Man: 4,2-5,7 Vrouw: 3,9-5,0 MCV (fl) 96-112 68-90 64-95 83-98 HCT (%) 39,0-55,6 29,4-42,0 32,7-42,7 Man: 39,6-49,2 Vrouw: 36,4-43,9 20

PLTi (x10 3 /mm 3 ) 158-394 158-470 158-433 158-450 HGB (g/dl) 13,1-18,3 9,8-13,8 11,0-14,5 Man: 13,0-16,5 Vrouw: 11,8-14,5 MCH (pg) 32-37 23-31 24-33 27-33 MCHC (g/dl) 32-35 32-35 32-35 32-35 3.1.2 Cell-Dyn Slide Maker Stainer 3.1.1.1 Doel De Cell-Dyn slide maker stainer (SMS) maakt automatisch uitstrijkjes van volbloed en kleurt de glaasjes voor microscopisch onderzoek. De kleuring is de May- Grünwald-Giemsa kleuring. Figuur 13: Cell-Dyn SMS 3.1.1.2 Principe en werking Een druppel volbloed wordt automatisch uitgestreken, volgens de Wedge methode, door de SMS op een microscoopglaasje. Nadien wordt het uitstrijkje in een houder geplaatst en het rekje wordt ondergedompeld in verschillende baden. De onderdompeling zorgt ervoor dat de glaasjes gekleurd en gespoeld worden. Als laatste is er de droogoven waar het rekje wordt gedroogd door warme lucht. De kleuring die wordt gebruikt is de May-Grünwald-Giemsa kleuring. In volgende tabel staat de samenstelling van de baden om de uitstrijkjes te kleuren. 21

Tabel 8: Schema kleuring Bad Oplossing Hoeveelheid (ml) Tijd (min) 1 May-Grünwald 340 3,5 2 May-Grünwald + buffer 170 + 170 in en uit 3 Giemsa + buffer 50 + 290 10 4 Buffer 340 1' 5 Buffer 340 1 Droogoven / / 8 tot het gedroogd is De MGG kleuring bevat een zure eosine kleurstof die de basische bestanddelen zoals hemoglobine rood gaat kleuren. Het basische methyleenblauw kleurt de zure bestanddelen zoals DNA en RNA blauw. Nadien worden de glaasjes bekeken onder de microscoop om hun morfologie te bepalen. (Damiaens, 2012) 22

3.2 Materialen 3.2.1 Cell-Dyn Sapphire en Slide Maker Stainer Principe: zie 3.1 Toestellen Meetmethodes: CBC + RETIC en RBC Open Flow, in deze mode wordt via de open mode van de Sapphire enkel de RBC gemeten. Wedge uitstrijkjes maken via de SMS 3.2.2 Software: FCS Express Dit is een flow cytometry software programma met o.a. de FRC kunnen bepaald worden via scatterplots. 3.2.3 Statistiek via analyse it en SPSS 3.2.3.1 Analyse it Dit is een programma dat met Excel werkt en in deze studie gebruikt om de ROC curve, Receiver Operating Characteristic uit te zetten. Het programma geeft extra mogelijkheden om in Excel statistische gegevens te verwerken zoals de variatiecoëfficiënt, het gemiddelde, etc. 3.2.3.2 Statistical Package for the Social Sciences SPSS Dit programma is van het bedrijf International Business Machines Corporation, beter gekend als IBM. De basis van het SPSS programma is dat het een functionaliteit bevat om data te lezen, bewerken en visualiseren. SPSS werd in deze studie gebruikt om de Intraclass Correlation Coëfficiënt te berekenen. 23

