Code Datum Revisie :VPARA/007/01 :13-05-2004 : Taenia spp. onderzoek 1. Inleiding 5. Materiaal 9. Samenhangende procedures 2. Verantwoordelijkheden 6. Werkwijze 10. Bijlagen 3. Reagentia 7. Interpretatie en uitslag 11. Literatuur 4. Apparatuur 8. Kwaliteitsbeheersing OPSTELLING, VERIFICATIE EN BEKRACHTIGING Naam Functie Opsteller Verificateur Verificateur Bekrachtiger K. Borggreve, analist A. Fietje, unitleider B. Mulder, arts-microbioloog M.G.R. Hendrix, hoofd laboratorium VERZENDLIJST Naam Functie Aantal B. Mulder A.U. Fietje C.F.M. ter Horst A.A. van den Heuvel arts-microbioloog unitleider Hogeschool Enschede kwaliteitsfunctionaris origineel 1. INLEIDING 1.1 Algemeen Taenia spp. (lintworm) bestaat uit een kleine scolex (kop), eventueel voorzien van een hakenkrans, met daar achter een groot aantal proglottiden. Er zijn twee soorten Taenia te onderscheiden: Taenia saginata en Taenia solium. Taenia saginata is een ongewapende lintworm (geen hakenkrans in de scolex). Deze lintworm heeft als tussengastheer runderen en komt in Nederland endemisch voor. Taenia solium is een gewapende lintworm (wel een hakenkrans in de scolex). Deze lintworm heeft als tussengastheer varkens en komt in Nederland niet endemisch voor.
1.2 Doel 1.3 Principe Dit onderzoeksprotocol beschrijft de methode van onderzoek op Taenia saginata en Taenia solium proglottiden en eieren in ongefixeerde feces en direct van lintworm(delen). Alle ongefixeerde feces dient te worden gescreend op aanwezigheid van proglottiden. De proglottiden bevatten Taenia spp. eieren. Zowel de proglottiden als de eieren worden uitgescheiden via de feces. Taenia saginata heeft een sterk vertakte uterus (15-32 vertakkingen aan weerszijden) in de proglottiden en de eieren hebben de eigenschap zuurvast te zijn. Deze eieren kleuren rood aan in een gedeeltelijke IHK kleuring (zie werkwijze). Taenia solium heeft een duidelijk minder vertakte uterus (7-13 vertakkingen aan weerszijden) in de proglottiden en de eieren zijn niet zuurvast. 1.4 Definities en afkortingen IHK TFT 1.5 Doelgroep 1.6 Veiligheid IJzerhaematoxyline-Kinyoun kleuring Triple feces test De test wordt uitgevoerd door de medewerkers van het medisch microbiologisch laboratorium die door de unitleider van de afdeling bacteriologie daartoe geautoriseerd zijn. Zie voorschrift veilig microbiologisch werken PALG/002 Gebruik handschoenen bij het werken met de feces; inname van eieren kan cysticerose veroorzaken. Werk bij de IHK-kleuring in de zuurkast i.v.m. het vrijkomen van schadelijke dampen 2. VERANTWOORDELIJKHEDEN De werkzaamheden worden uitgevoerd onder de eindverantwoordelijkheid van het hoofd van het laboratorium. De verantwoordelijkheid voor het volgens dit protocol uitvoeren van de analyse en van de verslaglegging van het testresultaat, berust bij degene die de analyse feitelijk uitvoert. 3. REAGENTIA, MEDIA EN HULPSTOFFEN Zie voor IHK-kleuring VPARA/001 Zie voor Ridleyconcentratie VPARA/001 Glycerol 4. APPARATUUR EN HULPMIDDELEN Zuurkast FPC buizen (Ridley) Glazen roerstaven Microscoop Zeiss Petrischalen Handschoenen Objectglaasjes
Scalpelmesjes 5. BIOLOGISCH MATERIAAL - Ongefixeerde feces - Lintworm of proglottiden ingezonden in een schoon potje. 6. WERKWIJZE Werk met handschoenen aan! Ongefixeerde feces: Screen alle ongefixeerde feces macroscopisch op aanwezigheid van proglottiden. Indien proglottiden aanwezig: Haal de proglottiden uit de feces en leg deze in een schone petrischaal Voeg een kleine hoeveelheid glycerol toe, zodat de proglottide(n) net onder de vloeistof staan Laat dit ca 1 uur staan, zodat de proglottiden schoon en opgehelderd worden Leg daarna een proglottide in het deksel van een schone petrischaal. Knijp deze samen tussen de bodem en het deksel van de petrischaal Houd de geplette proglottide tegen het licht en bekijk de vertakkingen van