4 Methodes 4.1 Methode validatie 4.1.1 Antiglycophorine methode Monoclonaal Mouse Anti-Human glycophorine 100 mg/l, antilichaam anticd235a. Dit reagens is afkomstig van de firma Dako met al referentienummer F0870 en lotnummer: 00040720. AntiCD235a, antiglycophorine, bindt specifiek aan alle stadia van de rode bloedcellen. Het protocol is als volgt: 10 µl staal + 4 µl antiglycophorine 10 minuten incuberen op kamertemperatuur 126 µl dilutiebuffer ( diluent sheath ) toevoegen meten in RBC open flow op Sapphire Elk staal wordt in duplo uitgevoerd. 4.1.2 Dilutie van een positief staal Een positief staal wordt verdund met een negatief staal van gezonde personen met dezelfde ABO bloedgroep. Dit protocol werd uitgevoerd op drie patiënten gediagnosteerd met TMA. Elk positief staal werd verdund met een negatief staal. Verdunningsreeks: 1/1,5 verdund 1/2 verdund 1/4 verdund De verdunning werd enerzijds gemeten in de CBC + RETIC mode op de Sapphire en anderzijds werd de methode van antiglycophorine uitgevoerd. Bij deze test moet men wel aandacht schenken aan de autofluorescentie van de bloedplaatjes. 4.1.3 Autofluorescentie van de bloedplaatjes De autofluorescentie van de plaatjes wordt aangetoond a.d.h.v. volgend protocol: 10 µl staal + 4 µl CD235a + 4 µl CD41(Dako ref.: R7058) 10 minuten incuberen op kamertemperatuur 126 µl dilutiebuffer toevoegen CD41 gaat specifiek aan de plaatjes binden. 24

4.2 Vergelijkende studie: cut off bepaling 4.2.1 Normaalwaarden Dertig stalen van gezonde individuen werden elk één keer gerund in de CBC + RETIC mode op de Sapphire. Het protocol van antiglycophorine werd ook op elk van de stalen uitgevoerd. Van ieder staal werd een uitstrijk gemaakt. Deze werd microscopisch geteld. 4.2.2 Reproduceerbaarheid Zowel twee stalen van de gezonde individuen als twee positieve TMA stalen werden elk tien keer door de Sapphire gerund in de CBC + RETIC mode. De analyse gebeurde door één persoon. Zo kan er een variatiecoëfficiënt, CV, bepaald worden. De formule om dit te bepalen is als volgt: 4.2.3 Intraclass correlation coëfficiënt' Dertig ad random stalen werden door drie verschillende personen geanalyseerd voor de bepaling van schistocyten via FCS Express. Intraclass correlation coefficiënt, ICC, wordt hierdoor bepaald. De ICC wordt bepaald om na te gaan of er een overeenkomst is tussen de resultaten van, in dit onderzoek, de drie verschillende personen. De waarde van de ICC ligt tussen nul en één. Indien het dicht bij nul ligt, is er geen overeenkomst tussen de resultaten van de examinators. Indien het dicht bij één ligt, is er wel een overeenkomst tussen de resultaten van de examinators. 4.2.4 Microscopie versus Cell-Dyn Sapphire 139 stalen met een vermoeden van aanwezigheid van schistocyten zijn, werden gemeten via de Sapphire en deze werden vergeleken met de resultaten van de microscopische telling. De microscopische telling is de gouden standaard, de referentie methode. In de literatuur wordt een drempelwaarde van meer dan 1% bij de manuele telling als diagnostisch beschouwd (Zini et al., 2011), maar in dit onderzoek wordt er een drempelwaarde van 0,4% gehanteerd als diagnostisch voor TTP voor de microscopische methode. Voor de resultaten van de Cell-Dyn Sapphire wordt de sensitiviteit en de specificiteit bepaald. Sensitiviteit is een maat voor de gevoeligheid van de test, d.w.z. dat de patiënten met de ziekte correct worden geïdentificeerd. Het percentage positieve resultaten wordt weergegeven. De formule van sensitiviteit:. Het resultaat hiervan moet zo dicht mogelijk bij de 100% liggen. 25

Specificiteit gaat na hoe specifiek een test is, d.w.z. om de patiënten die de ziekte niet hebben te identificeren. Het percentage negatieve resultaten wordt weergegeven. De formule van specificiteit:. Ook hier moet het resultaat zo dicht mogelijk bij de 100% liggen. Een positieve predictieve waarde, PPV, en een negatieve predictieve waarde, NPV worden ook bepaald in deze test. De PPV wordt als volgt berekend: het aantal personen met een positieve test die aan de ziekte lijdt, wordt gedeeld door de som van het aantal personen met een positieve test die aan de ziekte lijden en het aantal personen met een positieve test die niet aan de ziekte lijden. De formule van PPV:. De NPV wordt bepaald door volgende berekening: het aantal personen met een negatieve test die niet aan de ziekte lijden, wordt gedeeld door de som van het aantal personen met een negatieve test die aan de ziekte lijden en het aantal personen met een negatieve test die niet aan de ziekte lijden. De formule van NPV:. 26

5 Resultaten en discussie 5.1 Methode validatie 5.1.1 Antiglycophorine methode Figuur 14: FCS scatterplot na meting in CBC + RETIC mode ALL: axial light loss (0 ) PSS: polarized side scatter (90 ) (links) FRC: 0,06% (rechts) In figuur 14 wordt een FCS scatterplot weergegeven met in de tabel ernaast het percentage gefragmenteerde rode bloedcellen, wat in dit staal 0,06% bedraagt. Dit is een staal van een gezond individu. In de scatterplot zijn twee wolken zichtbaar, namelijk een rode en een blauwe wolk. De rode wolk zijn de rode bloedcellen en volgens de tabel zijn er 39.456 rode bloedcellen aanwezig. De blauwe wolk zijn de gefragmenteerde rode bloedcellen en dit zijn slechts 25 cellen of 0,06%, van de totale RBC. 27

Figuur 15: FCS scatterplot na meting met de antiglycophorine methode ALL (0 ) PSS (90 ) In figuur 15 is te zien hoe de schistocyten worden geïsoleerd van de rode bloedcellen. Dit resultaat werd bekomen met de antiglycophorine methode. De blauwe wolk zijn de schistocyten en de rode wolk de RBC. Figuur 16: FCS scatterplot na meting in CBC + RETIC mode In figuur 16 is de FCS scatterplot van een TMA patiënt weergegeven na meting in de CBC + RETIC mode op de Sapphire. De blauwe wolk zijn opnieuw de FRC en de rode wolk de RBC. Het percentage FRC t.o.v. het totale gehalte RBC bedraagt hier 1,06%. 28

retic mode 3 Biomedische laboratoriumtechnologie In onderstaande grafiek is de correlatie, tussen de retic mode en de antiglycophorine methode, van de FRC telling te zien gebaseerd op de resultaten van FCS Express. Op de y-as staan de gegevens van de CBC + RETIC mode en op de x-as die van de antiglycophorine methode. De tabel met resultaten staat in bijlage 1. 1,2 Correlatie FRC telling y = 0,7892x + 0,237 R² = 0,6251 0,9 0,6 0,3 0, 0, 0,28 0,55 0,83 1,1 1,38 antiglycophorine Figuur 17: Correlatie FRC telling 29

% FRC % FRC 3 Biomedische laboratoriumtechnologie 5.1.2 Dilutie van een positief staal In figuur 18 zijn de resultaten van de dilutie, gemeten in de CBC + RETIC mode, van drie TMA patiënten uitgezet in een grafiek. In bijlage 2 is de tabel met resultaten terug te vinden. 2,4 2,1 1,8 Dilutie CBC + RETIC mode 1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0, 0,00 0,25 0,50 0,75 % dilution patient1 patient1 patient2 Figuur 18: Dilutie positief staal in de CBC + RETIC mode In figuur 19 zijn de resultaten te zien van de dilutie van opnieuw drie TMA patiënten, maar in dit geval zijn het de gegevens van de antiglycophorine methode die zijn weergegeven. De tabel met resultaten staat in bijlage 3. Dilutie antiglycophorine methode 2,4 2,1 1,8 1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0, 0,00 0,25 0,50 0,75 % dilution Figuur 19: Dilutie positief staal antiglyocphorine methode patient1 patient2 patient3 30

5.1.3 Autofluorescentie van de bloedplaatjes De linker scatterplot toont het resultaat van een staal waarbij enkel antiglycophorine werd toegevoegd. Er is een duidelijke wolk van CD235a positieve pulsen zichtbaar. Naast deze wolk worden losse pulsen gedetecteerd. Door het staal te labelen met CD41 kunnen we aantonen dat deze hoogst waarschijnlijk overeenkomen met fluorescerende plaatjes. CD235a CD235a CD41 Figuur 20: Links: CD235a (rood) Rechts: CD235a (rood) en CD41 (groen) FL1: Fluorescence channel 1 IAS: intermediate angle scatter (7 ) 31

5.1.4 Werkwijze uit gaten van de gefragmenteerde rode bloedcellen A C B D Figuur 21: Uit gaten van de schistocyten met tabel waarin percentage schistocyten wordt weergegeven t.o.v. totale RBC In figuur 21 worden de verschillende stappen weergegeven hoe men de schistocyten gaat uit gaten. In paneel A ziet met verschillende wolken, deze wolken worden in paneel B geïdentificeerd. De groene wolk zijn de plaatjes, de paarse wolk de WBC en de rode en blauwe wolk zijn de rode bloedcellen. Deze worden geïdentificeerd door hun ligging in de scatter. 32