de proglottide Sterk vertakte uterus in proglottide: Taenia saginata Minder vertakte uterus in proglottide: Taenia solium Indien deze methode niet voldoende duidelijkheid geeft, kunnen de eieren uit de proglottide geknepen worden en gekleurd via een gedeeltelijke IHK kleuring. Voor deze methode hoeft de proglottide niet opgehelderd te worden. Leg een proglottide op een objectglaasje Snijd een proglottide in of door met een mesje en knijp/druk voorzichtig uit Strijk het vocht uit over het glaasje (Maak het preparaat niet te dun, want de eieren zijn relatief zwaar en kunnen tijdens de kleuring van het glaasje vallen) Laat het preparaat goed drogen Fixeer en kleur het preparaat volgens de IHK kleuring, maar sla de Hematoxyline-/ Pykrinezuur-stap over. Kleur dus eerst tot en met de zure alcohol en spoel goed, ga daarna verder bij de 100% ethanol stap en kleur verder zoals beschreven in SOP VPARA/001) Bed het preparaat in. Bekijk de preparaten onder de microscoop bij objectief 10x of 40x Taenia saginata: rood gekleurde eieren Taenia solium: kleurloze eieren Let op: Indien kleurloze eieren worden aangetroffen, overleggen met een arts-microbioloog, omdat een enkele keer Taenia saginata ook kleurloze eieren kan geven!
Indien geen proglottiden aanwezig: Behandel de feces als alle andere ongefixeerde feces en voer een Ridley concentratie uit. Indien in het Ridleysediment Taenia spp. eieren worden aangetroffen, kan er van het sediment ook een gedeeltelijke IHK kleuring uitgevoerd worden (zie boven beschreven). Deze preparaten worden vaak minder mooi gekleurd, omdat er veel achtergrondkleuring is van het sediment. Lintworm of proglottiden: Indien een lintworm of een gedeelte daarvan wordt in gestuurd, werk dan volgens de werkwijze 'indien proglottiden aanwezig' Kleuring van eventuele eieren geldt dan ter bevestiging. 7. INTERPRETATIE, BEREKENING EN UITSLAG Uitslag ongefixeerde feces met proglottiden en/of eieren: Proglottiden IHK-kleuring Uitslag sterk vertakte uterus - Taenia saginata proglottiden sterk vertakte uterus zuurvaste (rode) eieren Taenia saginata proglottiden en eieren - zuurvaste (rode) eieren Taenia saginata eieren minder vertakte uterus - Taenia solium proglottiden minder vertakte uterus ongekleurde eieren Taenia solium proglottiden en eieren - ongekleurde eieren overleg met artsmicrobioloog Uitslag bij lintworm of proglottiden: Proglottiden IHK-kleuring Uitslag sterk vertakte uterus - Taenia saginata worm/proglottiden sterk vertakte uterus zuurvaste (rode) eieren Taenia saginata worm/proglottiden minder vertakte uterus - Taenia solium worm/proglottiden minder vertakte uterus ongekleurde eieren Taenia solium worm/proglottiden Indien er door bovenstaande methodes geen duidelijk onderscheid kan worden gemaakt tussen beide Taenia soorten, geef dan als uitslag: Taenia spp. proglottiden en/of Taenia spp. eieren en/of Taenia spp. worm Indien Taenia spp. aangevraagd en geen proglottiden en/of eieren aanwezig in de ongefixeerde feces, geef dan als uitslag: Geen Taenia spp. proglottiden Geen Taenia spp. eieren
Geen Taenia spp. worm 8. KWALITEITSBEHEERSING Zie P/002 Externe kwaliteitscontrole 9. SAMENHANGENDE PROCEDURES EN FORMULIEREN. PALG/002 Veilig microbiologisch werken VPARA/001 Parasitologisch onderzoek van feces m.b.v. TFT (w.b.ihk-kleuring en Ridleyconcentratie) 10. BIJLAGEN Foto 1: Foto 2: Foto 3: Sterk vertakte proglottide Taenia saginata Taenia saginata eieren in gedeeltelijke IHK-kleuring Taenia spp. eieren in Ridley sediment 11. LITERATUUR - Medische Parasitologie, handleiding bij de laboratorium diagnostiek A.M. Polderman 3 e herziene druk 1999