In paneel C worden de WBC en de plaatjes gewist uit de scatter zodat enkel de wolk van de RBC overblijft. De assen worden dan veranderd, namelijk van FL1 en IAS naar ALL en PSS zodat de RBC kunnen onderverdeeld worden in een rode populatie en een blauwe. Deze blauwe populatie komt overeen met FRC. Zo kan men het percentage van de schistocyten laten berekenen t.o.v. de totale RBC wat in dit voorbeeld 0,12% bedraagt. Figuur 22: Uit gaten van de schistocyten in een positief staal met in de tabel het percentage schistocyten In figuur 22 wordt een voorbeeld weergegeven van een positief staal. Het percentage schistocyten bedraagt hier 1,19%. 33

5.1.5 Discussie methodevalidatie De correlatiecoëfficiënt bedraagt 0,6251. Er werd een positieve bias van de antiglycophorine methode t.o.v. CBC + RETIC methode. Deze had hogere resultaten t.o.v. de CBC + RETIC mode van een positief staal. Daarom worden er bijkomende analyses uitgevoerd om de validatie te bevestigen. Er werd een dilutie van een positief staal uitgevoerd. Er is een duidelijke daling te zien van de FRC. Bij de antiglycophorine meetmethode zien we autofluorescentie van de plaatjes. Om de plaatjes zichtbaar te maken in de scatterplots werd er CD41 toegevoegd. Ook al is er een lage correlatiecoëfficiënt, we gaan toch verder met het analyseren van de patiëntenstalen. 34

5.2 Vergelijkende studie 5.2.1 Normaalwaarden Figuur 23: Scattergram van een gezond individu 1 via CBC + RETIC mode 35

Figuur 24: Scattergram van een gezond individu 1a via antiglycophorine methode 36

Figuur 25: Scattergram van een gezond individu 1b via antiglyocphorine methode 37

Bovenstaande figuren zijn voorbeelden van normaalwaarden. Er is één scatter van de CBC + RETIC meting en twee scatters van de antiglycophorine methode. De bloedfilmen van gezonde personen werden ook microscopisch geteld en men bekomt voor de normaalwaarden minder dan 0,2% schistocyten t.o.v. de rode bloedcellen. Een gemiddelde van gefragmenteerde rode bloedcellen gemeten in de RETIC mode, kwam neer op 0,11% t.o.v. de RBC met een standaarddeviatie van 0,04%. Een gemiddelde gefragmenteerde rode bloedcellen gemeten met de antiglycophorine methode kwam neer op 0,10% t.o.v. de RBC met een standaarddeviatie van 0,04%. 5.2.2 Reproduceerbaarheid De resultaten van de gezonde individuen: 1) 0,13 ±0,02% CV 19,31% 2) 0,10 ± 0,03 % CV 29,44 % De resultaten van de twee TMA patiënten: 1) 3,18 ± 0,36 % CV 11,24 % 2) 0,65 ± 0,08 % CV 12,83 % 5.2.3 Intraclass correlation coëfficiënt ICC = 0.97 (CI 95%: 0.946-0.984) 38

5.2.4 Microscopie versus Cell-Dyn Sapphire Uit de vergelijkende studie werd een ROC curve, via het programma Analyse it, opgemaakt waarbij een cut-off waarde werd bepaald. Figuur 26: ROC plot - Cut-off: 0.42 % - Sensitivity: 100% - Specificity: 69% - PPV: 42% - NPV: 100% 39

5.2.5 Discussie vergelijkende studie Voor de normaalwaarden, net zoals gezien wordt bij microscopie, zijn ook bij gezonde personen fragmentocyten aanwezig in de bloedbaan. Het gemiddeld percentage schistocyten bedraagt 0,05%. Het is algemeen geweten dat het tellen van schistocyten via manuele microsocpie zéér subjectief is. Meestal worden hier hoge ICC-waarden bekomen. De ICC voor de Sapphire methode bedraagt 0,97. Dit wijst erop dat analysten goed overeen komen. Deze methode is véél objectiever. De reproduceerbaarheid van Cell-Dyn Sapphire is duidelijk beter dan deze van microscopie. Bij gezonde, normale, personen is de CV hoog, maar dit komt door de lage waarden die bekomen worden. De tien opeenvolgende stalen zijn kleiner dan de cut off, dus allemaal negatief. Daar we geen TMA patiënten willen missen, kiezen we een cut off van 0,42. Bij deze waarde worden alle positieve patiënten gedetecteerd. Anderzijds bedraagt de specificiteit bij deze waarde slechts 69%. Er zullen dus veel vals positieve patiënten gedetecteerd worden. Het maken van een bloedfilm zal de echte positieven van de vals positieve onderscheiden. 40