Code Datum Revisie :VPARA/001/02 :26-06-2002 :04-08- 2003 Parasitologisch onderzoek van feces m.b.v. TFT 1. Inleiding 5. Materiaal 9. Samenhangende procedures 2. Verantwoordelijkheden 6. Werkwijze 10. Bijlagen 3. Reagentia 7. Interpretatie en uitslag 11. Literatuur 4. Apparatuur 8. Kwaliteitsbeheersing OPSTELLING, VERIFICATIE EN BEKRACHTIGING Naam Opsteller Verificateur Verificateur Bekrachtiger A. Romenij, analist A.U. Fietje, unitleider L. Mulder, arts-microbioloog M.G.R. Hendrix, hoofd laboratorium Functie VERZENDLIJST Naam Functie Aantal S. Kuipers L. Mulder S. Meijer A.U. Fietje C.F.M. ter Horst A.A. van den Heuvel arts-microbioloog arts-microbioloog secretaresse medische staf unitleider Hogeschool Enschede kwaliteitsfunctionaris origineel 1. INLEIDING 1.1 Algemeen 1.2 Doel 1.3 Principe Dit onderzoeksprotocol beschrijft de methode van onderzoek op parasieten in feces, ingestuurd met de triple-feces-test (TFT). Bij het TFT onderzoek worden drie fecesmonsters ingestuurd; twee gefixeerd met SAF en
één ongefixeerd monster.van beide monsters gefixeerd in SAF wordt een uitstrijkje gemaakt wat vervolgens wordt gekleurd met de IHK-kleuring. M.b.v. deze kleuring zijn in de monsters zowel de vegetatieve vormen en, in mindere mate, de cysten blijvend waar te nemen en te identificeren.het ongefixeerde monster wordt geconcentreerd met de methode van Ridley. Hierin zijn cysten en wormeieren goed te zien en te identificeren. 1.4 Definities en afkortingen TFT IHK SAF BR DU GV PA PB PC PD PE PF PG PL PN : triple feces test : IJzer-haemotaxiline-kinyoun : sodiumacetate, acetic acid, formalin : brijig : dun : gevormd : de SAF-containers van de TFT afnameset waren te vol / niet goed gemengd. Dit heeft tot gevolg dat de eventueel aanwezige trofozoieten niet goed worden gefixeerd en niet kunnen worden herkend. A.u.b. vullen met feces tot aan de rode pijl en 20 seconden krachtig mengen : de aanwezigheid van Blastocystis hominis is alleen bij blijvende klinische verschijnselen een indicatie voor behandeling (metronidazol 3 dd 500 mg p.o. gedurende 10 dgn) : aangezien Dientamoeba fragilis / Blastocystes hominis meestal asymptomatische infecties veroorzaken, wordt prioriteit gegeven aan de behandeling van de andere pathogene microorganismen : behandeling van Dientamoeba fragilis kan overwogen worden bij persisterende klachten en wanneer geen pathogene micro-organismen gevonden worden (metronidazol 3 dd 500 mg p.o. gedurende 10 dgn) : voor betrouwbaar parasitologisch onderzoek TFT-set insturen : TFT-set voor parasitologisch onderzoek is ongeschikt voor bacteriologisch onderzoek. Voor bacteriologisch onderzoek (Salmonella, Campylobacter etc.) gaarne aparte fecescontainer insturen : Bij parasitologisch fecesonderzoek zijn relatief veel leucocyten waargenomen : Materiaal is doorgestuurd voor nadere differentiatie : Deze niet pathogene protozoa behoeven niet te worden behandeld 1.5 Doelgroep 1.6 Veiligheid De test wordt uitgevoerd door de medewerkers van het medisch microbiologisch laboratorium die door de unitleider van de afdeling bacteriologie daartoe geautoriseerd zijn. Zie voorschrift veilig microbiologisch werken PALG/002 Werk bij de IHK-kleuring in de zuurkast i.v.m. het vrijkomen van schadelijke dampen. Werk met ether altijd in de zuurkast i.v.m. brandgevaar. 2. VERANTWOORDELIJKHEDEN De werkzaamheden worden uitgevoerd onder de eindverantwoordelijkheid van het hoofd van het laboratorium. De
verantwoordelijkheid voor het volgens dit protocol uitvoeren van de analyse en van de verslaglegging van het testresultaat, berust bij degene die de analyse feitelijk uitvoert. 3. REAGENTIA, MEDIA EN HULPSTOFFEN Mayer s albumine, aangeleverd door mediabereiding Hematoxyline werkoplossing; vermeng tenminste 2 uur voor gebruik gelijke delen (80 + 80 ml) Mordant en hematoxyline oplossing (beide aangeleverd door mediabereiding), 1 week houdbaar 1,2 % pikrinezuuroplossing, Merck 100604.0500 Carbolfuchsine-oplossing, Merck 109215.0500 70% ethylalcohol-oplossing, aangeleverd door mediabereiding zure alcoholoplossing, aangeleverd door mediabereiding ammoniakale-alcoholoplossing, aangeleverd door mediabereiding 100% ethyl-alcohol, aangeleverd door de mediabereiding depex inbedmiddel, BDH 361254D formaldehyde 4%, Merck 104003 diethylether, Merck 100923.1000 JKJ oplossing, aangeleverd door mediabereiding, 1 maand houdbaar 4. APPARATUUR EN HULPMIDDELEN - glazen kleurbakjes - objectglashouders - houten stokjes - glazen roerstaaf - FPC (fecal parasite concentrator) systeem firma Evergreen no. 308-1000-00 - Heraeus megafuge 1.0 - KNF membraan vacuumpomp n811kt18 - receptal (gesloten afzuigpomp) ABOTT b.v - objectglaasjes en dekglaasjes - microscoop 5. BIOLOGISCH MATERIAAL Fecesmonsters; ongefixeerd en met SAF gefixeerd 6 WERKWIJZE 6.1 Algemeen Indien feces niet als TFT-set binnenkomt, voer het onderzoek niet uit en vermeld code PH. Voer het onderzoek wel uit het monster afkomstig is van het ziekenhuis in Almelo of Hengelo, vermeld dan geen code.
Controleer of de containers van de SAF monsters niet te vol zijn: - indien de container boven de rode pijl gevuld is: voer het onderzoek uit en voeg code PA toe. Controleer of de feces goed met de SAF gemengd is: - indien niet goed gemengd: voer het onderzoek uit en voeg code PA toe. Controleer alle monsters op de aanwezigheid van wormen, larven, proglottiden Beoordeel van de ongefixeerde feces de consistentie; gevormd, brijig of dun en vermeld dit op het werkformulier. Indien aangevraagd op Salmonella, Shigella, Campylobacter en / of Yersinia: voer dit onderzoek niet uit en vermeld code PF 6.2 IHK-kleuring meng op een objectglaasje 1 druppel SAF-gefixeerde fecessuspensie met 1 druppel Mayer s albumineoplossing en maak een uitstrijkpreparaat laat aan de lucht drogen (30 minuten, maximaal enkele uren) breng in ethanol 70 % (5-10 minuten) spoel in kraanwater (2 minuten) kleur in carbolfuchsine (20 minuten) was met kraanwater door het preparaat 1 minuut onder de zacht lopende kraan te plaatsen was de overtollige kleurstof uit in zure alcohol (2 minuten) (eventueel 2 bakjes) was met kraanwater door het preparaat 1 minuut onder de zacht lopende kraan te plaatsen kleur in hematoxyline-werkoplossing (8 minuten) was gedurende 1 minuut door het in een bakje gevuld met aqua-dest te brengen breng in de pikrinezuur (4 minuten) was met kraanwater door het preparaat 10 minuten onder de zacht lopende kraan te plaatsen (hoe langer hoe beter) breng in de ammoniakale 70% ethyl-alcohol (3 minuten) ontwater in 3 opeenvolgende baden 100% ethylalcohol (5 minuten elk) breng het preparaat tenslotte in 3 baden xyleen (5 minuten elk) dek af en sluit in met Depex (preparaat mag niet droog zijn) laat de preparaten goed drogen (eventueel op een strekplaat van max. 35 o C) beoordeel het preparaat met een vergroting van 10 x 100 verversen van de reagentia: - pikrinezuuroplossing : bij overgang van geel naar oranje - carbolfuchsineoplossing : 1 x per maand - 70% ethylalcoholoplossing : 1 x per week - zure alcoholoplossing : zodra vloeistof donker wordt - ammoniakale alcoholoplossing : 1 x per week - ethyl-alcohol 100% : het laatste bakje dagelijks verversen en de drie bakjes doorschuiven - xyleen : bij doffe kleur - hematoxyline werkoplossing : 1 x per week
Noteer het verversen in het logboek 6.3 Concentratiemethode volgens Ridley suspendeer 0,5-1,0 gram feces m.b.v. een glazen roerstaaf in enkele ml. formaline 4% in de eerste buis zonder dop vul aan met formaline tot ca. 9 ml trek het ontluchtingspijpje tot halverwege uit het zeefje van de tweede buis en schroef deze goed op de eerste buis filtreer de suspensie door de buizen om te draaien schroef de eerste buis inclusief zeefje van de tweede buis voeg ca. 3 ml. ether toe in de zuurkast sluit de buis met de schroefdop en schud krachtig met de hand gedurende 1 minuut centrifugeer gedurende 2 minuten 2000 tpm en