5.3 Interferenties Er zijn veel vals positieve resultaten die de Sapphire zou doorgeven als diagnostisch voor TMA terwijl deze personen deze aandoening niet hebben. Enkele voorbeelden zijn: - Alle RBC abnormaliteiten zoals thalassemia, sferocytose, sikkelcelanemie, poikylocytose - Megaloblastaire anemie - Bijna alle nefrologie patiënten (dialyse) - Verschillende postbeenmergtransplantpatiënten, zie figuur 30. 41

Figuur 27: Scattergram van een postbeenmergtransplantaat 42

Figuur 28: Scattergram van een staal met poikylocytose 43

Figuur 29: Scattergram van een staal met sikkelcelanemie 44

6 Conclusie Het gebruik van de Cell-Dyn Sapphire om de gefragmenteerde rode bloedcellen in bloedstalen te detecteren werd gevalideerd door deze studie. Een hoge sensitiviteit werd bereikt, maar de specificiteit was laag. Deze lage specificiteit wordt ook gezien bij andere celtellers waarbij de detectie van FRC geïntegreerd is in het systeem zoals Sysmex die kleiner dan 0,5% geeft en ADVIA kleiner dan 0,3% voor normaalwaarden. Sysmex, bijvoorbeeld, geeft een flagging voor FRC wanneer deze celteller kleine fragmenten van RBC detecteert. Een geoptimaliseerd softwarepakket van Cellavision legt zich toe op digitale detectie van schistocyten. Ook bij deze digitale microscoop worden meer cellen gezien als schistocyten dan dat er werkelijk aanwezig zijn. Het is duidelijk dat de detectie van FRC niet gemakkelijk is. Een koppeling van een celteller, bijvoorbeeld, de Cell-Dyn Sapphire aan digitale microscopie, zou de werklast kunnen verminderen. Verder tonen we in deze studie aan dat het niet mogelijk is om de Cell-Dyn Sapphire te gebruiken om schistocyten te kwantificeren. Dit komt door het hoge aantal interferenties. De analyzer kan wel gebruikt worden als screening test. 45

7 Referenties Damiaens. (2012). Toestellen algemeen: Slide Maker Stainer. Brussel. Huh et al. (2013). Microscopic schistocyte determination according to International Council for Standardization in Hematology recommendations in various diseases. International Journal of Laboratory Hematology, 542-547. Kater et al. (2002, december 9). Trombotische Microangiopathie: trombocytopenie en hemolytische anemie. Opgeroepen op januari 5, 2014, van Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde: http://www.ntvg.nl/publicatie/trombotische-microangiopathietrombocytopenie-en-hemolytische-anemie/volledig Schieving. (2013, maart 25). Hemolytisch Uremisch Syndroom. Opgeroepen op februari 10, 2014, van Kinderneurologie.eu: http://www.kinderneurologie.eu/ziektebeelden/ontsteking/hus.php Thrombotic Microangiopathy: ahus and TTP. (2014). Opgeroepen op februari 18, 2014, van Cincinnati Children's: http://www.cincinnatichildrens.org/service/t/thromboticmicroangiopathy/about-tma/ Trombotische microangiopathie van de nieren. (2014). Opgeroepen op februari 13, 2014, van Codex Medicus: http://www.codexmedicus.nl/sectie/7/chap7disp8200/trombotische_microangiopathie _van_de_nieren.html TTP. (2011, Oktober 20). Opgeroepen op februari 6, 2014, van Nederlandse Vereniging voor Hematologie: http://www.hematologienederland.nl/ttp Van Moer. (2013). Toestellen algemeen: Cell-Dyn Sapphire. Brussel. Zini et al. (2011). ICSH recommendations for identification, diagnostic value, and quantitation of schistocytes. International Journal of Laboratory Hematology, 10. 46