laat de centrifuge ongeremd uitdraaien zuig m.b.v. de vacuumpomp de detritusprop en de vloeistof af tot vlak boven het sediment, houd een weinig vloeistof over om het sediment te resuspenderen breng een druppel JKJ oplossing op een objectglas en suspendeer hierin een druppeltje van het sediment, zodat een dun gekleurd preparaat ontstaat breng hiernaast op het objectglas een grotere druppel van het sediment zodat een dikker ongekleurd preparaat ontstaat dek beide druppels af met een dekglas screen met objectief 10x, bekijk details (evt. m.b.v. immersie olie) met objectief 40x (zonodig 100x) 7. INTERPRETATIE, BEREKENING EN UITSLAG 7.1 Interpretatie 7.2 Uitslag - bekijk bij de IHK-kleuring minimaal 200 velden van het preparaat alvorens het als negatief af te geven - meet altijd de grootte van de parasiet - interpreteer verdachte elementen m.b.v. : Medische Parasitologie van Polderman en Rijpstra Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites, World Health organization Fixatives and permanent stains in the laboratory diagnosis of intestinal protozoal infections, T. Mank - Bij monster 1 en 3, SAF; resultaat uitslag toevoegen code negatief E. histolytica / dispar geen trofozoieten geen cysten - - rode bloedcellen in cytoplasma Entamoeba histolytica trofozoiet - minutavorm, cysten B. hominis en D. fragilis - Entamoeba histolytca / dispar, (opsturen naar Leiden) - Diëntamoeba fragilis Vermeld code PD
B. hominis - Blastocystis hominis Indien alleen B. hominis toeveoegen code PB Indien in combinatie met pathogenen*: PC D. fragilis (i di ll h i i i d - Diëntamoeba fragilis Indien alleen D. fragilis toevoegen code PD Indien in combinatie met pathogenen*: PC overige cysten / trofozoieten -vermeld de naam van de parasiet en in welke vorm (cysten of trofozoiet) deze is gevonden Indien alleen apathogenen zijn gevonden toevoegen code PN -vermeld indien alleen trofozoieten zijn - -vermeld indien alleen cysten zijn - * pathogeen zijn: - E. hystolitica - G. lamblia - alle wormen / larven / wormeieren Indien relatief veel leucocyten in het preparaat aanwezig zijn moeten deze bij de opmerkingen bij de uitslag worden vermeld. Bij monster 2, ongefixeerd; resultaat negatief wormeieren Cysten uitslag geen wormeieren geen cysten - vermeld de naam van de gevonden parasiet / wormei - vermeld bij Ascaris eieren tevens of deze bevrucht of onbevrucht zijn vermeld indien alleen wormeieren zijn gevonden tevens; geen cysten vermeld de naam van de gevonden parasiet vermeld indien alleen cysten zijn gevonden tevens; geen wormeieren toevoegen code 8. KWALITEITSBEHEERSING 8.1 Intern - neem aan het begin van iedere dag een bekend positief of een leucocytenrijk preparaat mee ter controle van de kleuring en noteer dit in het logboek
8.2 Extern - steekproefsgewijs worden positieven door een tweede analist beoordeeld - Bewaar de resultaten van rondzendingen SKMM. Zie P/002 externe kwaliteitscontrole. - steekproefsgewijs wordt een selectie van de preparaten gecontroleerd door een externe deskundige - Deelname aan het Regionaal Overleg Laboratoria voor Parasitologische Diagnostiek Oost Nederland (PROOST). 9. SAMENHANGENDE PROCEDURES EN FORMULIEREN Werkformulier TFT 10. BIJLAGEN I. Lijst van parasieten II. Logboek verversen reagentia III. Logboek controle kleuring 11. LITERATUUR - Comparison of fresh versus Sodium acetate Acetic acid Formalin preserved stool specimens for diagnosis of intestinal protozoal infections Mank et al. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 1995 - Medische parasitologie, handleiding bij de laboratoriumdiagnostiek A.M. Polderman en A.C. Rijpstra derde druk, 1999 - Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites World Health organization, 1994 - Fixatives and permanent stains in the laboratory diagnosis of intestinal protozoal infections T. Mank, 1992